Cynthia Azeredo Cordeiro
POLIMORFISMOS DOS GENES DAS
CITOCINAS IL-1
α
, IL-1 , IL-10 E TNF-
α
NA
RETINOCOROIDITE TOXOPLÁSMICA
Belo Horizonte
Minas Gerais – Brasil
Cynthia Azeredo Cordeiro
POLIMORFISMOS DOS GENES DAS
CITOCINAS IL-1
α
, IL-1 , IL-10 E TNF-
α
NA
RETINOCOROIDITE TOXOPLÁSMICA
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina da
Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial para
obtenção do título de Doutor
Área de Concentração:
Oftalmologia
Orientadores:
Fernando Oréfice
Antônio Lúcio Teixeira Júnior
Faculdade de Medicina da UFMG
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
Magnífico Reitor
Prof. Ronaldo Tadêu Pena
Pró-Reitor de Pós-Graduação
Prof. Jaime Arturo Ramirez
Pró-Reitor de Pesquisa
Prof. Carlos Alberto Pereira Tavares
Diretor da Faculdade de Medicina
Prof. Francisco José Penna
Diretora do Hospital das Clínicas
Profa. Tânia Mara Assis Lima
Coordenador do Centro de Pós-Graduação da Faculdade de Medicina
Prof. Carlos Faria Santos Amaral
Coordenador do Curso de Pós-Graduação em Oftalmologia
Chefe do Departamento de Oftalmologia, Otorrinolaringologia e Fonaudiologia
Profa. Ana Rosa Pimentel de Fiqueiredo
Membros do Colegiado do Curso de Pós-Graduação em Oftalmologia
Prof. Joel Edmur Boteon
Prof. Márcio Bittar Nehemy
Prof. Marco Aurélio Lana Peixoto
Prof Sebastião Cronemberg Sobrinho
Prof. Evaldo Nascimento
Prof. Fernando Oréfice
Prof. Henderson Celestino de Almeida
Prof.Homero Gusmão de Almeida
A Comissão Examinadora que assina abaixo ___________________________ a
tese intitulada “POLIMORFISMO DOS GENES DAS CITOCINAS IL-1α, IL-1 , IL-10 E TNF-α NA RETINOCOROIDITE TOXOPLÁSMICA”, apresentada e defendida em sessão pública, por Cynthia Azeredo Cordeiro, para obtenção do grau de doutor em
Medicina, pelo curso de pós-graduação em Medicina, área de Oftalmologia,
Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais.
___________________________________________________________________ Prof. Dr. Fernando Oréfice
___________________________________________________________________ Prof. Dr. Antônio Lúcio Teixeira Júnior
___________________________________________________________________ Prof. Dr. Wesley Ribeiro Campos
___________________________________________________________________ Profa. Dra. Walderez Ornelas Dutra
___________________________________________________________________ Prof. Dr. Francisco Max Damico
___________________________________________________________________ Profa. Dra. Joyce Yamamoto
Suplentes:
___________________________________________________________________ Prof. Dr. Daniel Vítor Vasconcellos
___________________________________________________________________ Prof Dr. Carlos Eduardo Hirata
AGRADECIMENTOS
A Deus, que me deu o dom da vida.
Ao meu pai, que, mesmo não estando mais aqui, ilumina e norteia cada
um dos meus passos.
À minha mãe, por dar-me força a cada obstáculo, sorrir a cada vitória e
nunca duvidar dos meus sonhos.
Aos meus irmãos e cunhadas, pela paciência, ajuda e compreensão
em todos momentos.
Ao meu namorado Rogério, companheiro sempre presente, mesmo à
distância, nas dúvidas, decisões e vitórias; com palavras de carinho e
incentivo.
Aos meus familiares e amigos, por estarem sempre prontos a aplaudir
a cada passo dado e ajudar a cada obstáculo que surge. Em especial às
crianças da minha família, que alegram e encantam meus dias.
À minha amiga Mariana e seus familiares Tia Hilda, Tio Afrânio e Tia
Lubélia, que me acolheram como família, dando-me moradia, conforto e,
acima de tudo, amor.
Ao meu orientador Prof. Dr. Fernando Oréfice, eterno mestre, por todas
oportunidades de aprendizado e exemplo de vida.
Ao meu orientador Antônio, pelos conhecimentos transmitidos, pela
oportunidade, confiança e apoio durante esta jornada.
Ao Dr. Wesley, pelos ensinamentos, olhar fraterno e amigo e por
À Wal, pela receptividade e disponibilidade em ajudar, recebendo-me
de braços abertos em seu laboratório.
À minha amiga Paula, que me pegou pela mão e ensinou-me
passo-a-passo cada experimento com paciência, competência, carinho e amizade a
todo o momento.
Ao Germano, pelo apoio nos experimentos e análises. E, em extensão,
a todos amigos do Laboratório de Interações celulares do ICB.
Aos amigos do Setor de Uveítes pelo apoio, incentivo e ajuda.
À Edilaine, Carlos Eduardo, Diogo, Mariana e Priscila pela ajuda na
coleta e exame dos participantes do estudo.
À minha amiga Iluska, pelo apoio, carinho e amizade a todo o
momento, sempre disposta a ajudar-me.
À Bernadete e Adriana, pelo colo de mãe e pelas palavras de amizade
e incentivo.
À Mônica, por estar sempre pronta a me ajudar.
" De tudo, ficaram três coisas: A certeza de que estamos sempre começando...
A certeza de que precisamos continuar... A certeza de que seremos interrompidos antes de terminar... Portanto, devemos: Fazer da interrupção um caminho novo... Da queda, um passo de dança... Do medo, uma escada... Do sonho, uma ponte... Da procura, um encontro... "
RESUMO
Objetivos: A Retinocoroidite Toxoplásmica (RT) é a causa mais comum de uveíte posterior em muitas partes do mundo, incluindo o Brasil. Existem grandes
controvérsias com relação aos fatores responsáveis pela ocorrência ou recorrência
da RT. Dados experimentais demonstraram papel relevante da interleucina-10
(IL-10), fator de necrose tumoral (TNF-α), interleucina-1α (IL-1α) e interleucina-1 (IL-1 ) na modulação da TO. A partir disso, foi proposto investigar a possível
associação entre o polimorfismo funcional do gene IL10 na posição –1082 (G/A),
TNF-α na posição –308 (G/A), IL1A na posição –889 (C/T) e IL1B na posição +3954
(C/T) e a RT em humanos. Metodologia: Cem pacientes com diagnóstico de TO foram recrutados do Setor de Uveítes da UFMG. Como controles, cem doadores de
sangue com sorologia positiva para Toxoplasmose e sem história e/ou sinais de TO
prévia foram incluídos no estudo. DNA foi obtido através do raspado de mucosa oral
dos indivíduos e submetido à determinação dos genótipos. Os fragmentos
específicos de DNA foram amplificados pela reação em cadeia da polimerase (PCR).
