IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS ASSOCIADAS À CARCINOGÊNESE INDUZIDA POR DIBENZOTIOFENO E DIBENZOTIOFENO SULFONA EM RATOS WISTAR

(1)

KARINA TACIANA SANTOS SILVA

IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS ASSOCIADAS À CARCINOGÊNESE INDUZIDA POR DIBENZOTIOFENO E DIBENZOTIOFENO SULFONA EM

RATOS WISTAR

(2)

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS

BIOLÓGICAS – NUPEB

PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS ASSOCIADAS À CARCINOGÊNESE INDUZIDA POR DIBENZOTIOFENO E DIBENZOTIOFENO SULFONA EM

RATOS WISTAR

Autora: Karina Taciana Santos Silva

Orientador: Prof. Dr. Milton Hércules Guerra de Andrade

Coorientador: Prof. Dr. William de Castro Borges

(3)

S381i Silva, Karina Taciana Santos.

Identificação de proteínas associadas à carcinogênese induzida por Dibenzotiofeno e Dibenzotiofeno Sulfona em ratos Wistar [manuscrito] / Karina Taciana Santos Silva. - 2015.

xxii, 172pf.: il.: color; grafs; tabs.

Orientador: Prof. Dr. Milton Hércules Guerra de Andrade. Coorientador: Prof. Dr. William Castro-Borges.

Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas. Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas.

Área de Concentração: Bioquímica Estrutural e Biologia Molecular. 1. Câncer. 2. Dibenzotiofeno. 3. Proteômica. I. Andrade, Milton Hércules Guerra de. II. Castro-Borges, William. III. Universidade Federal de Ouro Preto. IV. Titulo.

CDU: 616-006.6:577.122

(4)

(5)

Silva, K.T.S. Colaboradores

ii

COLABORADORES

Prof. Dr. Wanderson Geraldo de Lima - UFOP

Profª. Drª. Yara Cristina de Paiva Maia - UFU

Prof. Dr. Luiz Ricardo Goulart Filho – UFU Dr. Fausto Emílio Capparelli - UFU

Msc. Renata Alves de Oliveira e Castro

Msc. Vinícius Corrêa Rodrigues

(6)

Silva, K.T.S. Auxílio

(7)

Silva, K.T.S. Dedicatória

iv

(8)

Silva, K.T.S. Epígrafe

“O homem interior se renova

sempre. A luta enriquece-o de experiência, a dor aprimora-lhe as emoções e o sacrifício tempera-lhe

(9)

Silva, K.T.S. Agradecimentos

vi

AGRADECIMENTOS

Às agências de fomento FAPEMIG e CNPq pelo apoio financeiro.

Ao Prof. Dr. William de Castro Borges, pela disponibilidade e

aprendizado. Obrigada pela coorientação e por compartilhar os problemas,

alegrias e enfrentar comigo as dificuldades encontradas.

Ao Prof. Dr. Milton Hércules Guerra de Andrade, pela orientação.

Ao Técnico José Henrique Braga Fortes, muito obrigada por toda a ajuda,

pela amizade, risadas e por compartilhar as alegrias, angústias e dúvidas

surgidas durante esses anos de convivência.

Ao Prof. Marcos Aurélio de Santana, pelo apoio e colaboração.

Ao Prof. Dr. Wanderson Geraldo de Lima, pelo aprendizado e

colaboração.

Aos laboratórios LIMP, LIP e LBBM por permitirem o uso de equipamentos

e dependências para realização de parte deste trabalho.

Aos professores do NUPEB que contribuíram de maneira construtiva para

a realização deste trabalho.

À Renata, pela colaboração e disponibilidade dedicadas a este trabalho.

Pela amizade e apoio que recebi durante esses anos de estudo.

Aos alunos de iniciação científica Aline, Vinícius e Pablo, que

participaram diretamente da realização deste trabalho, obrigada pela ajuda

inestimável. Sem vocês, a conclusão deste trabalho teria sido impossível.

Aos amigos que fiz no LEP durante esses 6 anos de pós-graduação, muito

obrigada pelas risadas, conversas e pela ajuda, principalmente nos momentos

finais do desenvolvimento deste trabalho.

Aos meus pais, pelo amor, carinho e apoio incondicionais. Obrigada por

acreditarem nos meus sonhos e muitas vezes abrirem mão dos seus para que

essa conquista se tornasse possível.

A minha irmã, pela amizade e companheirismo mesmo à distância.

Ao Allan, por transformar qualquer dia em um dia especial, pelo amor,

carinho e apoio.

Enfim, agradeço a todos que de maneira direta ou indireta contribuíram

(10)

Silva, K.T.S. Índice

ÍNDICE

RESUMO ...x

LISTA DE ABREVIATURAS ...xiii

LISTA DE FIGURAS ...xvi

LISTA DE TABELAS ...xx

1. INTRODUÇÃO ...2

1.1. Epidemiologia ...2

1.2. Aspectos Gerais da Oncogênese ...3

1.3. Trato Gastrointestinal Inferior ...4

1.3.1. Características Gerais ...4

1.3.2. Câncer Intestinal ...6

1.3.3. Fatores de Risco e Genéticos ...8

1.4. Visão Geral de Vias de Sinalização Atuantes no CCR ...9

1.4.1. Via Wnt/β-catenina ...9

1.4.2. Via Notch ...11

1.4.3. Via Hedgehog ...12

1.4.4. Via PI3K/Akt ...14

1.5. Carcinogênese Química ...16

1.5.1. Dibenzotiofeno e Dibenzotiofeno Sulfona ...18

1.5.2. 1,2-Dimetilhidrazina ...21

1.6. Biomarcadores e Câncer ...21

1.6.1. Proteômica e Phage Display ...23

2. JUSTIFICATIVA ...25

3. OBJETIVOS ...27

3.1. Objetivo Geral ...27

3.1.1. Objetivos Específicos ...27

4. MATERIAL E MÉTODOS ...29

(11)

viii

4.3. Extração de Proteínas e Análise Proteômica ...31

4.3.1. Eletroforese Uni e Bidimensional (1D/2D SDS-PAGE) ...32

4.3.2. Digestão in gel ...33

4.3.3. Análise de Proteínas por Espectrometria de Massas ...34

4.3.4. Categorização Funcional e Mapa de Interação Proteica ...34

4.4. Western bloting ……….35

4.5. Biopanning (Phage Display)……….35

4.5.1. Extração de Proteínas para Phage Display ...35

4.5.2. Ciclos de Seleção de Phage Display ...36

4.5.3. Titulação de Clones Obtidos no Phage Display ...37

4.5.4. Extração de DNA de Fagos e Sequenciamento ...37

4.5.5. Análise in silico dos Peptídeos Obtidos ...39

4.6. Síntese de Peptídeos ...40

4.6.1. Análise de Pureza e Confirmação de Identidade ...41

4.7. Síntese de Colunas de Afinidade ...42

4.7.1. Identificação de Proteínas Ligantes ...43

4.7.2. Análise in silico da Interação Proteína/Peptídeo ...44

4.8. Análise Estatística ...44

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...46

5.1. Efeitos Biológicos do Tratamento com DMH, DBT e DBTO2 ...46

5.1.1. Hemogramas e Dosagens Séricas de ALT, AST e Amilase ...47

5.1.2. Avaliações Morfológicas Macro e Microscópicas de Tecidos Extraídos Durante a Necropsia ...48

5.1.3. Marcação Imunohistoquímica: CEA e CD44 ...54

5.2. Análise Proteômica ...57

5.3. Identificação de Peptídeos Ligantes à Tecidos Neoplásicos Intestinais de Animais Tratados com DMH, DBT e DBTO2 ...71

5.3.1. Biopanning de Tecido Intestinal ...72

5.3.2. Análise in silico de Peptídeos Selecionados ...73

5.3.3. Síntese de Peptídeos ...75

5.3.4. Isolamento de Proteínas por Afinidade aos Peptídeos Selecionados por Phage Display ...77

6. CONCLUSÕES ...82

(12)

