Atividade Antibacteriana In Vitro de Polímero Hidrofílico com Nanopartículas de Óxido de Cério para Úlceras Infectadas / In Vitro Antibacterial Activity of Hydrophilic Polymer with Cerium Oxide Nanoparticles for Infected Ulcers

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Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n. 8, p. 54842-54850 aug. 2020. ISSN 2525-8761

Atividade Antibacteriana In Vitro de Polímero Hidrofílico com Nanopartículas

de Óxido de Cério para Úlceras Infectadas

In Vitro

Antibacterial Activity of Hydrophilic Polymer with Cerium Oxide

Nanoparticles for Infected Ulcers

DOI:10.34117/bjdv6n8-049

Recebimento dos originais: 08/07/2020 Aceitação para publicação: 07/08/2020

Ellen Caroline Araújo da Silva Graduanda do Curso de Odontologia Instituição: Universidade Federal da Paraíba

Endereço: Cidade Universitária - João Pessoa - PB - Brasil CEP: 58051-900

E-mail: ecaroline710@gmail.com Kauanne Fonsêca de Lima

Cirurgiã-dentista pela Universidade Federal da Paraíba Instituição: Universidade Federal da Paraíba

E-mail: kauannefonseca@gmail.com Alexandre Almeida Júnior

Doutorando pelo Programa de Pós-Graduação em Química da Universidade Federal da Paraíba Instituição: Universidade Federal da Paraíba

E-mail: alexandre_junior.02@hotmail.com Fábio Correia Sampaio

Doutorado em Cariologia pela Universidade de Oslo Instituição: Universidade Federal da Paraíba

E-mail: fcsampa@gmail.com Jocianelle Maria Felix Fernandes Nunes

Doutorado em Odontopediatria pela Faculdade de Odontologia de Pernambuco Instituição: Universidade Federal da Paraíba

E-mail: jocianelle@gmail.com Isabela Albuquerque Passos Farias

Doutora em Biotecnologia em Saúde pela Rede Nordeste de Biotecnologia Instituição: Universidade Federal da Paraíba

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Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n. 8, p. 54842-54850 aug. 2020. ISSN 2525-8761 Endereço: Cidade Universitária - João Pessoa - PB - Brasil

CEP: 58051-900

E-mail: isabelaapassos@yahoo.com.br RESUMO

Os hidrogéis são polímeros hidrofílicos de interesse para curativo de úlceras, pois promovem ambiente úmido, facilitando a atividade imunológica. No tratamento de úlceras infectadas, nanopartículas ganharam atenção pela atividade antimicrobiana. Os objetivos desse estudo foram desenvolver um hidrogel com nanoparticulas de óxido de cério (CeNP) incorporados à sua matriz, determinar a menor concentração capaz de inibir o crescimento de Staphylococcus aureus e Escherichia coli, além de avaliar atividade inibitória de biofilme bacteriano do hidrogel com CeNP. Foram testadas três amostras de hidrogel: G1 0,5%, G2 2,0% e G3 5,0% peso/ peso de CeNP/ poloxamer 407. ANOVA One-way foi aplicado para comparar G1, G2 e G3 entre si e com controles positivo e negativo, e comparação pareada foi feita com teste de Tukey. O nível de significância adotado foi de 5%. Os valores da concentração inibitória mínima do CeNP foi de 22,5 (± 7,07) mg/ mL para S. aureus e 15,8 (± 1,27) mg/ mL para E. coli. Os resultados do biofilme estático demonstraram inibição da formação de biofilme com diferença estatisticamente significante entre os grupos testes G1, G2 e G3 e controle negativo. As nanopartículas de óxido de cério apresentaram atividade antibacteriana contra Staphylococcus aureus e Escherichia coli; O hidrogel com menor concentração de CeNP apresentou efeito inibitório preferencial contra bactéria Gram-negativa em um modelo de biofilme bacteriano, indicando ser material promissor no tratamento de úlceras infectadas.

