NATAÇÃO DE ALTA INTENSIDADE REDUZ NOCICEPÇÃO SOMÁTICA INDUZIDA POR GLUTAMATO PELA ATIVAÇÃO DE RECEPTORES ACOPLADOS A PROTEÍNA G / INIBIÇÃO DA PROTEÍNA CINASE A
PALHOÇA 2015
ALINE SITENESKI
NATAÇÃO DE ALTA INTENSIDADE REDUZ NOCICEPÇÃO SOMÁTICA INDUZIDA POR GLUTAMATO PELA ATIVAÇÃO DE RECEPTORES ACOPLADOS A PROTEÍNA G / INIBIÇÃO DA PROTEÍNA CINASE A
Dissertação de Mestrado a ser apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde.
Orientador: Prof. Daniel Fernandes Martins, Dr.
PALHOÇA 2015
S63 Siteneski, Aline, 1981-
Natação de alta intensidade reduz nocicepção somática induzida por glutamato pela ativação de receptores acoplados a proteína G / inibição da proteína cinase A / Aline Siteneski. – 2015.
238 f. : il. color. ; 30 cm
Dissertação (Mestrado) – Universidade do Sul de Santa Catarina, Pós-graduação em Ciências da Saúde.
Orientação: Prof. Dr. Daniel Fernandes Martins
1. Dor. 2. Neurobiologia. 3. Natação. 4. Exercícios físicos. 5. Canabinóides. 6. Opióides. 7. I. Martins, Daniel Fernandes. II. Universidade do Sul de Santa Catarina. III. Título.
CDD (21. ed.) 616.0472
ALINE SITENESKI
NATAÇÃO DE ALTA INTENSIDADE REDUZ NOCICEPÇÃO SOMÁTICA INDUZIDA PELO GLUTAMATO POR ATIVAÇÃO DE RECEPTORES ACOPLADOS A PROTEÍNA G / INIBIÇÃO DA PROTEÍNA CINASE A
Esta Dissertação foi julgada adequada pelo Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde - Mestrado, para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde.
Palhoça, 08/2015
Orientador: Prof. Daniel Fernandes Martins, Dr. Universidade do Sul de Santa Catarina- UNISUL
Profa. Clarissa Martinelli Comim, Dra. Universidade do Sul de Santa Catarina- UNISUL
Profa. Leidiane Mazzardo-Martins, Dra. Universidade Federal de Santa Catarina- UFSC
Dedico este trabalho as pessoas que inspiram a minha vida. Minha mãe, minha filha e meu amor.
AGRADECIMENTOS Serei sempre grata:
A Deus por permitir.
A minha mãe meu exemplo de bondade, serenidade, amor, trabalho, disciplina e perseverança. Obrigado por ter segurado as pontas para a realização deste trabalho.
Ao meu pai pelo apoio nos estudos, pelo exemplo de inteligência e integridade.
A minha filha luz da minha vida, obrigado por me apoiar, por todo amor que você me faz sentir, ter você faz o mundo parecer melhor, teu sorriso alegra meus dias, tudo o que faço é por você.
Ao meu marido Felipe grande amor da minha vida. Por estar do meu lado, meu companheiro, atencioso, carinhoso, obrigado por me dizer que tudo ia dar certo, por me amar. Sem ter você não seria possível.
Aos meus irmãos Robin (que colabora com o inglês sempre) e Darlan (por todo apoio). Vocês são os melhores, meu orgulho!!
Ao meu orientador, por ter sido um verdadeiro mestre. Obrigado por me aceitar no LaNex por todos os ensinamentos.
Aos meus colegas do laboratório: Luiz, Dai, Fe, Ralf, Bru, Ale. Obrigada pelas discussões cientificas e pelas não-cientificas, mas sempre prazerosas conversas. Em especial a Dani obrigado pelas incontáveis horas de contagem de glutamato, pela companhia, pela amizade. Obrigado a Aline por todas as caronas a Tubarão. A todos que me auxiliaram em algum momento nos experimentos.
Aos meus colegas de turma que tornaram tão agradáveis os dois semestres que estivemos juntos. Alexandre, Rodrigo, Jaime, Drielly, Naiana e em especial a Lidi amiga querida sempre me apoiando nos momentos difíceis.
As meninas secretárias da pós-graduação Silvane, Francieli e Marcieli por serem sempre tão solicitas e nos tratarem com tanto carinho.
A todos os professores que contribuíram com o aprendizado, em especial a Professora Clarissa.
Ao Laboratório de Neurobiologia da Dor e Inflamação (LANDI) da UFSC por me receber com tanto carinho. Ao Dr. Adair Roberto Soares dos Santos por permitir a realização de parte deste trabalho no LANDI. Em especial a Dani, uma pessoa
muito especial que tive o privilégio de conviver durante minha estada no LANDI, obrigado pelo Blot, pelo carinho por todo o aprendizado.
Aos meus amigos queridos Filipe e Tanara que me ensinaram com paciência no começo de tudo, obrigado pelos muitos Blot, MTT, fatias e cia de acái.
Aos camundongos, por serem instrumentos fundamentais para minha pesquisa.
À UNISUL e ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde por todo o apoio.
À CAPES e a UNISUL por financiar minha bolsa de mestrado.
A todos vocês... MUITO OBRIGADA!
“Embora ninguém possa voltar atrás e fazer um novo começo, podemos começar agora e fazer um novo fim”.
RESUMO
Introdução: O neurotransmissor excitatório glutamato é amplamente distribuído pelo sistema nervoso de mamíferos. Vias glutamatérgicas tem sido associadas a diferentes tipos de dor. Analgesia induzida pelo exercício físico é um fenômeno observado em estudos pré-clínicos e clínicos. No entanto, o mecanismo neurobiológico adjacente a esta analgesia ainda não foi totalmente elucidado.
Objetivo: Avaliar o efeito da natação de alta intensidade na nocicepção somática e hiperalgesia induzida pelo glutamato, analisando o papel de diferentes receptores e vias envolvidas neste efeito.
