IGOR ANTÔNIO DE ARAÚJO PINTO
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL CARCINOGÊNICO DO DIBENZOTIOFENO E
DIBENZOTIOFENO SULFONA EM RATOS WISTAR
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL CARCINOGÊNICO DO DIBENZOTIOFENO E DIBENZOTIOFENO SULFONA EM RATOS WISTAR
AUTOR: Igor Antônio de Araújo Pinto
ORIENTADOR: Prof. Dr. Milton Hércules Guerra de Andrade
COORIENTADOR: Profª. Drª. Cibele Velloso Rodrigues
Ouro Preto – MG, Outubro de 2012
iii
Catalogação: sisbin@sisbin.ufop.br A663a Pinto, Igor Antônio de Araújo.
Avaliação do potencial carcinogênico do dibenzotiofeno e dibenzotiofeno sulfona em ratos wistar [manuscrito] / Igor Antônio de Araújo Pinto. - 2012.
xix, 90f.: il., color; graf.; tabs.; mapas.
Orientador: Prof. Dr. Milton Hércules Guerra de Andrade. Coorientadora: Profª. Drª. Cibele Velloso Rodrigues.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas (NUPEB).
Área de concentração: Biologia Molecular.
1. Dibenzotiofeno (DBT) - Teses. 2. Dibenzotiofeno sulfona (DBTO2) - Teses. 3. Câncer - Teses. 4. Marcadores biológicos de tumor -
Teses. 5. Proteinase - Inibidores, Bowman-Birk (BBI) - Teses. I. Universidade Federal de Ouro Preto. II. Título.
v COLABORADORES
vi
vii
viii
“O sucesso é ir de fracasso em fracasso sem perder o entusiasmo”
ix AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pela força e serenidade para trilhar meus caminhos.
À minha mãe, sinônimo de amor, força e inspiração. Obrigado por acreditar em mim e abrir mão de tanto pela minha felicidade. Ao meu pai, pela torcida e exemplos de vida.
Aos meus irmãos pela amizade, cumplicidade e por sempre estimularem meu crescimento pessoal e profissional.
À Célia, por todos esses anos de carinho e apoio incondicional.
Ao Prof. Dr. Milton Hércules Guerra de Andrade, pela oportunidade, orientação e aprendizado. Agradeço pela grande amizade criada nesses anos de convívio.
À Profª. Drª. Cibele Velloso Rodrigues pela cooperação ao longo do trabalho. Ao Prof. Dr. William de Castro Borges, pela amizade e ensinamentos.
Ao Técnico José Henrique Braga Fortes, pela amizade, piadas e pelos importantes conselhos durante esses anos de laboratório.
Ao Prof. Dr. Wanderson Geraldo de Lima, pelo aprendizado e colaboração. À Profª. Drª. Renata Guerra de Sá Cota, pelo aprendizado e colaboração.
Aos alunos da pós-graduação do laboratório, Karina, Marina, Jonathan, Gustavo, Lorran, Leandro, André, Fernanda e demais alunos do LEP, Aline, Vinícius e Simone.
“Hoje, cheguei ao LEP, peguei meu jaleco e fui trabalhar...”
Às pessoas que me auxiliaram durante a execução do projeto, Karina, Roberta, Leandro, Victor, Prof. Dr. Laser e Prof. Dr. Leandro.
Aos diversos laboratórios do NUPEB por permitirem o uso de equipamentos e dependências para realização de parte deste trabalho.
Aos demais professores do NUPEB que contribuíram de maneira construtiva para a realização deste trabalho.
x
ÍNDICE
Resumo...xii
Abstract...xiv
Lista de Abreviaturas...xvi
Lista de Figuras...xviii
Lista de Tabelas...xx
1. Introdução...2
1.1. Epidemiologia do Câncer...2
1.2. Biologia do Câncer...3
1.3. Câncer Colorretal...5
1.3.1. Carcinogênese Intestinal...9
1.4.Carcinogênese Química...11
1.4.1. Dibenzotiofeno (DBT) e seu metabólito Dibenzotiofeno Sulfona (DBTO2)...13
1.4.2. 1,2-Dimetilhidrazina (DMH) - Indutor Clássico de Câncer...14
1.5. Marcadores Moleculares do Câncer...16
1.5.1. O Antígeno Carcinoembrionário (CEA)...16
1.5.2. Importância da Molécula CD44...18
1.6. Importância das Proteases no Desenvolvimento de Neoplasias...20
1.6.1. Inibidores de Proteases do Tipo Bowman-Birk (BBI)...22
2. Justificativa e Objetivos...27
2.1. Justificativa...27
2.2. Objetivo Geral...27
2.3. Objetivos Específicos...27
3. Materiais e Métodos...30
3.1. Indução de Câncer em ratos Wistar tratados com DMH, DBT e DBTO2....30
3.2. Avaliação Morfológica Microscópica (Histologia)...31
3.3. Imunohistoquímica...32
3.4. Análise por Fluorescência Direta (FA)...33
3.4.1. Conjugação BBI-FITC...33
3.4.2. Preparação dos Cortes Histológicos para FA...33
xi
3.6. Análise da Expressão Gênica por qPCR (Real Time)...35
3.6.1. Oligonucleotídeos Iniciadores (Primers)...35
3.6.2. Extração de RNA Total...36
3.6.3. RT-PCR e Obtenção dos cDNA’s...37
3.6.4. Reação da PCR Quantitativa em Tempo Real (qPCR)...38
3.6.5. Curva de Eficiência dos Primers...39
3.6.6. Curva de Dissociação dos Amplicons...41
3.7. Análise Estatística...42
4. Resultados e Discussão...44
4.1. Efeitos Biológicos da Indução Química por DBT, DBTO2 e DMH em Ratos Wistar...44
4.1.1. Variação Massa Corporal dos Animais Associada aos Carcinógenos Durante Tratamento...44
4.1.2. Avaliação das Alterações de Peso do Fígado e do Baço...45
4.2. Avaliações Morfológicas Macroscópicas...46
4.3. Avaliações Morfológicas Microscópicas (Histologia)...47
4.4. Imunohistoquímica...54
4.5. Ensaios de Fluorescência com BBI – FITC...58
4.6. Expressão Gênica Relativa dos Transcritos Avaliados...60
5. Conclusão...67
6. Perspectivas...70
7. Referências Bibliográficas………71
xii
RESUMO
O elevado nível de compostos sulfurados em derivados do petróleo é considerado prejudicial à qualidade de combustíveis, sendo sua remoção, mesmo que parcial uma das exigências no processo de refino. Além disso, legislações específicas delimitam sua concentração máxima em combustíveis fósseis, a fim de minimizar efeitos negativos dos compostos organossulfurados no ambiente. Dentre tais compostos, o dibenzotiofeno (DBT) é um hidrocarboneto policíclico aromático sulfurado, referência em trabalhos de remediação ambiental e com atividade carcinogênica. Considerando a importância dessa classe de substâncias na oncogênese e a escassez de estudos toxicológicos relacionados ao DBT, essa dissertação apresenta como objetivo, uma avaliação dos efeitos tóxicos provocados pelo tratamento crônico de ratos Wistar com
doses sub-letais de DBT e de seu derivado oxidado DBTO2 (dibenzotiofeno sulfona), e compara o potencial toxicológico dessas substâncias com o agente mutagênico clássico 1,2-dimetilhidrazina (DMH). Esse trabalho permitiu uma avaliação do tratamento crônico com a dose de 30 mg/Kg de DBT e DBTO2 em ratos Wistar, sendo observadas
lesões pré-neoplásicas nos intestinos delgado e grosso dos animais tratados, com intensidade e características semelhantes às lesões observadas no cólon de ratos tratados com DMH. As lesões, identificadas pelas análises histopatológicas, indicaram a ocorrência de um processo neoplásico em fase inicial de desenvolvimento. Além disso, verificou-se a marcação de células empregando-se técnicas imunohistoquímicas com anticorpos para o antígeno carcinoembrionário (CEA) e CD44, para os grupos DMH, DBT e DBTO2, com intensidades semelhantes. Através dessa avaliação, tais resultados indicam que a capacidade de induzir neoplasias do DBT e do DBTO2, se assemelha ao DMH, que é considerado um potente carcinógeno. Além disso, foi realizada análise da expressão gênica, por meio de qPCR, de transcritos de Cd44, c-Myc, c-Jun, Stat3,
Psma6, Mapk3 e Sulf1, que são genes conhecidos como bons indicadores de câncer em
xiii frescos de pólipos intestinais foram incubados com um conjugado BBI-FITC. Verificou-se uma marcação do conjugado BBI-FITC mais intensa em todos os grupos submetidos aos tratamentos com os agentes químicos. O aumento da fluorescência nos grupos testes foi em torno de 1,7 vezes maior em relação aos controles, e de maneira semelhante entre os grupos DMH, DBT e DBTO2. Sendo assim, verificou-se que o conjugado BBI-FITC, proposto como um ligante específico de proteases tripsina e quimotripsina símiles, indicou ser satisfatório para detecção do aumento da concentração de proteases-alvo do BBI, em animais tratados com agentes carcinógenos em estágio neoplásico inicial de desenvolvimento. Esses resultados demonstram que os inibidores de Bowman-Birk podem ser úteis no diagnóstico precoce de análises
xiv
ABSTRACT