Os produtos da PCR foram clivados por enzima de restrição e visualizados através
de eletroforese para distinguir os alelos específicos de cada gene, permitindo a
detecção do polimorfismo e determinação dos genótipos. Resultados: Na análise do polimorfismo do gene IL10 (-1082G/A) foi encontrada diferença significativa na
distribuição do genótipo entre pacientes e controles (x² = 6.33, P = 0.04).
se observou associação significativa nas freqüências dos genótipos ou alelos ou
com a ocorrência ou recorrência da doença. Na análise do polimorfismo do gene
IL1A (-889C/T) não foi encontrada associação significativa na distribuição do
genótipo e do alelo entre pacientes e controles. Já na análise de subgrupo,
observou-se associação significativa da distribuição do genótipo (x² = 5.71, P = 0.03)
e alelo (x² = 5.46, P = 0.02, OR = 3.21, CI = 1.11<OR<9.22) entre os grupos com e
sem recorrência. Quando investigou-se o polimorfismo do gene da IL1B (+3954C/T),
não foram encontradas associações significativas nas freqüências dos genótipos ou
alelos com a ocorrência e recorrência da doença. Conclusão: Os resultados do nosso estudo sugerem que polimorfismos dos genes IL10 e IL1A estão associados
com a RT.
ABSTRACT
Purpose: Toxoplasmic Retinochoroiditis (TR) is the most common identifiable cause of posterior uveitis in many parts of the world. There is a great controversy regarding
which factors are responsible for the occurrence or reccurrence of TR. Experimental
data have demonstrated a relevant role for IL-10, TNF-α, IL-1α and IL-1 in the modulation of acute ocular toxoplasmosis. Therefore, we aim to investigate the
possible association between an IL10 (-1082G/A), TNF-α (-308G/A), IL1A (-889C/T)
and IL1B (+3954C/T) gene polymorphisms and TR in humans. Methods: One hundred patients with diagnosed TR were recruited from the Uveitis Section, Federal
University of Minas Gerais. For comparison, one hundred healthy blood donors with
positive serology for Toxoplasmosis and without retinal signs of previous TR were
included in the study. Genomic DNA was obtained from oral swabs of individuals
and amplified using polymerase chain reaction (PCR) with specific primers for each
locus gene. PCR products were submitted to restriction endonuclease digestion and
analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis to distinguish specific alleles for each
gene, allowing the detection of the polymorphism and determination of genotypes.
Results: In the IL10 gene polymorphism analysis, there was a significant difference in the genotype distribution between TR patients and control subjects (x² = 6.33, P =
0.04). Carriers of the IL10 -1082 A allele (AA + AG genotypes) were more often
patients with TR than controls (x² = 5.97, P = 0.01, OR = 2.55, CI = 1.11<OR<5.55).
genotype or allele distributions in patients with TR compared with control subjects. In
a subgroup analysis, prevalence of the genotype (x² = 5.71, P = 0.03) and allele (x² =
5.46, P = 0.02, OR = 3.21, CI = 1.11<OR<9.22) distributions significantly differ
between with and without recurrence episode groups. When we investigated the IL1B
gene polymorphism, no significant difference in the genotype or allele distributions in
patients with TR compared with control subjects and recurrence analysis between
with and without recurrence episode groups. Conclusions: Our results suggest that some polymorphisms related with cytokine genes are associated with TR.
LISTA DE ABREVIATURAS
A - Adenina
Bp - Pares de bases
C - Citosina
CI - Intervalo de confiança
(C/T) - Troca de uma citosina por uma timina
DNA -Ácido desoxirribonucléico
EPR - Epitélio Pigmentar da Retina
G - Guanina
GM-CSF -Fator estimulador de colônias de granulócito-macrófago
(G/A) -Troca de uma guanina por uma adenina
HLA - Antígeno Leucocitário Humano
ICAM-1 -Molécula de adesão intercelular-1
IL-1 - Interleucina 1
IL-1α- Interleucina 1 alfa
IL1A- gene produtor da interleucina 1 alfa
IL-1 - Interleucina 1 beta
IL1B- gene produtor da interleucina 1 beta
IL-2 - Interleucina 2
IL-4 - Interleucina 4
IL-5 - Interleucina 5
IL-6 - Interleucina 6
IL-8 - Interleucina 8
IL-10 - Interleucina 10
IL10- gene produtor da interleucina 10
IL-12 - Interleucina 12
IFN- -Interferon-gamma
mM - Milimolar
µl -Microlitro
NCoI - Enzima de restrição
OR - Razão de chances
P - p-valor
PCR - Reação em cadeia da polimerase
pH - Potencial de hidrogenização
pmol - picomoles
RFLP - polimorfismo de tamanho de fragmentos de restrição
RT - Retinocoroidite Toxoplásmica
T - Timina
Taq -Thermus aquatius DNA polimerase.
Taq I - Enzima de restrição
TE - Tris EDTA
TEMED - N,N,N’,N’,- tetrametiletilenodiamino
TNF-α - Fator de necrose tumoral alfa
TNF-α- gene produtor do fator de necrose tumoral alfa
Tris - Tris-hidroximetilaminometano
VNTR - polimorfismo de número variável em tandem Xag I - Enzima de restrição
SUMÁRIO
1 – INTRODUÇÃO ...1
2 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...6
2.1 - Resposta Imune na Toxoplasmose...6
2.2 - Artigo de Revisão ...14
3 – OBJETIVOS...34
3.1 – Geral ...34
3.2 – Específicos ...34
4 – ARTIGOS ...35
4.1 - Artigo 1 ...36
4.2 - Artigo 2 ...53
4.3 - Artigo 3 ...67
5 – RESULTADOS ADICIONAIS...83
5.1 – Análise Multivariada das Componentes Principais...83
5.2 – Análise de Regressão Logística Multivariada...85
7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...92
8 – ANEXOS...100
8.1 – Parecer do COEP/UFMG...101
8.2 – Fichas de coleta de dados dos pacientes e controles...103
Ficha de Atendimento – pacientes...104
Ficha de Atendimento – controles...105
8.3 – Protocolos de extração do DNA e confeccção do gel...106
Protocolo para extração de DNA pelo método da sílica...107
Soluções utilizadas na extração de DNA...108
Gel de poliacrilamida (10%)...109
1- INTRODUÇÃO
A toxoplasmose é uma zoonose causada pelo Toxoplasma gondii, um parasita
intracelular obrigatório, com ampla distribuição geográfica e alta prevalência
sorológica mundial (Nussemblatt e Whitcup, 2004; Soheilian et al., 2004; Oréfice,
2005). No Brasil, a prevalência de infecção por toxoplasmose em adultos varia de 50
a 80% dependendo da região estudada (Bonfioli e Oréfice, 2005 e Oréfice, 2005). A
infecção pode ser congênita, por via transplacentária, ou adquirida que ocorre
através da ingestão ou manipulação de carne crua ou mal-passada, contendo cistos
teciduais, ou água ou comida contendo oocistos eliminados em fezes de gato
infectados (Bahia-Oliveira et al., 2003; Montoya et al., 2004).
A infecção toxoplásmica em humanos é freqüentemente subclínica, ou seja,
apresenta-se assintomática ou com sintomas inespecíficos, como os de um resfriado
comum, sem determinar qualquer comprometimento ocular. No entanto, pode
tornar-se clinicamente evidente, evoluindo, por exemplo, com retinocoroidite, em indivíduos
imunossuprimidos ou não. A retinocoroidite toxoplásmica é reconhecidamente a
causa mais comum de uveíte posterior e pode deixar seqüelas graves, incluindo a
perda completa da visão (Bonfioli e Oréfice, 2005 e Koo e Young, 2006). No Brasil, é
responsável por aproximadamente 80% dos casos de uveíte posterior (Bonfioli e
Oréfice, 2005 e Oréfice, 2005).
A aparência típica ou clássica da retinocoroidite toxoplásmica consiste de uma
outro olho (Rothova, 2003; Bonfioli e Oréfice, 2005).