Métodos: O presente estudo foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA/Unisul) sob o número 13.020.4.06.IV. Foram utilizados camundongos Swiss machos. Animais foram submetidos à uma ou duas semanas de natação de alta intensidade e comparados à camundongos não exercitados. A nocicepção e hiperalgesia mecânica somática foram induzida por uma injeção intraplantar (i.pl.) de glutamato (GLU). Testou-se a resposta da pata (tempo de licking) ou (frequência de retirada) frente a estímulos nocivos. Pelo fato da pata (periférico) e da medula espinal (central) serem sítios de modulação importantes no controle da dor, a participação dos receptores dos principais sistemas endógenos (opióde, adenosinérgico e canabinóide) e a expressão da proteína cinase A (PKA) fosforilada foram avaliados nestes locais, por meio de antagonistas específicos dos referidos sistemas e por Western Blotting, respectivamente.
Resultados: Observou-se que receptores opióides e adenosinérgicos (A1) periféricos e espinais participam da analgesia induzida pela natação de alta intensidade. Além disso, receptores canabinóides CB1 espinais, mas não periféricos, também estão envolvidos neste efeito. Paralelo a estes resultados, também foi encontrado aumento na expressão de PKA fosforilada induzido pela injeção i.pl. de GLU, o qual foi reduzido significativamente pela natação, em ambos sítios, pata e medula espinal. Conclusão: Natação de alta intensidade reduz nocicepção somática e hiperalgesia induzida pelo glutamato. A inibição da fosforilação de PKA pela ativação de receptores opióides, adenosinérgicos e canabinóides parece, pelo menos em parte, mediar este efeito.
ABSTRACT
Introduction: The excitatory neurotransmitter glutamate is widely distributed throughout mammals' nervous system. Glutamatergic pathways have been associated with different kinds of pain. Analgesia induced by exercise is a phenomenon observed in preclinical and clinical studies. However, the analgesia associated with this neurobiological mechanism has not been fully elucidated.
Goal: To evaluate the effect of high-intensity swimming in the somatic hyperalgesia and nociception induced by glutamate analyzing the role of different receptors and pathways involved in it.
Methodology: This study was approved by the Ethics Committee on Animal Use (CEUA /Unisul in the Portuguese acronym) under the number 13.020.4.06.IV. Swiss male mice were submited to one or two weeks of high-intensity swimming and compared to mice that did not exercise. The somatic nociception and hyperalgesia was induced by intraplantar injection (i.pl.) of glutamate (GLU). The paw response (licking time or removal frequency) against noxious stimuli was tested. Because paw (peripheral) and spinal cord (central) modulation are important sites for pain control, the involment of receptors of the main endogenous systems (opioid adenosinergic and cannabinoid) and the expression of protein kinase A (PKA) phosphorylated were evaluated by, respectively, specific antagonists of these systems and by Western blotting.
Results: It was concluded that central and peripheral opioid and adenosinergic (A1) receptors are part of the spinal analgesia induced by high intensity swimming. In addition, spinal but not peripheral cannabinoid receptors CB1 are involved in this effect. An increased expression of phosphorylated PKA was induced by i.pl. injection of GLU, that was significantly reduced by swimming, was also found on both sites (paw and spinal cord).
Coclusion: High intensity swimming reduces somatic nociception and hyperalgesia induced by glutamate. Inhibition of PKA phosphorylation by the activation of opioid, cannabinoid and adenosinergic receptors seem at least partially, to mediate this effect.
LISTA DE ABREVIATURAS
AMPA - Ácido -amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiônico; AMP - Monofosfato de adenosina-5';
AMPc - Monofosfato de adenosina cíclico; AP - Aferente primário;
ATP - Trifosfato de adenosina-5';
BDNF - Fator neurotrófico derivado do encéfalo; CB - Canabinóide;
CCI - Constrição do nervo isquiático; DAG - Diacilglicerol;
DRG - Gânglio sensorial do nervo espinal;
EATTs - Transportadores de aminoácidos excitatórios; EC - Endocanabinóide;
FCmax - Frequência cardíaca máxima; GABA - Ácido γ- aminobutírico;
G i - Proteína G inibitória; GTP- Guanosina trifosfato; GLU- Glutamato;
IASP - Associação Internacional para o Estudo da Dor; i.pl. – Intraplantar;
i.t. – Intratecal; KA – Cainato;
NMDA - Ácido N-metil-D-aspartato; PKA - proteína-cinase A;
PKC - proteína-cinase C;
RsGLUi - Receptores para glutamato ionotrópicos; RsGLUm - Receptores para glutamato metabotrópico; SCP - Substância cinzenta periaquedutal;
SNC - Sistema nervoso central; SNP - Sistema nervoso periférico; SP - Substância P;
VO2 - Consumo de oxigênio;
Lista de figuras
Figura 1 - Receptores canabinóides ... 23
Figura 2 - Receptores opióides ... 25
Figura 3 - Receptores adenosinérgicos ... 27
Figura 4 - Proteína cinase A . ... 32
Figura 5 - Esquema representando a execução do protocolo de natação e o dia do teste nociceptivo.. ... 38
Figura 6 - Esquema de tratamento utilizado para avaliar o mecanismo de neurobiólogos ... 39
Figura 7 - Concentrações de lactato sanguíneo ... 44
Figura 8 - Efeito da natação na nocicepção induzida pelo glutamato. ... 45
Figura 9 - Efeito da natação na hiperalgesia mecânica induzida pelo glutamato. ... 46