The high level of sulfur compounds in petroleum is detrimental to the quality of fuels, and its removal, even partially, is one of the requirements in the refining process. Furthermore, specific laws delimit its maximum concentration in fossil fuels, in order to minimize negative effects of organosulfur compounds in the environment. Among such compounds, dibenzothiophene (DBT) is a polycyclic aromatic hydrocarbon sulphide, a reference in environmental remediation works and with carcinogenic activity. Considering the importance of this class of substances in oncogenesis and the lack of toxicological studies related to DBT, this dissertation presents the objective, an assessment of the toxic effects caused by chronic treatment of rats with sub lethal doses of DBT and its oxidized derivative DBTO2 (dibenzothiophene sulfone), as well as compares the toxicological potential of these substances with the classic mutagen 1,2- dimethylhydrazine (DMH). This work performed an assessment of chronic treatment at the dose of 30 mg/kg of DBT and DBTO2 in Wistar rats, precancerous lesions in small and large intestines of the treated animals were observed, with intensity and characteristics similar to those reported lesions in the colon of rats treated with DMH. The lesions identified by histopathological analysis indicated the occurrence of a neoplastic process in early development. Furthermore, there was labeling of cells employing immunohistochemical techniques with antibodies to carcinoembryonic antigen (CEA) and CD44, for groups DMH, DBT and DBTO2 with similar intensity. Through this assessment, these results indicate that the ability to induce tumors of DBT and DBTO2 resembles the DMH, which is considered a potent carcinogen. Furthermore, analysis was performed of gene expression by qPCR of transcripts Cd44, c-Myc, c-Jun,
Stat3, Psma6, Mapk3 e Sulf1, which are known genes to be good indicators of advanced
xvi
LISTA DE ABREVIATURAS
A - Adenina
ACF - Focos de criptas aberrantes Actb - Actina β
ANOVA - Análise de variância
Apc -Adenomatous polyposis coli
BBI - Inibidores tipo Bowman-Birk
CcnD1 - Ciclina D1
CCR - Câncer colorretal
CD44 -Cluster of differentiation 44
Cd44 - Gene que codifica a proteína CD44
cDNA - DNA complementar
CEA-Carcinoembrionic antigen
CEUA- Comissão de ética no uso de animais
c-Jun - Proto-oncogene que codifica a proteína JUN c-Myc -Myelocytomatosis proto-oncogene
Ctnnb1 -β-catenina
DBT - Dibenzotiofeno
DBTO2 - Dibenzotiofeno sulfona
Dcc - Deleted in colorectal carcinoma
DL50 - Dose Letal 50% DMH - 1,2-Dimetilhidrazina
DMSO - Dimetilsulfóxido
DNA - Ácido desoxirribonucleico
F’ - Primer forward
FA- Fluorescência direta
FITC - Isotiocianato de fluoresceína
G - Guanina
HE - Hematoxilina/Eosina
HPAs - Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos
HRP -Horseradish peroxidase
xvii
IHQ - Imunohistoquímica
INCA - Instituto Nacional do Câncer
kDa - KiloDalton
K-ras -Rat sarcoma gene
KTI - Inibidores do tipo Kunitz
Mapk3 -Mitogen activated protein kinase 3
nm- Nanômetro
ng/mL - Nanogramas por mililitros
O6-MeG - Oxigênio ligado ao carbono seis da guanina
p185HER2 -Human epidermal growth factor receptor 2 gene
P450 - Família de proteínas celulares com um pigmento característico a 450 nm
p53 - Proteína 53
PCR- Reação em cadeia da polimerase Psma6 -Proteasome subunit alpha type 6
qPCR -Quantitativepolymerase chain reaction
R’ - Primer reverse
R2 - Coeficiente de correlação dos genes
RGD - Rat genome database
RNA - Ácido ribonucleico
RNAm- Ácido ribonucleico mensageiro
Stat3 -Signal transducer and activator of transcription 3
Sulf1 -Sulfatase 1
TCF -T-cell family
Tm - Melting temperature
WHO - World Health Organization
xviii
Lista de Figuras
Figura 01: Distribuição proporcional dos dez tipos de câncer mais incidentes por sexo, estimados para 2012 no Brasil, exceto pele não melanoma...02
Figura 02: Sequência adenoma-carcinoma em câncer colorretal...07
Figura 03: Modelo da via sinalizadora Wnt...10
Figura 04: Esquema de acumulação de alterações genéticas em células susceptíveis...11
Figura 05: Modelo da via 4S de oxidação do DBT...14
Figura 06: Modelo de metilação do oxigênio ligado ao carbono seis da guanina causado pela DMH...16
Figura 07: Esquema de interação de uma isoforma de CD44 na sinalização oncogênica e progressão tumoral...17
Figura 08: Modelo estrutural para o antígeno carcinoembrionário...19
Figura 09: Esquema das etapas de progressão tumoral e do envolvimento das proteases no desenvolvimento do câncer...21
Figura 10: Estrutura do BBI da soja, como determinado por Odani e Ikenaka (1973)..23
Figura 11: Esquema representativo do tempo de tratamento e de espera para o desenvolvimento de alterações patológicas nos animais tratados com DMH, DBT e DBTO2...31
Figura 12: Análise da qualidade das extrações de RNA total...37
Figura 13: Gráfico de amplificação referente à curva de eficiência do gene c-Myc
utilizando diluição seriada de 5x de cDNA de pólipos intestinais...39
Figura 14: Curva padrão referente ao gene c-Myc utilizando diluição seriada de 5x de
cDNA de pólipos intestinais...40
Figura 15: Curva de dissociação referente ao amplicon do primerc-Myc...41
Figura 16: Gráfico de acompanhamento de peso dos animais pertencentes aos grupos controles e testes ao longo de 10 semanas de tratamento...45
Figura 17: Relações Peso Fígado/Peso Animal provenientes dos grupos controles e testes ao final do período de tratamento/latência...45
Figura 18: Relações Peso Baço/Peso Animal provenientes dos grupos controles e testes ao final do período de tratamento/latência...46
xix
Figura 20:Fotomicrografias de cortes histológicos de intestino delgado (4µm) coradas pela técnica de HE...52
Figura 21: Fotomicrografias de cortes histológicos de intestino grosso (4µm) coradas pela técnica de HE...53
Figura 22: Gráfico com os resultados obtidos da quantificação de células marcadas pelo anticorpo para CEA nos cinco grupos avaliados...55
Figura 23: Gráfico com os resultados obtidos da quantificação de células marcadas pelo anticorpo para CD44 nos cinco grupos avaliados...56
Figura 24: Fotomicrografias de cortes histológicos de intestino delgado (4µm) marcados pela técnica de imunohistoquímica para os anticorpos CD44 e CEA, nos cinco grupos avaliados...57
Figura 25: Gráfico com os resultados obtidos da quantificação média da intensidade de fluorescência (UA) de regiões marcadas por fluorescência direta, pelo conjugado BBI-FITC, em intestinos delgados dos cinco grupos avaliados...59
Figura 26: Fotomicrografias de cortes histológicos de intestino delgado (20µm) marcados pela técnica de fluorescência direta, pelo conjugado BBI-FITC, nos cinco grupos avaliados...60
xx
Lista de Tabelas
Tabela 01: Número de acesso ao RGD das sequências de primers forward (F’) e
reverse(R’), referentes aos genes avaliados, temperatura de melting (Tm) e tamanho do
amplicon gerado...34
Tabela 02: Sequências de primers forward (F’) e reverse (R’), slope, eficiência de
reação e coeficiente de correlação (R2) referentes aos genes avaliados...39
Tabela 03: Comparação de frequência das lesões observadas no Fígado para os grupos Controle Óleo, Controle Salina, Teste DBT, Teste DBTO2 e Teste DMH...47
Tabela 04: Comparação de frequência das lesões observadas no Intestino Delgado para os grupos Controle Óleo e Controle Salina...47
Tabela 05: Comparação de frequência das lesões observadas no Intestino Grosso para os grupos Controle Óleo e Controle Salina...48
Tabela 06: Frequência das lesões observadas no Intestino Delgado para os grupos Controle Salina e Teste DMH 30 mg/Kg...48
Tabela 07: Frequência das lesões observadas no Intestino Grosso para os grupos Controle Salina e Teste DMH 30 mg/Kg...49
Tabela 08: Frequência das lesões observadas no Intestino Delgado para os grupos Controle Óleo, Teste DBT 30 mg/Kg e Teste DBTO2 30 mg/Kg...49
2
1. Introdução
1.1. Epidemiologia do Câncer
De acordo com a Agência Internacional para Pesquisa em Câncer (IARC) e a Organização Mundial de Saúde (WHO), o câncer é a principal causa de mortes no mundo, respondendo por 7,6 milhões em 2008 (cerca de 13% de todos óbitos). Isso corresponde a uma porcentagem maior do que a mortalidade causada por HIV, tuberculose e malária juntas. Os principais tipos de cânceres são: pulmonar (1,37 milhões de mortes), estômago (736.000), fígado (695.000) e colorretal (608.000). Mesmo com o desenvolvimento de novas estratégias de prevenção e combate a esta doença, a projeção de falecimentos por sua decorrência continua a crescer, com uma estimativa de 13,1 milhões de óbitos em 2030 (WHO, 2010; IARC, 2010).