Palavras-chave: Ação Antimicrobiana, Bactérias, Cério, Hidrogel. ABSTRACT

Hydrogels are hydrophilic polymer of interest for healing wounds because they promote the humid environment, facilitating immunological activity. Nanoparticles have antimicrobial activity. The aims of this study were to develop hydrogel with cerium oxide nanoparticles (CeNP) incorporated into its matrix, to determine the least ability to inhibit the growth of Staphylococcus aureus and Escherichia coli, in addition to evaluating the inhibitory activity of bacterial biofilm of the hydrogel with CeNP. Three types of hydrogel were tested: G1 0.5%, G2 2.0% and G3 5.0% weight/ weight of CeNP/ poloxamer 407. ANOVA One-way was applied to compare G1, G2 and G3 with each other and with positive and negative controls, and comparison performed with the Tukey test. The level of significance adopted was 5%. The minimum inhibitory concentration values for CeNP were 22.5 (± 7.07) mg/ mL for S. aureus and 15.8 (± 1.27) mg/ mL for E. coli. The results of the biofilm showed inhibit of biofilm formation with a statistically significant difference between the G1, G2 and G3 test groups, and negative control. Cerium oxide nanoparticle has antibacterial activity against S. aureus and E. coli; the hydrogel with the lowest concentration of CeNP showed preferential inhibitory effect against Gram-negative bacteria in the bacterial biofilm model, indicated as a promising material in the treatment of infected wounds.

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Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n. 8, p. 54842-54850 aug. 2020. ISSN 2525-8761 1 INTRODUÇÃO

As úlceras crônicas são caracterizadas pela falha no processo de restabelecimento reparativo do sítio injuriado por mais de três meses (AGALE, 2013).

O longo período de tempo do processo de cicatrização resulta em diminuição da qualidade de vida do indivíduo e redução da produtividade, além de elevado custo financeiro, principalmente quando ocorre complicação do quadro clínico por infecção (LEAPER, ASSADIAN, EDMISTON, 2015; NERI et al., 2020).

Diante da realidade da infecção, tem sido investigada a sensibilidade de cepas de Staphylococcus aureus e Escherichia coli a formulações para aplicação tópica em úlceras crônicas, principalmente hidrogéis com nanopartículas (MEKKAWY et al., 2017).

Os hidrogéis são materiais de interesse para curativo de úlceras. Pelo seu alto conteúdo de água promovem ambiente úmido, hidratado, facilitando a atividade imunológica do processo de cicatrização. Entretanto, esse mesmo ambiente hidratado pode facilitar a infecção local, sendo interessante a incorporação de pequenas moléculas no hidrogel com atividade antimicrobiana (VEIGA, SCHNEIDER, 2013).

O hidrogel é polímero hidrofílico unidos em uma rede tridimensional por ligações de associação ou forças coesivas (ZAKARIA et al., 2016). Os copolímeros triblocos solúveis em água de poli (óxido de etileno) (PEO) e poli (óxido de propileno) (PPO), frequentemente designado PEO-PPO-PEO são agentes tensoativos macromoleculares não iônicos denominados poloxamer e comercialmente disponíveis como Pluronics®_{(BODRATTI; ALEXANDRIDIS, 2018).}

O Poloxamer 407 com Sulfato de Gentamicina incorporado em sua matriz foi testado contra bactérias frequentes de infecções. O sistema proporciou manutenção da atividade antimicrobiana do fármaco, concluindo-se que o poloxamer 407 representa abordagem promissora no sistema de liberação para tratamento de infecções tópicas (NNAMANI et al., 2014).

Os fármacos ativos incorporados no hidrogel na forma de agentes antimicrobianos, em oposição aos antibióticos utilizados com frequência, pode ser vantagoso em relação ao aparecimento de resistência aos antibióticos (VEIGA, SCHNEIDER, 2013).

Mekkawy et al. (2017) incorporaram nanopartículas de prata a hidrogéis. A dispersão de nanopartículas apresentou atividade antimicrobiana, e o hidrogel revelou ser eficaz no processo de cicatrização.

A atividade antimicrobiana de nanopartículas inorgânicas incorporadas a hidrogéis está em uma área promissora a ser explorada. Dentre as nanopartículas, o óxido de cério (CeNP) tem potencial interessante de aplicação em úlceras crônicas pela sua atividade antimicrobiana

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(MALLESHAPPA et al., 2015; REDDY YADAV et al., 2016; PELLETIER et al., 2010) e antioxidante (RUBIO et al., 2016).

Assim, as propriedades físicas e químicas do poloxamer 407 e do óxido de cério nanoparticulado justificam a elaboração de um hidrogel com esse agente antimicrobiano para aplicação tópica em úlceras. A hipótese nula do presente estudo foi: o hidrogel com CeNP não possui atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positiva e Gram-negativa em modelo de biofilme.

