Otimização de fermentações sequenciais com duas leveduras do género Saccharomyces

Dissertação de Mestrado

Mestrado Integrado em Engenharia Biológica

Ramo Tecnologia Química e Alimentar

Trabalho Efetuado sob a orientação do

Professor Doutor José Maria Oliveira

e da

Mestre Isabel Araújo

(Vinalia – Soluções de Biotecnologia para a Vitivinicultura, Lda.)

Daniela Sofia Rodrigues Martins

Nome:

Daniela Sofia Rodrigues Martins

Título da dissertação:

Otimização de fermentações sequenciais com duas leveduras do género Saccharomyces

Orientadores:

Professor Doutor José Maria Oliveira Mestre Isabel Araújo

Ano de conclusão: 2015 Designação do Mestrado:

Mestrado Integrado em Engenharia Biológica – Ramo Tecnologia Química e Alimentar

É AUTORIZADA A REPRODUÇÃO INTEGRAL DESTA DISSERTAÇÃO APENAS PARA EFEITOS DE INVESTIGAÇÃO, MEDIANTE DECLARAÇÃO ESCRITA DO INTERESSADO, QUE A TAL SE COMPROMETE.

Universidade do Minho, 11/12/2015

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GRADECIMENTOS

Agradeço, em primeiro lugar, à Mestre Isabel Araújo da Vinalia pela confiança e pela oportunidade do estágio curricular.

Ao orientador, Professor José Maria Oliveira da Universidade do Minho, por me ter acompanhado durante todo o trabalho e incentivado a fazer sempre melhor.

À Eng.ª Eugénia Vieira e ao Mestre João Drumonde-Neves da Vinalia, por me ajudarem ao longo da execução do trabalho e ao mesmo tempo me darem espaço para tomar decisões, aceitando a minha opinião.

À Doutora Zlatina Genisheva pelo tempo que dispensou para ajudar na análise aos compostos voláteis do aroma, e aos restantes investigadores do Laboratório de Ciência e Tecnologia Alimentar, do Centro de Engenharia Biológica.

À minha família e amigos mais próximos pelo apoio incondicional em toda a jornada que foi a minha formação académica.

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ESUMO

A inoculação do mosto de uvas com leveduras puras selecionadas, normalmente da espécie Saccharomyces cerevisiae, é uma prática recorrente que permite uma fermentação rápida e eficiente. Apesar destas vantagens, a utilização generalizada de uma única espécie de levedura contribui para a uniformização dos vinhos. Para contrariar esta tendência e apresentar produtos mais diversificados e complexos organoleticamente, têm sido investigadas novas técnicas de fermentação e leveduras não convencionais. O principal objetivo deste trabalho foi a avaliação de uma destas técnicas, a fermentação sequencial com duas leveduras do género Saccharomyces com características fermentativas distintas. Primeiro foi inoculada uma estirpe de S. uvarum com elevada atividade _{β-glucosidásica e em seguida, a} diferentes densidades do mosto em fermentação, uma estirpe de S. cerevisiae com tolerância a altas concentrações de etanol.

As fermentações foram realizadas numa estação piloto com cubas de 20 L; a massa volúmica e a temperatura foram monitorizadas diariamente, e foram retiradas amostras do mosto em fermentação. Nos vinhos finais determinou-se a acidez total e volátil, o pH e o título alcoométrico com o equipamento OenoFoss™, e os açúcares e glicerol foram doseados por HPLC. As análises aos compostos voláteis do aroma maioritários foram feitas por GC-FID, e aos minoritários por GC-MS. Foram aplicadas técnicas de microbiologia para isolar e fazer crescer as colónias de leveduras recolhidas ao longo da fermentação, e diferentes técnicas de PCR para identificar as leveduras e compará-las com os controlos. Finalmente, foi feita uma prova organolética dos vinhos produzidos.

A baixa densidade inicial do mosto condicionou as etapas de inoculação e o título alcoométrico final dos vinhos produzidos, que ficou abaixo dos 8.5 %. As fermentações sequenciais foram mais lentas, e os vinhos produzidos desta forma terminaram com menor teor alcoólico, maior acidez e maior concentração de glicerol do que o vinho produzido com o inóculo de S. cerevisiae pura. Quando inoculadas em simultâneo, a estirpe de S. cerevisiae dominou a fermentação, mas não reprimiu totalmente o crescimento de S. uvarum. Esta produziu maior quantidade de 2-feniletanol e acetato de 2-feniletilo, e como tal os vinhos produzidos por fermentação sequencial apresentaram um aroma floral e a rosas. A maior acumulação destes compostos ocorreu no ensaio onde a inoculação com a segunda levedura foi feita mais cedo, e nos ensaios seguintes houve menor produção de aromas fermentativos. A fermentação sequencial com as duas leveduras testadas mostrou-se viável e produziu vinhos aprovados pelo painel de provadores.

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A

BSTRACT

Inoculation of grape must with pure selected yeasts, usually of the species Saccharomyces cerevisiae, is a recurring practice that allows a fast and effective fermentation. Despite these advantages, the widespread use of a single species of yeast contributes to the standardization of wines. To counter this trend and present more diverse and organoleptically complex products, new fermentation techniques and non-conventional yeasts have been investigated. The main purpose of this work was to assess one of these techniques, the sequential fermentation with two yeasts of the Saccharomyces genus with different fermentation profiles. Initially it was inoculated a strain of S. uvarum with high _{β-glucosidase activity, and} then, at different densities of the fermenting must, a strain of S. cerevisiae tolerant to high concentrations of ethanol.

Fermentations were performed in a pilot plant with 20 L tanks; density and temperature were monitored daily and samples of the fermenting must were collected. In the finished wines, total and volatile acidity, pH and the alcoholic strength were determined with OenoFoss™, and sugars and glycerol were measured by HPLC. Major volatile aroma compounds were analyzed by GC-FID and minor volatiles by GC-MS. Microbiological techniques were applied to isolate and grow colonies of the yeasts collected throughout the fermentation, and several PCR techniques were applied to identify yeasts and comparing them with the controls. Finally, it was made an organoleptic exam of the produced wines.

The low initial density of the must conditioned the steps of inoculation and the final alcoholic strength of the produced wines, which was below 8.5 %. The sequential fermentations were slower, and the wines produced in this way ended with lower alcohol content, higher acidity and higher glycerol concentration than wine produced with a pure culture of S. cerevisiae. When inoculated simultaneously, the S. cerevisiae strain dominated the fermentation, but did not completely suppress the growth of S. uvarum. The latter produced a larger amount of 2-phenylethanol and 2-phenylethyl acetate, so the wines produced by sequential fermentation exhibited a floral and rose like aroma. The greatest accumulation of these compounds occurred in the trial where the second yeast inoculation was done earlier, and in the following trials there was lower production of fermentative aromas. The sequential fermentation with both tested yeasts proved to be feasible and produced wines appreciated by the tasting panel.

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NDICE

Lista de Símbolos e Abreviaturas... xiii

1. Motivação e Objetivos ... 1

2. Introdução ... 3

2.1 A empresa: Vinalia – Soluções de Biotecnologia para a Vitivinicultura ... 3

2.2 A fermentação e o papel das leveduras de vinificação ... 4

2.2.1 Fermentação Natural ... 4

2.2.2 Fermentação com leveduras puras selecionadas ... 6

2.2.3 Fermentação com culturas mistas de leveduras ... 8

2.2.4 Fermentação Sequencial ... 11

2.2.5 Relações e características das principais leveduras do género Saccharomyces ... 12

2.2.6 Particularidades da vinificação em branco ... 13

2.3 O aroma do vinho ... 14

2.3.1 Aroma Varietal ... 15

2.3.2 Aroma fermentativo ... 17

2.3.3 Precursores de aroma ... 21

2.4 Fundamentos das técnicas utilizadas ... 23

2.4.1 O equipamento OenoFoss™ ... 23

2.4.2 Técnicas moleculares ... 24

2.4.3 A prova organolética ... 26

3. Materiais e Métodos ... 29

3.1 Preparação do meio e dos inóculos de levedura ... 29

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3.4.1 Massa volúmica e álcool provável... 32

