Efeito da laserterapia prévia sobre o reparo músculo esquelético de rato

Texto

(1)UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO – UNINOVE PROGRAMA DE MESTRADO E DOUTORADO EM CIÊNCIAS DA REABILITAÇÃO DIRETORIA DE SAÚDE. BEATRIZ GUIMARÃES RIBEIRO CARDOSO. EFEITO DA LASERTERAPIA PRÉVIA SOBRE O REPARO MÚSCULO ESQUELÉTICO DE RATO. SÃO PAULO 2013.

(2) BEATRIZ GUIMARÃES RIBEIRO CARDOSO. EFEITO DA LASERTERAPIA PRÉVIA SOBRE O REPARO MÚSCULO ESQUELÉTICO DE RATO. Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Reabilitação da Universidade Nove de Julho, para obtenção do título de mestre.. Orientadora: Raquel Agnelli Mesquita Ferrari. SÃO PAULO 2013.

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(5) DEDICATÓRIA. Aos meus pais, Maria e Luiz, por serem minha base; À minha irmã, Maria Fernanda, por ser meu pilar; E ao meu filho, Felipe, por ser a minha força. Obrigada, amo vocês!.

(6) AGRADECIMENTOS. À Deus, por permitir que eu traçasse novos caminhos e, mesmo com todas as dificuldades, encerrasse mais esse ciclo.. À minha família, especialmente aos meus pais, irmã e filho, por estarem ao meu lado em todos os momentos.. Aos meus amigos, em especial à Deise Araújo, Fernanda Colella, Luiz Henrique Carvalho, Marcelo Paiva, Raphael Cardoso, por permanecerem em minha vida mesmo quando tudo resolvia dar errado.. À minha Orientadora Raquel Agnelli Mesquita Ferrari, por todo o ensinamento, paciência e dedicação nesses dois anos de Mestrado.. Aos alunos Iniciação Científica, especialmente a Mariana Gomes e Tatiane Matarazzo Cantero, por toda a ajuda e auxílio, independente do dia e da hora estavam comigo no laboratório firmes e animadas.. Aos colegas do laboratório, em especial ao Agnelo Neves Alves, Ana Franco, Elis Victor, Gabriela Cardoso, Vinicius Cardoso, por esses dois anos de convivência e aprendizado.. À Universidade Nove de Julho (UNINOVE), por proporcionar essa oportunidade e a infraestrutura necessária para realização desse trabalho.. À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pela concessão da bolsa (2012/11461-5) que permitiu minha dedicação durante esse período, além da viabilização desse trabalho..

(7) “Talvez não tenha conseguido fazer o melhor, mas lutei para que o melhor fosse feito. Não sou o que deveria ser, mas Graças a Deus não sou o que era antes”.. (Marthin Luther King).

(8) RESUMO. O laser de baixa potência (LBP) tem sido utilizado por promover um reparo muscular de melhor qualidade, porém, pouco se sabe sobre seus efeitos quando aplicado previamente. O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos do LBP previamente a lesão muscular sobre o processo de reparo, atividade da metaloprotease de matriz MMP-2 e deposição do colágeno. Foram utilizados 40 ratos Wistar, divididos em 5 grupos: (G1) Controle; (G2) Sham; (G3) Somente irradiação com laser; (G4) LBP previamente à lesão; (G5) Somente lesão. A criolesão consistiu de duas aplicações de bastão resfriado em nitrogênio líquido no músculo tibial anterior (TA). Os grupos 4 e 5 foram avaliados em 1, 3 e 7 dias após a lesão. A irradiação prévia foi realizada com o laser AsGaAl (λ 780nm; 10 J/cm²; 40 mW; 10 segundos por ponto; 8 pontos; 3.2 J) e ao término do protocolo, os músculos TA foram removidos para análise morfológica (coloração com hematoxilina-eosina), colágeno (coloração de Picrosirius) e atividade de MMP-2 pela técnica de Zimografia. Os resultados demonstraram que o LBP aplicado previamente a lesão reduziu o infiltrado inflamatório após 3 dias, mionecrose após 1 e 3 dias, aumentou o número de vasos sanguíneos após 3 e 7 dias e de fibras imaturas após 7 dias. Também aumentou a atividade da MMP-2 e reduziu a deposição de colágeno após 7 dias. Concluindo, o LBP previamente à lesão modulou positivamente o processo inflamatório e reparo muscular, atividade da MMP-2 e organização e deposição do colágeno durante a regeneração muscular.. Palavras-chave: Terapia a laser de baixa potência; Músculo tibial anterior; Regeneração..

(9) ABSTRACT. The low level laser therapy (LLLT) is widely used in order to promote faster and better repair muscle with reference to different types of injury, however, studies on the prior application of the laser are scarce. The aim of this study is to evaluate the effect of LLLT prior to injury on the repair process and the matrix metalloproteinase MMP-2. For that, were used 40 Wistar rats divided into 5 groups: (G1) Control, (G2) Sham; (G3) No lesion with LLLT immediately prior to sacrifice; (G4) LLLT immediately prior to muscle injury TAD; (G5) Only injury without treatment with LLLT. The cryoinjury applications consist of two rod cooled in liquid nitrogen directly into the TA muscle. Groups 4 and 5 were assessed at 1, 3 and 7 days after injury. The LLLT were performed using the GaAlAs laser (λ 780nm) with the density energy of 10 J/cm², output power of 40 mW, time of 10 seconds per point, with 8 points of application and total energy 3.2 J. After treatment, the TA muscles were removed and sections were obtained with the assistance of a microtome for morphology analysis using hematoxylin-eosin and collagen using Picrosirius staining. To assess the activity of MMP-2 is used technique Zymography in the different groups and its characterization technique was used for Western blotting. The results demonstrate that LBP applied prior to induction of the injury caused a reduction of inflammatory cells after 3 days, myonecrosis after 1 and 3 days, an increase of blood vessels after 3 and 7 days and after 7 days immature fibers. There was increased activity of MMP-2 after 7 days and reduced collagen deposition in the same period, with better organization of your arrangement tissue. In conclusion, LBP applied immediately before the injury induced positive effects on the modulation of inflammation and repair muscle activity of MMP-2 and organization and collagen deposition during muscle regeneration.. Keywords: Laser Therapy, Low-Level; Muscle, Skeletal; Regeneration..

(10) ÍNDICE. 1. CONTEXTUALIZAÇÃO ....................................................................... 1.1.. Regeneração muscular e células satélites .................................. 1.2.. Matriz extracelular – importância de seu remodelamento e das. 12 12. metaloproteases de matriz na regeneração muscular ................ 13 1.3.. Importância do colágeno no tecido muscular .............................. 14. 1.4.. Laser de baixa potência .............................................................. 15. 1.5.. Justificativa .................................................................................. 16. 2. OBJETIVOS .......................................................................................... 17. 2.1.. Geral ............................................................................................ 17. 2.2.. Específicos .................................................................................. 17. 3. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................... 18. 3.1.. Animais ........................................................................................ 18. 3.2.. Grupos experimentais ................................................................. 18. 3.3.. Procedimento de criolesão .......................................................... 3.4.. Irradiação laser de baixa potência .............................................. 20. 3.5.. Análise morfológica ..................................................................... 22. 3.6.. Análise de colágeno .................................................................... 23. 3.7.. Zimografia ................................................................................... 23. 3.8.. Análise dos resultados ................................................................ 24. 19. 4. RESULTADOS ..................................................................................... 25 4.1.. Artigo 1 ........................................................................................ 25. 5. CONSIDERAÇÕES FINAIS .................................................................. 46. 6. REFERÊNCIAS .................................................................................... 47 7. APÊNDICES ......................................................................................... 54 7.1.. Comprovante de submissão de artigo para a Revista Fisioterapia e Pesquisa ............................................................... 7.2.. 54. Comprovante de submissão de artigo para a Revista Lasers in Medical Science .......................................................................... 55.