No Brasil, um estudo do Ministério da Saúde indica que serão diagnosticados 518.510 novos casos de câncer em 2012. Tal projeção foi estimada pelo Instituto Nacional de Câncer (INCA). Segundo a entidade, as estimativas são a principal ferramenta de planejamento da saúde pública na área oncológica, porque fornecem informações para a criação de políticas públicas de atendimento (Fig. 01).
Figura 01: Distribuição proporcional dos dez tipos de câncer mais incidentes por sexo, estimados para 2012 no Brasil, exceto pele não melanoma. (Números arredondados para 10 ou múltiplos de 10).
Fonte: INCA, 2012.
3 podem explicar essas variações. Estudos epidemiológicos mostraram que o ambiente é determinante nas variações entre países na incidência do câncer (PETO, 2001).
O aumento da expectativa de vida, juntamente com a maior exposição a fatores cancerígenos aumenta a ocorrência de casos de câncer, levando a idade a ser
considerada o seu maior fator de risco para ambos os sexos. A redefinição dos padrões
de vida, a partir da uniformização das condições de trabalho, nutrição e consumo
desencadeados pelo processo global de industrialização, refletem no perfil
epidemiológico das populações (MONTESANO et al, 2001). Tais modificações,
caracterizada pela redução das taxas de mortalidade e natalidade, provocaram o aumento da expectativa de vida e envelhecimento populacional no Brasil, levando ao aumento da incidência de doenças crônico-degenerativas, especialmente as cardiovasculares e o câncer (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006).
Apesar do crescente aumento no número de casos novos de câncer no Brasil e no mundo observa-se uma redução na taxa de mortalidade, fato este que pode ser atribuído às constantes e incessantes pesquisas nas áreas de diagnóstico e tratamento dessa doença (IARC, 2010).
Diante das taxas de incidência e estimativas futuras podemos perceber que o câncer representa um verdadeiro problema de saúde pública em todo o mundo. A partir desse panorama é fundamental a manutenção de investimentos no desenvolvimento de ações e pesquisas relacionadas ao controle do câncer.
1.2. Biologia do Câncer
O câncer é uma doença complexa e multicausal que ocorre como consequência do acúmulo progressivo de mutações no genoma de uma célula (WHO, 2010). Essas sucessivas alterações genéticas podem converter uma célula normal em uma célula alterada, afetando seu funcionamento e capacidade de resposta aos sinais no controle da proliferação, diferenciação celular e na apoptose. Normalmente, diversos fatores promotores atuam anteriormente ao desenvolvimento neoplásico, sendo que em poucos casos, uma mutação única seja suficiente para o estabelecimento da doença.
4
microRNA’s. Os proto-oncogenes são genes normais do organismo que têm o potencial intrínseco de induzir neoplasias, porém necessitam ser ativados em oncogenes. Sua ativação é desencadeada através de alterações genéticas que potenciam suas atividades convertendo-os em oncogenes (BUTEL, 2000).
Inversamente, os genes supressores de tumor são elementos genéticos cuja perda ou inativação permitem às células apresentarem algum dos vários fenótipos da transformação neoplásica. Esta inativação poderia ser causada por disfunções, como uma metilação do gene ou deleção deste (LI, 2009a). Os produtos desses anti-oncogenes são componentes das vias de sinalização intercelular que permitem à célula receber e processar sinais inibidores do seu redor. Quando a célula perde componentes críticos desta rede de sinalização, perde a capacidade de responder a certos sinais extracelulares inibidores da proliferação, mesmo que estes sinais ainda estejam presentes no meio celular (CROCE, 2008).
Os genes de microRNA’s, ao contrário dos genes supressores de tumor e
oncogenes, não codificam proteínas. O produto desses genes consiste em moléculas de RNA de 19-25 nucleotídeos, que atuam como potentes reguladores pós-transcricionais da expressão gênica (CROCE, 2008). Tal regulação pós-transcricional exercidas pelos
microRNA’s depende do grau de complementaridade com o RNA mensageiro (RNAm) alvo, podendo ocorrer por inibição traducional ou degradação do RNAm. O pareamento de modo imperfeito com o RNAm acarreta a inibição traducional do alvo, sendo o
mecanismo principal de atuação dos microRNA’s em mamíferos (BRENNECKE et al,
2005).
Apesar de agirem inicialmente de forma distinta, todos os agentes oncogênicos têm a mesma via final: transformação de proto-oncogenes em oncogenes e/ou inibição de supressores de tumor. Em diferentes tipos de tumores, mutações em um gene específico parecem preceder as mutações em outros. Pelo fato dos oncogenes e genes supressores de tumor controlarem o crescimento celular de formas diferentes, talvez a ordem na qual, tais controles são interrompidos, não seja importante, mas sim que um número suficiente de vias críticas tenha sido desregulada para que o crescimento do tumor ocorra (BUTEL, 2000).
5 à quimioterapia, radioterapia e outros tratamentos, tornando difícil o manejo clínico. Por estas razões, as etapas iniciais do desenvolvimento cancerígeno são de considerável importância clínica e uma prioridade no desenvolvimento de seu tratamento (CROCE, 2008).
O sucesso da terapia e consequente redução na mortalidade dos pacientes acometidos por essa doença baseiam-se principalmente na detecção precoce e na evolução das técnicas utilizadas para o tratamento dessa doença. As terapias no caso do câncer colorretal (CCR), apesar dos relevantes avanços nas técnicas tradicionais de cirurgia (ressecções clássicas, ampliadas e laparoscópicas), quimioterapia e radioterapia (ou até mesmo terapia combinada), ainda são técnicas que apresentam eficiência limitada. Além disso, apresentam graves complicações pós-operatórias como infecções, deiscência da anastomose e recaídas. Tais enfermidades aumentam substancialmente o custo do tratamento, tempo de internação, perpetuam sequelas funcionais e contribuem para indesejável índice de mortalidade (SANTOS JR., 2011).