3.4.2 Análises ao mosto inicial, mosto em fermentação e vinhos com o OenoFoss™ ... 33

3.4.3 Doseamento de açúcares e glicerol nos vinhos por HPLC ... 33

3.5 Análises microbiológicas ... 33

3.5.1 Isolamento e repicagem ... 34

3.5.2 Extração do DNA ... 34

3.5.3 PCR interdelta ... 35

3.5.4 PCR-RFLP das regiões ITS e do gene 5.8S ... 36

3.5.5 PCR da região D1/D2 do gene 26S e sequenciação ... 37

3.6 Análise sensorial ... 37

3.7 Análise aos compostos voláteis do aroma ... 39

3.7.1 Compostos voláteis maioritários ... 39

3.7.2 Compostos voláteis minoritários ... 40

4. Resultados e Discussão... 41

4.1 Características do mosto ... 41

4.2 Acompanhamento dos ensaios de fermentação ... 44

4.2.1 Alterações químicas do mosto em fermentação ... 44

4.2.2 Evolução da população de leveduras ... 47

4.3 Características dos vinhos finais ... 52

4.3.1 Composição química ... 52

4.3.2 Características organoléticas ... 54

4.3.3 Compostos voláteis do aroma ... 56

5. Conclusões ... 63

Referências Bibliográficas ... 65

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NDICE DE

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IGURAS

Figura 1 – Reação de formação de um éster (acetato de etilo) a partir de um ácido (acético) e um álcool (etanol)... 20 Figura 2 – Mecanismo de atuação das diferentes enzimas envolvidas na hidrólise dos precursores glicosilados ... 22 Figura 3 — Equipamento OenoFoss™ ... 24 Figura 4 — Esquema da organização dos genes de rDNA (SSU – Small Subunit; LSU – Large Subunit); a vermelho: zona de ligação dos primers ITS1 e ITS4 para amplificação das regiões ITS e do gene 5.8S; a azul: zona de ligação dos primers NL1 e NL4 para amplificação da região D1/D2 do gene 26S ... 25 Figura 5 — Representação esquemática dos ensaios realizados, com as etapas de inoculação das leveduras Y2 e Y59 nas fermentações sequenciais (t — tempo). ... 30 Figura 6 – Representação esquemática dos momentos em que foram retiradas amostras com biomassa do mosto em fermentação, nos diferentes ensaios (t — tempo). ... 32 Figura 7 — Ficha de prova descritiva simplificada para vinhos brancos. ... 38 Figura 8 — Representação gráfica da variação da massa volúmica a 20 ºC (ρ20ºC) nos diferentes ensaios

em função do tempo de fermentação (t). ... 45 Figura 9 — Perfil da variação da concentração média de açúcares (C Glu+Fru) nos diferentes ensaios em

função do tempo de fermentação (t). ... 46 Figura 10 — Variação do título alcoométrico volúmico (TAV ) nos diferentes ensaios, em função do tempo de fermentação (t ). ... 47 Figura 11 — Perfis de bandas obtidos depois da separação dos produtos do PCR realizado com os primers δ2 e δ12, visualizados sob luz UV (M – marcador de pesos moleculares; pb – pares de bases). ... 48 Figura 12 — Perfis de bandas visualizados com luz UV após restrição, com as enzimas Hinf I e HaeIII, dos fragmentos obtidos por PCR com os primers ITS1 e ITS4. ... 49 Figura 13 — Fragmento obtido por PCR do genoma da levedura Y2 com os primers NL1 e NL4. ... 50 Figura 14 — Representação esquemática da percentagem de Implementação da Estirpe (IE) nos diferentes ensaios realizados, no meio (A) e no final da fermentação (B)... 51 Figura 15 — Resultado das MG calculadas para os descritores gustativos dos diferentes vinhos, avaliados pelo painel de provadores durante a análise sensorial. ... 55

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NDICE DE

T

ABELAS

Tabela 1 – Álcoois monoterpénicos e descritores aromáticos associados ... 16 Tabela 2 — Álcoois superiores mais relevantes e descritores aromáticos associados ... 18 Tabela 3 – Ácidos gordos voláteis mais frequentes nos vinhos e descritores aromáticos associados ... 19 Tabela 4 – Principais ésteres encontrados nos vinhos e descritores aromáticos associados ... 20 Tabela 5 — Principais parâmetros físico-químicos do mosto utilizado, determinados com o OenoFoss™, e respetivos erros calculados para 95 % de confiança ... 41 Tabela 6 — Resultados das análises feitas aos vinhos finais, com os respetivos erros calculados para 95 % de confiança ... 53 Tabela 7 — Concentrações médias (C) dos compostos voláteis maioritários detetados nos vinhos por análise semiquantitativa com GC-FID, erros calculados para 95 % de confiança e LPO para cada composto ... 57 Tabela 8 — Concentrações médias (C) dos compostos voláteis minoritários detetados nos vinhos por análise semiquantitativa com GC-MS, erros calculados para 95 % de confiança e LPO para cada composto ... 59

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ISTA DE

S

ÍMBOLOS E

A

BREVIATURAS

ρ — Massa volúmica aparente ρ20ºC — Massa volúmica a 20 ºC

AAN — Alpha Amino Nitrogen, azoto com grupo α-amino AP — Álcool Provável

AT — Acidez Total, expressa em ácido tartárico AV — Acidez volátil, expressa em ácido acético C — Concentração média

C Ác.Tartárico— Concentração de ácido tartárico

C Ác. Málico — Concentração de ácido málico

CFru — Concentração de frutose

CGlu+Fru— Concentração de glucose+frutose

CGluc — Concentração de glucose

CGli— Concentração de glicerol

CNH4+— Concentração de azoto amoniacal

DO — Densidade Ótica

FCR — Força Centrífuga Relativa IE — Taxa de Implementação da Estirpe LPO — Limiar de Perceção Olfativa MG — Média Geométrica

SST — Sólidos Solúveis Totais TAV — Título Alcoométrico Volúmico

Siglas e abreviaturas

BLAST — Basic Local Alignment Search Tool, ferramenta de procura de alinhamentos locais DNA — Deoxyribonucleic acid, ácido desoxirribonucleico

dNTPs — deoxynucleotide triphosphates, desoxinucleótidos trifosfato

FTIR — Fourier Transform InfraRed Spectroscopy, espetroscopia de infravermelho com transformada de Fourier

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GC-MS — Gas Chromatography - Mass Spectrometry, Cromatografia Gasosa com Espetrometria de Massa HPLC — High Performance Liquid Chromatography, cromatografia líquida de alta eficiência

ITS — Internal Transcribed Spacer, espaçador transcrito interno. NTS — Non Transcribed Spacer, espaçador não transcrito. pb — pares de bases

PCR — Polymerase Chain Reaction, reação em cadeia da polimerase pPCR — produto de PCR

rDNA — DNA ribossomal

RFLP — Restriction Fragments Length Polymorphism, polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição

RNA — Ribonucleic Acid, ácido ribonucleico rRNA — RNA ribossomal

UV — Ultra Violeta

U — Unidade de atividade enzimática (não pertence ao Sistema Internacional de unidades), definida como a quantidade de enzima que hidrolisa o substrato a uma velocidade reacional de 1 µmol/min YEPD — Yeast Extract Peptone Dextrose, extrato de levedura peptona e dextrose

1

1.

M

OTIVAÇÃO E

O

BJETIVOS

O vinho é o produto obtido por fermentação alcoólica de um mosto de uvas. As leveduras são os microrganismos responsáveis pela conversão dos açúcares do mosto em etanol e compostos do gosto e aroma presentes no vinho acabado. Entre as leveduras de vinificação, a Saccharomyces cerevisiae é a mais utilizada por apresentar maior resistência ao etanol, garantir o arranque rápido da fermentação e não causar desvios no processo.

A diversidade de vinhos e o número de marcas existentes no mercado é enorme, assim como a necessidade de ter um fator de diferenciação no produto, para que este se destaque em relação à concorrência. Atualmente tem havido um aumento da produção mundial de vinho, assim como uma tendência dos consumidores para a procura de novos produtos, mais diversificados, o que estimulou a pesquisa e desenvolvimento de novas práticas de vinificação na tentativa de satisfazer esta procura. No processo natural de fermentação de um mosto de uvas, geralmente predominam numa fase inicial leveduras com baixa tolerância para o etanol; depois de poucos dias, tornam-se dominantes outras leveduras, mais resistentes, que dão continuidade à fermentação até se atingir o título alcoométrico pretendido. A presença de uma grande diversidade de leveduras, com todos os produtos principais e secundários que são excretados, dá uma maior complexidade organolética ao vinho final. Mas se o processo fermentativo ocorrer de forma espontânea, sem controlo, pode ficar sujeito a paragens ou ao aparecimento de compostos indesejáveis. É por isso que atualmente se faz a inoculação do mosto com leveduras selecionadas, normalmente da espécie S. cerevisiae, que permitem uma fermentação controlada. Um senão deste método é a perda de complexidade e a uniformização dos vinhos a nível global. Para contornar isto há a possibilidade de se fazer uma inoculação com culturas mistas de leveduras, ou então inoculação sequencial.