(11) LISTA DE FIGURAS. Figura 1. Demonstração do procedimento de criolesão ............................. 20. Figura 2. Procedimento de irradiação com LBP da região lesionada ....... 22.

(12) LISTA DE TABELAS. Tabela 1. Parâmetros dosimétricos do laser de baixa potência ................ 21.

(13) LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS. µg. Micrograma. µl. Microlitros. µm. Micrometro. AsGaAl. Arseneto de Gálio e Alumínio. CaCl2. Cloreto de cálcio. cDNA. DNA complementar. CK. Creatina quinase. cm2. Centímetro ao quadrado. CO2. Dióxido de carbono. COX-2. Ciclooxigenase 2. CS. Célula satélite. DEPC. Dimetil pirocarbonato. DNA. Ácido desoxirribonucleico. dNTP. Deoxinucleotídeos trifosfatos. EDTA. Ácido etilenodiamino tetra -acético. eV. Eletrón-volt. GAPDH. Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase. HCl. Ácido clorídrico. J. Joules.

(14) J/cm2. Joules por centímetro ao quadrado. LBP. Laser de baixa potência. LDH. Lactato desidrogenase. MEC. Matriz extracelular. mg. Miligrama. mg/ml. Miligrama por mililitro. ml. Mililitro. mM. Milimolar. mm. Milímetro. MMP-2. Metaloproteinase de matriz 2. MMP-9. Metaloprotease de matriz 9. MMPs. Metaloproteases de matriz. MRF4. Fator regulatório miogênico 4. MRFs. Fatores regulatórios miogênicos. mW. Miliwatts. Myf5. Fator miogênico 5. MyoD. Fator de determinação miogênico 1. NaCl. Cloreto de sódio. NaN3. Azida de sódio. nM. Nanomolar. nm. Nanômetros.

(15) ºC. Grau Celsius. PCR. Reação em cadeia polimerase. PCR. Proteína C-reativa. pH. Potencial de hidrogênio. RNA. Ácido ribonucleico. RNAm. Ácido ribonucleico mensageiro. ROS. Espécie reativa de oxigênio. rpm. Rotações por minuto. SDS. Dodecil sulfato de sódio. TA. Tibial anterior. TAD. Tibial anterior direito. TAE. Tibial anterior esquerdo. TGF- β. Fator de crescimento transformador β. TNF- α. Fator de necrose tumoral α. W/cm². Watts por centímetro ao quadrado. ZnCl2. Cloreto de zinco. λ. Comprimento de onda.

(16) 1. CONTEXTUALIZAÇÃO. O músculo esquelético é um tecido dinâmico (Muñoz-Cánoves et al, 2013) composto por fibras musculares e células satélites (CS) embebidas em uma matriz extracelular. (Shi & Garry, 2006) que apresenta excelente. capacidade de regeneração após uma lesão (Souza & Gottfried, 2013). As lesões musculares são comuns, principalmente em atletas (Souza & Gottfried, 2013) e representam de 10 a 55% de todas as lesões no meio esportivo (Kääriäinen et al, 2000), resultando em afastamento aos treinos e competições por longas semanas e comprometendo o desempenho dos atletas (Almekinders, 1999). Essas lesões são causadas, em sua maioria, por traumas diretos (Palacio et al, 2009; Almeida et al, 2013), sendo 90% delas, contusões ou estiramentos (Järvinen et al, 1993; Fernandes et al, 2011),. 1.1.. Regeneração muscular e Células Satélites (CS) A regeneração muscular envolve a reação inflamatória, ativação e. proliferação de células precursoras, síntese e degradação de elementos que constituem a matriz extracelular, degradação de tecido necrótico, deposição de colágeno e remodelamento (Tidball, 2005; Baptista et al, 2011; Souza et al, 2011). Durante o processo inflamatório, ocorre vasodilatação, aumento da permeabilidade. vascular,. estase. sanguínea,. aderência. das. células. inflamatórias através de moléculas de adesão e recrutamento de citocinas devido ativação inflamatória das células endoteliais (Sprague et al, 2009). Além disso, há infiltração de neutrófilos que fagocitam detritos celulares e fibras necróticas induzindo a ativação de CS (Grounds et al, 2002; Tidball, 2010). As CS são células precursoras miogênicas indiferenciadas que permanecem quiescentes entre a lâmina basal e o sarcolema das fibras musculares (Zammit et al, 2004; Buckingham & Montarras, 2008) e estão diretamente envolvidas com o crescimento e a regeneração muscular (Lindstrom, 2010; Tidball, 2010). Após uma lesão, as CS são ativadas e uma pequena quantidade de células regressa ao estado quiescente para restabelecer a população de CS (auto-renovação) (Hawke et al, 2001; Chargé 12.

(17) & Rudnicki, 2004; Tedesco et al, 2010), enquanto a maioria migra para o local da lesão (Tidball et al, 2010). Então elas se proliferam, sendo denominadas mioblastos (Muñoz-Cánoves et al, 2013), que se diferenciam e se fundem gerando células musculares multinucleadas (miotubos) jovens que se diferenciam para formar fibras musculares funcionais ou se fundirem a fibras pré-existentes (Pallafacchiana et al, 2010), reparando o tecido muscular lesionado (Yin et al, 2013). As CS, quando ativadas, expressam diversos fatores regulatórios miogênicos (MRFs) durante os diferentes estágios da miogênese, envolvidos no processo de proliferação e diferenciação celular (Assis et al, 2013). Os MRFs primários (MyoD e Myf5) são necessários para determinação e proliferação dos mioblastos e são expressos em estágio inicial (Chargé & Rudnicki, 2004; Buckingham et al, 2006; Shi & Garry, 2006; Vatansever et al, 2012). Já os MRFs secundários miogenina e MRF4 são importantes para a diferenciação terminal das células satélites e a fusão celular, sendo expressos nos estágios mais tardios (Chargé & Rudnicki, 2004; Relaix et al, 2006; Zammit et al, 2006; Vatansever et al, 2012).. 1.2.. Matriz extracelular - Importância de seu remodelamento e das metaloproteases de matriz na regeneração muscular A matriz extracelular (MEC) é uma estrutura dinâmica que fornece. suporte e proteção para as fibras musculares, estabilização para o tecido muscular (Carmignac & Durbeej, 2012) e permite a transmissão da força de contração muscular (Kragstrup et al, 2011), desempenhando um papel importante na regeneração muscular (Kjaer et al, 2004; Washington et al, 2011). A MEC é composta por colágenos, fibronectina, elastina, proteoglicanos e laminina (Cornelison et al, 2008; Mann et al, 2011) e seu remodelamento, que é um processo que envolve a síntese e degradação de seus componentes (Zimowska et al, 2008), é realizado por enzimas dependentes de cálcio e zinco chamadas metaloproteases de matriz (MMPs) (Nelson et al, 2000; Barnes et al, 2009; Rodríguez et al, 2010; Hadler-Olsen et al, 2011). No músculo esquelético, é demonstrada uma específica participação da MMP-2 (gelatinase A) e MMP-9 (gelatinase B) no remodelamento da MEC 13.