Figura 10 - Envolvimento de receptores acoplados a proteína G espinais na redução da nocicepção induzida pela natação. ... 48
Figura 11 - Envolvimento de receptores acoplados a proteína G periféricos na redução da nocicepção induzida pela natação.. ... 49
Figura 12 - Atividade da PKA em camundongos. ... 51
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 14
1.1 REFERENCIAL TEÓRICO ... 16
1.1.1 Neurobiologia da dor ... 16
1.1.2 Neurotransmissão glutamatérgica ... 18
1.1.3 Sistemas endógenos que participam do controle da dor ... 20
1.1.3.1 Sistema canabinóide ... 20
1.1.3.2 Sistema opióidergico ... 23
1.1.3.3 Sistema adenosinérgico ... 25
1.1.4 Exercício físico ... 28
1.1.4.1 Exercício físico na dor e na nocicepção ... 29
1.1.5 Sinalização proteína G i / o /AMPC/PKA e dor ... 31
2 OBJETIVOS ... 34 2.1 OBJETIVO GERAL ... 34 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 34 3 MÉTODOS ... 35 3.1 ASPECTOS ÉTICOS ... 35 3.2 ANIMAIS ... 35 3.3 FÁRMACOS E REAGENTES ... 35
3.4 NOCICEPÇÃO SOMÁTICA INDUZIDA PELA INJEÇÃO INTRAPLANTAR DE GLUTAMATO ... 36
3.5 MENSURAÇÃO DA HIPERALGESIA MECÂNICA INDUZIDA PELA INJEÇÃO DE GLUTAMATO ... 36
3.6 NATAÇÃO ... 37
3.7 MENSURAÇÃO DA INTENSIDADE DO EXERCÍCIO DE NATAÇÃO ... 38
3.8 ANÁLISE DO MECANISMO BIOLÓGICO DO EFEITO DA NATACÃO ... 39
3.8.1 Análise da participação dos receptores canabinóides 1 (CB1) na redução da nocicepção induzida pela natação ... 40
3.8.2 Análise da participação dos receptores opióides na redução da nocicepção induzida pela natação ... 40
3.8.3 Análise da participação dos receptores adenosinérgicos 1 (A1) na redução da nocicepção induzida pela natação ... 41
3.9 AVALIAÇÃO DO ENVOLVIMENTO DA PROTEÍNA CINASE A (PKA) ... 41
3.9.1 Preparação dos homogenatos ... 41
3.9.2 Ensaio de Western blotting ... 42
3.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 42
4 RESULTADOS ... 44
4.1 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRACÃO DE LACTATO SANGUÍNEO (INTENSIDADE DA NATAÇÃO) ... 44
4.2 EFEITO DA NATAÇÃO NA NOCICEPÇÃO INDUZIDA PELO GLU ... 45
4.3 EFEITO DA NATAÇÃO NA HIPERALGESIA MECÂNICA INDUZIDA PELO GLU ... 46
4.4 ENVOLVIMENTO DE RECEPTORES ACOPLADOS A PROTEÍNA G ESPINAIS NA REDUÇÃO DA NOCICEPÇÃO INDUZIDA PELA NATAÇÃO ... 47
4.5 ENVOLVIMENTO DE RECEPTORES ACOPLADOS A PROTEÍNA G PERIFÉRICOS NA REDUÇÃO DA NOCICEPÇÃO INDUZIDA PELA NATAÇÃO .... 48
4.6 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE DIFERENTES ISOFORMAS DE PROTEÍNA CINASE A FOSFORILADA ... 50
5 DISCUSSÃO ... 52
6 CONCLUSÃO ... 61
REFERÊNCIAS ... 62
ANEXO ... 76
1 INTRODUÇÃO
''Uma experiência sensorial e emocional desagradável associada a dano tecidual real ou potencial, ou descrita em termos de tal dano'' é como a dor é defina pela Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP)1. Assim, apesar de
existir uma base anatômica e fisiológica discreta para a detecção e transmissão das mensagens que são interpretadas como dolorosas, o que torna a experiência de dor tão especial é o envolvimento emocional associado à esta experiência2.
No sentido fisiológico, o processamento da informação de dor envolve um sistema que transmite uma informação sensorial adaptativa importante sobre o ambiente e necessária para a sobrevivência do organismo. Este tipo de informação/sinalização é conhecida como nocicepção. O processamento da informação dolorosa envolve vários componentes, incluindo a ativação neuronal do aferente primário sensorial, transmissão aferente à medula espinal, integração espinal e modulação, processamento supra-espinal, e regulação descendente3.
O glutamato (GLU) é um neurotransmissor excitatório amplamente distribuído pelo sistema nervoso de mamíferos. Ele participa de todas as funções do sistema nervoso afetando o desenvolvimento do sistema nervoso em todas as fases, desde a migração neuronal, diferenciação e morte na formação e eliminação de sinapses4. Receptores glutamatérgicos (RsGlu) são divididos em duas classes
principais, ionotrópico e metabotrópicos. Os receptores ionotrópicos (RsGlui) são canais iônicos que são permeáveis a cátions e estão subdivididos em três subgrupos: ácido -amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiônico (AMPA), Cainato e receptores do tipo ácido N-metil-D-aspartato (NMDA)5. Os receptores
metabotrópicos (RsGlum) são acoplados a proteínas de ligação ao GTP (proteínas G), e operam tanto por liberação de mensageiros secundários no citoplasma ou por influenciar a atividade de canais iônicos por meio de interações com as subunidades da proteína G na membrana celular6.
O papel das vias glutamatérgicas em processos nociceptivos tem sido associado a diferentes tipos de dor7. Concentrações de glutamato elevadas na
medula espinal de ratos são observadas durante a inflamação8.
O aumento do cálcio intra-celular mediado por receptores NMDA em neurônios do corno posterior da medula espinal provoca ativação de cinases, incluindo a proteína cinase A (PKA)9. As cascatas de ativação de cinases conduzem
a uma maior excitabilidade neuronal mediada pela fosforilação de receptores NMDA, AMPA e canais de cálcio dependentes da voltagem, bem como pela inibição de canais de potássio dependentes da voltagem10,11. A fosforilação de receptores
NMDA ainda contribui para potenciais pós-sinápticos excitatórios12, e também para
aumentar o período em que os receptores permanecem abertos após a despolarização neuronal13.