Mesmo dentro do género Saccharomyces existe bastante diversidade: há leveduras que produzem bastantes compostos aromáticos de interesse, mas são pouco tolerantes ao etanol e não conseguem, por si só, levar a fermentação até ao final; outras estirpes são muito resistentes, mas dão origem a vinhos mais pobres em termos sensoriais. O propósito da fermentação sequencial é reunir estes dois tipos de leveduras, inocular primeiro a menos resistente e, antes que a fermentação cesse introduzir a mais resistente, para que no final se consiga um vinho com a quantidade necessária de álcool, e com um perfil sensorial mais complexo.

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O estágio curricular que conduziu a este trabalho de Dissertação foi realizado na empresa Vinalia – Soluções de biotecnologia para a vitivinicultura, sob o tema “Otimização de fermentações sequenciais com duas leveduras do género Saccharomyces”. Os objetivos inerentes ao trabalho desenvolvido foram a realização de fermentações sequenciais à escala piloto com duas leveduras do género Saccharomyces, Y2 (com elevada atividade _{β-glucosidase) e Y59 (elevada tolerância ao etanol),} otimização do processo por inoculação do mosto a diferentes densidades, e a avaliação físico-química e sensorial dos diferentes vinhos produzidos.

Ambas as leveduras utilizadas neste projeto fazem parte da coleção da YeastWine e já tinham sido testadas em separado. O comportamento distinto que apresentaram em condições de fermentação levou ao interesse de as testar em fermentação sequencial, tentando incorporar num único vinho o melhor que ambas poderiam proporcionar.

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2.

I

NTRODUÇÃO

Este trabalho está dividido em 5 secções principais. Na primeira secção já foi apresentado o tema do trabalho e os principais objetivos. Nesta secção de Introdução é apresentada a empresa onde foi realizado o trabalho, é feita uma revisão bibliográfica sobre as leveduras envolvidas na produção artesanal e industrial de vinho e as diferentes técnicas de inoculação, fala-se um pouco sobre as particularidades das leveduras testadas e da fermentação de mostos de vinhos brancos; são referidos sucintamente alguns dos principais compostos do aroma presentes nos vinhos jovens; finalmente são explicados os fundamentos de algumas das técnicas utilizadas. Na secção de Materiais e Métodos são descritas pormenorizadamente todas as metodologias utilizadas no decorrer das fermentações, na recolha e análise de amostras e na análise sensorial dos vinhos. Na quarta secção são apresentados todos os dados e resultados obtidos, com uma explicação dos mesmos e comparação de valores com a literatura. Finalmente, na última secção dá-se maior relevo às principais conclusões retiradas em todo o trabalho e são definidas perspetivas a adotar em experiências futuras.

2.1 _{A empresa: Vinalia – Soluções de Biotecnologia para a Vitivinicultura}

A oportunidade para o estágio curricular foi proposta pela empresa Vinalia — Soluções de Biotecnologia para a vitivinicultura, um Spin-Off académico da Universidade do Minho criado em 2006, que conta com o apoio de Professores e investigadores da mesma como mentores científicos. Como interlocutor pluridisciplinar em investigação e desenvolvimento para o setor vitivinícola, a Vinalia disponibiliza uma vasta gama de serviços para os produtores de vinhos: consultoria com vista à otimização da qualidade das uvas, das vinificações, e da estabilização e conservação de vinhos; análises químicas, físicas e microbiológicas dos vinhos; análise sensorial, e ainda estudos de mercado. A empresa organiza também formações à medida das necessidades das empresas ou associações, como é o exemplo de cursos à iniciação da prova de vinhos (http://www.vinalia.com.pt/).

O trabalho experimental foi realizado nas instalações da YeastWine – Wine solutions, Lda., uma empresa fundada em 2011 que se ocupa com o isolamento e investigação de leveduras com propriedades únicas, que possam ser utilizadas no setor dos vinhos como uma mais-valia para a diferenciação e valorização do produto (http://www.yeastwine.com/). A empresa possui uma estação piloto com 12 fermentadores de 20 L cada, com acoplamento de sensores para monitorizar em tempo real os parâmetros mais

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significativos da fermentação. Com o auxílio deste equipamento e de um laboratório de genética, é possível testar diferentes leveduras ou condições de fermentação em simultâneo, reduzindo desperdícios. A empresa oferece serviços como a identificação das espécies de leveduras presentes nas uvas, mosto e vinho, a caracterização enológica das mesmas, identificação de leveduras de contaminação, testes à escala piloto, produção de fermentos selecionados em pequena escala e ainda a sua conservação. Podem ser também feitas análises físico-químicas aos vinhos, assim como análise sensorial (cor, aroma e sabor) por um painel treinado de provadores.

Para explorar o potencial enológico das leveduras autóctones, a YeastWine detém hoje cerca de 60 variedades de fermentos, oriundos de diversas regiões do país, prontos para serem disponibilizados ao mercado, oferecendo ainda a possibilidade de recolher as leveduras junto do viticultor. Tudo isto contribui para que o cliente possa escolher a levedura mais adequada ao tipo de vinho que pretende produzir, aquela que confere as características mais desejáveis ou diferenciadoras.

2.2 _{A fermentação e o papel das leveduras de vinificação}

O vinho, segundo a definição da União Europeia que consta no Regulamento CE N.º 491/2009, é um produto obtido exclusivamente por fermentação alcoólica, total ou parcial, de uvas frescas ou mosto de uvas. As castas de uvas que podem ser utilizadas na produção de vinho devem pertencer à espécie Vitis vinífera, ou ser provenientes de um cruzamento entre esta e outra espécie do género Vitis, salvo exceções previstas no mesmo regulamento.

A fermentação alcoólica é um processo complexo que envolve uma série de reações bioquímicas, e que ocorre por ação de microrganismos presentes no próprio substrato. Estes podem afetar a qualidade do produto final de várias formas, ao longo de todas as etapas da vinificação: durante a maturação das uvas, ao longo da fermentação alcoólica e mais tarde durante o envelhecimento. As leveduras são os principais contribuintes para a qualidade do vinho, uma vez que são elas que realizam a fermentação alcoólica do mosto, transformando os açúcares da uva em etanol, dióxido de carbono e centenas de outros metabolitos secundários que, em conjunto, contribuem para o gosto e aroma característicos do vinho (Ciani et al., 2010; Fleet, 2003; Romano et al., 2003; Saberi et al., 2012).

2.2.1 _{Fermentação Natural}

As películas das uvas maduras são um meio não estéril, e possuem uma grande biodiversidade microbiana. Após o esmagamento das uvas e das películas, são transferidos para o mosto diversos

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fungos e bactérias, e em particular várias espécies de leveduras com capacidade para realizar uma fermentação espontânea (Ciani et al., 2010; Perrone et al., 2013; Romano et al., 2003; Saberi et al., 2012).

Durante a fermentação natural do mosto podem estar presentes vários géneros e espécies de leveduras, que interagem entre si e operam simultânea ou sucessivamente (Barrajón et al., 2011; Ciani et al., 2010; Fleet, 2003; Romano et al., 2003). Nos primeiros estágios da fermentação predominam leveduras apiculadas, com capacidade fermentativa moderada, dos géneros Hanseniaspora/Kloeckera, Metschnikowia e Candida, e por vezes ainda Pichia e Kluyveromyces (Ciani et al., 2006; Fleet, 2003; Medina et al., 2013; Rodríguez et al., 2010). Depois de 3 ou 4 dias (Ciani et al., 2010), e à medida que a matriz do mosto se altera e começa a tornar em vinho, estas leveduras perdem atividade e são substituídas por leveduras elípticas, da espécie S. cerevisiae (Ciani et al., 2006; Perrone et al., 2013), que assumem o controlo do processo de fermentação até que este esteja terminado.

Apesar de nas películas da uva e nas primeiras fases da fermentação a S. cerevisiae não estar presente em grande quantidade (geralmente ocorre em populações com número de unidades formadoras de colónias inferior a 100 g−1_{, e em alguns estudos não se conseguiu isolar esta espécie a partir das uvas),}

o facto de surgir sempre em todas as fermentações e a sua capacidade para dominar as etapas intermediárias e finais do processo levaram a que fosse considerada a principal levedura de vinificação (Andorrà et al., 2012; Beltran et al., 2002; Capece et al., 2013; Romano et al., 2003).