(18) (Chen et al, 2009). A MMP-2 está diretamente relacionada à regeneração e maturação das fibras musculares esqueléticas (Alameddine et al, 2012) uma vez que atua na degradação de colágeno do tipo IV modulando sua deposição e permitindo sua melhor organização no tecido (Chang et al, 2001; Kjaer et al, 2004; Prakobwong et al, 2007; Chen et al, 2009). Já a MMP-9, além de degradar a matriz durante a reação inflamatória, ativa as CS no início da regeneração muscular (Chen et al, 2009). Dessa forma, as MMPs são importantes durante a regeneração muscular por degradarem os componentes da lâmina basal, facilitando a migração, proliferação e diferenciação das CS (Zimowska et al, 2008), além de permitirem a angiogênese, importante para um reparo muscular de melhor qualidade (Mann et al, 2011; Assis et al, 2013).. 1.3.. Importância do colágeno no tecido muscular O colágeno é um dos componentes da MEC e seu tipo é classificado. de acordo com sua localização e função. O colágeno do tipo I é encontrado no tecido conjuntivo denso (epimísio) e tem como função estabilizar a arquitetura do tecido. Já o colágeno do tipo III é abundante no tecido conjuntivo frouxo (perimísio) e tem importante função elástica (Souza et al, 2011). O colágeno do tipo IV é o principal componente da lamina basal (Visse et al, 2003) e tem um papel importante no arranjo tecidual (Kjaer et al, 2004, Lampe & Bubhby, 2005). No músculo esquelético, o colágeno mantém a integridade funcional das fibras musculares e auxilia na transmissão da força durante a contração muscular, por isso a correta organização e distribuição das fibras colágenas são necessárias para uma melhor funcionalidade do tecido muscular (Gillies et al, 2011). Quando há uma lesão, uma rápida resolução do dano tecidual requer uma sequencia bem organizada dos eventos que ocorrem durante a reação inflamatória e qualquer perturbação em um desses eventos resulta em ineficiência da regeneração muscular caracterizada pela persistência da degeneração das fibras musculares, inflamação e fibrose (Mann et al, 2011). A fibrose é uma condição patológica onde há acumulo excessivo de componentes da MEC, especialmente de colágeno, resultando em permanente 14.

(19) cicatriz tecidual que reduz a capacidade e desempenho muscular (Mann et al, 2011; Souza & Gottfried, 2013).. 1.4.. Laser de baixa potência Na prática clínica, o laser de baixa potência (LBP) é um recurso. terapêutico muito utilizado para promover de forma mais rápida e de melhor qualidade o reparo muscular frente aos diferentes tipos de lesão (Peplow et al, 2010). Existem diversos tipos de laser, sendo os mais usados os que se encontram na porção óptica do espectro vermelho (400 a 780 nm) e do infravermelho (780 a 1 mm), sendo que seus fótons de energia são inferiores a 2,0 elétron-volt (eV) e, por isso, não são capazes de induzir mutação e carcinogênese por não atingirem a energia necessária para quebrar a ligação das moléculas biológicas e do DNA (Moore et al, 2005). Estudos utilizando o LBP demonstram efeitos positivos na modulação da resposta inflamatória, reparo muscular e deposição de colágeno em excesso, além de aumento da atividade de MMP-2 quando aplicado após a indução da lesão (Mesquita-Ferrari et al, 2011(a); Baptista et al, 2011; Souza et al, 2011; Assis 2012; Assis, 2013; Alves, 2013). No estudo de Baptista et al (2011) foi demonstrado que a irradiação com LBP após lesão muscular promoveu incremento no processo de reparo evidenciado pelo aumento de colágeno IV após 7 dias. No estudo de Souza et al, (2011) foi verificado aumento significativo de fibras colágenas dos tipos I e III após 7 dias no grupo tratado com laser após criolesão além de aumento da angiogênese e redução da mionecrose. Utilizando também o LBP, Mesquita-Ferrari et al (2011(a)) verificaram que houve uma modulação na expressão de citocinas uma vez que este causou diminuição na expressão de TNF-α após 1 e 7 dias, e de TGF- β após 7 dias. Alves et al (2013) verificaram que a aplicação do LBP após a criolesão teve um efeito positivo no processo inflamatório, na atividade da MMP-2 e na organização e distribuição do colágeno na regeneração muscular. Contudo há poucos estudos que avaliaram os efeitos do LBP quando aplicado previamente. a. uma. lesão.. Esta. situação. é. de. extrema. relevância. especialmente quando consideramos indivíduos nos quais o risco de lesão é 15.

(20) sempre eminente, como ocorre na prática desportiva. Estudos em animais (Lopes-Martins et al, 2006; Almeida et al, 2011) e humanos (Leal-Junior et al, 2009(a); Leal-Junior(b) et al, 2009; Baroni et al, 2010, Marchi et al, 2012) têm demonstrado que o uso do laser previamente a indução de fadiga muscular tem diminuído o nível de lactato sanguíneo por melhorar sua remoção, além de redução do processo inflamatório, proteína C-reativa (PCR) e Creatina Kinase (CK). Lopes-Martins et al (2006) demonstraram que o laser aplicado antes da indução de fadiga muscular por meio de estimulação elétrica previne seu desenvolvimento no músculo TA de ratos durantes as repetições tetânicas. Almeida et al (2011) demonstrou que o LBP aplicado imediatamente antes à indução de fadiga muscular melhorou o desempenho muscular e reduziu a expressão de ciclooxigenase-2 (COX-2). Leal-Junior et al (2009(a)) avaliaram o feito do LBP infravermelho aplicado imediatamente antes da indução de fadiga em atletas e observaram redução de CK e de lactato sanguíneo. Baroni et al (2010) observaram que o tratamento com LBP antes do exercício reduziu CK e LDH e atenuou a diminuição da força muscular. Marchi et al (2012) demonstraram que o LBP antes do exercício de corrida aumentou o desempenho muscular e reduziu o estresse oxidativo e o dano muscular.. 1.5.. JUSTIFICATIVA Há grande interesse no estabelecimento de recursos e terapias a. serem utilizados na tentativa de proporcionar uma regeneração muscular de melhor qualidade e menor duração e, com esse intuito, muitos estudos sobre a utilização do LBP foram realizados. Contudo, até o momento, foi avaliado o efeito do laser somente após a lesão muscular e, os estudos sobre aplicação prévia do laser foram, na sua maioria, em humanos e na condição de estudar a fadiga muscular. Desta forma, com o presente estudo, objetivamos verificar se o LBP pode ser um importante recurso terapêutico a ser utilizado previamente em indivíduos que, frequentemente, estão sujeitos a lesão muscular como os atletas, minimizando os danos causados por essas lesões.. 16.