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...86

9. APÊNDICES ...99

9.1. Apêndice A – Contagens Global e Diferencial de Leucócitos para Todos os Animais Tratados ...99

9.2. Apêndice B – Dosagens séricas de AST, ALT e Amilase ...100

9.3. Apêndice C – Análise Estatística Referente a Avaliação Histológica de Intestinos Delgado e Grosso Entre Grupos Controle ...101

9.4. Apêndice D – Dados Obtidos por Espectrometria de Massas para 2D

SDS-PAGE e Cromatografia de Afinidade ...102

9.5. Apêndice E – Western bloting ...155

9.6. Apêndice F – Alinhamento Entre Sequências Peptídicas e Banco de Dados de Proteínas para Rattus norvegicus ...156

(13)

Silva, K.T.S. Resumo

x RESUMO

O alto conteúdo de compostos organossulfurados nos derivados de petróleo compromete sua qualidade; assim, sua remoção ou conversão a substâncias menos tóxicas são importantes etapas durante o processo de refino. Os limites de concentração para esses compostos estão sob rígido controle em diversos países com o objetivo de minimizar seu impacto negativo sobre a saúde animal e o ambiente. Dentre eles, o dibenzotiofeno (DBT) é um hidrocarboneto policíclico aromático que contém um átomo de enxofre em substituição em sua estrutura. Devido à importância dessas moléculas na oncogênese, e a escassez de investigações toxicológicas relacionadas ao DBT, este trabalho propôs realizar uma avaliação dos efeitos tóxicos e moleculares promovidos por um tratamento crônico de ratos Wistar com dose sub-letal (30 mg/kg) de DBT e seu derivado oxidado

DBTO2 (dibenzotiofeno sulfona), ambos administrados durante 10 semanas. Em paralelo,

seus efeitos tóxicos foram comparados com aqueles provocados pelo tratamento com o agente mutagênico clássico, 1,2-dimetilhidrazina (DMH), administrado na mesma dose durante o mesmo período. Na 14ª semana após a última dose, os animais foram sacrificados para uma avaliação inicial da contagem de células sanguíneas e das funções hepáticas e pancreáticas. Não foram observadas alterações nesses parâmetros. Entretanto, análises histopatológicas revelaram lesões de caráter pré-neoplásico nos intestinos dos

animais tratados com DBT e DBTO2 que mostraram-se comparáveis em intensidade e

(14)

Silva, K.T.S. Resumo

mecanismos envolvidos no estabelecimento das lesões encontradas nos animais tratados

(15)

Silva, K.T.S. Abstract

xii

ABSTRACT

The high content of organosulfur compounds in petroleum derivatives compromises their quality and, therefore, their removal or conversion to less toxic substances are important steps during oil refining. The concentration limits of such compounds in fuels are under strict control worldwide with the aim to minimize their negative impact upon animal health and the environment. Among them, dibenzothiophene (DBT) is a polycyclic aromatic hydrocarbon containing a sulfur atom replacing a carbon in the main structure. Given the importance of such molecules during oncogenesis and the scarcity of toxicological investigations related to DBT, this work proposes an evaluation of the toxic effects promoted by a chronic treatment of Wistar rats with a sub-lethal dose (30 mg/kg)

of DBT and its oxidized derivative DBTO2 (dibenzothiophene sulfone), both

administered during 10 weeks. In parallel, their toxicological effects were compared to those inflicted by treatment with the classic mutagenic compound, 1,2-dimethylhydrazine (DMH), given at 30 mg/kg for the same period. At the 14th_{week after the last dose, the}

animals were sacrificed for the initial evaluation of blood cell counts and assessment of hepatic and pancreatic functions. We have observed no alterations in either blood cell parameters or indication of liver and spleen injuries. However, pre-neoplastic lesions in the small intestine of DBT and DBTO2 treated animals were comparable in intensity and

(16)

Silva, K.T.S. Lista de Abreviaturas

LISTA DE ABREVIATURAS

µg- micro gramas µL- micro litros µm- micro metros

2D SDS-PAGE- Eletroforese bidimensional em

gel de poliacrilamida

ACF- Focos de criptas aberrantes ACN- Acetonitrila

ACTB- Actina subunidade beta

ADH- Álcool dehidrogenase

AHR- Receptor aril hidrocarbono

AKR1B1- Aldose redutase

Akt- Proteína quinase B

ALDOA- Aldolase A

ALT- Alanina amino transferase

ANOVA- Análise de variância

ANXA2- Anexina 2

ANXA5- Anexina 5

AOM- Azoximetanol

APC-Adenomatous polyposis coli

ARHGDIA- Inibidor de dissociação Rho-GDP

AST- Aspartato amino trasnferase ATIC- Biossíntese de purina bifuncional

BAX- Proteína associada a BCL2

Bcl2- B-cell CLL/lymphoma 2

Bmi- BMI polycomb ring finger oncogene CA- Carbohydrate antigen

CALR- Calreticulina

CANX- Calnexina

CCA- Centro de Ciência Animal

CCR- Câncer colorretal

CCT6- Proteína complexo T1 sub. zeta

CD44-Cluster of differentiation 44

CEA- Carcinoembrionic antigen

CEUA- Comissão de ética no uso de animais

CFL- Cofilina

c-Jun- Protooncogene jun

CK1- Caseína quinase 1

CKB- Creatina quinase B

CMPK- Citidina monofosfato quinase

c-Myc- Protooncogene myc

CORO1A- Coronina 1A

COX2- Ciclooxigenase

CYP450- Citocromo P450

DMF- Dimetilformamida

DMH- 1,2-Dimetilhidrazina

DNA- Ácido desoxiribonucleico DPP7- Dipeptidil peptidase Dvl- Dishevelled

Dyrk1-Dual-specificity tyrosine-(Y)-phosphorylation regulated kinase 1A E1A- Fator de transcrição E1A E2F- Fator de transcrição E2F

EEF2- Fator de elongação EEF2

EGFR- Receptor de fator de crescimento

epidermal

ENO1- Enolase alfa

EZR- Ezrina

FAK- Quinase de adesão focal

FDR- False Discovery rate

FITC- Isotiocianato de Fluoresceína Fz- Frizzled

GAPDH- Gliceraldeído 3-fosfato dehidrogenase

GLI- Fator de transcrição GLI

GLUT- Receptor de glicose

GNB2L1- Proteína ligante de nucleotídeo guanina

GSK3- Glicogênio sintase quinase 3 HBP- 2-Hidróxibifenil

HDAC- Histona deacetilase

HE- Hematoxilina/Eosina Hh- Hedgehog

HPA- Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos

HPAS- Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos

sulfurados

HPLC- Cromatografia Líquida de Alta Pressão

HRP- Horseradish peroxidase

HSP70- Heat shock protein 70

HSP90B1- Endoplasmina

HSPA2- Heat shock protein HSPA2

HSPA5- Heat shock protein HSPA5

IARC- Agência internacional para pesquisa em

câncer

IGF-IIR- Receptor de fator de crescimento tipo insulina 2

IGG2A- Imunoglobulina gama 2A

INCA- Instituto Nacional do Câncer

(17)

Silva, K.T.S. Lista de Abreviaturas

xiv

LRP6- Lipoprotein receptor related protein 6

LUM- Lumican

M- Molar

MAM- Metil azoximetanol

MCPT1- Protease de mastócitos

mM- mili molar mm- milímetro

MS- Espectrometria de Massas mTORC1-

MYL- Miosina cadeia leve ng- nanogramas

NHS- N-hidroxisuccinimida

NICD- Porção terminal do receptor Notch NL- Não linear

NuA4- Histona acetiltransferase

OPAS- Organização Pan-Americana de Saúde

p/v- peso/volume

p53- Proteína tumoral p53

PAF- Polipose adenomatosa familiar

PBSS- Tampão Fosfato de Sódio com Salina

PGAM1- Fosfoglicerato mutase 1

PGK1- Fosfoglicerato quinase pH- potencial hidrogeniônico

PIC- Coquetel de inibidores de protease PIP- Fosfatidil inositol fosfato

PKM2- Piruvato quinase

PNLIP- Triacilglicerol lipase ppm- Partes por milhão

PRDX1- Peroxiredoxina 1

Ptch- Proteína Patched

PTEN- Phosphatase and tensin homolog

PVDF- Polyvinylidene fluoride

Rac- Rho-GTPase Raf- Quinase Raf

Ras- GTPase

RBBP4- Proteína ligante de histona RBBP4

RBP-JK- Recombining binding protein supressor

of hairless

RFESD- Proteína Rieske Fe-S

RNA- Ácido ribonucleico SAGA- Histona acetiltransferase SDS- Duodecil sulfato de sódio