A produção de etanol por S. cerevisiae é considerado um dos principais fatores que condiciona o crescimento de espécies não-Saccharomyces durante a fermentação. A evolução sequencial das espécies de leveduras é em grande parte determinada pela sua suscetibilidade ao aumento da concentração em etanol no mosto em fermentação (Capece et al., 2013; Ciani e Comitini, 2015; Fleet, 2003). As leveduras que não pertencem ao género Saccharomyces morrem mais cedo porque são mais sensíveis ao etanol, e geralmente não tolerantes a concentrações deste composto que ultrapassem os 5 % a 7 % (Capece et al., 2013; Ciani e Comitini, 2015; Fleet, 2003).

As diferentes estirpes de S. cerevisiae sobrevivem e predominam nos últimos estágios da fermentação devido à sua elevada resistência ao etanol, que é também o principal produto do seu metabolismo (Cheraiti et al., 2005). Dentro desta espécie, distintas estirpes apresentam diferentes tolerâncias ao etanol e outros compostos, pelo que este é também um fator que condiciona o crescimento sequencial de estirpes de leveduras da mesma espécie (Fleet, 2003).

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Na verdade, dentro do ecossistema vinho, existem numerosos mecanismos através dos quais uma levedura pode influenciar o crescimento de outras espécies (Fleet, 2003). Além do etanol, outros compostos produzidos pelas leveduras durante a fermentação podem tornar-se inibitórios para outras espécies ou estirpes de leveduras, exercendo no meio uma pressão seletiva _{(Ciani e Comitini, 2015).} São exemplos o ácido acético, ácidos gordos de cadeia média e acetaldeído; algumas proteínas e péptidos também apresentam propriedades antimicrobianas, e pode ainda haver produção de toxinas e enzimas que destroem as paredes celulares de determinadas espécies de microrganismos (Ciani e Comitini, 2015; Fleet, 2003).

O mosto de uvas, devido à sua composição, constitui um meio seletivo onde o crescimento das leveduras

pode também ser influenciado pela competição por nutrientes, como açúcares, azoto, sais minerais e oxigénio (Ciani e Comitini, 2015; Perrone et al., 2013). O crescimento inicial de leveduras diminui o conteúdo em nutrientes do mosto, tornando-o um ambiente menos favorável para o desenvolvimento de novas espécies microbianas (Fleet, 2003). S. cerevisiae é altamente eficiente na conversão de fontes nutricionais em biomassa, o que pode representar a razão para o seu sucesso nas fermentações industriais (Andorrà et al., 2012; Perrone et al., 2013). Existem ainda outros fenómenos que podem influenciar o crescimento sequencial das leveduras ao longo da fermentação, como a temperatura e a densidade celular, uma vez que o contacto entre células de diferentes espécies (ou mesmo diferentes estirpes dentro da mesma espécie) pode despoletar mecanismos de competição ou proteção (Capece et al., 2013; Ciani e Comitini, 2015; Perrone et al., 2013).

Em suma, a forte capacidade competitiva das leveduras S. cerevisiae deve-se a uma combinação de propriedades, tais como um crescimento rápido, o consumo eficiente de glucose e outros nutrientes, boa capacidade de produção e tolerância ao etanol (Andorrà et al., 2012; Perrone et al., 2013). Estes fatores aplicam-se também na competição existente entre estirpes da mesma espécie (Perrone et al., 2013).

2.2.2 Fermentação com leveduras puras selecionadas

Tradicionalmente a fermentação alcoólica do vinho era realizada pelas leveduras indígenas da uva, o que muitas vezes resultava em fermentações lentas, crescimento de microrganismos de alteração, formação de compostos indesejáveis ou mesmo paragens na fermentação, o que tornava a vinificação um processo arriscado e com baixa fiabilidade (Ciani et al., 2010; Raynal et al., 2009). Há, de facto, evidências de que o controlo microbiológico do processo de fermentação permite uma melhor gestão da fermentação alcoólica (Comitini et al., 2011). Por esta razão, e para assegurar uma fermentação controlada e mais confiável, foram introduzidas no mercado culturas de leveduras selecionadas, sob a forma de levedura

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seca ativa, para serem utilizadas como culturas de arranque para a fermentação alcoólica do mosto (Cheraiti et al., 2005; Saberi et al., 2012). Estes fermentos são, na sua maioria, estirpes puras de S. cerevisiae, já que esta levedura (quando inoculada em quantidade suficiente) domina o processo de fermentação e suprime o crescimento das leveduras nativas não-Saccharomyces do mosto, além de ser mais resistente a agentes antisséticos como o SO2 (Ciani et al., 2010; Comitini et al., 2011;

Medina et al., 2013; Ortiz et al., 2013; Romano et al., 2003).

A inoculação do mosto com uma cultura selecionada de S. cerevisiae foi sendo introduzida na indústria vinícola como uma forma de aumentar o controlo do processo, garantir uma fermentação suave, rápida e sem desvios, reduzir o risco de defeitos organoléticos resultantes do crescimento e metabolismo de certas leveduras indígenas, obter vinhos com as características desejadas _{e com qualidade consistente} (Andorrà et al., 2012; Barrajón et al., 2011; Cheraiti et al., 2005; Ciani et al., 2010; Ciani e Comitini, 2015; Raynal et al., 2009; Romano et al., 2003). Com a disponibilidade comercial de culturas secas ativas de S. cerevisiae, a inoculação do mosto tornou-se atrativa e conveniente, e como tal, no presente é uma prática difundida (Ciani et al., 2010).

Além de assegurar o controlo microbiológico da fermentação, a inoculação com uma estirpe particular também pode ter como objetivo a obtenção de características específicas no produto final (um determinado teor alcoólico, uma aroma particular, menor acidez, etc.). Para tal é necessário que a estirpe inoculada apresente um crescimento rápido, capaz de competir com as leveduras nativas e dominar a fermentação, para que se obtenham os efeitos desejados no vinho produzido. Só quando a predominância é garantida é que a cultura de arranque inoculada pode produzir o efeito desejado no produto final: como já referido neste capítulo, a S. cerevisiae possui as características necessárias para se sobrepor e assumir o controlo da fermentação alcoólica (Andorrà et al., 2012; Capece et al., 2013; Perrone et al., 2013), e certas estirpes têm capacidade para dominar sobre outras da mesma espécie. Embora as leveduras indígenas da uva (na sua maioria espécies não-Saccharomyces) não sejam as mais adequadas para a realização de fermentação alcoólica (Raynal et al., 2009), estudos têm demonstrado que estas não são totalmente suprimidas nas primeiras fases da fermentação, e enquanto competem com a cultura inoculada também libertam certos metabolitos de interesse, que podem contribuir para a qualidade do produto final (Capece et al., 2013; Medina et al., 2013).

As fermentações inoculadas com leveduras puras não-Saccharomyces, por si só, na maior parte das vezes não são viáveis: estas leveduras têm capacidades fermentativas limitadas (taxas de fermentação

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baixas, baixa resistência ao etanol, o que resulta muita vezes em paragens antes do final expectável da fermentação), produzem metabolitos indesejáveis, têm baixa resistência ao SO2 e são pouco competitivas

em condições enológicas (Andorrà et al., 2012; Ciani et al., 2010; Rodríguez et al., 2010). Estas leveduras só devem ser utilizadas como culturas de arranque em conjunto com estirpes de S. cerevisiae fortemente fermentativas, garantindo assim a conclusão do processo (Rodríguez et al., 2010).

O uso generalizado de estirpes selecionadas de S. cerevisiae é uma simplificação da diversidade microbiológica do mosto, e limita não só o desenvolvimento de organismos de alteração, mas também o de espécies e estirpes que poderiam contribuir positivamente para o aroma e singularidade de um vinho (Barrajón et al., 2011; Ciani et al., 2010). A utilização de monoculturas para inoculação do mosto resulta na padronização das propriedades analíticas e sensoriais do vinho, diminuindo a complexidade do produto (Cheraiti et al., 2005; Ciani et al., 2010).

2.2.3 _{Fermentação com culturas mistas de leveduras}

A fermentação conduzida com a flora natural do mosto conduz a resultados imprevisíveis; por outro lado, a utilização de estirpes puras industriais pode resultar na perda de complexidade do vinho. Por estas razões, um processo alternativo ganhou interesse: a inoculação do mosto de uvas com várias estirpes diferentes de leveduras secas ativas (Cheraiti et al., 2005; Saberi et al., 2012; Sadoudi et al., 2012). O número limitado de estirpes de leveduras comerciais utilizados para a elaboração do vinho contribui para a produção de vinhos com estilos semelhantes e características uniformes em todo o mundo (Medina et al., 2013; Saberi et al., 2012). Acredita-se que os vinhos elaborados por inoculação de uma estirpe comercial de S. cerevisiae são menos complexos do que os produzidos por fermentação natural do mosto com as leveduras indígenas (Sadoudi et al., 2012).