(21) 2. OBJETIVOS. 2.1.. Geral . Analisar efeitos da irradiação com LBP (λ 780nm) previamente à criolesão do músculo esquelético de rato.. 2.2.. Específicos . Avaliar os efeitos da aplicação do LBP previamente à lesão sobre os aspectos morfológicos durante o processo de reparo do músculo esquelético de rato após criolesão.. . Avaliar os efeitos da irradiação prévia do LBP na deposição e organização de colágeno no músculo esquelético.. . Avaliar os efeitos da irradiação prévia do LBP sobre o remodelamento da MEC por meio da análise da atividade de MMP-2 no músculo esquelético de rato em processo de reparo, após criolesão.. 17.

(22) 3. MATERIAL E MÉTODOS. Os experimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes do Conselho Nacional para o Controle de Experimentação Animal (CONCEA) e Comitê de Ética em Pesquisa Animal da Universidade Nove de Julho (UNINOVE) (aprovação AN0016/2012).. 3.1.. Animais Foram utilizados 40 ratos (Rattus norvegicus) Wistar machos mantidos. no biotério da UNINOVE em caixas plásticas apropriadas, temperatura ambiente de 22°C, umidade relativa de 40%, luminosidade controlada com ciclo de 12h (claro/escuro) e comida e água ad libitum.. 3.2.. Grupos experimentais Os. animais. foram. distribuídos. aleatoriamente. em. 5. grupos. experimentais: I.. Grupo controle: os animais não foram submetidos a nenhum procedimento, com remoção bilateral do músculo tibial anterior (TA) (n= 5);. II.. Grupo Sham: submetidos ao procedimento de exposição do músculo TA (n= 5);. III.. Grupo irradiado com LBP: irradiação com LBP imediatamente antes à eutanásia, no músculo TA esquerdo (TAE) sem criolesão dos animais que compõem o Grupo irradiado com LBP e lesionado (n= 5);. IV.. Grupo somente lesão: foi realizada a criolesão no músculo TA direito (TAD) sem a irradiação prévia com LBP (n= 15);. V.. Grupo irradiado com LBP e lesionado: Foi realizada irradiação com LBP imediatamente antes da criolesão no músculo TAD (n= 15).. 18.

(23) Os animais do Grupo somente lesão e Grupo irradiado com LBP e lesionado foram eutanasiados em 1, 3 e 7 dias. Os animais do Grupo Controle e Grupo Sham foram eutanasiados no primeiro dia do experimento e,. os. animais. do. Grupo. irradiado. com. LBP. foram. eutanasiados. imediatamente após a irradiação com laser. As amostras musculares foram destinadas a análise morfológica por análise histológica (HE - coloração com Hematoxilina e Eosina), deposição de colágeno pela coloração de Picrosirius, além da atividade da MMP-2 utilizando a técnica de Zimografia.. 3.3.. Procedimento de criolesão O procedimento de criolesão foi realizado após os animais serem. anestesiados com injeção intraperitonial de anestésico geral injetável a base de Ketamina 10% (0,2 ml/100 gramas do animal) e de Xilazina 2% (0,1 ml/100 gramas do animal). Para aplicação da anestesia foram utilizadas seringas da marca BD 100 Unidades com Agulha BD Ultra-Fine®, modelo insulina com a agulha Ultra-Fine® (regular), comprimento: 12,7 mm, calibre: 0,33 mm e bisel trifacetado. Após a anestesia, foi realizada a tricotomia (Figura 1) e, em seguida, a irradiação com LBP imediatamente antes da realização da criolesão (Figura 2). O músculo TA foi exposto cirurgicamente e a criolesão realizada por meio de duas aplicações (duração de 10 segundos cada), utilizando bastão metálico (3 mm com extremidade plana) previamente resfriado em nitrogênio liquido, diretamente na superfície ventral do músculo. Após o procedimento, foi realizada a sutura das áreas incisadas utilizando-se fio de poliamida (5.0) e os animais foram mantidos em gaiolas com aquecimento para prevenir a hipotermia, conforme figura 1. O modelo de criolesão utilizado está de acordo com o descrito na literatura (Miyabara et al, 2005; Baptista et al, 2011; Souza et al, 2011; Alves et al, 2013).. 19.

(24) Figura 1: Demonstração do procedimento de criolesão desde a tricotomia e exposição do TA até a sutura.. A criolesão foi o modelo de lesão escolhido por ser bem conhecido e altamente reprodutível, capaz de reproduzir a resposta natural do músculo frente a lesões, bem como a sua capacidade de regeneração. Dessa forma, esse modelo para indução da lesão muscular foi o escolhido para este estudo por produzir lesões com características homogêneas, com área bem definida, de forma limpa, além de visualização macroscópica observada pela cor branca que se desenvolve na superfície ventral do músculo, causando menor variabilidade na severidade da lesão (Baptista et al., 2011, Assis et al, 2012; Alves et al, 2013).. 3.4.. Irradiação laser de baixa potência A irradiação laser foi realizada com base nos parâmetros (Tabela 1). descritos por Alves et al, 2013; sendo utilizado o Twin Laser® (MM Optics, São Carlos – SP, Brasil).. 20.

(25) Tabela 1: Parâmetros do laser de baixa potência. Meio ativo. Arseneto de Gálio e Alumínio (AsGaAl). Comprimento de onda. 780 nm. Área do feixe. 0,04 cm2. Potência média. 40 mW. Densidade de potência. 1 W/cm2. Densidade de energia. 10 J/cm2. Energia por ponto. 0.4 J. Total de pontos. 8 pontos. Tempo por ponto. 10 segundos. Tempo total. 80 segundos. Energia total. 3.2 J. Foi realizada a irradiação do laser imediatamente antes da criolesão no Grupo irradiado com LBP e lesionado e imediatamente antes da eutanásia no Grupo irradiado com LBP, sendo realizada a eutanásia dos grupos experimentais nos períodos determinados. Os animais do Grupo irradiado com LBP receberam irradiação diretamente sobre a área correspondente ao local dos animais do Grupo irradiado com LBP e lesionado, sendo oito pontos de irradiação na região do músculo TA na área lesionada, conforme descrito previamente (MesquitaFerrari et al, 2011(a); Baptista et al, 2011). Utilizamos a técnica de irradiação pontual diretamente sobre a pele que recobre o músculo TA (Figura 2). Para evitar refração do feixe, o laser foi aplicado em ângulo de 90 graus entre o emissor e a pele do animal. No início e final do procedimento experimental, a potência de emissão de luz do laser foi aferida utilizando o “LaserCheck power meter” (Coherent, Santa Clara,CA, USA).. 21.