SELENBP- Proteína ligante de selênio 1

SOD- Superóxido dismutase

STAGA- Histona acetiltransferase

TAGLN- Transgelina

TBST- Tampão Tris-HCL com Tween 20

TCF- Fator T celular TF- Transferrina

TFA- Ác. Trifluoroacético

TFTC- TAT-binding protein free TAF-containing

complex

TGFβ- Fator de crescimento transformador TIMP-1- Tissue inhibitor of metalloproteinases TIP60- Histona acetiltransferase

TKT- Transcetolase

TNM- Estadiamento tumoral

TPM- Tropomiosina

TRA1- Proteína associada a transcrição 1 UI- Unidades internacionais

UICC- Union for International Cancer Control

v/v- volume/volume

VDAC2- Canal aniônico voltagem dependente

VEGF- Fator de crescimento vascular endotelial

WDR1- Repetição WD

WHO- World Health Organization

(18)

(19)

Silva, K.T.S. Lista de Figuras

xvi LISTA DE FIGURAS

Figura 01: Distribuição proporcional de óbitos no Brasil por tipo de câncer em 2014 por

sexo...2

Figura 02: Corte histológico de seção do duodeno no intestino delgado mostrando as camadas que compõem o mesmo...5

Figura 03: Corte histológico de seção de intestino grosso mostrando as camadas Mucosa, Submucosa, Túnica Muscular e Serosa além de componentes característicos...5

Figura 04: Sequência adenoma-carcinoma em câncer colorretal...6

Figura 05: Eventos genéticos envolvidos no desenvolvimento do câncer colorretal...7

Figura 06: Via Wnt/β-catenina...10

Figura 07: Diagrama simplificado da via de sinalização Notch e seus possíveis alvos....12

Figura 08: Via de sinalização Hedgehog em vertebrados...13

Figura 09: Via de sinalização PI3K/Akt e vias associadas...15

Figura 10: Vias de sinalização Notch, Wnt, e Hedgehog regulando o destino celular...16

Figura 11: Estruturas químicas dos principais compostos contendo enxofre encontrados no petróleo...19

Figura 12:“Via de metabolismo 4S para DBT”...20

(20)

Figura 14: Biopanning com a biblioteca de peptídeos Ph.D. Seleção de ligantes

específicos...37

Figura 15: Gráfico de acompanhamento de peso dos animais pertencentes aos grupos

controles e testes ao longo de 24 semanas de tratamento/latência...46

Figura 16: A) Fotografia de parte do intestino grosso de animal pertencente ao Grupo III

(Teste DMH 30 mg/kg) onde podem ser observadas as formações de pólipos. B) Fotografia de parte do intestino delgado de animais pertencentes aos Grupos IV e V (Testes DBT 30 mg/kg e DBTO2 30 mg/kg respectivamente) onde podem ser observados pólipos...49

Figura 17: Fotomicrografias de cortes histológicos de intestino delgado e grosso corados

pela técnica de HE...53

Figura 18: Fotomicrografias de cortes histológicos de intestino delgado e grosso corados

pela técnica de imunohistoquímica com anti-CEA e anti CD44 e contra corados com hematoxilina...56

Figura 19: Géis 2D SDS-PAGE 10% representativos da extração de proteínas solúveis

de intestinos delgados dos A) Grupo Controle Óleo (III) e B) Teste DBT (IV)...58

de intestinos delgados dos A) Grupo Controle Óleo (III) e B) Teste DBTO2 (V)...58

de intestinos delgados dos A) Grupo Controle Salina (I) e B) Teste DMH (II)...59

Figura 22: Diferenças nos níveis de expressão proteica dos grupos Teste DBT IV (barras

(21)

xviii

Figura 24: Diferença nos níveis de expressão proteica entre o grupo Teste DMH (II) e o

grupo Controle Salina (I). Os resultados representam a média ± SEM de triplicatas biológicas independentes...67

Figura 25: Mapa de interação proteína-metabólito para proteínas diferencialmente

expressas entre grupos Teste II e Controle I...70

Figura 26: Perfis eletroforéticos representativos em 1D SDS-PAGE 12% de proteínas de

Intestino Delgado (Controle DBT; Teste DBT (D)) e de Intestino Grosso (Teste DBT (G); Controle DMH; Teste DMH) para a verificação da qualidade da extração proteica...71

Figura 27: Fotografias representativas da titulação dos fagos obtidos no último ciclo de

seleção de cada grupo para isolamento das colônias de ER2738 e consequente amplificação e sequenciamento do DNA...73

Figura 28: Alinhamento das sequências peptídicas obtidas após sequenciamento do DNA

dos fagos selecionados randomicamente ao fim do terceiro ciclo de biopanning para os três grupos avaliados...74

Figura 29: Perfis cromatográficos em sistema HPLC dos peptídeos obtidos em fase

reversa...76

Figura 30: Perfis eletroforéticos de 1D SDS-PAGE de extratos proteicos referentes a

grupos Controle e Testes após cromatografia de afinidade...77

Figura 01.A: Contagens global e diferencial de leucócitos provenientes dos grupos

Controles (I e III) e Testes (II, IV e V) ao final do período de tratamento/latência...99

Figura 01.B: Dosagens enzimáticas séricas: A) Razão AST/ALT; B) Amilase

provenientes dos grupos Controles (I e III) e Testes (II, IV e V) ao final do período de tratamento/latência...100

Figura 01.E: Validação dos experimentos de imunohistoquímica e análise proteômica.

(22)

pertencentes aos grupos III, IV e V. B) Western blotting para detecção de CEA, Calnexina

(23)

Silva, K.T.S. Lista de Tabelas

xx LISTA DE TABELAS

Tabela 01: Peptídeos selecionados por Phage display para síntese em fase sólida...40

Tabela 02: Frequência de lesões observadas no intest. grosso dos animais pertencentes

aos Grupos I-V...51

Tabela 03: Frequência de lesões observadas no intest. delgado dos animais pertencentes

aos Grupos I-V...51

Tabela 04: Proteínas identificadas por spot nos géis referentes aos grupos Teste IV e V

que apresentaram alteração na expressão ≥ 1,5 vezes em relação ao grupo Controle III

..

60

Tabela 05: Proteínas identificadas por spot nos géis referentes ao grupo Teste II que apresentaram alteração na expressão ≥ 1,5 vezes em relação ao grupo Controle I...61

Tabela 06: Massas moleculares preditas e observadas para cada peptídeo sintetizado....75

Tabela 01.C: Comparação de frequência das lesões observadas no intestino delgado para

os Grupos Controle Óleo e Controle Salina...101

Tabela 02.C: Comparação de frequência das lesões observadas no intestino grosso para

os Grupos Controle Óleo e Controle Salina...101

Tabela 01.D: Peptídeos sequenciados por proteína identificada através de espectrometria

de massas para os grupos Teste IV e V em relação ao grupo Controle III no experimento empregando 2D SDS-PAGE...102

(24)

Silva, K.T.S. Lista de Tabelas

de massas para as bandas isoladas por cromatografia de afinidade e selecionadas em 1D SDS-PAGE...149

Tabela 01. F: Relação de proteínas que apresentaram região de similaridade com os

(25)

(26)

Silva, K.T.S. Introdução

1- INTRODUÇÃO

1.1. Epidemiologia

Apesar dos avanços tecnológicos, a incidência e a mortalidade por câncer têm aumentado nas últimas décadas. Em 2008, a Agência Internacional para Pesquisa em Câncer (IARC)/Organização Mundial de Saúde (WHO) estimou que ocorreriam 12,4 milhões de novos casos e 7,6 milhões de óbitos por câncer, doença esta que em 2030 será responsável por mais de 11 milhões de óbitos em todo o mundo (UICC 2005; WHO 2007, 2008). No ano de 2014 mais de 220 mil pessoas vieram a óbito no Brasil vítimas desta patologia (Fig. 05) (WHO, 2015).