O AMPc foi o primeiro segundo mensageiro celular a ser descoberto, e também foi o primeiro ser sugerido estar implicado na dor e sensibilização do nociceptor. A sinalização do AMPc é resulta em fosforilação da PKA uma proteína dependente de AMPc, que pode ser ativada ou inibida. A inibição farmacológica, bem como genética da PKA resulta em uma redução no comportamento de hiperalgesia induzida por mediadores inflamatórios14, em reduzidas descargas dos
nociceptores15, bem como, na atenuação da liberação de peptídeos induzida por
estímulos16.
A analgesia induzida pelo exercício físico é um fenômeno bem estabelecido na literatura e que há muito tempo vem sendo estudada. Vários sistemas endógenos de controle estão implicados neste fenômeno, entre eles, o sistema opióide, o sistema adenosinérgico e mais recentemente tem sido postulado o envolvimento do sistema canabinóide17,18,19,20,21. Além disso, tem sido
demonstrado que as concentrações intracelulares de AMPc podem ser reduzidas pela ativação de receptores opióides (µ, ou ), adenosinérgicos (A1) ou
canabinóide (CB1)14,22,23,24.
Estudos também sugerem a possibilidade do exercício físico em modular a transmissão glutamatérgica. Chen et al., (2013)25 mostrou em animais (ratos) com
dor pós-operatória que o exercício físico reduziu a hipersensibilidade mecânica até 35 dias após cirurgia. Paralelo a este efeito, os autores observaram menores quantidades nas concentrações de TNF-alfa e interleucina 6, bem como menor expressão da subunidade NR1 do receptor NMDA na medula espinal. Além disso, Sluka et al. (2012)26 comparou animais não exercitados e exercitados por 8 semanas
em um modelo de dor crônica. Os autores também avaliaram as mudanças na fosforilação da subunidade NR1 do receptor NMDA no bulbo ventromedial rostral (RVM). Assim os autores demostraram que o exercício físico previne a dor crônica por reduzir a fosforilação da subunidade NR1 do receptor NMDA no sistema nervoso central (SNC).
Neste estudo pretendeu-se responder algumas questões sobre a analgesia induzida pelo exercício físico que ainda não foram esclarecidas, como a verificação do efeito da natação de alta intensidade na nocicepção somática e hiperalgesia mecânica induzida pelo GLU. Além da análise do papel da ativação de receptores chaves (canabinoidérgico, opioidérgico e adenosinérgico) do controle da dor que são acionados por mediadores endógenos liberados durante ou após o exercício físico. Finalmente, a avaliação da participação de uma proteína cinase (PKA) fundamental na gênese da dor e que sua inibição faz parte de uma cascata (downstream) da ativação de receptores acoplados a proteína G que induzem analgesia.
1.1 REFERENCIAL TEÓRICO
1.1.1 Neurofisiologia da dor
A dor pode ser definida como “uma experiência sensorial desagradável associada com lesão tecidual real ou potencial, ou descrita em termos de tal lesão”27. A dor atua como mecanismo de defesa do organismo, um alerta induzido
por estímulos nocivos28. A percepção da dor é um fenômeno complexo porque
envolve aspectos sensório-discriminativos, emocionais, cognitivos, motivacionais e afetivos29.
Normalmente a sensação dolorosa é acompanhada por alterações sensoriais como hipernocicepção (ou hiperalgesia) definida como o prolongamento ou aumento exagerado da dor a partir de estímulos nocivos que normalmente provocam dor (por exemplo, uma picada de alfinete)28. E por alodinia que denota a
dor provocada por estímulos que normalmente não causariam dor (por exemplo, dor causada por movimentos das articulações interfalangeanas em pacientes com artrite reumatóide)30.
Nocicepção, por outro lado, expressa a percepção sensorial no sistema nervoso central (SNC), produzido pela ativação do nociceptor. A transmissão neuronal que codifica a informação dolorosa se inicia pela detecção, na periferia pelos neurônios aferentes primários (AP) ou neurônios de primeira ordem que transmitem a informação por meio de vias nociceptivas específicas31.
Um nociceptor é um receptor sensorial com a capacidade de transdução e codificação dos estímulos nocivos. Existem receptores não-nociceptivos (por
exemplo, receptores táteis e receptores de calor), que podem responder a estímulos nocivos (mecânicos ou térmicos respectivamente) quando estes estímulos estão acima de seus respectivos limiares. Mas, somente os nociceptores são capazes de codificar propriedades pertinentes a estes estímulos (por exemplo, nitidez, intensidade do calor). O nociceptor é proteína localizada na terminação nervosa periférica que age como um receptor sensorial, realizando a transdução de estímulos nocivos de diferentes naturezas em potenciais geradores e/ou codificação de sucessivos potenciais de ação27.
Os neurônios AP possuem dois ramos axonais, o ramo periférico mais longo detecta na periferia o estímulo nocivo e consequentemente deflagra um potencial de ação pelo axônio, em seguida, este potencial é conduzido ao longo da fibra nervosa até o gânglio sensorial do nervo espinal (DRG), onde é transmitido para a medula espinal pelo o ramo axonal mais curto do neurônio, alcançando assim o corno posterior da medula espinal32. Os corpos celulares desses neurônios AP
estão localizados dentro do DRG, enquanto seus ramos mais curtos estão localizados nas camadas superficiais (lâminas I e II) do corno posterior da medula espinal2.
As fibras axonais dos neurônios AP podem ser de dois tipos: fibras do tipo “Aδ”, os quais possuem corpos celulares de médio diâmetro e axônios com velocidade de condução rápida, são neurônios que medeiam a sensação de dor aguda localizada servindo como um sinal de alerta à lesão eminente, e fibras do tipo C que possuem corpos celulares de pequeno diâmetro e axônios de condução lenta, transmitem informação dolorosa mais lentamente e pouco localizada, oferecem suporte ao reparo tecidual, induzindo comportamentos de defesa32.
Algumas fibras do tipo C são polimodais porque elas compartilham a capacidade de reconhecer estímulos nocivos de diferentes naturezas tais como: térmica, química ou mecânica27. A origem desta capacidade de detectar estímulos
nocivos de naturezas diferentes, é a existência de um repertório distinto de canais iônicos de membrana, receptores e proteínas de sinalização intracelular nos neurônios AP33.