(26) Figura 2. Irradiação com LBP realizada previamente à criolesão. (A) Equipamento utilizado; (B) Pontos irradiados; (C) Realização da irradiação.. Ao término do protocolo proposto, os animais foram submetidos à eutanásia por superdose de anestésico e os músculos TA foram removidos e seccionados transversalmente em duas partes no centro da lesão (Durigan et al, 2008) para a análise morfológica, de deposição e distribuição de colágeno e detecção da atividade da MMP-2.. 3.5.. Análise morfológica Amostras dos músculos foram coletadas, fixadas em formol tamponado. 10%, incluídas em parafina e espécimes foram cortados transversalmente com 10 µm de espessura por meio de um micrótomo (Leica RM2125, Nussloch, Alemanha).. Foi utilizada a coloração com hematoxilina-eosina (HE) para. exame histológico de rotina realizada sob microscopia de luz convencional (Zeiss Axioplan 2, Alemanha). A análise qualitativa dos cortes histológicos corados com HE incluiu uma descrição das fases da reparação de tecidos, envolvendo a presença de infiltrado inflamatório, mionecrose, fibras musculares imaturas (núcleo centralizado) e vasos sanguíneos maduros (Alves et al, 2013). Para análise quantitativa, cinco áreas correspondentes à região da lesão foram fotografadas com auxílio de microscópio de luz convencional (Zeis s Axioplan 2, Alemanha). As imagens foram analisadas utilizando o plug-in “Count Cells” do software Image J (National Institute of Health - NIH, EUA). Foram contabilizadas as células inflamatórias totais, mionecrose, vasos sanguíneos maduros e fibras musculares imaturas (núcleo centralizado), por. 22.

(27) área.. Três cortes de cada animal foram examinados e os dados foram. submetidos à análise estatística.. 3.6.. Análise de colágeno Cortes adicionais foram corados com Picrosirius Red (Sigma, St. Louis,. MO, EUA), seguindo o método descrito por Junqueira et al (1982) e foram examinados com auxílio de microscópio de luz polarizada Pol-Interferencial Photomicroscope (Modelo 61282, Carl Zeiss, Alemanha). As imagens também foram analisadas pelo programa Image J (NIH, EUA), no qual a área relativa ocupada pelo colágeno foi calculada em relação à área total do corte, conforme descrito por Hadi et al (2011) e Alves et al (2013).. 3.7.. Zimografia O extrato tecidual do músculo TA foi testado quanto à presença de. atividade proteolítica, conforme descrito por Cleutjens et al (1995). As amostras musculares de aproximadamente 50 mg foram lavadas duas vezes em solução salina e, então, homogeneizadas em 2ml de tampão de extração (10 mM de ácido cacodílico, pH 5,0, 150 mM de NaCl, 1 μM de ZnCl2, 20 mM de CaCl2, 1.5 mM de NaN3, e 0.01% de Triton X-100) com contínua homogeneização no gelo por um período de aproximadamente 5 minutos. O conteúdo proteico total foi estimado usando o reagente Bradford (BioRad Laboratories, Hercules, CA, EUA) de acordo com o método descrito por Bradford (1976). Para o ensaio enzimático, 100 µg de proteínas foram resolvidas por eletroforese em gel de poliacrilamida (10%) com 1 mg/ml de gelatina bovina (SigmaAldrich, St Louis, EUA). Após a eletroforese, o gel foi lavado 3 vezes durante 20 minutos em solução 2,5 % de Triton X-100 para remoção do SDS e incubado no tampão de substrato (50 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 5 mM de CaCl2, 10 mM de ZnCl2 e 0,02 % de NaN3), a 37ºC, durante aproximadamente 20 horas. Após este tempo, o gel foi corado com Coomassie Blue por 30 minutos, descorado com ácido acético: metanol: água (1: 4: 5) para visualização das bandas de atividade. Para documentação, o gel foi escaneado e analisado. Foi utilizado o software Image J (NIH) para a quantificação das bandas de 23.

(28) atividade proteolítica do gel por densitometria (quantidade em pixels). Em seguida, esses valores foram convertidos em unidades arbitrárias a partir do valor obtido no grupo controle.. 3.8.. Análise dos resultados Os valores foram testados quanto a sua normalidade pelo teste. Kolmogorov-Smirnov e os dados foram expressos em média e desvio-padrão, pois aderiram à curva de Gauss. A comparação entre os grupos foi realizada pela ANOVA, por serem dados paramétricos. O Teste de contraste (Pós-Hoc) utilizado foi o Tukey. Os resultados foram considerados estatisticamente significantes se p≤ 0,05. Os dados foram analisados por meio do programa BioStat 5.0.. 24.

(29) 4. RESULTADOS. 4.1.. Artigo 1. Laserterapia prévia sobre o reparo músculo esquelético de rato Ribeiro-Cardoso BG1, Alves AN2, Cantero TM3, Fernandes KPS4, França CM5, Teixeira DF6, Bussadori SK4, Mesquita-Ferrari RA4 1. Mestranda em Ciências da Reabilitação, Universidade Nove de Julho –. UNINOVE, São Paulo – SP, Brasil. 2. Doutorando em Ciências da Reabilitação, Universidade Nove de Julho –. UNINOVE, São Paulo – SP, Brasil. 3. Aluna de graduação, Universidade Nove de Julho – UNINOVE, São Paulo –. SP, Brasil. 4. Docente dos Programa de Mestrado e Doutorado em Ciências da. Reabilitação e em Biofotônica aplicada as Ciências da Saúde, Universidade Nove de Julho – UNINOVE, São Paulo – SP, Brasil. 5. Docente do Programa de Mestrado e Doutorado em Biofotônica aplicada às. Ciências da Saúde, Universidade Nove de Julho – UNINOVE, São Paulo – SP, Brasil. 6. Docente do Departamento de Exatas, Universidade Nove de Julho –. UNINOVE, São Paulo – SP, Brasil.. Autor para correspondência: Raquel Agnelli Mesquita-Ferrari Departamento de Pós Graduação, Mestrado em Ciências da Reabilitação; Universidade Nove de Julho – UNINOVE Rua Vergueiro, 349, CEP 01504001, São Paulo – SP, Brasil Tel (11) 3385-9222. Título para as páginas: Laser prévio e reparo muscular 25.

(30) RESUMO. O laser de baixa potência (LBP) é muito utilizado com intuito de promover de forma mais rápida e de melhor qualidade o reparo muscular frente aos diferentes tipos de lesão, porém, os estudos sobre a aplicação prévia do laser ainda são escassos. O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos do LBP aplicado previamente a lesão muscular sobre o processo de reparo, atividade da metaloprotease de matriz MMP-2 e deposição do colágeno. Foram utilizados 40 ratos Wistar, divididos em 5 grupos: (G1) Controle; (G2) Sham; (G3) Sem lesão com LBP imediatamente antes ao sacrifício; (G4) LBP imediatamente antes da lesão; (G5) Somente lesão sem tratamento com LBP. A criolesão consistiu de duas aplicações de bastão resfriado em nitrogênio líquido diretamente no músculo tibial anterior (TA). Os grupos 4 e 5 foram avaliados em 1, 3 e 7 dias após a lesão. Foi utilizado para o tratamento o laser AsGaAl (λ 780nm) com densidade de energia de 10 J/cm², potência de 40 mW, tempo de 10 segundos por ponto, sendo 8 pontos de aplicação e energia total de 3.2 J. Ao término do tratamento, os músculos TA foram removidos e cortes histológicos foram obtidos com auxílio de micrótomo para análise da morfologia utilizando a coloração com hematoxilina-eosina e de colágeno utilizando coloração de Picrosirius. Para a avaliação da atividade de MMP-2 nos diferentes grupos avaliados foi utilizada a técnica de Zimografia. Os resultados demonstram que o LBP aplicado previamente a indução da lesão causou redução de células inflamatórias após 3 dias, mionecrose após 1 e 3 dias, aumento de vasos sanguíneos após 3 e 7 dias e de fibras imaturas após 7 dias. Houve aumento da atividade da MMP-2 após 7 dias e redução da deposição de colágeno nesse mesmo período, com melhor organização de seu arranjo tecidual. Em conclusão, o LBP aplicado imediatamente antes da lesão induziu efeitos positivos sobre a modulação do processo inflamatório e reparo muscular, atividade da MMP-2 e organização e deposição do colágeno durante a regeneração muscular.. Palavras-chave: Terapia a laser de baixa potência; Músculo tibial anterior; Regeneração. 26.