O diagnóstico da doença ocular é basicamente clínico, através das
características da lesão, associado a uma sorologia positiva, IgM ou IgG. A sorologia
positiva não é, por si só, diagnóstica, mas a negativa exclui a possibilidade de
toxoplasmose ocular (Oréfice, 2005; Koo e Young, 2006).
O tratamento ideal para a retinocoroidite toxoplásmica seria aquele que
erradicasse o parasita por completo, mas o corrente apenas inibe a multiplicação do
parasita e limita a inflamação. O tratamento padrão envolve um período de drogas
sistêmicas antiparasitárias com ou sem uso de corticosteróide e geralmente dura de
4 a 8 semanas dependendo da gravidade da doença. Existem vários regimes de
tratamento utilizados e não existe consenso com relação à escolha das drogas
antiparasitárias. O regime mais comum, denominado “terapia clássica”, consiste de
Pirimetamina e Sulfadiazina, que podem ser associadas a Prednisona e Ácido
Folínico (Oréfice, 2005; Koo e Young, 2006).
Os fatores que controlam a ocorrência, gravidade e recorrência da doença
ocular não são bem compreendidos, embora uma variedade de componentes,
incluindo a susceptibilidade genética do hospedeiro, estado nutricional e do sistema
imune, carga do parasita, genótipo do parasita, têm sido sugeridos como
possivelmente envolvidos no desenvolvimento da infecção (Sibley et al., 2002;
Holland, 2004).
Muitas questões sobre a doença permanecem ainda confundindo os
oftalmologistas e infectologistas. A resposta a antibioticoterapia em combinação com
corticóides ou não, varia amplamente entre os pacientes. A apresentação clínica
mínima enquanto outros têm múltiplas recorrências de uveíte grave levando a perda
da visão. A resposta imune provavelmente apresenta um papel na determinação da
evolução da doença e possivelmente sua resposta à terapia convencional (Vallochi
et al., 2002).
Define-se polimorfismo genético como a ocorrência de múltiplos alelos num
locus, no qual pelo menos dois alelos aparecem com freqüências superiores a 1%
na população (Thompson et al.,1993). Entende-se por locus o local ocupado por um
gene em um cromossomo e entendem-se por alelos, os genes correspondentes de
dois cromossomos homólogos. Por convenção, loci polimórficos são aqueles para os
quais pelo menos 2% da população é heterozigota. Neste caso, levanta-se a
hipótese de que algum fator seletivo atuou sobre aquele sistema genético, levando
ao aumento da freqüência do alelo anômalo (Thompson et al., 1993 e Brasileiro
Filho, 1998).
Os polimorfismos têm valor, preferencialmente, pelo seu uso como
“marcadores” genéticos para distinguir diferentes formas hereditárias de um gene em
estudos de famílias (Thompson et al., 1993). Com as técnicas de DNA
recombinante, tem sido possível detectar os polimorfismos que consistem,
geralmente, em uma simples troca de base, deleções ou inserções casuais, ou na
presença de números variáveis de cópias repetidas de um determinado fragmento
de DNA (repetições em tandem). As técnicas mais usadas para se detectar a
ocorrência de polimorfismos gênicos envolvem a análise dos polimorfismos de
seqüências de reconhecimento específicas no DNA, as alterações da seqüência do
DNA genômico acarretam na criação ou na abolição de sítios de clivagem, alterando,
desse modo, o tamanho de um ou mais fragmentos de DNA oriundos da ação da
enzima de restrição. Os VNTRs são polimorfismos causados por inserção/deleção
que acarretam em uma série de comprimentos de fragmentos alélicos, relacionados
entre si por um número variável de seqüências de DNA repetidas em tandem no
intervalo entre dois sítios de restrição. Os VNTRs e os RFLPs podem ser detectados
de forma similar, através da amplificação da região de interesse pela técnica da
reação em cadeia da polimerase (PCR) e posterior tratamento com enzimas de
restrição que reconhecem sítios específicos e originam fragmentos de DNA com
comprimentos variados. Enquanto os RFLPs revelam polimorfismos devido à
presença ou ausência de um sítio de restrição, os VNTRs revelam polimorfismos
devido a números diferentes de repetições situadas entre dois sítios de restrição
(Jorde et al., 1996; Thompson et al., 1993; Otto et al., 1998).
A presença de polimorfismos em um determinado gene pode ou não acarretar
alterações funcionais. Polimorfismos funcionais em genes de citocinas, que podem
confirmar diferenças interindividuais na síntese e secreção destas proteínas, têm
sido associados a doenças que têm uma patogênese inflamatória. Estudos já
demonstraram a associação de polimorfismos dos genes de determinadas citocinas
com a ocorrência e a gravidade de uveítes (Martin e Rosenbaum, 2005), como
uveíte intermediária (Stanford et al., 2005), oftalmia simpática (Atan et al., 2005),
uveíte por HTLV-1 (Seki et al., 1999), uveíte anterior (Verma et al., 1997; Kuo et al.,
2005; Wegcheider et al.,2005; El Shabrawi et al., 2006; Menezo et al., 2006; Yeo et
na doença de Behçet (Ahmad et al., 2003; Karasneh et al., 2003; Sallakci et al.
2005).
Não existem estudos de polimorfismo genético com relação à ocorrência da
retinocoroidite toxoplásmica. Pretendeu-se então, nesse estudo, investigar a
associação de polimorfismo dos genes de determinadas citocinas: interlucina-10
(IL-10), fator de necrose tumoral - α (TNF-α), interleucina 1α (IL-1α) e interleucina 1 (IL-1 ) com a retinocoroidite toxoplásmica, em comparação com controles com
ausência de história prévia de uveíte e cicatrizes retinocoroidianas e com sorologia
2- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1- Resposta Imune na Toxoplasmose
A resposta imune compreende o conjunto de mecanismos elaborados pelo
organismo frente a um patógeno, como vírus, bactérias, protozoários. Existe uma
resposta inata, que fornece a linha de defesa inicial contra os microorganismos e
outra adquirida, estimulada pela exposição a agentes infecciosos. Existem dois tipos
de resposta imunológica adquirida, a imunidade humoral e a celular, mediadas por
diferentes componentes do sistema imunológico. A imunidade humoral é mediada
pelos anticorpos, que são produzidos pelos linfócitos B, e sua função é neutralizar e
eliminar microorganismos extracelulares e toxinas que são acessíveis a anticorpos.
Já a imunidade celular, mediada pelos linfócitos T, atua como mecanismo de defesa
contra microorganismos que sobrevivem dentro de fagócitos ou células
não-fagocíticas infectadas (Abbas e Lichtman, 2005). Os linfócitos T efetores, da
linhagem CD4+, são divididos nas subpopulações Th1 e Th2, distinguidas pelo
padrão seletivo de produção de citocinas. Células de perfil Th1 secretam IL-2 e
e contribuem na resistência aos patógenos intracelulares (Mosmann e Coffman,
1992). Já as células de perfil Th2 produzem IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13 e são
responsáveis pela defesa contra infecções por helmintos e artrópodes e por reações
alérgicas (Garside e Mowat, 1995).
O Toxoplasma gondii é uma parasita intracelular e, portanto, induz uma
potente reposta imune celular. Entretanto, no momento da infecção aguda, quando
primeiras linhas de defesa (Roberts e McLeod, 1999).