Os objetivos desse trabalho foram desenvolver e avaliar a atividade antimicrobiana contra Staphylococcus aureus e Escherichia coli de um hidrogel sintético com CeNP para tratamento de úlceras crônicas.

2 METODOLOGIA

Desenvolvimento do hidrogel com nanopartículas de óxido de cério

O polaxamer 407 (Pluronic® 127, Sigma-Aldrich, São Paulo, Brasil) foi dissolvido em água destilada-deionizada (qsp 15 mL) à temperatura de aproximadamente 5°C. A eles foram incorporados gradientes de CeNP (< 25 nm, Sigma-Aldrich, São Paulo, Brasil) na proporção de 0,5% (G1), 1,0% (G2) e 5,0% (G3) peso/ peso de CeNP/ poloxamer 407. A mistura, foi adicionado 5% do veículo propolenoglicol (LabSynth, Diadema, SP) e 0,15% do conservante metilparabeno (LabSynth, Diadema, SP). O processo foi realizado sob agitação lenta e constante em agitador mecânico até total homogeneização da mistura. Em seguida, o hidrogel foi levado a uma câmara fria (5ºC) durante 5 dias para eliminação das bolhas de ar.

Avaliação da atividade antimicrobiana do hidrogel com nanopartículas de óxido de cério Os testes de verificação de atividade antimicrobiana foram conduzidos com cepas de Staphylococcus aureus (ATCC 15656) e Escherichia coli (ATCC 25922) com densidade padronizada na escala 0,5 de Mc Farland.

A concentração inibitória mínima (CIM) da solução foi determinada pelo método de microdiluição em placa de 96 poços de acordo com Committee for Clinical laboratory Standard (COCKERILL, 2012; CLSI, 2015). Duas filas de poços foram preparadas iniciando com CeNP. Cada poço apresentou caldo do meio de cultura, CeNP e inóculo bacteriano (20%) em concentrações decrescentes. A placa foi incubada em estufa microbiológica por 24 h a 37 °C. Após esse período, 35 µL do indicador de oxidação-redução de resazurina (SigmaAldrich, São Paulo, Brasil) foi acrescentado em cada poço. Os poços que mudaram de cor de azul para róseo após 40 minutos de

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contato com corante, apresentam crescimento microbiano. O poço com maior concentração de CeNP que permaneceu azul, representa o valor da CIM.

O biofilme foi formado em discos de celulose de 6 mm em placa de Petri (HAMMOND et al., 2011). Dez microlitros do inóculo bacteriano padronizado foram dispensados em cinco discos de celulose em placa contendo meio de cultura BHI ágar. A superfície da placa foi coberta com quadrado de gaze saturada de hidrogel com CeNP, mantendo os discos em contato direto com a gaze. O mesmo procedimento foi realizado com gaze não tratada (controle positivo) e tratada com pomada antibiótica com Sulfato de Neomicina (ESPERSON®_{N, Sanofi-Aventis, São Paulo). As} placas foram incubadas em estufa microbiológica a 37°C. Após 24 horas, os discos foram imersos em solução salina 0,9% para eliminar os microorganismos não aderidos ao biofilme. Em seguida, os discos foram mergulhados em 1 mL de solução salina a 0,9% e agitados em vórtex 3 vezes por 2 minutos cada, para os microorganismos do biofilme serem liberados na solução. Foi realizada diluição seriada e plaqueada em ágar para contagem de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) após incubação a 37 °C por 24 horas. O número de UFC/disco foi determinado usando a fórmula: UFC contadas x fator de diluição x 100.

Potencial hidrogeniônico

O pH do hidrogel foi avaliado antes de cada teste com fita medidora de pH (Merck, São Paulo) para assegurar sua estabilidade no pH da pele de 5,5.

Análise estatística

Os dados foram conduzidos para banco de dados informatizados. ANOVA One-way foi aplicado para comparar G1, G2 e G3 entre si e com controles positivo e negativo, e comparação pareada foi feita com teste de Tukey. O nível de significância adotado foi de 5%.

3 RESULTADOS

O teste de pH foi feito com fita medidora de pH (Merck, São Paulo) e o resultado obtido foi de ph= 6 para G1, G2 e G3.