(31) INTRODUÇÃO. As lesões musculares representam de 10 a 55% de todas as lesões no meio esportivo1, sendo 90% delas causadas por contusões ou estiramentos 2,3, resultando em afastamento dos atletas aos treinos e competições por um longo período4,5. Após uma lesão muscular, as células satélites (CS) são ativadas, migram para o local da lesão6 e se proliferam, sendo denominadas mioblastos7, que se diferenciam e se fundem gerando células musculares multinucleadas (miotubos) jovens que se diferenciam para formar fibras musculares funcionais ou se fundirem a fibras pré-existentes8, reparando o tecido muscular lesionado9. As CS são células precursoras miogênicas indiferenciadas que permanecem quiescentes entre a lâmina basal e o sarcolema das fibras musculares10 e estão diretamente envolvidas com o crescimento e a regeneração muscular6,11. A matriz extracelular (MEC) é uma estrutura dinamica que fornece suporte e proteção para as fibras musculares, estabilização para o tecido muscular12, e a transmissão da força de contração muscular13. A MEC é composta por colágenos, fibronectina, elastina, proteoglicanos e laminina14,15 e seu remodelamento é realizado por enzimas dependentes de cálcio e zinco chamadas metaloproteases de matriz (MMPs)16,17,18, sendo que no músculo esquelético há específica participação das enzimas MMP-2 (gelatinase A) e MMP-9 (gelatinase B)19. Dessa forma, as MMPs são importantes durante a regeneração muscular por degradarem os componentes da lâmina basal, facilitando a migração, proliferação e diferenciação das CS20,21, além de permitirem a angiogênese, importante para um reparo muscular de melhor qualidade15,22. E na busca por recursos terapêuticos que modulem o processo inflamatório e melhore o reparo muscular, temos hoje vários estudos com o laser de baixa potência (LBP) demonstrando efeitos positivos na modulação da resposta inflamatória, reparo muscular, deposição de colágeno em excesso e atividade da MMP-2 quando aplicado após a indução da lesão22,23,24,25,26,27. Contudo, poucos estudos avaliaram os efeitos do LBP quando aplicado 27.

(32) previamente a uma lesão. Esta situação é de extrema relevância, especialmente quando consideramos indivíduos nos quais o risco de lesão é sempre eminente, como ocorre na prática desportiva. Estudos em animais 28,29 e humanos30,31,32,33 têm demonstrado que o uso do laser previamente a indução de fadiga muscular causou diminuição do nível de lactato sanguíneo por melhorar sua remoção, redução do processo inflamatório e dano muscular. Dessa forma, o objetivo do presente estudo foi investigar os efeitos da aplicação prévia deste recurso sobre os aspectos morfológicos do tecido muscular após a criolesão, além da quantificação de colágeno e análise da atividade gelatinolítica da MMP-2.. MATERIAIS E MÉTODOS. Os experimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes do Conselho Nacional para o Controle de Experimentação Animal (CONCEA) e Comitê de Ética em Pesquisa Animal da Universidade Nove de Julho (UNINOVE) (aprovação AN0016/2012). Foram utilizados 40 Wistar machos mantidos no biotério da UNINOVE em caixas plásticas apropriadas, temperatura ambiente de 22°C, umidade relativa de 40%, luminosidade controlada com ciclo de 12h (claro/escuro) e comida e água ad libitum. Durante o período experimental, os animais foram divididos em 5 grupos experimentais: Grupo controle (n=5); Grupo Sham - apenas submetidos ao procedimento de exposição do músculo tibial anterior direito (TAD) (n=5); Grupo irradiado com LBP - irradiação com LBP no músculo tibial anterior esquerdo (TAE) imediatamente antes a eutanásia dos animais que compõem o Grupo irradiado com LBP e lesionado; Grupo somente lesão (n= 15); Grupo irradiado com LBP e lesionado (n=15). O grupo controle foi eutanasiado no primeiro dia após o início do experimento. O Grupo irradiado com LBP foi eutanasiado imediatamente após a aplicação do recurso. O Grupo somente lesão e o Grupo irradiado com LBP e lesionado foram eutanasiados nos períodos de 1, 3 e 7 dias após a indução da lesão.. 28.

(33) Procedimento de criolesão Os animais foram anestesiados com administração intraperitoneal de 1 ml/kg de 10% ketamina e 2% xilazina. Então, foi realizada incisão cirúrgica e exposição do músculo TA seguida da criolesão que foi realizada por meio de duas aplicações (duração de 10 segundos cada com intervalo de 30 segundos entre elas) com bastão metálico de 3 mm e extremidade plana resfriado em nitrogênio liquido, na superfície ventral do músculo TA23,24,27,34. Após o procedimento, foi realizada a sutura das áreas incisadas utilizando-se fio de poliamida (5.0) e os animais mantidos em gaiolas com aquecimento para prevenir a hipotermia.. Irradiação laser de baixa potência A irradiação laser foi realizada com base nos parâmetros (Tabela 1) descritos por Alves et al (2013)27, sendo utilizado o Twin Laser® (MM Optics, São Carlos – SP, Brasil). Foi realizada a irradiação do laser imediatamente antes da criolesão no Grupo irradiado com LBP e lesionado e imediatamente antes da eutanásia no Grupo irradiado com LBP.. Tabela 1: Parâmetros do laser de baixa potência. Meio ativo. Arseneto de Gálio e Alumínio (AsGaAl). Comprimento de onda. 780 nm. Área do feixe. 0,04 cm2. Potência de saída. 40 Mw. Densidade de potência. 1 W/cm2. Densidade de energia. 10 J/cm2. Energia por ponto. 0.4 J. Total de pontos. 8 pontos. Tempo por ponto. 10 segundos. Tempo total. 80 segundos. Energia total. 3.2 J. 29.