Figura 01: Distribuição proporcional de óbitos no Brasil por tipo de câncer em 2014 por sexo.

Fonte: (WHO, 2015).

Segundo o Instituto Nacional do Câncer (INCA) o câncer é uma importante causa de doença e morte no Brasil e desde 2003 as neoplasias malignas representam quase 17% dos óbitos de causa conhecida notificados no Sistema de Informações sobre Mortalidade. As estimativas para o ano de 2014 apontaram a ocorrência de 32.600 novos casos de câncer colorretal sendo 15.070 homens e 17.530 mulheres. Além disso, ocorreram mais de 14 mil óbitos por essa neoplasia em 2011 (INCA, 2015).

(27)

3

do total observado nos cinco continentes, como registrou em 2002 a Organização Pan-Americana da Saúde (OPAS) (INCA, 2006).

Diante deste cenário, fica clara a necessidade da continuidade em investimentos no desenvolvimento de ações para o controle do câncer nos diferentes níveis de atuação, como na promoção da saúde, na detecção precoce, na assistência aos pacientes, e na formação de recursos humanos.

1.2. Aspectos Gerais da Oncogênese

Neoplasia (gr. “neo” + “plasis” = neoformação) é o termo utilizado para caracterizar a proliferação local de clones celulares atípicos, sem causa aparente, de crescimento excessivo, progressivo, ilimitado, não coordenado, autônomo, irreversível, e

com tendência a perda de diferenciação celular (Robbins and Cotran, 2010).No entanto,

a persistência do crescimento é resultado de alterações genéticas que permitem a proliferação excessiva e desregulada de forma autônoma; apesar de os tumores geralmente dependerem do organismo hospedeiro para nutrição e suprimento sanguíneo. As anomalias genéticas encontradas no câncer afetam tipicamente três classes gerais de genes (Croce, 2008). Os genes promotores, ou oncogenes (1), os genes supressores de tumor (2) e, os genes envolvidos no reparo do DNA (3). Quando algum desses sofre mutação, os controles genéticos pelos quais eles são responsáveis são perdidos e o processo carcinogênico pode ser iniciado (Vogelstein and Kinzler, 2004; Lea et al., 2007; Croce, 2008).

Desta forma, o câncer é uma doença complexa e multicausal que ocorre como consequência do acúmulo progressivo de mutações nos genes onde os produtos protéicos desempenham importantes papéis no controle da proliferação e diferenciação celular e na apoptose. Usualmente, diversos fatores promotores atuam anteriormente ao desenvolvimento neoplásico e com poucas exceções, uma mutação única não é suficiente para o estabelecimento da doença.

(28)

presentes na superfície das células malignas expressos diferencialmente daqueles das células normais e, em alguns casos, pode ser responsável pelo retardo do crescimento tumoral e de sua progressão (Zbar, 2004).

In vitro, células isoladas do sistema imune têm mostrado serem efetivas contra tumores através de mecanismos como lise osmótica ou apoptose e citotoxicidade celular. In vivo, contudo, os tumores parecem desenvolver mecanismos de escape ao sistema imune. As células neoplásicas podem evadir ao sistema imune por diversas vias, sendo a capacidade de interferência na função das células imunes o principal motivo de falha no controle da progressão tumoral (Dunn et al., 2004; Bellati et al., 2009). Além disso, o papel do microambiente tumoral no reconhecimento e progressão do câncer tem sido cada vez mais estudado, e as interações entre as células imunes, as células tumorais e os componentes moleculares do tumor exercem influência significativa na progressão da doença (Rosenberg et al., 2004).

1.3. Trato Gastrointestinal Inferior

1.3.1. Características Gerais

O trato gastrointestinal inferior está morfologicamente divido em regiões distintas: intestino delgado (duodeno, jejuno e íleo) e intestino grosso (ceco, cólon, reto, canal anal e apêndice). É constituído de várias camadas histológicas dispostas concentricamente e similares em toda a extensão com pequenas modificações e especificações regionais.

(29)

5

Lieberkuhn e grande abundância de células caliciformes quando comparado com o intestino delgado (Fig. 02) (Vries et al., 2010).

Figura 02: Corte histológico de seção do duodeno no intestino delgado mostrando as camadas que compõem o mesmo: Mucosa; Submucosa; Túnica Muscular e Serosa além de Tecido Conjuntivo, Células Caliciformes e Glândulas de Lieberkhunn.

Fonte: Atlas Virtual de histologia UFSM

Figura 03: Corte histológico de seção de intestino grosso mostrando as camadas Mucosa, Submucosa, Túnica Muscular e Serosa além de componentes característicos: Glândulas de Lieberkhunn e Células Caliciformes.

(30)

1.3.2. Câncer Intestinal

Os adenomas constituem os tipos de pólipos mais frequentemente encontrados no intestino delgado, possuindo predileção pelo duodeno distal embora possam ser encontrados em toda a sua extensão. Histologicamente, eles são similares aos adenomas encontrados na região colorretal tendendo a apresentar uma arquitetura de vilos mais pronunciada. Assim como para a região colorretal, o risco de progressão maligna de um adenoma é maior quanto maior for o pólipo (Brosens et al., 2007).

A transformação de células epiteliais normais em adenomas e carcinomas segue, usualmente, um modelo de progressão de estágios histológicos e alterações genéticas e epigenéticas simultâneas (Fearon and Vogelstein, 1990) (Fig. 03). Tais alterações fornecem às células neoplásicas vantagens sob sua expansão clonal e levam à perda da inibição por contato celular, evasão de mecanismos apoptóticos e de interrupção do ciclo celular, aquisição de características do tipo célula tronco, entre outros (Cardoso et al., 2007).

Figura 04: Sequência adenoma-carcinoma em câncer colorretal. A iniciação e progressão da tumorogênese

de uma mucosa normal em carcinoma e metástase é geralmente associada a características morfológicas e histopatológicas.

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7

(ACF). Os ACF são agregados de criptas anormais caracterizados por hiperproliferação, tamanho aumentado, zonas pericrípticas expandidas e fendas alongadas (Rosenberg and Liu, 1995; Papanikolaou et al., 1998; Papanikolaou et al., 2000).

Algumas mutações estágio-específicas que ocorrem no modelo de progressão adenoma-carcinoma-metástase são conhecidas, e incluem alterações no gene supressor

de tumor APC (Adenomatous polyposis coli) (Epitélio Normal  Adenoma), no

proto-oncogene K-ras (presente em adenomas) e no gene supressor de tumor p53 (na transição Adenoma  Carcinoma) (Nambiar et al., 2010). Além disso, outros genes estão significativamente alterados em diferentes classes de tumores e envolvidos na carcinogênese colorretal, no entanto, métodos de classificação e estadiamento do tumor e realização de prognósticos mais robustos e menos invasivos continuam sendo necessidades médicas ainda não atendidas (Fig. 04) (Hoops and Traber, 1997; Nambiar et al., 2010).

Figura 05: Eventos genéticos envolvidos no desenvolvimento do câncer colorretal. A acumulação gradativa de mutações afeta o controle de crescimento, diferenciação e sobrevivência celular. Para o CCR os genes cruciais envolvidos no desenvolvimento de pólipos e câncer para cada etapa são mostrados nas caixas brancas.

Fonte: Adaptado de Simpson and Dorow, 2001.

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quantificação e caracterização de modificações pós-traducionais presentes em proteínas e que influenciam diretamente o funcionamento celular (Wilkins et al., 1996; Cho, 2007). Nesse sentido, a proteômica tem sido utilizada também como nova ferramenta na busca por biomarcadores moleculares para o câncer colorretal (CCR). As alterações na expressão proteica envolvidas na transformação maligna podem ser monitoradas de maneira quantitativa e qualitativa e fornecem valiosas informações que podem ser utilizadas para a obtenção de diagnósticos e prognósticos mais efetivos. Além disso, representam um grande impacto na oncologia clínica, especialmente se o biomarcador pode ser detectado antes dos sintomas clínicos ou se permite um acompanhamento da resposta ao tratamento (Cho, 2007; Alhquist, 2010).