No corno posterior da medula espinal os neurônios AP liberam mediadores como o neurotransmissor GLU e o neuropeptídeo substância P, este evento permite a transmissão do sinal nociceptivo a neurônios de segunda ordem,34
neurônios de terceira e quarta ordem alcançando diferentes regiões corticais, onde ocorre a percepção dolorosa (primariamente no córtex somatossensorial)35.
Em todos os níveis do sistema nervoso existe um mecanismo endógeno de controle modulador da dor que pode exercer ações tanto estimulatórias quanto inibitórias36. As vias descendentes inibitórias da dor são originadas no tronco
encefálico e tornam-se ativas liberando neurotransmissores tais como serotonina e noradrenalina que reduzem a atividades de neurônios do corno posterior da medula espinal (segunda ordem) e dos neurônios AP37.
A ativação destas vias descendentes é precedida pela ativação dos neurônios da substância cinzenta periaquedutal (SCP), eles projetam-se para o núcleo magno da rafe ou para o Lócus Coeruleus, onde em seguida projetam-se ao longo do funículo dorso lateral e para a medula espinal36.
Na medula espinal a inibição é mediada por neurotransmissores como o ácido γ-aminobutírico (GABA) ou glicina liberados por interneurônios inibitórios e também pela ação de neuropeptídios como os opióides que interagem com receptores específicos e reduzem a excitação dos neurônios AP no corno posterior da medula espinal38. No tecido lesionado ocorre uma interação entre derivados de
leucócitos e peptídeos opióides que podem atuar em seus respectivos receptores na terminação periférica do neurônio AP inibindo sua atividade39.
Como consequência de uma lesão o tecido libera muitas substâncias químicas como macrófagos, mastócitos e também células lesionadas que podem agir de forma direta ou indireta, alterando a sensibilidade de canais iônicos e receptores metabotrópicos dos terminais periféricos. Simultaneamente os receptores liberam mensageiros secundários que ativam proteínas cinases como a PKA e a proteína cinase C (PKC), capazes de ativar outros receptores acoplados à membrana e/ou desencadear a transcrição gênica40.
1.1.2 Neurotransmissão glutamatérgica
O GLU é o principal neurotransmissor excitatório do SNC de mamíferos, é essencial para o desenvolvimento encefálico, comunicação celular e processos de aprendizagem e memória41. Exerce um papel fundamental na transmissão
nociceptiva, sendo liberado tanto a nível periférico quanto a nível central após uma lesão tecidual42.
A modulação da neurotransmissão glutamatérgica ocorre assim que o GLU é liberado a partir de um terminal nervoso por exocitose, um processo ATP (trifostato de adenosina) Ca2+/dependente. O GLU é captado pelas células
neurogliais (astrócitos) próximos da sinapse por meio de transportadores de aminoáciodos exitatórios (EAATs). Dentro do astrócito glutamina sintetase detoxifica GLU convertendo-o a glutamina (GLn), processo dependente de ATP. A GLn é liberada dos astrócitos e captada pelos neurônios por meio de transportadores diferentes para GLn43.
Após a captação para dentro dos neurônios pré-sinápticos a enzima glutaminase transforma a GLn novamente a glutamato. As vesículas sinápticas são conduzidas com GLU através do citosol por meio de um transportador de GLU vesicular (GLUTv) deslocando-se até a membrana pré-sináptica, onde sofre exocitose e libera novamente o GLU na fenda sináptica43.
A estimulação excessiva dos receptores glutamatérgicos decorrente de níveis elevados de GLU na fenda sináptica colabora com diversos distúrbios agudos (acidente vascular encefálico [AVE], convulsão, trauma) e crônicos (demência vascular, doenças neurodegenerativas e psiquiátricas) que acometem o SNC (CHAO; FEI, 2010). Na dor crônica, ocorre um estado clinico de hiperalgesia e alodinia onde a estimulação contínua e a liberação sustentada de GLU resultam no estado de hiperexcitabilidade de neurônios nociceptivos, fenômeno conhecido como sensibilização39.
O GLU liberado pelo neurônio pré-sináptico pode interagir com o neurônio pós-sináptico através da ligação em diferentes tipos de receptores para o GLU, os ionotrópicos (RsGLUi) e metabotrópicos (RsGLUm) expressos em neurônios pré- e pós-sinápticos5.
Os RsGLUi formam complexos tetraméricos de subunidades heteroméricas individuais; são canais permeáveis a cátions que podem ser subdivididos em três grandes famílias, receptores do tipo AMPA, receptores do tipo cainato e os receptores do tipo NMDA44. Mudanças conformacionais abrem o canal
em resposta à ligação do agonista6. Assim, quando o NMDA é ativado, permite o
influxo de Ca2+ e quando AMPA e cainato são ativados, ocorre principalmente o
influxo de sódio (Na+) e potássio (K+)11.
Os RsGLUm são receptores acoplados a proteína G membros da família heteromérica guanosina 5’ trifosfato, caracterizada por possuir uma proteína com
sete α hélices associadas com um domínio N-terminal extracelular e um domínio C-terminal intracelular. Possui três subunidades distintas α, β e γ que ativam ou inibem mensageiros secundários. Estão divididos em três grupos, o grupo I consistem dos R1Glum e R5Glum, do tipo II R2Glum e R3Glum e os do grupo III R4Glum e R8Glum6.
O grupo I consiste em receptores acoplados a proteína Gq onde a
proteína efetora é a fosfolipase C e possui duas rotas: uma ativa o diacilglicerol (DAG) que age como segundo mensageiro ativando a PKC; a outra rota ativa IP3 como segundo mensageiro e promove a liberação de Ca2+, sendo que ambas
culminam no aumento da fosforilação e ativação de proteínas que se ligam ao Ca2+.
Em contrapartida, os grupos II e III, encontram-se acoplados a proteínas Gi são vias
inibitórias, sua ação diminui o monofosfato de adenosina cíclico (AMPc) 6.