O parasita pode diretamente estimular macrófagos a produzir citocinas
macrofágicas, como IL-12 e TNF-α. Seguindo a ativação dos macrófagos, estas citocinas atuam em sinergia para induzir as células NK a produzirem IFN- . IL-1 é
também estimulado pela IL-12 para induzir a produção de IFN- pelas células NK. O
IFN- pode, então, estimular a atividade microbicida dos macrófagos. Os
mecanismos efetores da ação dos macrófagos incluem produção de oxigênio tóxico
e intermediários do nitrogênio, produtos do metabolismo do ácido araquidônico pela
via da 5-lipoxigenase e degradação do triptofano intracelular do parasita. Esses
eventos atuam como primeira linha de defesa na resistência a infecção pelo T. gondii
antes do desenvolvimento da resposta das células T (Hunter et al., 1996; Gazzinelli
et al., 1996).
A resistência ao T. gondii depende das células T CD4+ e CD8+. Células T de
perfil Th1 exercem seus efeitos protetores através da produção de citocinas
pró-inflamatórias como IFN- e IL-2. A habilidade do IFN- de ativar macrófagos já foi
descrita. IL-2 induz as células citocina-ativadas, de fenótipo das células NK ou
células T, que são citotóxicas contra células-alvo infectadas pelo T. gondii.
Inversamente, as citocinas produzidas pelas células T CD4+, perfil Th2, como IL-4,
IL-5 e IL-10, estão associadas com downregulation da resposta imune celular. As
citocinas de perfil Th2 podem promover a multiplicação parasitária; entretanto, elas
também podem ser recrutadas para controlar a resposta imune pró-inflamatória
histocompatibilidade maior) tipo I contra as células infectadas pelo T. gondii (Hunter
et al., 1996).
Como um parasita intracelular obrigatório, a imunidade mediada por células é
a principal defesa do hospedeiro contra a infecção pelo Toxoplasma gondii.
Entretanto, infecção pelo T. gondii estimula a produção de anticorpos IgG, IgM, IgA e
IgE. Taquizoítas extracelulares cobertos pelos anticorpos e complemento podem ser
lisados pela via clássica do complemento ou destruídos dentro dos fagócitos. Estes
mecanismos não oferecem proteção contra os parasitas vivos que já estão no
interior das células. Entretanto, anticorpos como IgA secretória podem interferir na
interação inicial do parasita com a célula do hospedeiro nas membranas mucosas
(Hunter et al., 1996; Gazzinelli et al., 1996 e Roberts e McLeod, 1999).
As plaquetas podem apresentar um papel na defesa do hospedeiro contra o T.
gondii. Na ausência de anticorpos, plaquetas humanas são citotóxicas contra os
taquizoítas. Esta citotoxicidade coincide com aumento significativo na liberação de
tromboxane A2 e outros metabólitos do ácido araquidônico. (Yong et al., 1991 e
Roberts e McLeod, 1999)
RESPOSTA IMUNE NA TOXOPLASMOSE OCULAR
O olho é um local imunologicamente privilegiado e sua resposta imune local é
suprimida para prevenir a destruição tecidual. Sob circunstâncias normais, o fluido
intra-ocular contém citocinas que têm propriedades imunossupressoras. Taquizoítas
e cistos do T. gondii foram observados na retina neuro-sensorial e epitélio pigmentar
da retina (EPR) de pacientes com toxoplasmose ocular (Bhopale, 2003). Estudos
animal quanto em humanos.
Estudos em Modelo Animal
O papel das citocinas na retinocoroidite toxoplásmica tem sido estudado em
modelos animais, nos quais tem sido proposto que citocinas apresentam um
importante papel no controle da doença. Camundongos infectados pelo T. gondii
desenvolveram inflamação ocular focal e envolvimento do EPR. O tratamento destes
animais com anti-IFN- ou anti-TNF-α resultou em um aumento das lesões oculares, associadas principalmente com as taquizoítas (Gazzinelli et al, 1994). Outro estudo
demonstrou, no entanto, que a estimulação de endotélio vascular retiniano de
camundongos infectados pelo parasita com IFN- , TNF-α e IL-1 inibiu o crescimento do parasita dentro destas células (Brunton et al., 2000). Estes
resultados sugerem que IFN- e TNF-α são elementos cruciais no controle do crescimento parasitário, que está diretamente associado ao desenvolvimento das
lesões oculares.
A IL-10 é uma citocina com importante propriedade antiinflamatória e
imunossupressora. Para entender o papel da IL-10 na retinocoroidite toxoplásmica,
foram comparados camundongos com deficiência funcional do gene desta
interleucina e controles, após injeção intraperitoneal do parasita. Aumento da
infiltração celular e necrose foram observados no tecido ocular dos hospedeiros
imunodeficientes, não encontrados nos controles (Lu et al., 2003).
IFN- é um importante mediador inflamatório com atividades anti-toxoplasma.
diminuição na capacidade de produção do IFN- e que isto está relacionado ao
desenvolvimento de infecções oportunistas. O estudo então estabeleceu um modelo
animal de retinocoroidite toxoplásmica em ambos hospedeiros imunocompetentes e
imunocomprometidos infectados perioralmente. Uma maior carga parasitária foi
observada na retina, coróide e nervo óptico dos camundongos com deficiência.
Taquizoítas foram observados nos imunodeficientes e bradizoítas nos
imunocompetentes. A angiofluoresceinografia demonstrou vazamento nos capilares
retinianos dos hospedeiros imunodeficientes (Norose et al. 2003).
Foi investigado o papel da IL-6 em olhos de camundongos infectados pelo
parasita, comparando a progressão da doença e o desenvolvimento da resposta
imune local em camundongos normais e com deficiência da produção desta
interleucina. Os hospedeiros imunodeficientes desenvolveram uma inflamação mais
grave da retina, vítreo e úvea do que os controles, associada com o aumento do
número de parasitas (Lyons et al., 2001).
Os resultados desses estudos demonstram a importância das citocinas na
modulação da toxoplasmose ocular e sugere que a deficiência na produção de
determinadas citocinas pode acarretar um aumento das lesões oculares, associado
a um maior número de parasitas.
Estudos Em Humanos
Embora existam muitos estudos referentes a imunologia na toxoplasmose
sistêmica, poucos estudos foram realizados com relação à resposta imune na
toxoplasmose ocular.
Realizou-se um estudo para avaliar a produção de citocinas pelas células
gondii em pacientes brasileiros. Os indivíduos foram divididos em quatro grupos:
com toxoplasmose ocular congênita, com toxoplasmose ocular adquirida,
soropositivos e soronegativos. Pacientes com diagnóstico de toxoplasmose ocular
adquirida apresentaram maiores níveis de IL-1 do que indivíduos assintomáticos. Por
outro lado, indivíduos assintomáticos secretaram significativamente mais IL-12 e
IFN- do que os indivíduos com toxoplasmose ocular adquirida. Esses dados
sugerem que a resistência ao desenvolvimento de lesões oculares está associada
com a habilidade de produzir IL-12 e IFN- e que a susceptibilidade a ocorrência de
lesões está relacionada com uma maior produção de IL-1. IL-4 e IL-5 foram
indetectáveis em todos os grupos. Já os pacientes com toxoplasmose ocular
congênita, secretaram significativamente menos IL-12 e IFN- em resposta ao
antígeno parasitário do que os pacientes com a doença adquirida. A resposta
diminuída ao antígeno pelas células T dos indivíduos com toxoplasmose ocular
congênita sugere que as células T específicas para o T. gondii podem ter sido
destruídas ou “anergizadas” pela exposição ao antígeno do parasita no período
pré-natal (Yamamoto et al., 2000).