Embora as alterações moleculares relacionadas ao CCR tenham sido extensivamente investigadas, poucos pesquisadores têm descrito as aplicações desses biomarcadores na detecção de estágios primários de diagnóstico e prevenção do câncer. Considerando que o CCR pode ser prevenido se o adenoma for diagnosticado e removido, torna-se necessária a identificação de marcadores capazes de diagnosticar de maneira tecido-específica e precoce as alterações iniciais que ocorrem durante o desenvolvimento desta doença (Chang et al., 2005).

1.3.3. Fatores de Risco e Genéticos

A explicação para os altos índices encontrados para o CCR está na maior

exposição dos indivíduos a fatores de risco cancerígenos. A redeﬁnição dos padrões de

vida, a partir da uniformização das condições de trabalho, nutrição e consumo

desencadeados pelo processo global de industrialização refletem-se no perﬁl

epidemiológico das populações (Montesano and Hall, 2001).

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9

Quanto à influência da alimentação, é sabido que a dieta ocidental caracterizada pelo alto teor de gordura saturada, juntamente com a ingestão excessiva de proteína de origem animal e baixo teor de fibras, está associada a maior potencial carcinogênico. Também são considerados nocivos, os fatores relacionados ao estilo de vida como fumo, sedentarismo, obesidade, consumo excessivo de álcool e ingestão de aminas heterocíclicas e hidrocarbonetos aromáticos (Marques-Vidal et al., 2006).

1.4. Visão Geral de Vias de Sinalização Atuantes no CCR

No cólon humano, cerca de 10 bilhões de novas células são geradas diariamente por progenitoras localizadas na base das criptas. O destino desse novo epitélio é determinado por sinais extracelulares gerados a nível populacional. Tal sinalização extrínseca é realizada por morfógenos, proteínas solúveis que formam gradientes de concentração e atuam de maneira dose dependente induzindo respostas celulares distintas em suas células alvo (Tabata and Takei, 2004).

1.4.1. Via Wnt/β-catenina

A via de sinalização Wnt/β-catenina é altamente conservada em eucariotos e participa de diversos acontecimentos ligados ao desenvolvimento celular. Ela desempenha papéis na proliferação, movimento, estabelecimento da polaridade e decisão do destino celular e manutenção de células tronco. Um dos caminhos mais bem estudados para essa via é caracterizado pela estabilização e acúmulo de β-catenina no citosol, que então migra para o núcleo onde participa da ativação da transcrição de proteínas chave na carcinogênese como c-Myc, VEGF, ciclina D1, entre outras (via canônica) (Krauzova and Korinek, 2014; Markowska et al., 2014; Klimczak, 2015).

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Wnt se liga ao receptor transmembrana Fz (Frizzled) e seu co-receptor LRP6 (Lipoprotein receptor related protein 6). Ocorre a formação de um complexo transmembrana Wnt-Fz-LRP6 e recrutamento de uma terceira proteína chamada Dvl (Dishevelled), que por fosforilação resulta no sequestro do complexo de degradação, inibindo-o (Fig. 06, B) (MacDonald et al., 2009; White et al., 2012).

Figura 06: Via Wnt/β-catenina. A) Na ausência de Wnt, β-catenina é fosforilada pelo complexo formado por Axina, CK1, GSK3 e APC sendo posteriormente reconhecida e ubiquitinada por β-Trcp e direcionada para degradação proteassomal. B) Na presença de ligante Wnt, ocorre a formação de um complexo receptor Fz-LRP6 que sequestra o complexo de degradação inibindo-o e estabilizando a β-catenina presente no citosol que então migra para o núcleo onde co-ativa TCF levando à transcrição dos regulados por esta proteína.

Fonte: MacDonald et al., 2009.

Os mamíferos apresentam 19 formas de proteínas Wnt ricas em cisteína e com peptídeo sinal N-terminal para secreção. Tais proteínas sofrem glicosilação e lipidação antes da excreção e tais modificações têm papel direto na ativação da via. No CCR cerca de 90% dos tumores apresentam alguma mutação em fatores regulatórios da via sendo as

mais comuns aquelas que afetam o gene APC ou CTNNB1 (β-catenina). Tais mutações

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11

O crosstalk entre a via Wnt/β-catenina e outras vias de sinalização ligadas ao desenvolvimento podem modular a via β-catenina no CCR. A proteína de membrana Notch1 pode se ligar à β-catenina ativa e regular negativamente sua função em células

tronco e tumorais. A via Hedgehog também pode regular a via Wnt/β-catenina. Arimura

e colaboradores demonstraram correlação entre a presença do mediador de Hedgehog,

Smoothened (Smo), e aumento da atividade de Wnt/β-catenina em camundongos

mutantes para APC (Arimura et al., 2009).

Por fim, deve-se ressaltar que embora a via Wnt/β-catenina seja essencial na reprogramação celular relacionada ao CCR através do estímulo da expressão gênica de fatores chave, ela possui um efeito transitório e ativo somente nos estágios iniciais da transformação não sendo necessária para a manutenção celular de pluripotência (Klimczak, 2015).

1.4.2. Via Notch

A via Notch é essencial na diferenciação de células caliciformes e células progenitoras, participando da regulação do desenvolvimento e homeostase intestinal. Em humanos e camundongos os ligantes Notch (Jagged1, Jagged2, DLL1, DLL3 e DLL4) ativam os receptores Notch (Notch1-4) levando à transcrição de diversos genes alvo (p21, Hes-1, Dellex, etc) (Fre et al., 2005).

Um ligante Notch presente na membrana de uma célula adjacente liga-se a um receptor presente na célula receptora. A interação receptor-ligante leva à ativação do

complexo enzimático γ-secretase que cliva a região transmembrana do próprio receptor

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Figura 07: Diagrama simplificado da via de sinalização Notch e seus possíveis alvos. Setas para cima

indicam aumento de expressão regulada por Notch e setas para baixo indicam diminuição de expressão

regulada por Notch.

Fonte: Qiao and Wong, 2009.

1.4.3. Via Hedgehog

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13

Figura 08: Via de sinalização Hedgehog em vertebrados. A cascata de Hh é iniciada quando Hh liga-se a

Patch ativando uma segunda proteína transmembrana chamada Smo. Os fatores de transcrição GLI localizados downstream na via de sinalização ativam a transcrição de genes alvo (GLI A). Na ausência de

Hh Ptch inibe a atividade de Smo afetando sua localização na membrana e levando ao processamento proteolítico de proteínas GLI reprimindo a transcrição de genes alvo (GLI R).

Fonte: Adaptado de Gupta et al., 2010.

Os fatores GLI existem como três proteínas separadas: GLI1 e GLI2 que atuam como ativadores transcricionais e GLI3 que atua como repressor transcricional. A expressão de GLI1 é altamente dependente da ativação da sinalização por Hh. Na ausência de Hh, Ptch bloqueia a atividade de Smo e as proteínas GLI são proteoliticamente processadas para gerar o repressor GLIR_{, largamente derivado de GLI3}

que reprime a transcrição. A ligação de Hh a Ptch interrompe a inibição de Smo gerando

o ativador GLIA_{constituído principalmente por GLI2 e ativando a expressão de genes}

(38)

1.4.4. Via PI3K/Akt

A ativação da via PI3K/Akt (fosfatidilinositol-3 quinase) ocorre através da ligação de fatores de crescimento, citocinas ou insulina a um receptor de membrana tirosina quinase, levando à autofosforilação de um domínio intracelular do mesmo. Tal fosforilação permite que ocorram alterações na conformação e subsequente ativação de

PI3K (composta por uma subunidade catalítica – p110 e uma subunidade regulatória –

p85). PI3K promove a transformação de fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2) em fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato (PIP3) que, por sua vez, medeia a fosforilação e ativação de Akt. PIP2 e PIP3 são lipídeos chave responsáveis por mediar respostas celulares ao estímulo por fatores de crescimento ou citocinas, ligação de integrinas, e sinalização via integrina quinase ou quinase de adesão focal (FAK) (Markowska et al., 2014).