1.3. Câncer Colorretal
O Câncer Colorretal (CCR) constitui atualmente uma neoplasia de ocorrência universal e de importância crescente como problema de saúde pública. Sua incidência varia de maneira diferente entre países, representando a terceira causa de câncer no mundo entre ambos os sexos e a segunda em países desenvolvidos (LOPEZ et al, 1993;
JEMAL et al, 2005).
6 causam inflamação em graus variados na mucosa do intestino grosso. As doenças inflamatórias intestinais estão associadas ao maior risco de câncer colorretal, especialmente em indivíduos com doença com mais de oito anos de evolução. A idade também é considerada um fator de risco, uma vez que tanto a incidência como a mortalidade aumentam com a idade (DOLL and PETO, 1981; PLATZ et al, 2000;
FERRARI et al, 2007).
A incidência de CCR tem aumentado no âmbito geral devido, possivelmente, ao envelhecimento das populações, bem como à adoção de estilo de vida sedentária e a adoção de hábitos alimentares pouco saudáveis, como a dieta baseada em gorduras animais, baixa ingestão de frutas, vegetais e cereais, assim como consumo excessivo de tabaco e álcool (FRANCO et al, 2004; FERRARI et al, 2007). Como fatores protetores
são citados o cálcio, a vitamina D, os folatos, o selênio e os antioxidantes (MARQUES-VIDAL, 2006).
Essa neoplasia é considerada de bom prognóstico se a doença for diagnosticada em estádios iniciais. A sobrevida média global em cinco anos se encontra em torno de 55% nos países desenvolvidos e 40% para países em desenvolvimento. Assemelhando-se à incidência, as taxas de mortalidade são mais baixas em mulheres do que nos homens (WHO, 2007). Para seu diagnóstico precoce podem ser utilizados os exames de: toque retal, pesquisa de sangue oculto nas fezes, enema opaco, retossigmoidoscopia e colonoscopia. Em casos de descoberta de tecidos suspeitos são realizadas biópsias para verificação da presença de células malignas, já que a biópsia é o único exame que pode determinar a presença de câncer.
A dosagem sérica de marcadores tumorais, como o antígeno carcinoembrionário (CEA), tem valor principalmente no controle pós-operatório da doença e não para o diagnóstico do câncer colorretal, devido à sua baixa sensibilidade e especificidade no sangue para este marcador. Sua simples detecção pode indicar a presença de recidiva da doença durante o período de seguimento (MITCHELL et al, 2001).
7 malignos, sendo o risco de tal progressão aumenta quanto maior for o pólipo (BROSENS et al, 2010).
A transformação de células epiteliais normais em adenomas e carcinomas segue, usualmente, um modelo de progressão de estágios histológicos e alterações genéticas e epigenéticas simultâneas (ex. metilação do DNA, acetilação de histonas) (FEARON et
al, 1990) (Fig. 02). Tais alterações fornecem às células neoplásicas vantagens sob sua
expansão clonal e levam à perda da inibição por contato celular, evasão de mecanismos apoptóticos e de interrupção do ciclo celular, aquisição de características do tipo célula tronco, entre outros (CARDOSO et al, 2007).
Figura 02: Sequência adenoma-carcinoma em câncer colorretal. A iniciação e progressão da tumorogênese de uma mucosa normal até carcinoma e metástase é geralmente associada a características morfológicas (colonoscopia) e histopatológicas (fotomicrografias de cortes histológicos).
Fonte: Adaptado de CARDOSO et al, 2007.
8 encontradas tanto no cólon de roedores tratados com cancerígenos químicos, quanto em seres humanos acometidos por polipose ou propriamente câncer de cólon (ALRAWI et
al, 2006).
Na maioria dos casos, os ACF têm como origem mutações em enterócitos, ocasionando a não migração correta destas células para fora da cripta colônica, acumulando-se. O acúmulo destas populações de células e suas descendentes, que sustentam tais mutações, permanecem retidas nas criptas, cada vez mais propensas a novas alterações, ao invés de serem destruídas por apoptose (PAPANIKOLAOU et al,
1998, 2000).
A descoberta de mudanças genéticas restritas às células neoplásicas demonstra que a detecção em estágio inicial de tumores colorretais é possível através de identificação de produtos de genes alterados secretados no sangue ou nas fezes, ou pela detecção de anticorpos do paciente contra tais produtos. A identificação dessas mudanças genéticas é o principal objetivo atual da pesquisa em câncer. Desde o início da década de 90 é relatada uma importante correlação entre a incidência de danos ao DNA no âmbito molecular e uma maior frequência do fenótipo neoplásico (FEARON
and VOGELSTEIN, 1990; LIOTTA et al, 1991). Alterações na expressão gênica são
diretamente responsáveis pela progressão ao fenótipo maligno, então se faz necessária à busca de marcadores tumorais envolvidos nas mudanças fenotípicas (proteínas, RNAm) e genotípicas (mutações, deleções, translocações cromossomais).
Já foram descritos genes envolvidos na carcinogênese colorretal que estão significativamente alterados, entretanto, métodos de classificação e estadiamento do tumor e realização de prognósticos mais robustos e menos invasivos continuam sendo necessidades médicas ainda não atendidas (HOOPS et al, 1997; NAMBIAR et al,
2010).
9
1.3.1. Carcinogênese Intestinal
A carcinogênese é um complexo processo envolvendo diversas mudanças genéticas e epigenéticas, ocorrendo em níveis moleculares, celulares e morfológicos, que pode ser dividida em três estágios principais: iniciação, promoção e progressão (PITOT, 2001).
A iniciação pode ser caracterizada por alterações na sequência do DNA celular provocada pela exposição a um agente cancerígeno químico, físico ou biológico. Esta interação pode levar às células iniciadas, responsividade alterada ao microambiente e vantagem proliferativa. Na etapa de promoção, as células iniciadas se multiplicam formando lesões pré-neoplásicas (displasias e anaplasias) sob estímulos promotores. O agente cancerígeno promotor age de forma a selecionar as células iniciadas e dessa forma ocorre a expansão clonal das mesmas, levando a um acúmulo de mutações e aumentando a instabilidade genética. Já no estágio de progressão tumoral ocorre a aquisição de múltiplas alterações genéticas que desencadeiam multiplicação descontrolada e irreversível das células alteradas. Quando tais células invadem vasos sanguíneos e/ou linfáticos, alcançam tecidos distantes do hospedeiro formando sítios de metástases (PAPANIKOLAOU et al, 2000; PITOT, 2001).
Segundo o modelo da sequência adenoma-adenocarcinoma colorretal de Fearon e Vogelstein (1990), os genes que são mutados nos estágios iniciais do câncer de cólon são o Apc (transição epitélio normal para adenoma) e o K-ras (presente em adenomas),
e logo em seguida os supressores de tumorais Dcc e p53 (na transição adenoma para
carcinoma) (NAMBIAR et al, 2010).
De acordo com a literatura, mutações em Apc ou β-catenina estão relacionadas
com a maioria dos tumores de cólon humanos e em roedores. Acredita-se que a primeira alteração que ocorre é a mutação do gene Apc, envolvido com a regulação da proteína
β-catenina, organização do citoesqueleto, apoptose, controle do ciclo celular e adesão celular. Mutações no gene Apc são consideradas os principais fatos responsáveis e
causadores da Polipose Adenomatosa Familiar (TAKAHASHI et al, 2004; TANAKA,
2009).
A proteína APC é o principal fator de sinalização da via Wnt (mais conhecida
por seu papel na embriogênese e desenvolvimento de câncer), que regula a ligação e
10 com a e-caderina, importante proteína do controle da arquitetura tecidual. Quando os genes Apc e Ctnnb1 (codifica β-catenina) são mutados ou a via sinalizadora Wnt é
ativada, a β-catenina deixa de ser degradada e acumula-se no citoplasma, liga-se a fatores de transcrição TCF e move-se para o núcleo, resultando no aumento da expressão de genes ligados a proliferação celular como c-Myc e CcnD1 (que codifica
ciclina D1 - inibidor de supressores de tumor), importantes na carcinogênese (Fig. 03) (TAKAHASHI et al, 2004; TANAKA, 2009). Outros importantes genes no
desenvolvimento tumoral que são regulados pela via β-catenina/TCF são c-Jun e Cd44
(NARAYAN et al, 2003).