Nos últimos anos os consumidores têm procurado novos produtos, mais diversificados, o que estimulou a pesquisa e o desenvolvimento de novas práticas de vinificação na tentativa de responder a esta tendência e atrair um mercado mais amplo (Saberi et al., 2012). Uma das tendências atuais é a fermentação controlada do mosto utilizando culturas de arranque mistas, compostas por uma ou mais leveduras de vinificação com uma combinação de boas propriedades fermentativas e elevada produção de compostos aromáticos e outros de interesse (Barrajón et al., 2011; Ciani e Comitini, 2015; Clemente-Jimenez et al., 2005; Fleet, 2003). Desta forma é possível superar a falta de complexidade dos vinhos produzidos por culturas puras de uma única levedura, e consegue-se melhorar as características particulares e específicas de muitos vinhos (Capece et al., 2013; Ciani et al., 2010).

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Diversos estudos já descreveram fermentações alcoólicas de mostos de uvas (natural ou sintético) realizadas com culturas de arranque mistas com uma levedura não-Saccharomyces e com uma estirpe de S. cerevisiae (Andorrà et al., 2012; Ciani et al., 2006; Clemente-Jimenez et al., 2005; Comitini et al., 2011; Gobbi et al., 2013; Loira et al., 2014; Medina et al., 2013; Raynal et al., 2009; Rodríguez et al., 2010; Sadoudi et al., 2012), com duas leveduras do género Saccharomyces (Cheraiti et al., 2005; Howell et al., 2006), ou então duas estirpes diferentes de S. cerevisiae (Barrajón et al., 2011; Capece et al., 2013; Saberi et al., 2012). Regra geral, S. cerevisiae deve estar presente para garantir uma fermentação completa. Existem ainda duas formas de aplicar estes inóculos: de forma simultânea, ou aplicados sequencialmente (Clemente-Jimenez et al., 2005; Comitini et al., 2011).

Algumas espécies de leveduras que não pertencem ao género Saccharomyces, apesar de na sua maioria não terem uma tolerância ao etanol que lhes permita concluir a fermentação, também se mostram importantes para a qualidade de um vinho (Ortiz et al., 2013). Elas produzem grandes quantidades de metabolitos secundários que contribuem para o aroma, gosto e corpo do vinho, podendo melhorar o seu perfil sensorial (Andorrà et al., 2012; Ciani et al., 2010). Leveduras de vinificação não-Saccharomyces selecionadas podem ser utilizadas em associação com culturas de arranque de S. cerevisiae para alterar a composição química, melhorar a qualidade e complexidade do produto final (Comitini et al., 2011). De entre as leveduras não-Saccharomyces que têm sido estudadas em associação com S. cerevisiae destacam-se Torulaspora delbrueckii, Hanseniaspora uvarum, Pichia fermentans, Hanseniaspora vineae, Candida pulcherrima, Kluyveromyces thermotolerans e Metschnikowia pulcherrima (Andorrà et al., 2012; Ciani et al., 2006; Clemente-Jimenez et al., 2005; Comitini et al., 2011; Gobbi et al., 2013; Loira et al., 2014; Medina et al., 2013; Raynal et al., 2009; Rodríguez et al., 2010; Sadoudi et al., 2012).

Embora o crescimento de cada espécie de levedura de vinificação seja caracterizado por uma atividade metabólica específica e conhecida, dentro de cada espécie existe uma variabilidade significativa entre estirpes (Romano et al., 2003). Está bem estabelecido que, dentro de S. cerevisiae, diferentes estirpes têm diferentes efeitos sobre o sabor do vinho (Fleet, 2003; Molina et al., 2009). A produção de certos compostos que influenciam o aroma do vinho é afetada pela estirpe de levedura utilizada (Barrajón et al., 2011; Molina et al., 2009). Por esta razão estudos foram também feitos com diferentes estirpes da espécie S. cerevisiae, tanto em inoculação simultânea como introduzidas sequencialmente no mosto (Barrajón et al., 2011; Capece et al., 2013; King et al., 2010; Perrone et al., 2013; Saberi et al., 2012). Existem ainda, embora em menor quantidade, estudos feitos com diferentes espécies do género Saccharomyces (Cheraiti et al., 2005; Howell et al., 2006).

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Atualmente já existem no mercado inóculos de arranque que contêm uma mistura de leveduras industriais com propriedades distintas, como é o caso dos produtos ZYMAFLORE® _{ALPHA TD N. SACCH.,}

da empresa europeia Laffort, e do LEVEL2™ TD, produzido pela Lallemand no Canadá. Ambos contêm uma estirpe de T. delbrueckii e uma estirpe de S. cerevisiae (Loira et al., 2014; Raynal et al., 2009). Os estudos já referidos provam que vinhos com culturas mistas ou sequenciais têm composição diferente dos vinhos produzidos por inoculação do mosto com estirpes puras. Mesmo que apenas uma das espécies domine no final da fermentação, as culturas mistas produzem maior quantidade de metabolitos secundários voláteis, que contribuem para uma maior complexidade e intensidade do aroma (Andorrà et al., 2012; Barrajón et al., 2011; Medina et al., 2013; Saberi et al., 2012). Em determinados casos também se consegue uma melhoria no corpo do vinho (Medina et al., 2013). De facto, a composição do vinho, e consequentemente a sua qualidade, pode ser melhorada por seleção e combinação de diferentes espécies ou estirpes, diferentes metodologias e taxas de inoculação (Comitini et al., 2011).

Quando se analisam vinhos produzidos por culturas mistas, é intuitivo afirmar-se que estes apresentam perfis sensoriais distintos dos vinhos elaborados com uma cultura pura. O que também acontece é que quando se misturam vinhos produzidos por duas culturas puras em separado para tentar reproduzir um vinho produzido por essas duas leveduras em co-inoculação, o resultado não é o mesmo. Durante as fermentações mistas, as estirpes de levedura produzem um vinho caracterizado por uma combinação de substâncias diferente da dos vinhos obtidos por mistura de vinhos de estirpes individuais (Capece et al., 2013; Ciani et al., 2010; Howell et al., 2006).

O sabor global do vinho resultante da fermentação de cultura mista não pode ser reproduzido por simples mistura de vinhos de culturas puras (Capece et al., 2013). Este resultado sugere que as diferenças verificadas são devidas a interações metabólicas entre leveduras (Capece et al., 2013; Ciani et al., 2010; Comitini et al., 2011; Howell et al., 2006). Durante as fermentações mistas as interações entre diferentes leveduras afetam o metabolismo das espécies envolvidas, alterando o tipo de compostos ou a quantidade produzida (Andorrà et al., 2012; Barrajón et al., 2011; Sadoudi et al., 2012).

No entanto, as interações entre estirpes ou espécies em culturas mistas podem ter efeitos positivos ou negativos sobre as características organoléticas do vinho (Cheraiti et al., 2005; Ciani e Comitini, 2015; Sadoudi et al., 2012). Por exemplo, uma co-cultura de Candida zemplinina e de S. cerevisiae resultou numa menor concentração de compostos aromáticos (em comparação com vinho de uma cultura pura de C. zemplinina), o que sugere uma possível interação negativa entre estas duas leveduras

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(Sadoudi et al., 2012). Estas interações entre as estirpes de leveduras utilizadas e os potenciais efeitos sobre o produto final têm que ser testados e avaliados, para que se consigam selecionar leveduras com efeitos sinérgicos no perfil sensorial do vinho (Barrajón et al., 2011; Cheraiti et al., 2005).

Como referido anteriormente neste capítulo, um aspeto importante no delinear de uma fermentação com culturas mistas é a seleção de leveduras compatíveis, com interações positivas para o perfil sensorial do vinho. A temperatura de fermentação é outro fator a ter em conta, uma vez que influencia significativamente a produção da maioria dos compostos voláteis (Molina et al., 2009). O perfil dos vinhos pode ainda variar com o tipo de mosto e com a escala a que é realizada a fermentação _{(Ciani e Comitini,} 2015; Mateos et al., 2006). A levedura em desenvolvimento interage com o substrato: isto tem que ser considerado na escolha de uma estirpe para uma variedade de uva ou mosto particular. Os resultados obtidos em ensaios laboratoriais também podem diferir das fermentações em grande escala (Rodríguez et al., 2010; Romano et al., 2003).