Um estudo francês avaliou também a produção de citocinas (IFN- , 10 e
IL-4) por células mononucleares do sangue periférico, após cultura, expostas a
antígeno do T. Gondii. Essas células foram coletadas de indivíduos portadores de
toxoplasmose ocular congênita, adquirida ou indeterminada, indivíduos com
sorologia positiva, mas sem lesão ocular e indivíduos com sorologia negativa. Não
cultura das células sanguíneas, carga parasitária na cultura e carga parasitária na
infecção congênita (Fatoohi et al, 2006).
Cultura de células do EPR de humanos foram utilizadas para investigar a
resposta celular primária das células retinianas à replicação intracelular do T. gondii,
através da secreção de IL-1, IL-6, fator estimulador de colônias de
granulócito-macrófago (GM-CSF) e molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1). Os níveis
dessas moléculas aumentaram progressivamente com o tempo e em correlação com
o número de células infectadas, assim como com a concentração intracelular do
parasita, em relação aos controles, sugerindo um papel imunoregulatório dessas
moléculas no processo fisiopatológico da toxoplasmose ocular (Nagineni et al.,
2000).
Recentemente, um estudo do nosso grupo avaliou o nível sérico de cinco
quimiocinas (CCL2, CCL11, CXCL9, CXCL8 e CXCL10) em pacientes com
retinocoroidite toxoplásmica ativa e controles. A intensidade do processo inflamatório
foi avaliada pela graduação da opacidade vítrea, tamanho da lesão ativa e presença
de vasculite retiniana. Observou-se aumento significativo dos níveis da quimiocina
CXCL8 nos pacientes em relação aos controles. Além disso, essa quimiocina
apresentou-se aumentada também entre os pacientes com vasculite retiniana, com
lesões de maior diâmetro e houve diminuição dos seus níveis após o tratamento.
Este estudo demonstra a importância desta quimiocina na patogênese da
toxoplasmose ocular, podendo ser usado como marcador de atividade da doença
(Gonçalves et al., 2007).
Apesar de escassos, esses estudos comprovam a importância das citocinas
doença ocular, observado em modelos experimentais foi confirmado em humanos.
São necessários mais estudos com relação a resposta imune à toxoplasmose ocular
2.2- Artigo de Revisão
“IMUNOGENÉTICA DAS UVEÍTES” – aceito para publicação na revista Arquivos
I
MUNOGENÉTICA DASU
VEÍTESCynthia A. Cordeiro, MD,1 Paula R. Moreira, PhD,2 Walderez O. Dutra, PhD,2 Wesley
R. Campos, MD, PhD, 1 Antônio L. Teixeira, MD, PhD,2 Fernando Oréfice, MD, PhD.1
1
Departamento de Oftalmologia, Setor de Uveítes, Hospital São Geraldo,
Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG, Brasil; e 2Instituto de
Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG,
Brasil.
Autor correspondente:
Cynthia A. Cordeiro
Rua Gilberto Siqueira 87 apto 502
Campos, RJ 28010-400 Brasil
Telefone: 55(22) 2723-2918
E-mail: cordeiro.cy@gmail.com
RESUMO
Citocinas são moléculas envolvidas na comunicação intercelular nas respostas
inflamatória e imune, desempenhando papel relevante nas uveítes. Polimorfismos
dos genes responsáveis pela produção de determinadas citocinas têm sido
relacionados com a ocorrência e a gravidade de algumas uveítes. Portanto, o
presente trabalho tem como objetivo relatar essas possíveis associações,
salientando o aspecto individual genético no prognóstico das uveítes.
SUMMARY
Cytokines are molecules involved in intercellular communication in the immune and
inflammatory responses, playing an important role in uveitis. Genetic polymorphisms
responsible for the production of certain cytokines have been associated with the
occurrence and the severity of uveitis. Therefore, the present study has the purpose
of describing these possible associations, pointing out the individual genetic
DESCRITORES
Uveíte, Polimorfismo genético, Citocinas.
KEYWORDS
A resposta imune, responsável pela defesa do organismo, é determinada pela
interação entre moléculas (citocinas, complexo HLA) e células (monócitos, linfócitos)
do sistema imune. Alterações nos níveis dessas moléculas podem interferir na
resposta imune, oferecendo maior proteção ou susceptibilidade a diversas doenças
inflamatórias e infecciosas.1
Alterações genéticas podem estar associadas a um grau de maior ou menor
produção dessas moléculas, ou ainda interferir em sua fisiologia. Algumas mutações
genéticas podem ser suficientemente graves para ocasionar doenças, enquanto
outras podem ser silenciosas ou gerar mudanças sutis ou subclínicas. Entre estas,
destacam-se os polimorfismos genéticos que podem ser definidos como a troca de
um nucleotídeo (adenina – A, guanina – G, timina – T e citosina – C) por outro em
determinado local de um gene (locus), cuja frequência na população geral é superior
a 1%.2
A maioria dos estudos buscando associações imunogenéticas com as uveítes
foi realizada com os genes dos loci do complexo de moléculas do Antígeno
Leucocitário Humano (HLA, do inglês Human Leukocyte Antigen). Essas moléculas
são responsáveis pela apresentação de antígenos aos linfócitos, células
responsáveis pelo desencadeamento da resposta imune. 1 Os genes do sistema
HLA apresentam diversos polimorfismos, sendo que alguns deles estão associados
a maior susceptibilidade a várias doenças, inclusive oftalmológicas. 3 A Tabela 1
apresenta uveítes associadas com polimorfismos de determinadas moléculas HLA.
3,4,5,6
As citocinas são proteínas que promovem a interação entre as células do
ou a função das células-alvo (Tabela 2). A partir de estudos experimentais realizados principalmente em camundongos, as citocinas foram classificadas em
citocinas inflamatórias (por exemplo, IL-1, TNF-α), envolvidas na inflamação; citocinas de perfil Th1 (por exemplo, IFN- ), que medeiam resposta imune celular, e
citocinas de perfil Th2 (por exemplo, IL4, IL-6, IL-10), que inibem a resposta Th1,
tem efeito antiinflamatório e participam de resposta imune humoral. 1 Em humanos, a
IL-10 é uma citocina produzida tanto por células Th1 como Th2, que possui um
importante papel anti-inflamatório. Outras subpopulações de células T CD4+, como
as Th3, T regulatórias e Th17 também já foram descritas e desempenham funções
imunoregulatórias, baseadas nas citocinas produzidas por elas. 1
Embora o mecanismo patogênico exato de várias uveítes seja desconhecido,
observa-se o envolvimento de diferentes citocinas no processo. 7 Assim,
polimorfismos que resultem em aumento da produção de citocinas inflamatórias ou
diminuição da produção de citocinas antiinflamatórias na ocorrência de uveíte
podem predispor a uma maior inflamação intra-ocular. 2
O objetivo do presente trabalho é revisar sistematicamente os estudos de
associação de determinados polimorfismos dos genes das citocinas com a
ocorrência e/ou gravidade de diferentes uveítes.