Figura 03: Modelo da via sinalizadora Wnt. (A) Retrata a regulação diminuída da ativação transcricional
da β-catenina em células epiteliais normais do cólon. Na ausência da sinalização Wnt, a proteína APC
auxilia na fosforilação da β-catenina que seguirá a via de degradação pelo proteassoma. Dessa forma a expressão dos genes c-Myc e ciclina D1 é reprimida para o controle da progressão do ciclo celular. (B)
Demonstra o papel das mutações das proteínas β-catenina ou APC nos níveis de β-catenina e sua ativação transcricional em células neoplásicas. Ao não ser degradada a β-catenina se acumula no citoplasma e conjuga-se com o fator de transcrição TCF e se desloca para o núcleo onde potenciam a transcrição em direção à proliferação celular.
11 O gene mutado k-ras identificado em vários adenomas, favorece o aumento da
proliferação celular, anaplasia e consequente crescimento tumoral (TAKAHASHI et al,
2004). Presume-se que em sequência ocorrem as mutações dos genes supressores de tumor Dcc, que codifica uma proteína homóloga a de adesão celular, e o p53, que é um
fator de transcrição que regula o ciclo celular e apoptose. Tais mutações são denotadas de adenomas tardios e adenocarcinomas (POZZA et al, 2011).
Além disso, outros genes estão envolvidos na carcinogênese colorretal e significativamente alterados em diferentes classes de tumores, no entanto, métodos de classificação e estadiamento de tumores e realização de prognósticos mais robustos e menos invasivos continuam sendo necessidades médicas ainda não atendidas (HOOPS
et al, 1997; NAMBIAR et al, 2010).
1.4. Carcinogênese Química
É fato que cânceres causados por agentes ambientais frequentemente tendem a ocorrer em regiões como pulmão, trato gastrointestinal e pele, porque normalmente os tecidos desses órgãos estão mais expostos ao ambiente (SHUBIK et al, 1956).
Atualmente, pesquisas que envolvem a carcinogênese química têm sido feitas atentando as diversas alterações celulares inerentes às células cancerígenas, possibilitando assim, a busca por marcadores biológicos e vias metabólicas alteradas.
A carcinogênese química causa anomalias genéticas e epigenéticas em células susceptíveis que acumulam mutações no genoma e sofrem uma expansão clonal, que são condições prévias para o desenvolvimento neoplásico (Fig. 04).
Figura 04: Esquema de acumulação de alterações genéticas em células susceptíveis.
12 O campo de estudos sobre a carcinogênese química provavelmente teve início com as associações epidemiológicas de ocorrência de tumores com a exposição à fumaça do tabaco, realizadas por Hill e Pott no início do século XIX. A partir disso, seguiram-se as observações de tumores no trato urinário de trabalhadores que mantinham contato com arilaminas nas fábricas europeias no final do século 19. Além destes, diversos trabalhos começaram a dar ênfase aos carcinógenos hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPA) no século 20. Os principais estudos sobre o metabolismo dos HPA foram relatados na década de 30 com Kennaway (1930) e Kinosita (1936), entre outros. Em 1940, químicos britânicos purificaram vários componentes do piche de carvão, o qual era particularmente carcinogênico. Compostos como os HPA benzo[a]pireno e 1,2,4,5-dibenz[a,h]antraceno eram produtos comuns da combustões
incompletas de compostos orgânicos e também encontrados em fumaça de cigarro (MILLER, 1978).
Os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos representam uma importante classe de poluentes ambientais que têm recebido atenção especial pelo fato de alguns de seus componentes demonstrarem forte potencial mutagênico e carcinogênico. Além disso, emissões antropogênicas destes compostos desempenham papéis cruciais em três problemas ambientais importantes: poluição do ar, chuva ácida e mudança climática global. Esses compostos estão presentes nos combustíveis fósseis e são formados durante a combustão incompleta e pirólise de matéria orgânica. Os HPA podem, por exemplo, ser gerados durante incêndios florestais e erupções vulcânicas além de serem constituintes naturais de alguns tipos de alimentos e produtos petroquímicos. Consequentemente, podem ser formados pelo gás de cozinha e no tráfego de automotores sendo, também, uma das diversas classes de carcinogênicos químicos presentes na fumaça de cigarro (HONER, 2001; MEIRE et al, 2007). Além disso, uma
vez que diversas classes de HPA são agentes promotores, bem como iniciadores de neoplasias, uma devida atenção deve ser dada às possíveis atividades de seus metabólitos (VAN DUUREN, 1976; HONER, 2001).
A absorção dos hidrocarbonetos policíclicos através do trato pulmonar, gastrointestinal e da pele ocorre de maneira dependente do tipo de HPA, do tamanho das partículas onde estão adsorvidos, da composição do adsorvente, e da sua afinidade por gordura (KAWAMURA et al, 1988). Em roedores, a absorção no trato
13 Um dos principais vilões da poluição ambiental é o gás dióxido de enxofre (SO2), um dos causadores do efeito estufa. Sua fonte de geração mais comum é pela combustão do enxofre contido em combustíveis fósseis, o que conduziu a criação de regulamentos ambientais estritos para produção de baixas concentrações desses compostos orgânicos sulfurados em combustíveis (SWATY, 2005).
1.4.1. Dibenzotiofeno (DBT) e seu metabólito Dibenzotiofeno Sulfona (DBTO2)
Atualmente, uma das estratégias para diminuir os níveis de emissão de compostos sulfurados consiste na remoção do enxofre antes da combustão do carvão, petróleo e seus derivados por processos químicos e biológicos (hidrodessulfurização e biodessulfurização). Entretanto a remoção é complicada, devido à sua difícil biodegradabilidade e são considerados compostos recalcitrantes (KROPP et al, 1997;
VAN HAMME et al, 2006). Estudos de biodessulfurização tiveram início nas décadas
de 50 e 60 por serem extremamente importantes para o meio ambiente em geral, e ainda de importância econômica uma vez que a presença de organossulfurados na gasolina causa a diminuição do poder de combustão com consequente perda econômica para a indústria petroquímica. No entanto, apenas nas últimas décadas, com o auxílio da biotecnologia, esta área passou a apresentar desenvolvimento significativo.
Técnicas de dessulfurização, geralmente, utilizam o dibenzotiofeno (DBT), que é um composto organossulfurado heterocíclico utilizado como fonte de carbono e energia principal ou secundária (co-substrato) por microorganismos, como composto modelo para avaliar a eficiência nestes processos de biorremediação (VAN HAMME et
al., 2003). A biodessulfurização do DBT requer uma série de enzimas e pode ocorrer
por três vias: a de Kodama, na qual, apesar da quebra do DBT, o enxofre não é removido (KODAMA et al., 1973), a de van Afferden a qual proporciona a remoção do
enxofre, no entanto ocorre a quebra da estrutura de carbono (VAN AFFERDEN et al.,
14
Figura 05: Via 4S. O enxofre é removido na forma de sulfito, permanecendo intacta a estrutura carbonilada.
Fonte: Adaptado de SILVA, 2007.
O DBT também é conhecido como uma das substâncias responsáveis pela queda da octanagem da gasolina e pela corrosão de partes de motores a combustão (MONTICELLO, 1985; INOUE et al, 2005). No entanto, poucos relatos sobre sua ação
tóxica em mamíferos têm sido apresentados (LEIGHTON, 1989).
Trabalhos anteriores utilizaram animais experimentais empregando doses maciças de DBT e derivados por via oral e subcutânea na expectativa de demonstrar efeitos tóxicos. Tais trabalhos estabeleceram a dose letal (DL50) de 470 mg/Kg para camundongos e demonstraram alterações de caráter neoplásico nos linfonodos mesentéricos e necrose das células do timo em ratos (LEVINE et al, 1977; LEIGHTON,
1989). Dessa forma, tornam-se necessários estudos minuciosos sobre a toxicologia dessa importante classe de compostos. A exposição crônica a pequenas doses representaria melhor a situação real da exposição cotidiana a seres vivos às essas substâncias.