A concentração inibitória mínima do CeNP frente as bactérias variaram de 15,8 (± 1,27) mg/mL para E. coli, e 22,5 ± 7,07 mg/ mL para S. aureus (Tabela1).

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Tabela 1 – Concentração inibitória mínima do CeNP e do Cloridrato de Ciprofloxacino contra bactérias frequentes em úlceras crônicas.

Bactéria Cepa Média (± DP) mg/ CeNP

mL Ciprofloxacino Média (± DP) µg/ mL E. coli ATCC 25922 15,8 (± 1,27) 1,4 (± 0,15) S. aureus ATCC 15656 22,5 (± 7,07) 1,2 (± 0,28)

Os resultados do biofilme para S. aureus demonstraram sobrevivência bacteriana de 62,75%, 62,75% e 66,18% para G1, G2 e G3, respectivamente, com diferença estatisticamente significante entre os grupos e controle negativo (p<0,013), bem como entre controle positivo (63,43%) e controle negativo (p< 0,05) (Figura 1).

Para E. coli, verificaram-se menor sobrevivência entre grupos G1(9,48%), G2 (7,29%), G3 (5,82%) com diferença estatisticamente significante entre os grupos e o controle negativo (p < 0,001), bem como entre controle positivo (8,09%) e controle negativo (p< 0,001). Também não foi observada diferença estatisticamente significativa entre os grupos teste e o controle positivo (Figura 1).

Figura 5 – Distribuição do percentual de UFC/mL de acordo com grupos do hidrogel.

Anova, S. aureus, **p<0,013, *p<0,05. Anova, E. coli, **p<0,001, *p< 0,001.

4 DISCUSSÃO

A complicação das úlceras crônicas pela presença de infecção é comum, sendo relevante a discussão de novas alternativas antimicrobianas para manejo e tratamento dessas infecções. Assim, no presente estudo foi desenvolvido um hidrogel incorporado com nanopartículas de Cério.

** ** ** * ** _** _** _* 0 20 40 60 80 100 Controle

negativo G1 G2 G3 Controlepositivo

% U FC/ d isc o S. aureus E. coli

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As nanopartículas de óxido de cério apresentaram atividade antimicrobiana contra S. aureus (MALLESHAPPA et al., 2015; REDDY YADAV et al., 2016) e E. coli (PELLETIER et al., 2010), com preferencial efeito antimicrobiano contra E. coli, pelo menor valor de MIC e menor número de células bacterianas sobreviventes. Sugere-se maior efeito de CeNP contra bactérias Gram-negativas, diferindo de estudo com nanopartículas de prata (AgNP) que possuíram maior efeito em S. aureus sensível, seguido de S. aureus resistente a Meticilina, e menor efeito em E. coli (MEKKAWY et al., 2017).

Diante do efeito das CeNP contra bactérias testadas, foi preparado o hidrogel com polaxamer 407 por possuir bom efeito na liberação do antimicrobiano (MEKKAWY et al., 2017; NNAMANI et al., 2014). Apesar do efeito do hidrogel com sulfato de Gentamicina (NNAMANI et al., 2014) e com AgNP (MEKKAWY et al., 2017) terem sido avaliado com teste de difusão em poços, obtendo resultados satisfatórios, o presente estudo trabalhou com um modelo de análise desenvolvido com o objetivo de verificar a eficácia de um antimicrobiano tópico específico para inibir o desenvolvimento de um biofilme bacteriano em úlceras in vitro (HAMMOND et al., 2011). As amostras com três diferentes concentrações apresentaram o efeito antimicrobiano similar, sugerindo, assim efeito dose não-dependente.

Assim, sugere-se para estudos futuros in vivo o hidrogel com CeNP na menor concentração testada (0,5%) com atividade antimicrobiana em veículo que permite preservação da umidade, libertação controlada de fármacos ativos, biocompatibilidade de tecidos moles e facilidade na dispersão de fármacos em matriz da rede de polímeros (ZAKARIA et al., 2016).

5 CONCLUSÃO

As nanopartículas de óxido de cério apresentaram atividade antibacteriana contra Staphylococcus aureus e Escherichia coli;

O hidrogel com menor concentração de CeNP apresentou efeito inibitório preferencial contra bactéria Gram-negativa em um modelo de biofilme bacteriano, indicando ser material promissor no tratamento de úlceras infectadas.

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Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n. 8, p. 54842-54850 aug. 2020. ISSN 2525-8761 REFERÊNCIAS

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