2.2.4 _{Fermentação Sequencial}

A inoculação sequencial é uma forma de reproduzir o processo de fermentação natural de um mosto de uvas (Barrajón et al., 2011; Ciani et al., 2010; Loira et al., 2014; Sadoudi et al., 2012). É também uma forma de aumentar a complexidade do aroma do vinho, evitando os riscos associados à fermentação espontânea (Ciani et al., 2010; Sadoudi et al., 2012). Tal como na fermentação natural, na fermentação sequencial é inoculada e desenvolve-se primeiro uma levedura com menor tolerância ao etanol, que produz compostos de aroma ou paladar desejáveis, e em seguida uma estirpe de S. cerevisiae que termina a fermentação, produzindo no vinho um teor alcoólico adequado (Barrajón et al., 2011). Comparando as várias modalidades de inoculação, a fermentação sequencial apresenta-se, muitas vezes, como a mais adequada para a combinação de estirpes diferentes (Rodríguez et al., 2010). A inoculação sequencial apresenta ainda uma outra vantagem: evita colocar as diferentes leveduras em competição entre si, pelo que cada uma consegue exprimir as suas qualidades sensoriais e fermentativas (Raynal et al., 2009). Mesmo nesta condição, para se conseguirem vinhos com um perfil desejável é necessário escolher leveduras compatíveis, porque embora não interajam diretamente, os compostos libertados pela primeira podem inibir o crescimento da segunda, ou a atividade enzimática da segunda pode degradar os compostos de aroma produzidos pela primeira. Como consequência diferentes combinações devem ser testadas, a fim de determinar a melhor combinação capaz de melhorar a qualidade do vinho (Barrajón et al., 2011).

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2.2.5 _{Relações e características das principais leveduras do género}

Saccharomyces

O estatuto taxonómico das espécies do género Saccharomyces sofreu várias alterações ao longo dos anos, o que ainda gera alguma confusão (Fernández-Espinar et al., 2000; Montrocher et al., 1998; Ribéreau-Gayon et al., 2006). As técnicas convencionais para classificação de leveduras passavam pelo estudo das suas características morfológicas e fisiológicas, como a capacidade para fermentar diferentes fontes de carbono (melibiose, galactose, lactose, entre outras) ou crescer em meios seletivos (como meio de lisina) (Montrocher et al., 1998; Pham et al., 2011). Devido à grande proximidade entre algumas das espécies, estes métodos não eram suficientes para a sua diferenciação (Montrocher et al., 1998). Devido à coexistência de espécies do género Saccharomyces em fermentações, elas acabam por trocar material genético entre si, formando novas espécies que são híbridas de outras pré-existentes (Montrocher et al., 1998; Nguyen e Gaillardin, 2005). Desta forma, a relação entre certas leveduras é muito próxima, não só a nível fisiológico mas também a nível molecular, e são necessárias técnicas muito específicas para se conseguir uma distinção evidente. Com o desenvolvimento das técnicas de biologia molecular tornou-se possível medir o nível de homologia do DNA, e com base nos novos dados foram feitas revisões taxonómicas (Fernández-Espinar et al., 2000; Ribéreau-Gayon et al., 2006).

Inicialmente (1952), S. cerevisiae, S. uvarum, S. oviformis e S. bayanus eram consideradas espécies distintas, juntamente com as restantes espécies pertencentes ao género Saccharomyces. Mais tarde (1970) foram integradas outras espécies no género Saccharomyces, e algumas espécies já existentes desapareceram ou foram integradas noutras, como foi o caso de S. oviformis, que passou a fazer parte de S. bayanus. Já em 1984 várias espécies foram agrupadas sob o nome S. cerevisiae (nomeadamente S. bayanus e S. uvarum), sendo consideradas como variedades desta espécie devido às suas semelhanças, embora tivessem capacidades de assimilação de açúcares diferentes (Ribéreau-Gayon et al., 2006). Mais tarde (2000), com base em dados de biologia molecular, o género Saccharomyces foi separado em três grupos, sendo que um deles, Saccharomyces sensu stricto, compreendia as espécies S. cerevisiae, S. bayanus, S. pastorianus e S. paradoxus, que não são diferenciáveis por testes fisiológicos (Fernández-Espinar et al., 2000; Montrocher et al., 1998; Ribéreau-Gayon et al., 2006). A espécie anteriormente conhecida como S. cerevisiae var. uvarum foi incluída em S. bayanus, passando a ser S. bayanus var. uvarum (Ribéreau-Gayon et al., 2006).

Mais recentemente, autores como Nguyen e Gaillardin (2005) e Pulvirenti et al. (2000) provaram através de técnicas moleculares utilizando o DNA ribossomal que S. uvarum é uma espécie distinta dentro do complexo Saccharomyces sensu stricto, e não um sinónimo ou variedade de S. bayanus ou S. cerevisiae.

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A estirpe tipo de S. uvarum para este novo estatuto taxonómico é a CBS 395 (Nguyen e Gaillardin, 2005). As principais leveduras de vinificação dentro do género Saccharomyces são S. cerevisiae e S. uvarum (Ribéreau-Gayon et al., 2006). As características que fazem de S. cerevisiae a levedura de eleição para a fermentação alcoólica, entre elas a capacidade de fermentações rápidas e completas, foram já referidas neste trabalho (secção 2.2.1 e secção 2.2.2). A espécie S. uvarum é também encontrada muitas vezes em fermentações espontâneas, e está associada a temperaturas baixas (Ribéreau-Gayon et al., 2006; Sampaio e Gonçalves, 2008). É também conhecida por produzir mais 2-feniletanol do que S. cerevisiae, e por isso dar origem a vinhos com aroma floral (a rosas) mais acentuado (Ribéreau-Gayon et al., 2006).

2.2.6 _{Particularidades da vinificação em branco}

Os processos aplicados na fermentação de mostos de uvas brancas não são os mesmos que se aplicam no caso de uvas tintas, o que faz com que os vinhos brancos tenham uma cor, sabor e caráter diferente, como é desejável. As principais diferenças, no caso da vinificação em branco, são a prensagem das uvas antes da etapa de fermentação e a ausência de maceração. Desta forma consegue-se que o vinho branco não incorpore as substâncias amargas de aroma herbáceo do engaço e da película (Peynaud, 1989). No processo tradicional de vinificação em branco, depois da vindima e receção das uvas, procede-se à extração do mosto por meios mecânicos. As uvas são desengaçadas, esmagadas, e depois prensadas para libertar o mosto. Pode ser adicionado dióxido de enxofre (sulfitagem) para proteger o mosto antes da fermentação, e também bentonite para clarificar o mosto, eliminar materiais em suspensão e diminuir a turvação (Peynaud, 1989).

Além de uma fonte de carbono, as leveduras necessitam também de uma fonte de azoto para se desenvolverem. O mosto contém azoto sob várias formas: azoto amoniacal (nomeadamente o ião amónio, NH4+, e o amoníaco, NH3), aminoácidos, polipéptidos e proteínas. O azoto amoniacal é o que as

leveduras assimilam mais facilmente, seguido dos aminoácidos, e deve estar presente em concentrações entre 25 mg/L e 50 mg/L. Quando o teor em azoto amoniacal do mosto é inferior a 25 mg/L, ou o teor de azoto assimilável é inferior a 100 mg/L, deve proceder-se à suplementação do mosto (Ribéreau-Gayon et al., 2006).

A etapa seguinte é a fermentação alcoólica. O mosto é inoculado com levedura seca ativa e a temperatura deve ser controlada e mantida abaixo dos 20 ºC (Peynaud, 1989). Temperaturas baixas podem ajudar numa maior produção de ésteres e menor perda de aromas varietais, o que contribui de forma positiva

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para a complexidade do aroma do vinho final. Um aumento da clarificação do mosto também pode resultar numa maior produção de ésteres — com aromas frutados e florais (Ribéreau-Gayon et al., 2006). Durante o início da fermentação o mosto deve ser arejado, para que as leveduras consigam sintetizar esteróis que são componentes essenciais para a permeabilidade da membrana celular. Durante a conversão dos açúcares em etanol, a massa volúmica do mosto diminui, e a fermentação dá-se por terminada (no caso dos vinhos secos) quando este parâmetro atinge um valor inferior a 1000 g/L. No final da fermentação alcoólica é feita uma trasfega para separar as borras que se depositam no fundo da cuba ou fermentador e procede-se novamente à sulfitagem, corrigindo a concentração de dióxido de enxofre, para preservar o vinho (Peynaud, 1989; Ribéreau-Gayon et al., 2006).