15 tais substâncias, o metabolismo em tecidos extra-hepáticos como o intestino pode ser de grande importância (CAVRET et al, 2005). Por outro lado, a investigação bioquímica
que pretendemos realizar não se limitou às abordagens do ponto de vista de medida de indicadores usuais de função hepática, pancreática e proteômica, anteriormente executadas em nosso laboratório. Esse projeto propôs a investigação de marcadores bioquímicos sensíveis para a exposição ao DBT e DBTO2, empregando-se técnicas de imunohistoquímica e análise de expressão gênica.
O fato de agentes químicos promoverem alterações randômicas no genoma justifica o direcionamento de esforços para a quantificação dessas mudanças, diminuição da exposição a esses agentes e desenvolvimento de alternativas para a quimioprevenção.
1.4.2. 1,2-Dimetilhidrazina (DMH) - Indutor Clássico de Câncer
Nas últimas décadas diversos modelos experimentais têm sido desenvolvidos em animais utilizando-se compostos químicos indutores da formação e desenvolvimento de tumores colorretais (LARANGEIRA et al, 1998), muitos com características
semelhantes àqueles de ocorrência natural visando à obtenção de informações sobre a gênese, evolução, bem como métodos de diagnóstico e terapias mais eficazes frente a essas neoplasias (SHETYE et al, 1990). Dentre os compostos químicos, um dos mais
utilizados em estudos experimentais é a 1,2-dimetilhidrazina (DMH), uma vez que induz carcinomas com semelhança morfológica e histológica daqueles tumores de ocorrência natural em humanos e, em razão de sua estabilidade química e alta taxa de obtenção de tumores após um determinado período de latência (LARANGEIRA et al,
1998).
A 1,2 dimetilhidrazina é um carcinógeno químico indireto, que resulta na metilação do oxigênio ligado ao carbono seis da guanina (O6-MeG) no DNA alterando a ligação de hidrogênio, o que leva a um erro de leitura pela DNA polimerase e resulta na transição G:A (Fig. 06) (LEVI et al, 2009). A DMH induz a proliferação de tumores no
16 ainda não esteja claramente elucidado (LARANGEIRA et al, 1998; COLUSSI et al,
2001).
Figura 06: Modelo da metilação do oxigênio ligado ao carbono seis da guanina causado pela DMH. Tal metilação resulta na alteração da ligação de hidrogênio entre nucleotídeos, no caso o que seria uma ligação entre G:C se torna uma ligação A:T.
Fonte: Adaptado de foto retirada no site http://flipper.diff.org/app/pathways/info/4645, 22/08/2012.
1.5. Marcadores Moleculares do Câncer
1.5.1. O Antígeno Carcinoembrionário (CEA)
Marcadores tumorais são substâncias que podem ser encontradas em concentrações alteradas em amostras biológicas de pacientes com certos tipos de câncer. Podem ser produzidos pelo próprio tumor ou pelo corpo, em resposta à presença do câncer. Testes para marcadores tumorais auxiliam no diagnóstico do câncer, entretanto raramente são usados prova definitiva para a constatação da enfermidade (RUBIE et al,
2005; YANG et al, 2009). Além disso, nem todos pacientes diagnosticados com câncer
possuem um nível alterado destes marcadores, principalmente em estágios iniciais da doença (DUFFY et al, 2003).
17 tumoral para seguir o curso da doença, para medir o efeito do tratamento e para verificar sua reincidência. Em alguns casos, o nível do marcador tumoral reflete a extensão da doença (estágio) ou indica o quão rápido a doença parece progredir (prognóstico) (DUFFY et al, 2003). Um marcador clínico, de suma importância é o antígeno
carcinoembrionário (CEA) característico de cânceres colorretais, de bexiga, mama, pancreático e de pulmão (ZHAO et al, 2008). Tal antígeno é uma proteína de membrana
de alto peso molecular pertencente à família das imunoglobulinas (Fig. 07). Tal molécula desempenha papéis na adesão celular, imunidade, apoptose e está relacionada à ocorrência de metástase em mamíferos (THOMAS et al, 2004; YANG et al, 2009). O
CEA é o protótipo dos marcadores tumorais e tem sido intensivamente investigado desde sua primeira identificação, em 1965, por Gold e Freedman. Estes autores identificaram o antígeno em extratos de adenocarcinoma de cólon de humanos e em células de cólon fetais, porém em baixos níveis na mucosa de cólons normais.
Figura 07: Modelo estrutural para o antígeno carcinoembrionário.
Fonte: Adaptado de BOEHM et al, 2000.
18 na definição do prognóstico, no acompanhamento do tratamento de CCR, já que é detectado apenas em baixas concentrações no sangue de pessoas saudáveis, e em elevadas concentrações em pessoas portadoras deste câncer (COBBEN-BELD et al,
1996). Considera-se que a existência de uma concentração sérica acima de 5 ng/mL, em indivíduos já submetidos ao tratamento, está associada com a recorrência de câncer e metástase. Todavia pacientes com outros tipos de câncer ou com desordens como infecção pulmonar, colite ulcerativa e doença inflamatória intestinal também podem ter níveis elevados de CEA (KAHLENBERG et al, 2003; ZHAO et al, 2008).
1.5.2. Importância da Molécula CD44
As moléculas de adesão constituem um grupo heterogêneo de proteínas transmembrana que regulam as interações adesivas célula-célula e célula-matriz extracelular (HYNES, 2009). O CD44 é uma molécula de adesão receptora de ácido hialurônico, que por sua vez, é um dos principais componentes da matriz extracelular. Estudos demonstraram a interação da matriz extracelular com células tumorais através da via do CD44, estabelecendo-a como um dos principais mecanismos para a progressão do tumor e metástase (Fig. 08). Alterações na expressão e na função das moléculas de adesão de variadas classes e funções relacionam-se com o desenvolvimento tumoral, a diferenciação das células neoplásicas, a invasão e metástase (CHRISTOFORI, 2003; HYNES, 2009).
Interações entre as células mesenquimais e epiteliais são consideradas fundamentais para o mecanismo de oncogênese, sendo apontado que o processo de invasão tumoral e metástase requerem alterações complexas nas interações célula-célula e célula-matriz extracelular, as quais refletem numa hiper-expressão de proteínas, entre elas o CD44 (HANLEY et al., 2006). Especificamente no câncer colorretal, a
transformação adenoma-carcinoma ocorre em consequência às alterações genéticas que incluem algumas moléculas já identificadas, dentre elas a proteína CD44 (MIKAMI et
19
Figura 08: Esquema de interação de uma isoforma de CD44 na sinalização oncogênica e progressão tumoral. A ligação do ácido hialurônico (HA) ao CD44 estimula a ativação de RAS, a cascata quinase e ao crescimento da célula tumoral. Sendo assim, o CD44 desempenha um papel central na regulação de
duas diferentes vias de sinalização (proliferativa X motilidade/invasão) durante a progressão tumoral.
Fonte: Adaptado de BOURGUIGNON et al, 1998.
O Cd44 é um gene que codifica uma ampla variedade de proteínas de superfície
celular, através do processamento alternativo de seus éxons. Este gene é composto por 20 éxons, dos quais 10 são chamados éxons constantes, sendo expressos juntos em todos os tipos celulares sob a forma padrão. Os éxons remanescentes podem sofrer processamento alternativo e serem incorporados aos éxons padrões, gerando um número variado de isoformas proteicas (GOODISON et al, 1998). O gene Cd44 representa uma
família de isoformas que, em certos tumores, têm expressão elevada nos tecidos. Estudos imunohistoquímicos também demonstraram que a expressão da proteína CD44 é alterada em diferentes tipos de neoplasias, sendo observado um padrão de expressão com notável diversidade molecular, indicando que essas moléculas apresentem grande valor para prognósticos de carcinomas (BÁNKFALVI et al., 2002). Estudos de casos de
20 Além disso, Franzmann e colaboradores (2005) avaliaram que a proteína CD44 solúvel na saliva como um potencial marcador molecular para câncer na região da cabeça e concluíram que o exame pode ser efetivo para detectar esse tipo de câncer em todos seus estágios. Dessa forma, acredita-se que esse marcador de células possa ser usado no acompanhamento terapêutico avaliando a progressão do tumor (Fig. 08).