Cada RGLUi, RGLUm com sua peculiaridade, participa da indução, modulação e manutenção da dor, tanto central como perifericamente37,45,46.
Centralmente a liberação de glutamato e do neuropetídeo substância P (SP) é capaz de ativar os astrócitos promovendo a liberação de citocinas pró-inflamatórias, como o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e a interleucina-1 beta (IL-1β), ambos mediadores nociceptivos47.
1.1.3 Sistemas endógenos que participam do controle da dor
1.1.3.1 Sistema canabinóide
O sistema canabinóide participa do controle endógeno da dor ao longo de toda a via nociceptiva48. Constituído pelos receptores canabinóides (CB) CB1
(RsCB1)49, e CB2 (RsCB2)50 e GPR5551, também por seus ligantes endógenos,
sendo os mais estudados o lipídeo transmissor N-aracdonoil etanolamina, (anandamida) e 2-araquidonoil glicerol (2-AG), chamados de endocanabinóides (EC)52.
Os EC endógenos são moléculas de sinalização lipídica geradas na membrana celular a partir de precursores de fosfolipídeos. Constituídos por uma cadeia de ácido graxo poli-insaturado, derivado do ácido araquidônico e de um grupamento polar, etanolamina para anandamida e glicerol para 2-AG. São
produzidos sobre demanda, em resposta a um estímulo externo e são rapidamente degradados53. As enzimas responsáveis pela formação dos EC são sensíveis ao
Ca2+, sendo que a atividade do Ca2+ intracelular age como estímulo fisiológico para a
síntese dos EC54.
A anandamida é formada por uma fosfolipase D seletiva para a N-araquidonil fosfatidil etanolamina (NAPE). Após uma série de reações para sua formação a enzima atinge os receptores CB. Posteriormente sofre recaptação pela célula sendo transportada intracelularmente por um transportador de membrana para anandamida. Uma vez dentro da célula, a anandamida é hidrolisada por uma amida hidrolase de ácidos graxos (FAAH) produzindo etanolamina e ácido araquidônico53.
O 2-AG é produzido pela hidrólise de precursores derivados do metabolismo fosfolipídico (sn1-acil-2-araquidonil glicerol). Sendo que as enzimas chave são as diacil glicerol lipases (DAGLs), localizadas em axônios e terminações axônicas pré-sinápticas durante o desenvolvimento, e pós-sinapticamente encontradas nos dendritos e corpos celulares de neurônios adultos. Seguindo a sinalização dos receptores CB, o 2-AG é transportado para dentro da célula por um transportador para 2-AG e degradado pela mono acil glicerol lipase (MAGL) produzindo então ácido araquidônico e glicerol22.
Estes compostos apresentam afinidades diferentes para os receptores de canabinóides. A anandamida tem uma afinidade preferencial para receptores CB1 e
canais de receptor de potencial transiente vanilóide 1 (TRPV1), enquanto que 2-AG apresenta afinidade funcional para ambos CB1 e CB255,56.
A sinalização dos ECs ocorre através de um mecanismo retrógrado, onde a estimulação do neurônio pós-sináptico desencadeia a biossíntese dos ECs, que são liberados e transportados por mecanismos ainda não esclarecidos, para ativar os receptores CB1 expressos principalmente no terminal pré-sináptico57. A ativação
de CB1 inicia uma cascata de sinalização através de proteínas Gi que regula os
canais de Ca2+ e K+ inibindo a liberação de neurotransmissores58. Após a ativação
de CB1 em membranas pré-sinápticas, os ECs são removidos do meio extracelular
por hidrólise enzimática rápida54.
Os receptores CB1 são abundantes no SNC e moderadamente expressos
em tecidos periféricos49. Observam-se os receptores CB
1 nos sítios de modulação
espinal, substância cinzenta periaquedutal48 e em neurônios sensoriais periféricos59.
Em âmbito neuronal, os receptores CB1 estão localizados principalmente em axônios
e terminais nervosos e estão em grande parte ausentes no soma neuronal ou dendritos60.
Os receptores CB2 são expressos principalmente pelas células imunes61
descritos em tecidos periféricos50e em células microgliais no SNC62.
Tanto os receptores CB1 quanto CB2 e seus ligantes endógenos, estão
presentes nas principais vias de modulação da dor, central e perifericamente, são capazes de alterar a percepção da dor63. Perifericamente, exercem um grande
controle inibitório no início da transmissão da dor. Quando os RsCB1 e RsCB2 são
ativados perifericamente ocorre inibição de comportamentos relacionados à dor64.
O mecanismo de transdução dos sinais dos RsCB1 e RsCB2 envolvem
preferencialmente vias com a participação da proteína G i / o (Figura 1) exercendo
sua ação através da inibição da adenilil ciclase, consequente redução da produção de monofosfato cíclico de adenosina (AMPc), inibição da PKA, inibindo a atividade dos canais de Ca2+ e ativando os canais de K+53,54.
Figura 1- Receptores canabinóides
Legenda: Ativação de ambos RsCB1 e RsCB2, resulta em subsequente estimulação da proteína G i / o
e inibição da adenilato-ciclase (AC) e inativação da proteína cinase A (PKA) (fosforilação) ou estimulação de proteína cinase ativada por mitogénio (MAPK). Estes eventos intracelulares levam entre outros efeitos, a regulação da expressão de vários genes. A estimulação de receptores acoplados a G i /0 estão diretamente relacionados a inibição de canais de Ca2+ dependente de
voltagem e a estimulação de canais de K+ com subsequente inibição da liberação de
neurotransmissores. Fonte: Adaptado de Di Marzo; Bifulco; Petrocellis, 200465.
1.1.3.2 Sistema opioidérgico
O sistema opioidérgico é composto pelos peptídeos opióides e os seus respectivos receptores, eles são expressos em todo o SNC e periférico, em tecidos neuroendócrinos e células imunes63. Os subtipos de receptores opióides já identificados são: receptor do tipo µ, , δ, e OFQ/N51.