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15

Figura 09: Via de sinalização PI3K/Akt e vias associadas. PTEN: Homólogo de fosfatase e tensina deletado no cromossomo 10; PI3K: fosfoinositol 3-quinase; EGFR: receptor de fator de crescimento epidermal; ERK ½: quinase regulada por sinal extracelular ½; FGFR: receptor de fator de crescimento de fobroblasto; HER2: fator de crescimento epidermal humano; IRS-1: substrato para receptor de insulina 1; MEK ½: proteinaquinase ½ ativada por mitógeno; VEGFR: fator de crescimento vascular endotelial.

Fonte: Simpson et al., 2015.

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Figura 10: Vias de sinalização Notch, Wnt, e Hedgehog regulando o destino celular. A) Via Notch: a

interação ligante-receptor promove a clivagem do domínio NICD por γ-secretase e sua translocação para o núcleo com consequente indução da transcrição de genes alvo. B) Via Wnt: estabilização e acúmulo nuclear

de β-catenina que se associa com os fatores de transcrição LCF/LEF e co-ativadores (CBP) ativando a expressão de genes alvo. C) Via Hedgehog: o ligante Hh ativa o receptor Ptch que por sua vez libera o

receptor Smo. Smo então passa a inibir a fosforilação e clivagem de GLI por GSK3, CK1 e PKA promovendo a formação de GLIA_{que ativa a transcrição. Notar que a transcrição de genes por}_Hedgehog ativa a via Notch e a presença de GSK3 3 CK1 do complexo de degradação de Wnt são também

responsáveis por inibir a via Hedgehog por fosforilação de GLI.

Fonte: Malhotra et al., 2011

1.5. Carcinogênese Química

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17

em células neoplásicas. O primeiro estágio da carcinogênese, o de iniciação tumoral, envolve a exposição de células normais a carcinógenos físicos e químicos. Estes carcinógenos causam danos ao DNA e a outras macromoléculas fornecendo às células iniciadas responsividade alterada ao microambiente e vantagem proliferativa. No segundo estágio, a promoção tumoral resulta na proliferação excessiva das células iniciadas e aumenta a probabilidade de ocorrência de danos genéticos adicionais, incluindo mutações endógenas que acumulam na população em expansão. No estágio de progressão tumoral ou terceiro estágio ocorre a aquisição de múltiplas alterações genéticas e multiplicação descontrolada e irreversível das células alteradas (Loeb and Harris, 2008; Irigaray and Belpomme, 2010).

O campo de estudos sobre a carcinogênese química provavelmente teve início com as associações epidemiológicas de ocorrência de tumores com a exposição à fumaça de tabaco realizadas por Hill e Pott no início do século 18. A partir daí, seguiram-se observações de tumores no trato urinário de trabalhadores que mantinham contato com arilaminas nas fábricas européias no final do século 19. Além destes, trabalhos com animais experimentais envolvendo hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPA) derivados de óleos crus serviram desde então como importantes protótipos para o estudo de HPA (Guengerich,2001).

Os HPA representam uma importante classe de poluentes ambientais os quais têm recebido atenção especial pelo fato de alguns de seus componentes demonstrarem forte potencial mutagênico e carcinogênico, além de desempenharem papéis cruciais em três problemas ambientais importantes: poluição do ar, chuva ácida e mudança climática global. Esses compostos estão presentes nos combustíveis fósseis e são formados durante a combustão incompleta e pirólise de matéria orgânica. Eles podem, por exemplo, ser gerados durante incêndios florestais e erupções vulcânicas além de serem constituintes naturais dos óleos crus, alguns tipos de alimentos e produtos petroquímicos. Além disso, podem ser formados pelo gás de cozinha e no tráfego, sendo também uma das diversas classes de carcinogênicos químicos presentes na fumaça de cigarro (Honer, 2001).

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da composição do adsorvente, e da sua afinidade por gordura (Jacob and Grimmer, 1996; Angerer et al., 1997; Schoket, 1999; Strickland and Kang, 1999).

O metabolismo desempenha um importante papel na conversão de carcinógenos químicos em espécies reativas que danificam macromoléculas celulares, interferem com vias de sinalização e que podem causar câncer. Células de cólon humano sabidamente metabolizam HPA. Os níveis induzíveis das enzimas do complexo citocromo P450 (CYP450) podem influenciar no desenvolvimento de tumores nos intestinos grosso e

delgado como consequência da ingestão de HPA (Diggs et al., 2011). Em roedores, a

absorção no trato gastrointestinal ocorre rapidamente e picos destes compostos podem ser identificados no sangue 1-2 horas após a administração (Lipniak et al., 1993).

1.5.1. Dibenzotiofeno e Dibenzotiofeno Sulfona

O petróleo e o carvão são importantes combustíveis fósseis de composição complexa da qual se distinguem quatro famílias de compostos: hidrocarbonetos alifáticos, cíclicos, aromáticos e heteromoléculas contendo átomos de nitrogênio (N), enxofre (S) ou oxigênio (O) na estrutura. Os compostos sulfurados constituem a terceira população presente nesses combustíveis e, devido à sua difícil biodegradabilidade, são considerados compostos recalcitrantes podendo servir como marcadores da poluição gerada por óleo. O dibenzotiofeno (DBT) e seus derivados são os maiores representantes desta classe (Fig. 11) (Kropp et al., 1997; Heilmann et al., 2004).

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19

Figura 11: Estruturas químicas dos principais compostos contendo enxofre encontrados no petróleo. Fonte: Adaptado de Speight, 2002.

Visando uma redução da queima e consequente emissão de compostos sulfurados no ambiente, diversos estudos buscam o desenvolvimento de tecnologias para a remediação do enxofre de combustíveis. A redução dessas substâncias por parte das refinarias revela a preocupação do setor em oferecer combustíveis menos tóxicos e menos poluentes. Neste contexto, o dibenzotiofeno é utilizado na verificação da eficiência de processos de dessulfurização em derivados do petróleo e, apesar disso, poucos relatos sobre sua ação tóxica em mamíferos têm sido apresentados (Leighton, 1989; Kobayashi et al., 2000; Madeira et al., 2008; Scherer et al., 2009).

Trabalhos da década de 80 foram realizados em animais experimentais empregando doses maciças de DBT e derivados por via oral e subcutânea na expectativa de demonstrar efeitos tóxicos. Tais trabalhos estabeleceram a dose letal (DL50) de 470

mg/kg e graves lesões no pâncreas e fígado, congestão pulmonar, edema, e hemorragia intestinal com doses de 335 mg/kg observadas nos ratos que sobreviveram a um tempo maior que 24 horas após a ingestão do DBT. Outros estudos onde foram administrados o DBT e outros análogos ativos de petróleo demonstraram, além dos efeitos citados acima, alterações nos linfonodos mesentéricos e necrose das células do timo (Leighton, 1989).

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carcinogênese química (Aas et al., 2000). Os metabólitos ativos formados a partir de HPA são produtos de reações catalisadas por enzimas CYP450 em particular, pela isoenzima P4501A1 e, embora os níveis basais dessa isoforma sejam baixos em diversos tecidos, ocorre uma indução da sua expressão após a exposição a diversos tipos de HPA (Soontjens et al., 1997; Jones et al., 2000).

Uma das vias de metabolização do DBT inicialmente descrita em espécies de Rhodococcus sp. IGTS8 é chamada de via sulfóxido-sulfona-sulfonato-sulfato ou “Via

4S”. Durante o metabolismo, o DBT sofre a ação de um sistema multienzimático com

três diferentes atividades, que promovem um ataque oxidativo progressivo no grupo tiofênico. A primeira enzima da via é uma monooxigenase que oxida o DBT a 5,5’

-dióxido de DBT (DBTO2) em dois passos; a segunda enzima apresenta atividade similar

(45)

21

Sabe-se que exposições ao DBT presente em ambientes aquáticos podem exercer efeitos em embriões de zebrafish, como por exemplo, promovendo uma curvatura dorsal do tronco e cauda, redução do crescimento, e edemas severos do pericárdio e saco vitelínico. Deformidades similares comumente chamadas de síndrome do saco azul e reduções no nível de incubação concentração-dependentes também foram observadas (Wozny et al., 2010).