1.6. Importância das Proteases no Desenvolvimento de Neoplasias
Durante a década de 40 que foram feitas as primeiras associações entre proteases e o câncer, nas quais foi proposto que a atividade proteolítica poderia ser responsável por degradação da matriz extracelular de células tumorais e subsequente invasão de tecidos normais (FISHER et al, 1946). Até então acreditava-se que as enzimas
proteolíticas contribuíam para o desenvolvimento do câncer apenas em etapas de metástase, no entanto, estudos mais recentes indicaram que as proteases participam de praticamente todos os passos do crescimento tumoral (KOBLINSKI et al, 2000;
NYBERG et al, 2006).
A homeostase celular requer a existência de um equilíbrio entre as proteases e seus inibidores endógenos. Caso esse equilíbrio seja perdido a favor das proteases, pode haver uma desregulação das proteólises que desencadeariam processos tais como, inflamação, artrites reumatóides, angiogênese patológica e crescimento tumoral (KENNEDY et al, 2008). Sabe-se que proteases participam de todas as etapas de
progressão do tumor, incluindo os processos de proliferação, adesão, migração, angiogênese, apoptose e evasão do sistema imune (Fig. 09) (LAUFS et al, 2006;
21
Figura 09: Esquema das etapas de progressão tumoral e do envolvimento das proteases no desenvolvimento do câncer. MMPs: metalo-proteases; BM: membrana basal; ECM: matriz extracelular.
Fonte: Adaptado de NYBERG et al, 2006.
As serino-proteases são exemplo de família envolvida nos processos fisiológicos e patológicos de degradação da membrana basal e matriz extracelular. Tal família representa quase um terço de todas as proteases (GETTINS et al, 2002). Entre as
principais enzimas pertencentes a esse grupo estão quimotripsina e tripsina, que apesar de apresentarem alta similaridade estrutural, reconhecem substratos diferentes. A tripsina hidrolisa, de maneira específica, as ligações peptídicas no lado carboxila dos aminoácidos arginina e lisina, enquanto a quimotripsina catalisa a hidrólise de ligações após resíduos de leucina, fenilalanina e tirosina (LOSSO et al, 2008). Certos estudos já
demonstraram que a expressão e a atividade de serino-proteases, como da tripsina, estão associadas a várias fases de progressão do tumor (KATO et al, 1998; BORGONO et al,
2007; AFFARA et al, 2009).
Diante da grande relevância das proteases em diversas etapas do desenvolvimento tumoral, o Instituto Nacional do Câncer dos Estados Unidos recomendou que as pesquisas para a cura dessa patologia deveriam envolver (LOSSO et
22 I) identificação de fontes de inibidores de proteases;
II) determinação da concentração de inibidores de proteases em alimentos; III) determinação da relação entre a concentração de inibidores de proteases
na dieta e prevalência de câncer na população humana;
IV) determinação da eficácia dos inibidores de proteases em modelos animais;
V) investigação do mecanismo de ação dos inibidores de proteases.
Em concordância com tais recomendações, temos os inibidores de serino-proteases sendo a classe mais bem estudada e caracterizada dos inibidores. Tal classe apresenta uma inibição estritamente competitiva, como inibidores de tripsina do tipo
Kunitz (KTI) e inibidores Bowman-Birk (BBI) (RICHARDSON, 1991; KENNEDY,
1998a).
1.6.1. Inibidores de Proteases do Tipo Bowman-Birk (BBI)
Os BBI foram isolados pela primeira vez em sementes de soja (Glycine max) por
Bowman, em 1946 e caracterizados por Birk em 1961, sendo posteriormente
identificados em outras leguminosas (NORIOKA et al, 1982) e gramíneas (ODANI et
al, 1986).
23
Figura 10: Estrutura do BBI da soja, como determinado por Odani e Ikenaka (1973). A) Em cinza, do lado direito, o sítio inibitório para a quimotripsina (Leu – Ser), e do lado esquerdo o sítio inibitório para a tripsina (Lys – Ser). B) Estrutura tridimensional do BBI. O BBI isolado de soja é uma proteína de 71 aminoácidos (AA). A região carboxi-terminal da proteína está representada em roxo (AA71), a região N-terminal representada em amarelo. O sítio inibitório para a quimotripsina está representado em verde e o para tripsina está mostrado em azul.
Fonte: Adaptado de Kennedy, 1998a.
A interação do BBI com a tripsina ou com a quimotripsina é capaz de inibir fortemente a atividade dessas serino-proteases. A conformação do loop do sitio reativo
do BBI é complementar ao sítio ativo da proteína a ser inibida, permitindo uma ligação firme do inibidor à protease (CHEN et al, 2005). Essa ligação do tipo reversível ocorre
com elevada afinidade, semelhante à afinidade pelos substratos proteicos.
Nesse contexto, os inibidores de proteases do tipo Bowman-Birk surgiram como
24 suprimir os processos carcinogênicos em vários modelos in vitro e in vivo (YAVELOW
et al, 1985; ARMSTRONG et al, 2000). Inclusive St. Clair e colaboradores (1990) já
haviam verificado que aproximadamente 0,1% do BBI adicionado às dietas de camundongos foram suficientes para inibir a indução de câncer hepático por 1,2-dimetilhidrazina.
Yavelow e colaboradores (1985) demonstraram que moléculas de BBI modificadas enzimaticamente, com atividade inibitória apenas para quimotripsina, foram completamente eficazes como supressores da transformação maligna de células in
vitro induzida por radiação. Neste mesmo trabalho, tais atividades anti-tumorais não
foram observadas em moléculas de BBI modificadas com atividade inibitória apenas para tripsina. Apesar disso, proteases tripsina-símile envolvidas na carcinogênese devem ser consideradas alvos potenciais de proteínas relacionadas ao BBI (CLEMENTEA and DOMONEY, 2006). Dessa forma alguns estudos revelaram que a
atividade proteolítica da tripsina correlaciona-se com a agressividade do tumor, pois está intimamente ligada à ativação de receptores envolvidos com processos de adesão e proliferação de células tumorais (MIYATA et al, 1998; MIYATA et al, 1999).
Embora os mecanismos pelos quais o BBI exerça suas funções anti-carcinogênicas ainda não sejam completamente conhecidas, várias hipóteses têm sido discutidas. Estudos demonstraram a capacidade deste inibidor em impedir a ativação de outras proteases envolvidas na degradação da membrana basal e matriz extracelular, além de prevenir processos angiogênicos necessários para a progressão tumoral. Assim sendo o inibidor de Bowman-Birk mostra-se capaz em reduzir o processo metastático (LOSSO et al, 2008). Recentemente seu efeito quimiopreventivo foi ainda associado à
inibição do proteassoma (CHEN et al, 2005; SAITO et al, 2007).
Foi demonstrada também atividade desse inibidor de proteases na redução do processo inflamatório. Como tal processo está intimamente associado à carcinogênese, acredita-se que a atividade antiinflamatória do BBI poderia ser o principal mecanismo pelo qual possa ser revertido o estágio inicial da carcinogênese, assim como afetar seu estágio promocional (KENNEDY, 1998a; KENNEDY, 1998b).
25 fibroblastos de seres humanos portadores de Síndrome de Bloom. Dessa forma,
demonstraram que proteases lisossomais ligantes em colunas de afinidade de BBI possivelmente estão intimamente relacionadas desenvolvimento neoplásico (BOND and
BUTLER, 1987; BILLINGS et al, 1987).
Recentemente, em nosso grupo de pesquisas, Carli e colaboradores (2012) confirmaram o efeito preventivo do BBI na indução de neoplasias por DMH em camundongos. Além disso, demonstraram que a expressão de CD44 e da atividade de proteases lisossomais associadas à coluna de afinidade de BBI são úteis no monitoramento desse modelo experimental.