2.3 _{O aroma do vinho}

A qualidade do vinho pode ser avaliada por uma mistura de análises sensoriais — cor, gosto e aroma — e químicas — diversidade e concentração de pigmentos, moléculas aromáticas, açúcares, ácidos, etc. (King et al., 2010; Loira et al., 2014). A primeira impressão que se tem de um vinho é dada pelo seu aspeto e, em especial, pela cor. O sentido da visão é determinante na avaliação primária da qualidade do vinho, do seu estado de evolução e da existência de defeitos (Genisheva et al., 2012).

Do ponto de vista do consumidor, a característica mais importante dos vinhos é o seu sabor (Genisheva et al., 2012; Lambrechts e Pretorius, 2000). O sabor de um vinho, ou de qualquer outro produto, pode ser visto como a impressão sensorial global causada tanto pelo seu gosto como pelo aroma (Lambrechts e Pretorius, 2000).

O gosto de um alimento está relacionado apenas com o que é percebido na boca pelas papilas gustativas, e pode ser doce, salgado, amargo, ácido, ou uma combinação destes. No caso do vinho, podem ser encontrados todos estes gostos elementares, provocados por diferentes moléculas que fazem parte da sua complexa constituição. A doçura, em maior ou menor grau, deriva do etanol, do glicerol e dos açúcares residuais que não foram fermentados; a acidez é causada pelos ácidos provenientes da uva ou formados durante a fermentação; sais minerais dissolvidos podem dar um gosto ligeiramente salgado; o amargor é proveniente de compostos fenólicos, como os taninos. Existem também outras sensações que são percebidas na boca, como a adstringência e o chamado “corpo” do vinho, que na realidade estão mais associadas ao sentido do tato (Peynaud, 1989).

Por sua vez, o aroma pode ser percebido por via nasal direta, quando moléculas voláteis atingem os recetores olfativos pelo nariz, ou por via retronasal, quando as moléculas se vaporizam na boca (devido

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também à temperatura corporal) (Jacobson, 2006; Peynaud, 1989).

O gosto e o aroma do vinho são perceções sensoriais que variam não só com a composição química do produto, mas também com o indivíduo e a sua experiência. A resposta final do consumidor depende de muitas variáveis e é difícil de prever (Fleet, 2003).

O aroma é um componente muito importante da qualidade organolética dos vinhos (Mateos et al., 2006). As várias espécies e estirpes de leveduras que se desenvolvem durante o processo fermentativo global metabolizam os constituintes do sumo de uva. A fermentação alcoólica é a via metabólica pela qual as leveduras convertem os açúcares do mosto em etanol, dióxido de carbono e outros subprodutos menos abundantes, enquanto produzem energia para as suas funções vitais (Andorrà et al., 2012; Ciani et al., 2010; Romano et al., 2003). Os metabolitos secundários destas reações são uma vasta gama de compostos voláteis e não voláteis, que influenciam e determinam o aroma e gosto do vinho (Andorrà et al., 2012; Romano et al., 2003). O teor total de compostos voláteis do aroma no vinho varia entre 0.8 g/L e 1.2 g/L (Mateos et al., 2006).

Em termos químicos, o aroma do vinho depende de vários fatores como a variedade, o estado sanitário e a maturação da uva, das práticas enológicas, dos microrganismos envolvidos e dos processos de maturação, se aplicados (Fleet, 2003; Hernández et al., 2003; King et al., 2010). Desta forma, os compostos que constituem o aroma do vinho podem ser classificados consoante a sua origem: compostos do aroma varietal são provenientes das uvas; o aroma pré-fermentativo está ligado aos compostos formados durante as operações de extração e condicionamento do mosto; aroma fermentativo corresponde aos compostos produzidos por leveduras e bactérias durante as fermentações; o aroma pós-fermentativo está relacionado com as reações que ocorrem durante os processos de conservação e/ou envelhecimento (Lambrechts e Pretorius, 2000; Ribéreau-Gayon et al., 2000; Romano et al., 2003).

2.3.1 _{Aroma Varietal}

Os compostos do aroma existentes nas próprias uvas refletem as principais características da casta, do clima e do solo, e são responsáveis pelo aroma varietal dos vinhos. Embora uma grande parte das castas seja praticamente inodora, os compostos voláteis do aroma originários das uvas revelam-se após a fermentação (Ribéreau-Gayon et al., 2000).

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presentes em duas formas: sob a forma livre volátil, ou sob forma de precursores glicosilados não-voláteis e inodoros (Hernández et al., 2003; Spagna et al., 2002; Villena et al., 2007). A razão de terpenos conjugados para livres pode ser tão alta como de 15:1 (Spagna et al., 2002). A fórmula base dos terpenos é (C5H8)n, e podem pertencer a diferentes grupos químicos: hidrocarbonetos, álcoois, aldeídos e ácidos

(Oliveira, 2000; Ribéreau-Gayon et al., 2000).

Os mais interessantes são os álcoois monoterpénicos (terpenóis), que apresentam aromas florais e frutados mesmo a baixas concentrações, como o linalol, geraniol, nerol, α-terpineol, citronelol e Ho-trienol (Ribéreau-Gayon et al., 2000) que constam da Tabela 1. Sendo capaz de hidrolisar a ligação entre terpeno e glicosídeo, a β-glucosidase contribui para um aumento da concentração destas substâncias aromáticas no vinho (Ciani et al., 2010; Hernández et al., 2003; Villena et al., 2007).

As metoxipirazinas são compostos heterocíclicos azotados voláteis, muito características de algumas castas, e que conferem um aroma vegetal (semelhante a pimento verde) e por vezes terroso. Alguns exemplos mais significativos são a 2-metoxi-3-isobutilpirazina, a 2-metoxi-3-isopropilpirazina e a 2-metoxi-3-sec-butilpirazina (Ribéreau-Gayon et al., 2000).

Os norisoprenóides em C13, derivados dos carotenoides, existem na uva principalmente associados a

açúcares e em menor quantidade no estado livre. No decorrer da fermentação são libertados dos precursores por hidrólise ácida ou enzimática, sofrendo depois alguns rearranjos químicos, e contribuindo para o aroma final do vinho. Um dos mais importantes é a β-damascenona, que tem um aroma complexo floral e frutado (rosa, mel, fruto tropical, compota de maçã) percetível a baixas concentrações (Francis e Newton, 2005; Ribéreau-Gayon et al., 2000).

Os tióis voláteis, originados a partir dos s-conjugados de cisteína podem ter aromas interessantes, mas a concentrações mais elevadas o seu cheiro torna-se desagradável. Isto acontece, por exemplo, com a

Tabela 1 – Álcoois monoterpénicos e descritores aromáticos associados

Terpenol _Descritores(a)

Linalol Floral, lavanda

α-Terpineol Pinho, lírio

Citronelol Limão verde

Nerol Lima, rosa

Ho-trienol Tília

Geraniol Rosa

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4-mercapto-4-metil-2-pentanona, que pode apresentar tanto um aroma de buxo, giesta ou maracujá, como de “urina de gato”, dependendo da concentração (Francis e Newton, 2005; Oliveira, 2000; Ribéreau-Gayon et al., 2000).

2.3.2 _{Aroma fermentativo}

As leveduras fazem uma contribuição positiva para as características sensoriais do vinho durante a fermentação alcoólica através da utilização dos componentes do mosto, da produção de etanol e outros solventes que ajudam a extrair componentes das partes sólidas da uva, pela produção de centenas metabolitos secundários aromáticos e pela produção de enzimas, que transformam compostos neutros da uva em compostos ativos do aroma. Estas reações, especialmente a produção de metabolitos secundários, variam com a espécie e estirpe de levedura (Fleet, 2003). Os compostos do aroma fermentativo são os mais abundantes e os principais responsáveis pelo caráter do vinho final (Oliveira, 2000).

O etanol, glicerol e dióxido de carbono são os principais compostos voláteis produzidos na fermentação, mas têm uma contribuição relativamente pequena para o aroma do vinho. Os compostos menos abundantes como ácidos orgânicos, álcoois superiores e seus ésteres, e o acetaldeído, formam o ''bouquet'' fermentativo e são os principais responsáveis pelo aroma do vinho (Andorrà et al., 2012; Lambrechts e Pretorius, 2000; Romano et al., 2003). Quando presentes em concentrações excessivas, alguns destes compostos podem tornar-se indesejáveis (Barrajón et al., 2011; Mateos et al., 2006; Romano et al., 2003).