(34) Utilizamos a técnica pontual diretamente sobre a pele que recobre o músculo TA. Para evitar refração do feixe, o laser foi aplicado em ângulo de 90 graus entre o emissor e a pele do animal. No início e final do procedimento experimental, a potência de emissão de luz do laser foi aferida utilizando o “LaserCheck power meter” (Coherent, Santa Clara, CA, USA). Ao término do protocolo proposto, os animais foram submetidos à eutanásia por superdose de anestésico e os músculos TA removidos para análise.. Análise morfológica As amostras musculares do TA foram fixadas em formol e incluídas em parafina, na sequência foram obtidos cortes transversais utilizando micrótomo (Leica RM2125, Nussloch, Alemanha). Os cortes foram submetidos à coloração com hematoxilina-eosina (HE) e analisados com microscopia de luz convencional (Zeiss Axioplan 2, Alemanha). Foram realizadas análises qualitativas e quantitativas dos aspectos relacionados à inflamação e reparo do tecido muscular. Na análise qualitativa foi dado enfoque a presença de infiltrado inflamatório, mionecrose, fibras musculares imaturas e vasos sanguíneos. Para a quantificação destes aspectos, foi realizado o registro fotográfico de cinco áreas de cada corte, conforme descrito por Alves et al (2013)27, e contagem do número de células inflamatórias totais, mionecrose, vasos sanguíneos e fibras musculares imaturas com auxílio do software Image J (National Institute of Health - NIH, EUA). Os resultados das cinco áreas do mesmo corte foram somados; três cortes de cada animal foram examinados. Os dados foram submetidos à análise estatística.. Análise de colágeno por coloração com Picrosirius Os cortes obtidos das amostras musculares foram corados com Picrosirius Red (Sigma, St. Louis, MO, EUA)35 e examinados e fotografados com. auxílio. de. microscópio. de. luz. polarizada. Pol-Interferencial. Photomicroscope (Modelo 61282, Carl Zeiss, Alemanha). As imagens também foram analisadas pelo programa Image J (NIH, EUA), conforme descrito por Hadi et al (2011)36 e Alves et al (2013)27. 30.

(35) Análise de atividade gelatinolítica pela técnica de Zimografia O tecido muscular (50 mg) foi submetido a homogeneização em tampão de extração contendo ácido cacodílico conforme descrito por Alves et al (2013). O conteúdo proteico total foi estimado usando o reagente Bradford (BioRad Laboratories, Hercules, CA, EUA) de acordo com o método descrito por Bradford (1976)37. O extrato tecidual do músculo TA foi testado quanto à presença de atividade proteolítica, conforme descrito por Cleutjens et al (1995)38. As amostras musculares foram resolvidas por eletroforese em gel de poliacrilamida (10%) com 1 mg/ml de gelatina bovina (SigmaAldrich, St Louis, EUA). Em seguida, o gel foi lavado com Triton X-100 para remoção do SDS e incubado em tampão de substrato a 37ºC, durante 20 horas sendo na sequência corado (Coomassie Blue) e descorado (ácido acético: metanol: água) para visualização das bandas líticas. O gel foi escaneado e a quantificação das bandas de atividade proteolítica foi realizada utilizando o software Image J (NIH). Os valores foram convertidos em unidades arbitrárias considerando o Grupo Controle igual a um27.. RESULTADOS. Análise morfológica qualitativa e quantitativa A quantificação dos achados permitiu verificar que a irradiação prévia com LBP induziu uma redução significativa no número total de células inflamatórias e mionecrose após três dias (p≤0,01) (Figura 1A e B) e uma redução da mionecrose após um dia (p≤0,01) (Figura 1B) quando comparado aos grupos criolesionados sem irradiação prévia nos respectivos períodos. Observou-se, também que após 3 e 7 dias (p≤0,01), houve um aumento significativo no número de vasos sanguíneos (Figura 1C) e após 7 dias (p≤0,01) um aumento no número de fibras musculares imaturas (Figura 1D) no grupo lesionando que recebeu foi irradiado previamente com LBP. Com base nos achados histológicos foi possível verificar que nos músculos do Grupo Controle não foram evidenciados sinais de inflamação e alterações na localização de mionúcleos e formato das fibras. Estes aspectos também foram 31.

(36) verificados para o Grupo irradiado com LBP sem lesão (dados não mostrados) e sham. Já nos grupos Lesão (1 e 3 dias) foram evidenciados moderado infiltrado inflamatório e mionecrose. Na presença da irradiação prévia com LBP, os músculos destes mesmos períodos de análise apresentaram uma redução da mionecrose, além de redução do infiltrado inflamatório após 3 dias. Após 7 dias, o grupo irradiado previamente à lesão apresentou aumento de vasos sanguíneos e de fibras imaturas em relação ao grupo somente lesão (Figura 2).. 32.

(37) Figura 1. Análise quantitativa dos aspectos morfológicos do tecido muscular nos diferentes grupos experimentais: (A) número total de células inflamatórias (B); mionecrose (C); número de vasos sanguíneos (D); número de fibras imaturas.. Os. valores. estão. expressos. em. média. e. desvio. padrão. (ANOVA/Tukey). #p≤0,01 comparado com o grupo criolesionado sem irradiação prévia com LBP.. 33.

(38) Figura 2. Cortes histológicos dos músculos TA, irradiados ou não com LPB prévio, corados por HE nos diferentes períodos avaliados. 34.

(39) Análise qualitativa e quantitativa das fibras colágenas A análise dos cortes corados por Picrosirius permitiu verificar uma distribuição uniforme e organizada das fibras colágenas no grupo controle, especialmente em região de perimísio e endomísio, sendo evidenciados estes mesmos aspectos no grupo somente irradiado com LBP e grupo sham. A irradiação prévia não alterou a organização e distribuição deste após 1 e 3 dias não havendo diferença estatística quando realizada a quantificação da concentração do colágeno (Figura 3). Após 7 dias, houve uma melhor distribuição e organização das fibras de colágeno no grupo que recebeu irradiação prévia com LBP em comparação ao grupo que somente foi submetido a lesão (Figura 4), sendo este fato comprovado pela quantificação do colágeno (p≤0,01) (Figura 3) que evidenciou redução significativa na concentração de colágeno no grupo irradiado previamente com LBP e avaliado neste período.. Figura 3. Quantificação da área de fibras colágenas em porcentagem. Os valores foram expressos em média e desvio padrão (ANOVA/ Tukey). *p≤0,01 quando comparado ao grupo controle. # p≤0,01 quando comparado ao grupo somente lesão.. 35.

(40) Figura 4. Cortes histológicos dos músculos TA, irradiados ou não com LPB prévio, corados por Picrosirius.. 36.

(41) Análise da atividade da MMP-2 Foram detectadas pela técnica de zimografia duas bandas líticas correspondentes as formas pró (72 kDa) e ativa (64 kDa) da. MMP-2 nas. amostras musculares analisadas (Figura 5A). Os resultados permitiram verificar que houve um aumento significativo na atividade da banda Pró nos grupos lesionados com e sem irradiação prévia (p≤0,05) em comparação aos grupos controle, sham e LBP nos períodos de 1, 3 e 7 dias. Após 1 dia, foi possível verificar uma redução significativa na atividade da MMP-2 Pró no grupo irradiado previamente com LBP e lesionado quando comparado ao grupo somente lesionado (p≤0,05). Após 7 dias observou-se a presença de duas bandas líticas da MMP-2 nos grupos lesionados com e sem irradiação prévia, sendo que o grupo irradiado com LBP e lesionado apresentou um aumento significativo tanto na atividade da banda lítica Pró quanto da banda Ativa quando comparado ao grupo somente lesionado, respectivamente (p≤0,05) (Figura 5B).. Figura 5. Detecção da atividade gelatinolítica em amostras musculares (100ug) dos diferentes grupos experimentais analisados utilizando Zimografia.. (A). Detecção das bandas referentes às formas Pró e Ativa da MMP-2 (~72 e 64 37.