UVEÍTE POR HTLV-1
O vírus linfotrópico humano tipo 1 (HTLV-1) está associado à leucemia /linfoma
Clinicamente, a uveíte associada ao HTLV-1 (HU) é caracterizada por
moderada a grave infiltração celular ocular e moderada vasculite retiniana. 9 Foi
demonstrado que quantidades significativas de várias citocinas, incluindo TNF-α, são produzidas no humor aquoso de pacientes portadores de HU.10 Paralelamente,
estudos demonstraram que indivíduos que apresentem polimorfismos nas posições
-238, -308, -863 e -1031 do gene produtor de TNF-α produzem maiores níveis dessa citocina na resposta imune frente a diferentes estímulos. 11, 12 A partir disso,
realizou-se um estudo investigando a distribuição de cinco polimorfismos do gene produtor do
TNF-α (-1031, -863, -857, -308 e -238) em pacientes portadores de HU, portadores assintomáticos e controles saudáveis. A freqüência de polimorfismos nas posições
-1031T/C e -863C/A foi maior nos pacientes portadores de HU, sendo
estatisticamente distinta em relação aos controles. Esses resultados sugerem que os
polimorfismos do gene do TNFα nessas posições podem constituir fator de risco para a ocorrência de HU. 11
UVEÍTE INTERMEDIÁRIA IDIOPÁTICA
Uveíte intermediária é uma inflamação intra-ocular que envolve vítreo anterior,
retina periférica e pars plana. Acomete com maior freqüência indivíduos de 5 a 30
anos de idade, sem preferência por gênero. A etiologia é desconhecida, mas
existem várias doenças associadas, como neurite óptica idiopática, esclerose
múltipla, doenças inflamatórias intestinais, linfoma, sarcoidose, doenças tireoidianas,
além de várias doenças infecciosas, como as causadas por vírus Epstein-Baar, HIV,
HTLV-1, hepatite C, doença de Whipple, doença de Lyme, doença da arranhadura
Estabeleceu-se que a produção de IFN na presença do alelo -874T
apresenta-se aumentada. 14 O polimorfismo de IL10, citocina antiinflamatória, nas posições
-1082, -819 e -592 está associado com baixa produção da citocina. 15
Realizou-se, então, um estudo em pacientes portadores de uveíte intermediária
idiopática e controles saudáveis, investigando a distribuição dos polimorfismos dos
genes IL10 (-1082G/A e -819C/T) e IFN- (-874T/A). Foi observada maior freqüência
do alelo -874T do gene do IFN em pacientes do que em controles e do genótipo
IL10 -1082AA em pacientes com maior gravidade da doença. Além disso,
constatou-se maior gravidade em pacientes que tinham o genótipo IFN- -874TA ou TT
combinado com o genótipo IL10 -1082AA. Esses resultados sugerem que a
gravidade da doença pode ser parcialmente determinada por uma interação entre os
genes das citocinas baseados na baixa produção de IL-10 e na alta produção de
IFN- . 16
OFTALMIA SIMPÁTICA
Oftalmia simpática é uma uveíte bilateral granulomatosa que ocorre após
trauma penetrante em um olho (olho “excitante”) que resultará, futuramente, em uma
resposta inflamatória no olho contralateral (olho “simpatizante”). 4
Em um estudo realizado em pacientes com diagnóstico de oftalmia simpática
e em controles saudáveis, investigou-se a distribuição do polimorfismo dos genes
produtores de IL-10 (-1082G/A, -819C/T e -592C/A). Associações estatisticamente
estabilidade do quadro com terapia de manutenção com corticosteróides. Além
disso, o complexo IL10 (-1082G, -819C e -592C) foi encontrado como fator protetor
contra a recorrência da doença. Esses resultados indicam que os polimorfismos do
gene IL10 podem constituir marcador de gravidade da doença. Foi estudada
também a distribuição de polimorfismos dos genes TNF-α (-308G/A e -238G/A),
TNF- (1/2G/A), receptor tipo 2 de TNF (+196R/M) e CLTA-4 (+49G/A) entre
pacientes e controles, mas não foram encontradas associações significativas com a
doença. 17
UVEÍTE ANTERIOR
Uveíte anterior pode apresentar-se como uveíte anterior idiopática, síndrome
de Fuchs, uveíte anterior associada ao HLA-B27, síndrome de Posner-Schlossman e
associada a doenças sistêmicas como espondilite anquilosante, síndrome de Reiter,
artrite psoriática, doenças inflamatórias intestinais, sarcoidose, artrite reumatóide
juvenil, doença de Behçet, sífilis, herpes, tuberculose. 4
Além da clássica associação entre o HLA-B27 e uveíte anterior, outros estudos
foram realizados na busca de fatores genéticos que estivessem envolvidos na
patogênese da doença.
Um estudo foi realizado em pacientes com uveíte anterior associada ao
HLA-B27 e controles saudáveis, HLA-HLA-B27 positivos e negativos, avaliando a distribuição
de polimorfismos do gene TNF-α (-857C/T, -308G/A e -238G/A). A freqüência dos
genótipos TNF-α -308GA e -238GA foram significativamente menores em pacientes
com uveíte anterior associada ao B27, quando comparados com controles
comparados com controles HLA-B27 positivos, uma menor freqüência do genótipo
TNF-α-238GA foi observada entre os pacientes. Nenhuma diferença nas freqüências
foi observada entre os diferentes grupos com relação ao polimorfismo do TNF-α
-857C/T. 12
Outro estudo procurou determinar a associação entre polimorfismos dos genes
TNF-α (-1031T/C, -863C/A, -857C/T, -308G/A e -238G/A), linfotoxina α/LTA (+720, +365 e +249), receptores de TNF-α : TNFRSF1A (-201, -230, -845, -839 e -1135) e TNFRSF1B (+1663, +1668 +1690 e +676) e uveíte anterior aguda, além da possível
associação com o HLA-B27 e/ou com o desenvolvimento de complicações. Foi
observada maior freqüência do alelo TNF-α -857T em pacientes com uveíte anterior
aguda quando comparados com controles saudáveis. Em uma análise de subgrupo,
observou-se que o desenvolvimento de complicações foi significativamente maior
nos pacientes com HLA-B27 positivo que apresentavam os alelos TNFRSF1A -201T
e -1135T. A partir desses resultados, sugere-se que variações genéticas no gene do
TNF-α e de seus receptores influenciam na susceptibilidade e na gravidade da resposta inflamatória intra-ocular durante o desenvolvimento de um episódio de
uveíte anterior aguda. Não foram observadas associações com os polimorfismos
TNF-α (-1031T/C, -863C/A, -308G/A e -238G/A), LTA (+720, +365 e +249) e
receptores de TNF-α : TNFRSF1A (-230, -845 e -839) e TNFRSF1B (+1663, +1668 +1690 e +676). 18
Estudo em modelo animal demonstrou que injeção do antagonista do receptor
Dessa forma, realizou-se um trabalho em que se encontrou maior freqüência do
alelo Il1RA +2018T nos pacientes com uveíte anterior crônica em comparação com
os quadros de uveíte recorrente, e do alelo TNF-α -308G em pacientes com uveíte
anterior associada ao HLA-B27. Foram pesquisadas ainda associações dos
polimorfismos dos genes das citocinas IL-6 (-174), IL-10 (-1082), TNF-α (238 e -308) com ocorrência, curso e complicações da uveíte anterior, que foram negativas.