O ácido acético, o acetaldeído, o acetato de etilo, o 1-propanol, o 2-metil-1-propanol, o 2-metil-1-butanol e o 3-metil-1-butanol perfazem mais de metade dos compostos voláteis responsáveis pelo aroma. A outra metade está distribuída entre 600 a 800 compostos presentes em quantidades muito baixas (acetais, ácidos orgânicos, álcoois, compostos fenólicos e compostos heterocíclicos, ésteres e compostos sulfurados) (Mateos et al., 2006). O perfil aromático do vinho não é definido pelos compostos individuais, mas sim pela mistura dos mesmos (Villena et al., 2007).

Os álcoois superiores são quantitativamente a maior família de compostos aromáticos no vinho. São hidrocarbonetos com uma função álcool e mais de dois átomos de carbono (peso molecular superior ao do etanol), e são caracterizados pelo seu cheiro forte e pungente, com exceção do 2-feniletanol que é associado a um aroma a rosas (Lambrechts e Pretorius, 2000; Ribéreau-Gayon et al., 2006). A concentração de álcoois superiores no vinho pode variar entre 100 mg/L e 300 mg/L, e dentro destes

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valores fazem uma contribuição positiva para o aroma do vinho; acima deste limite podem ter um impacto negativo (Lambrechts e Pretorius, 2000; Ribéreau-Gayon et al., 2000). Os álcoois superiores mais abundantes nos vinhos (que podem existir em concentrações superiores a 50 mg/L) são o 2-metil-1-propanol, o 3-metil-1-butanol, o 2-metil-1-butanol e o 2-feniletanol. Outros exemplos ainda são o 1-propanol, o 1-butanol e o 1-hexanol (Oliveira, 2000). Apesar de o cheiro forte a álcool ser uma característica bastante frequente dentro deste grupo, alguns compostos individuais apresentam odores agradáveis, como se pode observar nos exemplos da Tabela 2. O contributo da mistura, no entanto, pode ter um efeito mais positivo do que os compostos individuais para o caráter final do vinho.

As vias metabólicas da levedura pelas quais se formam os álcoois superiores estão muito dependentes dos aminoácidos e outras formas de azoto presentes do mosto, e a sua relação é complexa. A maior parte dos álcoois superiores é formado por via anabólica a partir dos açúcares; se o mosto for pobre em azoto facilmente assimilável, a levedura degrada os aminoácidos e formam-se os álcoois correspondentes (via catabólica). A presença de grandes quantidades de aminoácidos provoca a diminuição da formação de álcoois superiores por via anabólica (Lambrechts e Pretorius, 2000; Oliveira, 2000; Ribéreau-Gayon et al., 2000). Por esta e outras razões é importante controlar o teor de azoto no mosto: uma deficiência de azoto pode prejudicar o crescimento das leveduras e consequentemente a fermentação, mas como são forçadas a degradar aminoácidos para obter azoto a formação de álcoois superiores é maior, podendo acentuar o seu caráter pesado; pelo contrário, um excesso de azoto amoniacal significa que a levedura não necessita de metabolizar aminoácidos, e por isso formam-se menos produtos secundários (álcoois superiores e seus ésteres). Chuva no final da maturação pode diluir o mosto, o que pode intensificar o odor a álcoois superiores do vinho — que só é interessante no caso dos que apresentam aromas agradáveis, como o 2-feniletanol (Ribéreau-Gayon et al., 2006).

Tabela 2 —Álcoois superiores mais relevantes e descritores aromáticos associados

Álcoois superiores _Descritores(a)

2-feniletanol Rosas, adocicado, perfumado 2-metil-1-butanol Álcool, banana, medicinal, solvente 3-metil-1-butanol Álcool, banana, adocicado

1-hexanol Coco, folhas verdes

2-metil-1-propanol Álcool

1-propanol Álcool

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Os ácidos gordos voláteis são também um dos grupos envolvidos no aroma do vinho. O ácido acético é o principal composto deste grupo, e embora possa provocar um odor desagradável a vinagre quando em excesso, o seu contributo é importante em concentrações entre os 200 mg/L e os 700 mg/L. Outros ácidos gordos voláteis são o ácido propanóico, o 2-metilpropanóico, o 2-metilbutírico e o 3-metilbutírico (Lambrechts e Pretorius, 2000; Oliveira, 2000; Ribéreau-Gayon et al., 2000), apresentados na Tabela 3. Apesar dos odores negativos associados aos ácidos gordos, a sua concentração no vinho não costuma ser suficiente para ser percetível, e acredita-se que são necessários para manter um bom equilíbrio do aroma do vinho (Oliveira, 2000).

Os ésteres são componentes muito importantes do aroma, principalmente nos vinhos jovens (podem sofrer hidrólise durante a maturação) (Lambrechts e Pretorius, 2000). Pode existir um grande número de ésteres nos vinhos, provenientes das reações de equilíbrio entre um ácido e um álcool, como no exemplo da Figura 1, e quase todos eles apresentam individualmente aromas frescos e agradáveis, florais ou frutados (Lambrechts e Pretorius, 2000; Oliveira, 2000; Ribéreau-Gayon et al., 2000).

Os ésteres podem ser de acetatos de álcoois superiores, ésteres etílicos de ácidos gordos ou ésteres estílicos de ácidos fixos. Estes últimos, dos quais é exemplo o succinato de dietilo, são relativamente insignificantes para o aroma do vinho. Alguns dos principais acetatos de álcoois superiores são o acetato de 3-metil-1-butilo, o acetato de hexilo e o de 2-feniletilo. Exemplos de ésteres etílicos de ácidos gordos são o butanoato de etilo, o hexanoato de etilo e o octanoato de etilo. O acetato de etilo é o principal éster nos vinhos, e é o único que pode ser considerado de aroma desagradável acima de um certo limite (aproximadamente 100 mg/L) (Lambrechts e Pretorius, 2000; Oliveira, 2000).

Tabela 3 – Ácidos gordos voláteis mais frequentes nos vinhos e descritores aromáticos associados

Ácidos gordos voláteis _Descritores(a)

Ácido acético Vinagre

Ácido 2-metilpropanóico (isobutírico) Suor, amargo, avinagrado Ácido butírico (butanóico) Amanteigado, queijo, suor Ácido 3-metilbutírico (isovalérico) Queijo, suor

Ácido hexanóico (capróico) Ácido gordo, óleo vegetal, suor Ácido octanóico (caprílico) Ácido gordo, óleo vegetal, queijo, suor Ácido decanóico (cáprico) Cera, sebo, ranço, sabão

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Figura 1 – Reação de formação de um éster (acetato de etilo) a partir de um ácido (acético) e um álcool (etanol).

Alguns dos principais ésteres encontrados nos vinhos são referidos na Tabela 4. O teor de azoto no mosto também parece influenciar a formação de ésteres, mas enquanto alguns aumentam com o teor de azoto (hexanoato de etilo, octanoato de etilo e decanoato de etilo, acetato de hexilo e de 3-metil-1-butilo), outros diminuem (acetato de 2-feniletilo) (Ough e Lee, 1981).

Os compostos sulfurados formados na fermentação incluem tióis, sulfuretos e tioésteres, e a maioria está associada a odores intensos e desagradáveis. Dividem-se em dois grupos: compostos sulfurados ligeiros (com ponto de ebulição inferior a 90 ºC), que têm odores de “ovos podres” e “reduzido”, são negativos para a qualidade do vinho e incluem o sulfureto de hidrogénio, dióxido de enxofre e metanotiol; os compostos sulfurados superiores participam no aroma de forma mais complexa, incluem o metionol (3-metiltiopropanol, odor a “couve cozida”) e o dissulfureto de dimetilo (aroma a marmelo), entre outros (Lambrechts e Pretorius, 2000; Oliveira, 2000; Ribéreau-Gayon et al., 2006).

Os aldeídos pertencem ao grupo dos compostos carbonilados, e nos vinhos são percetíveis mesmo a

Tabela 4 – Principais ésteres encontrados nos vinhos e descritores aromáticos associados

Descritores(a)

Acetatos de álcoois superiores

Acetato de etilo Solvente, ananás, frutado, adocicado Acetato de hexilo Adocicado, aromático, perfumado Acetato de 2-feniletilo Rosas, mel, maçã, adocicado Acetato de 3-metil-1-butilo (de isoamilo) Banana, maçã, solvente

Ésteres estílicos de ácidos gordos

Butanoato de etilo (butirato etilo) Papaia, manteiga, adocicado, maçã Hexanoato de etilo Maçã, frutado, adocicado, anis Octanoato de etilo Maçã, adocicado, frutado

Decanoato de etilo Ácidos gordos, frutado, maçã, uva, solvente