Como a dieta é uma das principais fontes de exposição humana e animal a HPA, as células epiteliais intestinais constituem os alvos primários a entrarem em contato com os contaminantes. O metabolismo de HPA pelos citocromos P450 é bem caracterizado e, embora exista evidência considerável de que o fígado de mamíferos pode metabolizar tais substâncias, o metabolismo em tecidos extra-hepáticos como o intestino pode ser de grande importância (Cavret and Feidt, 2005).

O fato de agentes químicos promoverem alterações randômicas no genoma justifica o direcionamento de esforços para a quantificação dessas mudanças, diminuição da exposição a esses agentes e desenvolvimento de alternativas para a quimioprevenção.

1.5.2. 1,2-Dimetilhidrazina

O modelo de indução de CCR utilizando DMH é largamente aplicado por compartilhar similaridades histológicas, morfológicas e moleculares com o câncer esporádico observado em humanos (Chen and Huang, 2009; Rosenberg et al., 2009). Tal substância é metabolizada pelo fígado por diversas reações e intermediários (AOM – azoxymethanol e MAM – methylazoxumethanol), levando à formação do produto final altamente reativo: íon metildiazônio. O intermediário MAM pode ser excretado junto à bile e transportado ao cólon a partir do intestino delgado, ou seguir diretamente às células epiteliais do cólon via circulação na corrente sanguínea. Este metabólito é responsável pela metilação de bases do DNA do tecido epitelial resultando em apoptose, aumento na proliferação e surgimento de mutações nesse tecido (Chang, 1984; Perse and Cerar, 2011).

1.6. Biomarcadores e Câncer

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monitoramento do câncer e aferição da eficácia e segurança de agentes quimioterápicos (Duffy et al., 2003; Cho, 2007). Tais moléculas podem ser divididas pela habilidade de auxiliar na prevenção, promover detecção precoce, estabelecer prognóstico e predizer a resposta do paciente a terapias específicas (McLeod and Murray, 1999; Kulasingam and Diamandis, 2008). A descoberta de biomarcadores também auxilia no entendimento de mecanismos biológicos que ocorrem durante o desenvolvimento e progressão da doença. A ação de circuitos regulatórios e a ocorrência de reações cruzadas entre as vias envolvidas no processo bioquímico de estabelecimento do câncer dificulta o entendimento e predição do funcionamento intracelular. Como nas células normais, a maioria das células tumorais utiliza vias de sinalização redundantes para assegurar a manutenção e viabilidade das funções críticas à sobrevivência (Cho, 2007).

O estadiamento convencional para o CCR não leva em conta a grande variabilidade existente entre os pacientes e, alguns estágios de progressão não podem ser preditos utilizando o critério histopatológico comum (Kahlenberg et al., 2003). Com o avanço das técnicas de análise molecular e uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na tumorogênese, diversos fatores prognósticos moleculares têm sido identificados.

Entre os marcadores proteicos conhecidos, o antígeno carcinoembrionário (CEA) é utilizado atualmente na clínica para prognóstico molecular em câncer colorretal. A concentração sérica desta molécula acima de 5 ng/mL está associada com a recorrência da doença e metástase. O CEA é uma glicoproteína de membrana de alta massa molecular pertencente à superfamília das imunoglobulinas. Esta molécula desempenha papéis na adesão celular, imunidade e apoptose estando implicada na ocorrência de metástase (Duffy et al., 2003; Kahlenberg et al., 2003).

(47)

23

Sendo assim, o entendimento das bases bioquímicas e alterações moleculares envolvidas na carcinogênese pode facilitar a detecção de tumores em estágios iniciais e lesões pré-cancerosas que apresentam risco de sofrer transformações malignas. A detecção pré-sintomática desses estágios iniciais traz grande benefício na redução dos níveis de mortalidade (Alquist, 2010).

1.6.1. Proteômica e Phage Display

As aberrações relacionadas aos tumores afetam os níveis genômicos, transcricionais e pós-transcricionais (Hassaneim et al., 2011). Desde o sequenciamento do genoma humano, vários esforços na aplicação das análises de expressão gênica na pesquisa médica, especialmente em câncer, têm sido realizados. Estudos no nível de expressão gênica resultam em melhor entendimento do comportamento celular tanto nas células normais quanto nas células tumorais (Wulfkuhle et al., 2003). Entretanto, geralmente não há relação direta entre alterações na expressão gênica e níveis de expressão proteica.

As proteínas são os maiores elementos funcionais das células e os estudos de seus perfis de expressão em processos regulatórios podem auxiliar no entendimento das alterações moleculares presentes no câncer. Os estudos de interação de proteínas com outras moléculas, indução e controle de vias metabólicas, proliferação celular, crescimento, apoptose e senescência, oferecem uma visão única de sistemas biológicos complexos (Chuthapisith et al., 2007).

Métodos proteômicos utilizados na identificação de marcadores tumorais tem como objetivo buscar modificações específicas nas proteínas de tecidos tumorais para permitir a realização de tratamentos individualizados para certos tipos de câncer (Simpson and Dorow, 2001). Tradicionalmente, a análise do perfil proteômico de misturas complexas como lisados celulares ou frações sub celulares enriquecidas, envolve a combinação de diversas técnicas de fracionamento com a espectrometria de massas

(MS) para a identificação das proteínas que compõem a amostra (Cecconi and Zamò,

2011).

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proteínas e entender suas interações permite uma maior compreensão das alterações relacionadas ao proteoma tumoral (Sidhu and Koide, 2007).

A tecnologia de apresentação por fagos (Phage Display) consiste na fusão gênica de sequências nucleotídicas que codificam proteínas ou peptídeos ao DNA de um vírus bacteriófago e resultam na expressão heteróloga dessas sequências na superfície do capsídeo viral (Smith, 1985). A construção de uma biblioteca peptídica com sequências aleatórias (geralmente com mais de 1011_{sequências) constitui uma população de ligantes}

com diferentes capacidades de interação com moléculas alvo provenientes de tecidos ou células (Scott and Smith,1990; Sidhu et al., 2000).

Técnicas combinatoriais permitem a seleção imparcial de ligantes em um ensaio funcional sem conhecimento sobre a natureza do alvo na doença. Entretanto, é difícil isolar ligantes específicos devido à complexidade de alvos expressos simultaneamente em um tecido ou população celular. Estudos recentes detectaram um grande número de alvos moleculares super regulados em células tumorais ou associadas a tumores (St Croix et al., 2000; Ruoslahti, 2001; Vogelstein and Kinzler, 2004).

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Silva, K.T.S. Justificativa

2- JUSTIFICATIVA

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Silva, K.T.S. Objetivos

3- OBJETIVOS

3.1- Objetivo Geral

Avaliar as alterações moleculares desenvolvidas após a administração crônica dos hidrocarbonetos policíclicos aromáticos sulfurados Dibenzotiofeno e Dibenzotiofeno Sulfona em ratos Wistar.

3.1.1- Objetivos específicos

A) Avaliar possíveis alterações na estrutura tecidual de órgãos relacionados ao metabolismo de xenobióticos após tratamento com Dibenzotiofeno e Dibenzotiofeno Sulfona;

B) Avaliar alterações na expressão proteica de tecidos intestinais dos animais tratados com Dibenzotiofeno e Dibenzotiofeno Sulfona visando a identificação de marcadores tumorais;

C) Selecionar peptídeos com capacidade de ligação a proteínas com expressão

alterada presentes nos pólipos intestinais resultantes dos tratamentos empregados;

D) Identificar os alvos de ligação dos peptídeos isolados visando um melhor entendimento do mecanismo de indução promovido;

E) Realizar estudos histoquímicos utilizando peptídeos sintéticos que

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Silva, K.T.S. Material e Métodos

4- MATERIAL E MÉTODOS

Este trabalho foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal de Ouro Preto e catalogado sob o protocolo nº: 2010/14. Para a realização do mesmo, o número de animais utilizados assim como o tratamento aplicado restringiu-se ao estabelecido pelos objetivos delineados.