(42) kDa, respectivamente) nos diferentes grupos experimentais. Padrão de peso molecular (P), Grupo controle (C), grupo sham (Sh), grupo somente irradiação laser (LBP); grupo lesionado sem tratamento (L) e grupo irradiado com LBP e lesionado (LBP+L).. (B) Quantificação das bandas líticas por densitometria. após 1 dia, 3 e 7 dias. Os dados foram expressos em média e desvio padrão (ANOVA/Tukey).. *p≤0,05 comparados ao grupo controle, sham e LBP;. #p≤0,05 comparados ao grupo somente lesão.. DISCUSSÂO E CONCLUSÃO As lesões musculares, comuns no esporte, frequentemente levam a perda de função muscular e queda da qualidade de vida em atletas 39. Desta forma, a busca por recursos terapêuticos que favoreçam o reparo muscular torna-se cada vez mais evidente. Estudos analisando os efeitos do LBP durante o processo de regeneração muscular frente a diferentes tipos de lesão, tais como por veneno de serpente40, trauma41, criolesão24,25,27 têm sido descritos na literatura demonstrando efeitos positivos para o reparo muscular. Dourado et al (2011)40 avaliaram o efeito dos lasers vermelho e infravermelho (comprimento de onda 632,8 nm (HeNe) e 904 nm (GaAs), densidade de energia 4 J/cm²) aplicado após indução da lesão com veneno de serpente e observaram aumento da angiogênese e diminuição de neutrófilos após 3 dias. Souza et al (2011)25 utilizou o LBP após a criolesão (comprimento de onda 660 nm, potência de saída 20 mW, densidade de energia 5 J/cm²) e demonstraram aumento da angiogênese e redução da mionecrose no músculo esquelético de rato após 7 dias. Almeida et al (2013)41 demonstraram que o LBP (comprimento de onda 810 nm, potência de saída 100 mW, energia 1, 3 e 9 J) aplicado após trauma em músculo esquelético de rato diminuiu os danos morfológicos causados pela lesão após 6, 12 e 24 horas. Nosso grupo de pesquisa demonstrou em estudo prévio27 utilizando os mesmos parâmetros dosimétricos adotados no presente estudo que o LBP após criolesão reduziu o infiltrado inflamatório e a mionecrose após 1 dia, aumentou o número de vasos sanguíneos após 3 e 7 dias assim como aumentou o número de fibras musculares imaturas e da atividade. gelatinolítica. da. MMP-2. após. 7. dias, além de. melhorar a. organização e distribuição das fibras colágenas após 7 dias. 38.

(43) No presente estudo, que utilizou o LBP previamente a lesão aguda, foram encontrados resultados semelhantes aqueles verificados pela aplicação pós lesão, uma vez que foi demonstrada uma redução do infiltrado inflamatório após 3 dias e da mionecrose após 1 e 3 dias, aumento de vasos sanguíneos após 3 e 7 dias e de fibras imaturas após 7 dias, além de aumento da atividade de MMP-2 e redução na deposição de colágeno após 7 dias, sugerindo que a irradiação com LBP prévio pode promover um reparo muscular mais eficiente e de melhor qualidade. Mais especificamente com relação ao remodelamento da MEC e participação das MMPs foi demonstrado que o LBP (comprimento de onda 660 nm, potência de saída 20 mW, densidade de energia 5 J/cm²) aplicado após criolesão em músculo esquelético de rato reduziu a expressão de TNF-α após 1 e 7 dias e de TGF-β após 7 dias23, sendo o TGF-β associado a formação de tecido cicatricial durante a regeneração muscular e regulação da produção de enzimas que inibem a degradação da MEC15. No presente estudo, houve melhor organização das fibras colágenas com redução significante de sua deposição no grupo irradiado com LBP e lesionado após 7 dias associado com o aumento da atividade da MMP-2 após esse mesmo período, demonstrando que a irradiação com LBP imediatamente antes da criolesão pode ser um útil recurso terapêutico para prevenção de fibrose. A MMP-2 está diretamente relacionada com a regeneração muscular por estar envolvida com a síntese e degradação da MEC20, principalmente colágeno15, facilitando a migração, proliferação e fusão de mioblastos e promovendo a formação de novos vasos sanguíneos19, além de evitar uma deposição excessiva dos componentes da MEC (fibrose). Esse resultado é importante, principalmente no meio esportivo, uma vez que o acúmulo excessivo de componentes da MEC, especialmente de colágeno, pode resultar em redução de desempenho muscular15. O LBP aplicado previamente possui efeito protetor em músculo saudável por influenciar a atividade celular por meio da estimulação ou inibição de funções químicas e fisiológicas39. Esse efeito protetor possivelmente ocorre por aumento da atividade mitocondrial e dos componentes da cadeia respiratória que induz a aumento na síntese de ATP e AMPc39,42,43. Dias et al (2011)44 utilizaram diferentes doses de LBP no músculo masseter de rato e demonstraram um aumento de metabolismo oxidativo e de MMP-2 e 39.

(44) relacionaram estes achados ao aumento na quantidade de mitocôndria e síntese de ATP. No estudo de Wagatsuma et al (2011)45 foi realizado um bloqueio mitocondrial em músculo de rato seguido de criolesão e constatou-se que houve retardo na regeneração muscular evidenciando a importância da biogênese mitocondrial para este processo. Alguns estudos demonstraram efeitos positivos da aplicação prévia do LBP em situação de fadiga muscular sendo evidenciados efeitos como redução de creatina quinase (CK)29,30,32,33,46, de lactato sanguíneo30,46, de lactato desidrogenase (LDH)32,33, do estresse oxidativo33, aumento do desempenho muscular29,47,48, além de atenuação na diminuição da força32 e da fadiga muscular28,31,48. Além disso, foi verificado que o LBP aplicado previamente a indução de fadiga causou redução do processo inflamatório por diminuição na expressão de mRNA da ciclooxigenase 2 (COX-2)29. A modulação positiva da inflamação e enzimas relacionadas ao dano muscular pela aplicação do LBP previamente pode explicar os achados evidenciados no presente estudo. O LBP estimula a atividade da mitocôndria que sintetiza ATP e espécies reativas de oxigênio (ROS)43, sendo que ROS em combinação com fatores de crescimento e quimiocinas, participa de uma cascata de eventos relacionada a regeneração muscular redirecionando as células satélites para o local lesionado, mas se níveis elevados de ROS permanecem por longo período no local da lesão, levam a dano oxidativo e interferem negativamente na diferenciação de células musculares 49. Dessa forma, os resultados obtidos no estudo sugerem que o LBP tenha modulado positivamente a atividade mitocondrial e síntese de ATP e ROS. Em conclusão, os resultados do presente estudo demonstram que o LBP aplicado previamente à indução da lesão modulou positivamente o processo inflamatório e de reparo muscular, a atividade da MMP-2 e a organização e deposição do colágeno durante a regeneração muscular, sugerindo que esse recurso possa ser um grande aliado como intervenção terapêutica principalmente no meio esportivo onde o risco de lesão muscular é iminente.. Agradecimentos:. à. FAPESP. pelo. apoio. financeiro. (2011/17638-2;. 2012/11461-6). 40.

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