21
A quimiocina MCP-1 (CCL2), citocina envolvida no recrutamento de células
mononucleares, já foi detectada em concentrações elevadas no humor aquoso de
pacientes portadores de uveíte anterior aguda.22 Além disso, o polimorfismo do gene
da MCP-1 na posição -2518 foi relacionado com expressivo aumento da produção
dessa quimiocina. 23 Assim, foi investigada a distribuição desse polimorfismo
(2518A/G) nos portadores de uveíte anterior aguda com HLAB27 positivo. O alelo
-2518G foi significativamente mais freqüente nos pacientes do que nos controles
também positivos para o HLA-B27. Esse estudo indica papel do polimorfismo do
gene MCP-1 (-2518A/G) na ocorrência de uveíte anterior aguda em portadores de
HLA-B27 positivo. 24
Nessa linha de investigação, estudou-se também a associação entre
polimorfismos dos genes das quimiocinas IL-8 37511C/T e 36849C/T), MCP-1
(-62534A/T, -63997C/T e -63555A/T) e seus respectivos receptores IL-8-ra (-4205G/A,
6694C/G, 10188T/C) e CCR2 (50490T/A, 49776C/G, 49715A/G, 49652T/C,
-49105A/G, -46295 G/A e -39353A/G) e a ocorrência de uveíte anterior aguda
idiopática. Observou-se que a freqüência do alelo MCP-1 -63555T foi
pacientes, indicando que o alelo MCP-1 -63555T seria um fator protetor contra a
ocorrência da doença.25 Este estudo corrobora a hipótese de participação do MCP-1
na ocorrência de uveíte anterior aguda. 24,25 Os outros polimorfismos não
apresentaram associação com a presença e/ou gravidade da doença.25
VASCULITE RETINIANA IDIOPÁTICA
Vasculite retiniana é uma inflamação intra-ocular que afeta vasos retinianos.
Pode ocorrer como uma condição isolada, como uma manifestação de doenças
infecciosas (sífilis, tuberculose, toxoplasmose) ou neoplásicas, ou em associação
com doenças inflamatórias sistêmicas (doença de Behçet, sarcoidose). 26
A quimiocina CX3CL1 (fractalcina), implicada na adesão leucocitária, já foi
observada em tecido uveal, sugerindo seu envolvimento na vigilância imune dos
tecidos oculares. 27 Recentes estudos demonstraram que polimorfismos do gene do
receptor dessa quimiocina nas posições -839 e -745 estariam relacionados com
diminuição da atividade desse receptor. 28 A partir disso, realizou-se um estudo para
investigar a distribuição de polimorfismos do gene CX3CR1 (-745G/A e -839C/T) em
indivíduos portadores de vasculite retiniana idiopática e controles saudáveis.
Observou-se uma maior freqüência entre os pacientes do alelo CX3CR1 -839T e do
complexo CX3CR1 -745A e -839T. Sugere-se, então, que os polimorfismos que
diminuem a atividade funcional do receptor da quimiocina CX3CL1, desempenham
um papel na patogênese da vasculite retiniana idiopática. 29
clássica a presença de úlceras mucocutâneas recorrentes, sendo ulceração oral
geralmente o primeiro sintoma. Outras manifestações incluem úlceras genitais,
lesões cutâneas, alterações vasculares, neurológicas, articulares e oculares. A
doença pode afetar o segmento anterior e/ou posterior do olho, levando a ocorrência
de iridociclite, hipópio, vitreíte, vasculite e oclusão retiniana, hiperemia do disco
óptico e edema macular. 30
Estudos demonstraram a associação entre a doença de Behçet e o HLA-B51.
No entanto, a presença do HLA-B51 não é suficiente para explicar a manifestação
da doença, levando à busca de outros genes relacionados. 4 Como o aumento dos
níveis séricos de citocinas pró-inflamatórias tem sido relacionado com maior
atividade da doença de Behçet, estudos investigaram a associação de diversos
polimorfismos dos genes de citocinas e a doença (TNF-α, IL-1).31, 32
Nos pacientes com envolvimento ocular, observou-se maior freqüência do alelo
CTLA-4 -49A e do genótipo CTLA-4 -49AA, quando comparados a pacientes sem
envolvimento ocular. 33 CTLA-4 é uma molécula sinalizadora expressa na superfície
das células T, cuja função principal é inibir a ativação de células T.1 O polimorfismo
do gene da CTLA-4 na posição -49 ocasiona redução de sua função inibitória. 34
Portanto, uma menor capacidade de inibição de células T geneticamente
determinada estaria relacionada com o desenvolvimento de doença de Behçet
ocular.
CONCLUSÃO
Os estudos já realizados, que buscaram fatores imunogenéticos envolvidos na
do envolvimento das citocinas na patogênese das uveítes sugere alteração de sua
produção, levando a busca de associações dos polimorfismos dos genes produtores
dessas moléculas com a ocorrência e/ou gravidade das uveítes. Esses estudos
contribuem para o entendimento da etiopatogenia e da fisiopatologia das uveítes.
Foram observadas associações de polimorfismos dos genes de citocinas com
uveíte por HTLV-1, uveíte intermediária idiopática, oftalmia simpática, uveíte anterior,
vasculite retiniana idiopática e acometimento ocular na doença de Behçet.
Como perspectivas futuras, seria interessante investigar o papel desses
polimorfismos de genes de resposta imune na patogênese de uveítes infecciosas,
especialmente a retinocoroidite toxoplásmica, uveíte posterior mais comum em
diversos países e, notadamente, no Brasil. Esses estudos permitirão a identificação
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Tabela 1 – Uveítes associadas a Polimorfismos do Sistema HLA (Human Leukocyte Antigen):
UVEÍTE HLA
Síndrome da Histoplasmose Ocular Presumida
HLA-DR2, HLA-DQ6, HLA-DR15, HLA-B7
Pars planite DR2, DR15, HLA-DR17,HLA-DRB1, HLA-DQA1, HLADQB1
Uveíte associada a ARJ HLA-DRB1, HLA-B27
Doença de Behçet HLA-B51
Coriorretinopatia de Birdshot HLA-A29
Uveíte Anterior HLA-B27, HLA-B51,HLA-DQA1,HLA-DQB1, HLA-DRB1
TINU HLA-DQ, HLA DR
Síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada
HLA-DRB1,HLA-DQB1, HLA-DQA1
Oftalmia Simpática HLA-CW, HLA-DRB1, HLA-DQA1
Tabela 2 – Uveítes associadas a Polimorfimos dos Genes das Citocinas:
CITOCINAS EFEITOS CELULARES E SISTÊMICOS POLIMORFISMO ASSOCIADO (locus) Fator de Necrose Tumoral (TNF) Ativação de células endoteliais e neutrófilos; apoptose de
muitos tipos celulares; febre; síntese de proteínas de fase aguda; catabolismo muscular e de gordura.
Uveíte associada ao HTLV-I (-1031 e -868)
Uveíte Anterior (-857, -308 e -238) Interferon (INF) Estado antiviral e expressão de MHC de classe I aumentada
em todas células; ativação de células NK.
Uveíte Intermediária (-874)
Interleucina-1 (IL-1) Ativação de células endoteliais; febre e síntese de proteínas
de fase aguda.
Uveíte Anterior( IL-1ra +2018)
Interleucina-10 (IL-10) Inibição da produção de IL-12; expressão de
co-estimuladores e moléculas MHC da classe Iinos macrófagos e células dendríticas.
Uveíte Intermediária (-1082) Oftalmia
Simpática (-1082, -819 e -592) MCP-1 (CCL2) Recrutamento misto de leucócitos Uveíte Anterior (-63555, -2518)
Fractalcina (CX3CL1) Ativação leucocitária e proteção neuronal Vasculite Retiniana (-839 e -745)
3- OBJETIVOS
3.1- Geral
Investigar a associação entre polimorfismos genéticos das citocinas e a
retinocoroidite toxoplásmica.