4.1. Material Biológico

4.1.1. Indução de Câncer em Ratos Wistar Tratados com DMH, DBT e

DBTO2

Ratos da linhagem Wistar, machos, com aproximadamente 60 dias de idade, pesando 200-250 g, foram obtidos no Centro de Ciência Animal (CCA) da Universidade Federal de Ouro Preto, sendo mantidos à temperatura ambiente com ração e água ad libitum e ciclo claro/escuro de 12 horas.

Os animais foram divididos em cinco grupos, a saber:

Grupo I: Controle salina (n=5);

Grupo II: Teste DMH 30 mg/kg (n=15);

Grupo III: Controle óleo (n=5);

Grupo IV: Teste DBT 30 mg/kg (n=15);

Grupo V: Teste DBTO2 30 mg/kg (n=10).

Nos animais pertencentes aos grupos I e III administraram-se, respectivamente, injeções intraperitoneais semanais de salina e óleo vegetal durante 10 semanas. Os animais dos grupos II, IV e V receberam injeções de soluções de DMH (Sigma-Aldrich) em salina, DBT e DBTO2 (Sigma-Aldrich) em óleo vegetal na dose de 30 mg/kg no

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30

execução do experimento, os animais foram pesados e avaliados quanto a aparência corporal externa.

Figura 13: Esquema representativo do tempo de tratamento e espera para o desenvolvimento de alterações patológicas nos animais tratados com DMH, DBT e DBTO2.

4.1.2. Necropsia

Decorridos os tempos de injeção e espera, os animais receberam dose letal de associação quetamina 10% e xilazina 2% através de injeção intraperitoneal. Posteriormente, realizou-se a coleta do baço, pulmão, fígado, estômago e intestinos para a realização das análises histológicas, imunohistoquímicas e proteômicas, e do sangue para análise do hemograma, e dosagens de enzimas hepáticas e pancreáticas.

4.2. Análise Histológica

Os segmentos de tecidos biopsiados foram fixados em formol tamponado e posteriormente processados e incluídos em parafina. Para a análise histológica, secções

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4.2.1. Imunohistoquímica: CEA e CD44

A imunohistoquímica foi realizada utilizando-se anticorpos secundários complexados com biotina seguida de estreptavidina ligada à peroxidase para permitir a

revelação. Para tal, secções histológicas de 4 μm fixadas em formol-parafina foram desparafinizadas (lavagens sequenciais em xilol, etanol absoluto, etanol 90%, etanol 80%, etanol 70% e água) e reativadas antigenicamente através do aquecimento das mesmas em micro-ondas (5 ciclos de 3 minutos cada) em tampão citrato de sódio 0,1 M pH 6,0. Lavaram-se as lâminas por 3 vezes de 5 min. cada com tampão fosfato de sódio 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15 M (PBSS). A atividade da peroxidase endógena foi inibida por

incubação com H2O2 3,5% em PBSS por 30 minutos à temperatura ambiente e as lâminas

foram novamente lavadas com PBSS. Bloquearam-se as interações não específicas utilizando leite em pó 14% em PBSS por 30 minutos em câmara úmida. Os anticorpos primários anti-CEA e anti-CD44 foram diluídos separadamente na proporção de 1:1.000

sendo utilizados 100 μL por lâmina incubados a 4º C, overnight em câmara úmida. Após nova lavagem com PBSS os cortes foram cobertos com quantidade suficiente da solução link (anticorpo secundário-biotina) do kit para imunohistoquímica LSAB Universal (Dako), e mantidos por 30 minutos à temperatura ambiente em câmara úmida. Realizou-se a lavagem com PBSS como descrito anteriormente sendo os cortes

cobertos com a solução estreptavidina-peroxidase do kit LSAB, mantidos por mais 30

minutos à temperatura ambiente em câmara úmida.

A formação do precipitado marrom que indica a positividade da reação ocorre

após a adição de solução de cromogêneo DAB 0,05% (3-3’-Diaminobenzidine

Tetrahidrochloride Hidrate – Ambresco) em PBSS acrescido de 0,02% de peróxido de hidrogênio. As lâminas foram contra coradas por imersão em hematoxilina e montadas para avaliação.

4.3. Extração de Proteínas e Análise Proteômica

(57)

32

Potter S (B. Braun Biotech International) por 15 minutos a 1.000 x rpm em banho de gelo, seguido por três ciclos de sonicação de 20 segundos a 25 W, com intervalos de 45 segundos entre cada ciclo (Sonifier 250, Branson). As suspensões resultantes foram centrifugadas a 4ºC e 20.000 x g por 1 hora em centrífuga Mikro 200R (Hettich).

Após a centrifugação, separou-se o sobrenadante contendo a fração solúvel para a realização de eletroforeses uni e bidimensionais e descartou-se os precipitados contendo o debrit celular.

4.3.1. Eletroforese Uni e Bidimensional (1D/2D SDS-PAGE)

Anteriormente à confecção dos géis uni e bidimensionais, fez-se a dosagem de proteínas solúveis obtidas conforme o item 4.3 através de densitometria comparativa de

canaletas (30 μg de Proteínas Solúveis) por meio do software Quantity One versão 4.6.9 (Bio-Rad).

Os extratos proteicos foram analisados por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes (10%, 1D SDS-PAGE) como descrito por

Laemmli em 1970. Para o preparo das amostras, cerca de 30 μg de proteína foram solubilizadas em 10 μL de tampão de amostra (tris-HCl 0,125 M pH 6,8, SDS 4%, glicerol 20%, azul de bromofenol 0,002%) e posteriormente fervidas em banho-maria por 5 minutos. Aplicou-se 20 mA de corrente por gel durante aproximadamente 1,5 horas. Para coloração, utilizou-se solução de Coomassie Brilhant Blue G250 (Coomassie Brilhant Blue G 250 0,2%, Etanol 40%, Ácido Acético 7%) por 2 horas e descoloração do background com solução de Ácido Acético 7% e Etanol 10% overnight. As imagens dos géis foram capturadas utilizando-se o scanner ImageScanner III (GE Healthcare).

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A separação de proteínas por massa molecular (segunda dimensão - 2D SDS-PAGE) foi realizada em gel de poliacrilamida 10%. A eletroforese foi conduzida a 50 V/gel nos primeiros 10 minutos e, posteriormente a 100 V/gel por aproximadamente 2 horas. Para a coloração, utilizou-se Coomassie Brilhant Blue G 250 Coloidal (Sigma-Aldrich) (três lavagens de 20 minutos cada com solução de ácido fosfórico 2% e etanol 30%; seguidas de adicionais três lavagens de 10 minutos com solução de ácido fosfórico 2%; e coloração em solução de ácido fosfórico 2%, etanol 18% e sulfato de amônio 15%

contendo Coomassie 0,02%). As imagens foram capturadas com o scanner ImageScanner

III (GE Healthcare) e analisadas através de sobreposição realizada pelo software SameSpots (TotalLab Ltd. v. 20, UK).

4.3.2. Digestão in gel

Após a obtenção dos géis bidimensionais, os spots de interesse (proteínas diferencialmente expressas entre os respectivos grupos Controles e Testes) foram

excisados e transferidos para tubos plásticos de 1,5 mL contendo 300 μL de solução

descorante (etanol 20%, ácido acético 7%) e mantidos a 37º C até a completa

descoloração. Retirou-se a solução descorante e lavou-se cada spot com 500 μL de água

mili-Q para remover o excesso da mesma. Em seguida, lavou-se cada spot por 3 vezes de

5 minutos cada com 300 μL de solução NH4HCO3 20 mM em acetonitrila (ACN) 50%.

Os spots foram desidratados em concentrador a vácuo (Speed Vac System –

Iss110, Thermo) durante 30 minutos e rehidratados com 15 μL de solução de tripsina 0,1

μg/μL (Promega) em NH4HCO3 20 mM. Após 20 minutos retirou-se o excesso de solução

de tripsina e recobriu-se os spots com 40 μL de NH4HCO3 20 mM. Os tubos foram