27
2. Justificativa e Objetivos
2.1. Justificativa
A relevância ambiental dos Hidrocarbonetos Polícíclicos Aromáticos Sulfurados (HPA) não condiz com a escassez de informações toxicológicas, relacionadas às consequentes contaminações acarretadas pelos agentes DBT e DBTO2. Em consequência a isso, essas substâncias constituem importantes objetos de investigação científica na área da toxicologia voltada para a carcinogênese.
28
2.2. Objetivo Geral
Realizar um estudo toxicológico em ratos Wistar submetidos a um regime
crônico de administração de DBT, DBTO2 e DMH com ênfase no potencial carcinogênico desses compostos, por meio de técnicas moleculares.
2.3. Objetivos Específicos
A) Comparação da potência de indução do DBT e DBTO2 como carcinógenos frente ao indutor clássico DMH.
B) Realizar estudos histopatológicos no baço, fígado e intestinos dos animais submetidos à indução química da oncogênese.
C) Analisar a expressão gênica relativa dos genes Cd44, c-Myc, c-Jun, Stat3,
Psma6, Mapk3 e Sulf1 em pólipos intestinais pelo método de qPCR.
D) Avaliar os pólipos intestinais por meio de ensaios de imunohistoquímica utilizando marcadores moleculares CD44 e o antígeno carcinoembrionário (CEA).
30
3. Materiais e Métodos
Este trabalho foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal de Ouro Preto catalogado sob o protocolo de número 2011/11. Para a realização do mesmo, o número de animais utilizados assim como o tratamento aplicado restringiu-se ao estabelecido pelos objetivos delineados.
3.1. Indução de câncer em ratos Wistar tratados com DMH, DBT e DBTO2
Ratos da linhagem Wistar, machos, com aproximadamente 90 dias de idade,
foram obtidos no Centro de Ciência Animal (CCA) da Universidade Federal de Ouro Preto sendo mantidos à temperatura ambiente com ração e água ad libitum e ciclo
claro/escuro de 12 horas.
Os animais foram divididos em sete grupos, a saber:
Grupo I: Controle Salina (DMH) (n=5);
Grupo II:Controle Óleo (DBT’s) (n=5);
Grupo III: Teste DMH 30 mg/Kg (n=15) (NEWELL and HEDDLE, 2004);
Grupo IV: Teste DBT 30 mg/Kg (n=15);
Grupo V: Teste DBTO2 30 mg/Kg (n=15).
Nos grupos I e II foram administradas, respectivamente, injeções intraperitoniais semanais de solução salina 0,9 % e óleo vegetal industrializado durante 10 semanas, os grupos III, IV e V receberam injeções de soluções de DMH (Sigma-Aldrich) em solução
salina 0,9 %; DBT e DBTO2 (Sigma-Aldrich) em óleo vegetal industrializado, na dose
de 30 mg/Kg no mesmo regime de tempo dos grupos anteriores.
pré-31 neoplásicas em ratos. Após esse período, realizou-se a necrópsia dos animais para coleta de parte do pulmão e órgãos como, estômago, baço, fígado, intestinos grosso e delgado.
Figura 11: Esquema representativo do tempo de tratamento e de espera para o desenvolvimento de alterações patológicas nos animais tratados com DMH, DBT e DBTO2.
3.2. Avaliação Morfológica Microscópica (Histologia)
Para realizar as análises histológicas e imunohistoquímicas, os segmentos de tecidos, provenientes da necrópsia dos animais, foram fixados em formol tamponado, posteriormente processados e incluídos em blocos de parafina. Então foram realizadas
secções de 4,0 μm em micrótomo. As lâminas relativas à análise histológica foram
diafanizadas, hidratadas e submetidas aos corantes Hematoxilina e Eosina (HE), desidratadas, e então montadas em Entellan® sintético. Dessas, avaliou-se
32
3.3. Imunohistoquímica
Para a realização das reações imunohistoquímicas, foram utilizados cortes histológicos provenientes dos mesmos blocos usados na análise histopatológica. Os ensaios de IHQ foram realizados utilizando os anticorpos primários CD44 (anti-rat - BD
Biosciences) e CEA (anti-human com reação cruzada para rato - Sigma) na
concentração de 1:1000 (PBS 0,01M e BSA 0,1%), e o sistema estreptavidina-biotina peroxidase (método LSAB - DAKO®), revelado com solução DAB (Diaminobenzidina).
O protocolo utilizado teve as seguintes etapas:
- diafanização dos tecidos em xilol (2 lavagens de 15 minutos), seguida de hidratação em soluções de álcoois decrescentes (absoluto, 90⁰, 80⁰, 70⁰) e água, durante 5 minutos em cada;
- ativação antigênica com tampão citrato 0,01M, pH 6.0 e 5 ciclos, de 3 minutos cada, em potência máxima no microondas;
- lavagem 3 vezes, de 5 minutos cada, com tampão PBS 0,01M, pH 7.4;
- inibição da peroxidase endógena com solução de H2O2 3,5% em PBS durante 30 minutos;
- lavagem 2 vezes, de 5 minutos cada, com tampão PBS 0,01M, pH 7.4;
- bloqueio de reações não específicas com solução de leite em pó 14% em PBS por 30 minutos;
- incubação com anticorpo primário em quantidade suficiente para cobrir os fragmentos, sendo as lâminas incubadas por 16 horas em câmara úmida a 4ºC;
- lavagem 3 vezes, de 5 minutos cada, com tampão PBS 0,01M, pH 7.4;
- incubação com anticorpo secundário biotinilado (link do kit LSAB DAKO)
durante 30 minutos em câmara úmida, a temperatura ambiente;
- lavagem 2 vezes, de 5 minutos cada, com tampão PBS 0,01M, pH 7.4;
- adição do conjugado estreptavidina-HRP (peroxidases horseradish) e mantido
durante 30 minutos em câmara úmida, a temperatura ambiente;
- lavagem 2 vezes, de 5 minutos cada, com tampão PBS 0,01M, pH 7.4; - revelação com solução de DAB 0,05% com substrato (H2O2) por 5 minutos; - última lavagem de 5 minutos cada com tampão PBS 0,01M, pH 7.4;
- contracoloração rápida (5 segundos) com hematoxilina e lavagem com água corrente a fim de retirar excesso de corante;
33 Nos controles negativos, as lâminas foram incubadas com tampão PBS 0,01M, pH 7.4 ao invés do anticorpo primário.
3.4. Análise por Fluorescência Direta (FA)
Nos ensaios de fluorescência direta elaborados neste estudo, o ligante primário utilizado foi um inibidor de Bowman-Birk (BBI), previamente enriquecido e purificado em nosso laboratório. Já o composto fluorescente utilizado na conjugação ao anticorpo, foi o isotiocianato de fluoresceína (FITC - Sigma), que emite luz verde brilhante ao ser
estimulado por luz filtrada até 520 nm (filtro verde).
3.4.1. Conjugação BBI-FITC
A conjugação entre o BBI e o FITC foi padronizada de acordo com manual adaptado do fabricante do composto fluorescente (Biorad). Para tal padronização
utilizou-se solução estoque 10 mg/mL de FITC dissolvido em dimetilsulfóxido anidro (DMSO - Sigma) para estabelecer uma proporção de 80 µg de FITC por miligrama de
BBI. O BBI foi diluído no tampão de reação (500 mM carbonato/bicarbonato, pH 9.5) e prontamente misturado a solução de FITC. Foi incubado sob agitação leve durante 60 minutos, a temperatura ambiente ao abrigo da luz. O FITC não conjugado foi retirado através de coluna exclusão molecular (Sephadex G-25M - Pharmacia Biotech) e o
conjugado foi eluído em tampão de armazenamento (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1% NaN3, pH 8.2) e estocado a 4ºC no escuro. A concentração foi aferida pela medida da absorbância a 280 e 520 nm.
3.4.2. Preparação dos Cortes Histológicos para FA
Os segmentos de tecidos obtidos em necropsia que foram fixados em solução crioprotetora (Tissue-Tek®-SakuraTM) e imediatamente congelados a -80ºC.