Os receptores opióides estão localizados e podem ser ativados ao longo de todos os níveis da transmissão nociceptiva66, encontrados no SNC em estruturas
relacionadas com a emoção e recompensa51. Além de células neuroendócrinas,
imunológicas e ectodérmicas23.
A modulação ocorre através de peptídeos opióides endógenos, que se ligam aos receptores mediante estímulos como, por exemplo, eventos inflamatórios e/ou neuropatias dolorosas. Os principais peptídeos são as endorfinas, dinorfinas e
AMPc
Expressão gênica
Proteína G
encefalinas, cada um é produzido a partir da clivagem de proteínas precursoras diferentes67.
Endorfinas originam-se a partir da clivagem da proteína precursora proopiomelanocortina (POMC) e apresentam maior afinidade pelos receptores opióides do tipo μ. Encefalinas são formadas a partir da proteína precursora proencefalina (PENK) e apresentam afinidade pelos receptores opióides dos tipos μ e δ. Já as dinorfinas, originam-se da clivagem da prodinorfina e mostram maior afinidade pelos receptores opióides do tipo κ68.
Todos os receptores opióides são acoplados à proteína G51,
principalmente à proteína G i / o, sendo que, a rota desencadeada envolve a inibição
da adenilil ciclase (AC), diminuição da condutância dos canais Ca2+ dependente de
voltagem e/ou abertura de canais de K+, resultando na diminuição da atividade
neuronal. A prevenção do influxo Ca2+ inibe a liberação de neurotransmissores e
consequentemente a excitação neuronal (Figura 2)23. Os receptores opióides e
canabinóides compartilham as características de receptor metabotrópico, por este motivo existe uma interação entre eles na analgesia69.
Figura 2- Receptores opióides
Legenda: Expressão de receptores opióides periféricos, sinalização intracelular após a ligação de um agonista promovendo o acoplamento da proteína G i /0, consequentemente ativando canais de k+ e
inibindo canais de Ca2+, por sua vez inibindo a adenilato ciclase (AC). Os receptores opióides
indiretamente ativam a fosfolipase C (PLC), e cinase ativada por mitógeno (MAPK). Fonte: Adaptado de Kapitzke, Vetter, Cabot, 200570.
1.1.3.3 Sistema adenosinérgico
A adenosina é um nucleosídeo derivado da purina abundante em todas as células71. As concentrações basais de adenosina dependem de mecanismos que
regulam o metabolismo, a produção, a liberação e a recaptação72. Ela é considerada
um neuromodulador endógeno, pois influencia funções do SNC, como a liberação de neurotransmissores e a excitabilidade neuronal73.
A adenosina pode ser formada tanto no meio intra quanto extracelular. No meio intracelular, a adenosina é formada pela hidrólise do AMP através da enzima 5′-nucleotidase (5′NTase) ou por uma via alternativa através da enzima S-adenosil homocisteína hidrolase (SAHáse), que converte a S-adenosil homocisteína em adenosina e homocisteína. A adenosina pode ser novamente convertida em AMP pela enzima adenosina cinase, podendo ser transportada para o meio extracelular por transportadores equilibrativos. O ATP também pode ser levado para o meio extracelular por transportadores, exocitose ou ainda pelo rompimento da membrana plasmática em situações de dano celular74.
No meio extracelular a adenosina é formada pela clivagem sequencial de nucleotídeos por ecto-enzimas, incluindo a NTPDase que converte ATP e ADP em AMP e a ecto 5′-nucleotidase que converte AMP em adenosina74. Ao atingir a fenda
sináptica a adenosina se liga aos receptores para adenosina (RsA), A1, A2A, A2B e
A3, todos acoplados à proteína G75.
A principal via de sinalização dos receptores A1 e A3 está relacionada com
o acoplamento à proteína G i / o exercendo sua ação negativa sobre a enzima AC o
que diminui os níveis intracelulares de AMPc. E a principal via dos receptores A2A e
A2B é o acoplamento a proteína Gs, que agem positivamente à enzima AC,
promovendo um aumento dos níveis intracelulares de AMPc 76,77.
A adenosina regula a transmissão nociceptiva por ativar sítios supra-espinais, espinais e periféricos. Os efeitos inibitórios são mediados pelos receptores A1, enquanto os receptores A2A levam a facilitação da percepção nociceptiva73. A
diminuição da nocicepção induzida pela adenosina ocorre devido a inibição da atividade neuronal, tanto pelo aumento da condutância ao K+ quanto pelo bloqueio
de canais Ca2+, diminuindo a liberação do neurotransmissor glutamato e do
Figura 3- Receptores adenosinérgicos
Legenda: Representação esquemática simplificada de formação de adenosina, o metabolismo, transporte e os receptores de adenosina acoplados à proteína G. (A) Neurônios, astrócitos e células microglias podem liberar adenosina e adenosina-trifosfato (ATP; seta cinza). Todos os tipos de células expressam receptores para a adenosina, transportadores de adenosina e ecto-nucleotidases que convertem ATP em adenosina. ADP adenosina-di fosfato; AMP adenosina-mono-fosfato; HAS, S-adenosil-homocisteína; 5'-N, 5'-nucleotidase; AK, de adenosina-cinase; ADA, adenosina-desaminase; SAHH, S -homocisteína hidrolase-adenosil. (B) A ativação de receptores de adenosina inibe (receptores A 1/3 flechas azuis) ou estimula (receptores A 2A / 2B flechas vermelhas) a adenilato-ciclase
e AMP (via AMPc). Fonte: Adaptado de Landolt, Rétey, Adam, 201279. Inosina Inosina Adenosina Adenosina Proteína Cinase A Adenilato ciclase
1.1.4 Exercício físico
O exercício físico foi definido por Caspersen et al. (1985)80 como “toda
atividade física planejada, estruturada e repetitiva com o propósito de melhorar ou manter certo nível de aptidão física”. O exercício físico pode ser dividido em aeróbio e anaeróbio de acordo com os substratos energéticos empregados na realização da atividade. São exemplos de exercícios aeróbios caminhar, correr, andar, pedalar, nadar, dançar, entre outros. Os exercícios anaeróbios incluem treinamento de força ou treinamento resistido, frequentemente chamado de musculação81.