3.2- Específicos
Os objetivos específicos seguem os objetivos de cada artigo apresentado:
1- Investigar a associação entre o polimorfismo genético da interleucina-10
(-1082G/A) e a retinocoroidite toxoplásmica
2- Investigar a associação entre o polimorfismo genético do fator de necrose
tumoral-alfa (-308G/A) e a retinocoroidite toxoplásmica
3- Investigar a associação entre o polimorfismo genético da interleucina-1α (-889C/T) e a retinocoroidite toxoplásmica
4- Investigar a associação entre o polimorfismo genético da interleucina-1
4.1-Artigo 1
“INTERLEUKIN-10 GENE POLYMORPHISM (-1082G/A) IS ASSOCIATED WITH
TOXOPLASMIC RETINOCHOROIDITIS” – aceito para publicação na revista
I
NTERLEUKIN-10
G
ENEP
OLYMORPHISM(-1082G/A)
ISA
SSOCIATEDWITH
T
OXOPLASMICR
ETINOCHOROIDITISCynthia A. Cordeiro,1 Paula R. Moreira,2 Mariana S. Andrade,1 Walderez O. Dutra,2
Wesley R. Campos,1 Fernando Oréfice,1 Antônio L. Teixeira.3
From the 1Uveitis Section, Department of Ophthalmology, 2Department of
Morphology, and 3Department of Internal Medicine, Federal University of Minas
Gerais, Belo Horizonte, MG, Brazil.
Correspondence to:
Dra. Cynthia A. Cordeiro
Rua Gilberto Siqueira 87 apto 502
Campos, RJ 28010-400 Brazil
Telephone: 55(22) 2723-2918
E-mail: cordeiro.cy@gmail.com
ABSTRACT
Purpose: Experimental data has demonstrated a relevant role for IL-10, an
anti-inflammatory cytokine, in the modulation of acute ocular toxoplasmosis. Therefore,
we aim to investigate the possible association between an IL10 gene polymorphism
at position -1082 and toxoplasmic retinochoroiditis (TR) in humans.
Methods: One hundred patients with diagnosed TR were recruited from the Uveitis
Section, Federal University of Minas Gerais. For comparison, one hundred healthy
blood donors with positive serology for Toxoplasmosis and without retinal signs of
previous TR were included in the study. Genomic DNA was obtained from oral
swabs of individuals and amplified using polymerase chain reaction (PCR) with
specific primers flanking the locus -1082 of IL10 (-1082G/A). PCR products were
submitted to restriction endonuclease digestion and analyzed by polyacrylamide gel
electrophoresis to distinguish allele G and A of the IL-10 gene, allowing the detection
of the polymorphism and determination of genotypes.
Results: There was a significant difference in the genotype distribution between TR
patients and control subjects (x² = 6.33, P = 0.04). Carriers of the IL10 -1082 A allele
(AA + AG genotypes) were more often patients with TR than controls (x² = 5.97, P =
0.01, OR = 2.55, CI = 1.11<OR<5.55). In a subgroup analysis, there was no
significant difference in genotypes and allele carriage regarding visual acuity,
involvement of both eyes and TR recurrence.
Conclusions: This study suggests that the genotypes related with a low production of
Toxoplasmosis is a common infection worldwide, but the disease is often
asymptomatic in immunocompetent individuals. Only a few infected subjects develop
ocular lesions, named toxoplasmic retinochoroiditis (TR), but it is uncertain why this
happens.1 TR is the most common identifiable cause of posterior uveitis in many
parts of the world, including Brazil.2-4 The intensity of damage to the retina and
choroid depends on the severity of the infection and the associated inflammatory
reaction.2,4,5 The response to antibiotic therapy in combination with corticosteroids
and the clinical presentation vary significantly, with some patients presenting one
episode of mild inflammation whereas others have multiple recurrences of severe
uveitis leading to loss of eyesight. The immune response is likely to play a role in
determining the evolution of disease and possibly the response to conventional
therapy.5,6
A series of inflammation-related molecules, the cytokines, is involved in the
control of the immunopathology of uveitis.7,8 Cytokine production has been shown to
be under genetic control. Polymorphisms in the promoter region of cytokine genes
may determine lower or higher levels of their production in response of different
stimuli. As a consequence, these polymorphisms may influence the susceptibility to
inflammatory diseases or their severity.9
Interleukin-10 (IL-10) is a cytokine with a significant anti-inflammatory
function.10,11 Approximately three-quarters of interindividual variability in human IL-10
levels has been attributed to genetic variation, and there is a growing body of
characterized by the substitution of guanine (G) to adenine (A) nucleotides. The
-1082 AA IL10 genotype, marked by lower IL-10 production, was associated with the
occurrence of Behçet’s disease,14 the development of steroid-dependent
inflammatory bowel disease,15 and of invasive pulmonary aspergillosis infection.16
Another study found that IL-10 haplotype (-1082/-819/-592) seems to have a
protective role against the development of invasive pulmonary aspergillosis infection
after allogeneic stem cell transplantation, but this protective role was not dependent
on -1082A allele.17
Therefore, we aim to investigate the possible association between IL10
(-1082G/A) polymorphism and TR in humans.
MATERIAL AND METHODS
Subjects
The study protocol adhered to the tenets of the Declaration of Helsinki and was
approved by the local Institutional Review Board. Patients were informed verbally
and in writing of the potential benefits and risks of the study, and all patients signed a
written form stating that they understood and consented to participate.
One hundred patients (41 males, 59 females) with diagnosed TR were
recruited from the Uveitis Section, Department of Ophthalmology, Federal University
of Minas Gerais - Brazil, between August 2006 and November 2006. No subject
enrolled in this study presented autoimmune or systemic infectious disease. Active
TR was defined by the presence of gray-white focus of retinal necrosis next to a
pigmented retinal scar or in the other eye in patients with positive serology for
necrosis after 3 months of an active episode.18 The following clinical data were also
collected: age, gender, duration of follow-up, associated systemic disease and
number of recurrent episodes. All patients underwent a detailed ocular examination,
including best-corrected visual acuity, applanation tonometry for intraocular pressure,
slit lamp examination, fundus examination with 78-D lens and indirect
ophthalmoscope. The number and location of retinochoroidal lesions were
documented for all patients by careful fundus drawings or photographs.
One hundred healthy blood donors from Hemominas Foundation, matched by
age and gender were included as controls. All of them had positive IgG antibody for
Toxoplasmosis without any history of uveitis. All controls also underwent an ocular
examination to exclude the presence of retinal scars suggestive of previous TR.
Sample collection and DNA extraction
Epithelial cells from 200 individuals were obtained through an oral swab performed
with a sterile plastic spatula and placed immediately in 1500 μL of Krebs buffer (NaCl 20%, KCl 2%, CaCl2 2%, H2O 2%, MgSO4,KH2PO4, C6H12O6). DNA extraction was
performed. A pellet of cells was obtained by centrifugation at 200g for 5 min. The
supernatant was removed and 20μL of silica (SiO2, Sigma, St. Louis-USA) and 450 μL of lyses buffer (6,0M GuSCN, 65mM Tris-HCl pH=6,4, 25mM EDTA and 1,5% Triton X-100) were added to the microtubes. Samples were homogeneized by using
a Vortex and incubated for 30 min at 56ºC. After this incubation, samples were