Os princípios do treinamento: frequência, intensidade, tipo de exercício e tempo determinam a adaptação à prática de exercícios físicos. Considerações importantes são: o tipo do exercício (aeróbio ou anaeróbio), a frequência que se refere ao número de treinos (sessões), a intensidade (definida como o nível de esforço exigido pelo treino) e a duração (tempo pelo qual o treinamento foi mantido)82.
A prática de exercícios aumenta o consumo de oxigênio pelos tecidos chamado de VO2 máximo, que é regulado pela capacidade máxima dos sistemas
pulmonar e cardiovascular em captar e transportar oxigênio e também a capacidade dos tecidos de utilizar o VO2 na oxidação de substratos energéticos
preferencialmente os lipídeos e carboidratos83.
Existe uma relação importante entre a intensidade do exercício, VO2máx e
a concentração de lactato. A capacidade máxima de executar exercícios tem um “limite” de quantidade de energia que os músculos são capazes de produzir pela oxidação de substratos energéticos. Isso corresponde ao metabolismo mitocondrial do piruvato. Assim, quando as mitocôndrias atingem o ponto máximo de conversão de lactato em piruvato, isto é, próximo ao limite do exercício (VO2máx), o lactato
passa a acumular-se nos tecidos e no sangue83. Assim, tanto o limiar de lactato
pode ser utilizado como uma medida indireta da intensidade de exercícios aeróbios, quanto o VO284,85.
Segundo Gaesser Poole (1996)86, a cinética do VO2
máx durante o
exercício em carga constante pode classificar a intensidade do esforço em três domínios: moderado, pesado e severo. Moderado, atinge todas as intensidades de esforço que podem ser realizadas sem a modificação do lactato sanguíneo em relação aos valores de repouso, ou seja, abaixo do limiar de lactato. Pesado, inicia a
partir da intensidade de esforço onde o lactato se eleva e tem como limite superior a intensidade correspondente à máxima fase estável do lactato (aproximadamente 4mM). No domínio severo por sua vez, não existe fase estável de lactato sanguíneo, ele se eleva durante todo o tempo de esforço até a exaustão do praticante.
A prática de exercícios físicos regular é associada à redução no risco de doenças cardiovasculares87, metabólicas88, obesidade89, osteoporose90, câncer91 e
diabetes92. O exercício físico também é considerado uma intervenção não
farmacológica no tratamento de encefalopatia associada à insuficiência hepática93,
fibromialgia94, depressão95 e dor17. Após a inclusão de períodos de treinamento em
esteira é possível observar um aumento significativo no desempenho neuromuscular e cardiovascular40.
1.1.4.1 Exercício físico na dor e na nocicepção
Trabalhos clínicos demonstram que o exercício físico reduz dor crônica, em condições como: fibromialgia, dores lombares, osteoporose, dor miofascial, dor oncológica e dor cervical96. Uma meta-análise realizada por Naugle, Fillingim, Riley
(2012) 97, analisou estudos sobre a analgesia induzida pelo exercício físico.
Conclui-se que ambos os exercícios: aeróbios e de resistência, foram capazes de reduzir a dor experimental em adultos saudáveis. As variações podem ser observadas na população com dor crônica onde os exercícios de alta intensidade produzem maiores respostas na diminuição da sensibilidade à dor, quando comparados com exercícios de baixa intensidade98.
Diferentes sistemas de sinalização podem contribuir para a analgesia induzida pelo exercício físico; ela pode ser mediada pela ativação de opióides endógenos, fatores de crescimento, ativação do mecanismo inibitório supraespinal controlado pelo SNC99 e por concentrações elevadas de endocanabinóides
produzidos centralmente21.
Trabalhos pré-clínicos demonstram que o exercício físico influencia o limiar sensorial, reduzindo a nocicepção. O exercício aeróbio impede o desenvolvimento de dor muscular crônica26, apresenta efeito neuroprotetor
mostrando-se eficaz no restabelecimento da função motora após esmagamento ou constrição do nervo isquiático (CCI)100,101.
A natação é uma alternativa de exercícios aeróbios de alta intensidade para estudos de nocicepção; após períodos de treinamento observa-se um efeito de redução da nocicepção17, além de alívio nos quadros de dor neuropática após
CCI102. Quando comparados o treinamento da natação com o treinamento em
esteira, em ambos os casos verifica-se redução da nocicepção após CCI103.
Pelo fato de que os efeitos analgésicos observados após sessões de exercício são de longa duração, especula-se que a ativação de receptores metabotrópicos esteja mediando estes efeitos. Por este motivo, os receptores acoplados à proteína G são amplamente estudados para verificar os efeitos benéficos do exercício físico 104,105,19,20,106,107.
Os estudos tem demonstrados o envolvimento do sistema opióide na analgesia induzida pelo exercício físico observa-se; um aumento na expressão dos receptores opióides104,106, aumento de peptídeos opióides em regiões como o tronco
encefálico, um importante sítio de modulação da dor107; ativação de receptores
opoóides (após a pratica de treinamento resistido)19; glândulas supra-renais também
liberam opióides endógenos e é possível que o exercício físico da natação tenha interação com este efeito17.
Dentro da família dos opióides endógenos, a β-endorfina, um tipo de endorfina, tem um papel essencial na analgesia. O exercício provoca a liberação de β-endorfinas a partir da hipófise e hipotálamo o que permite o efeito analgésico pela ativação de receptores opióide do tipo μ, tanto periféricos como centrais108. A região
hipotalâmica, por meio de suas projeções na substância cinzenta periaquedutal, ativam mecanismos inibitórios descendentes nociceptivos109.
A participação do sistema canabinóide na analgesia induzida pelo exercício físico tem sido recentemente demonstrada. Galdino et al. (2010)20, observou que o
exercício aeróbio reduz a nocicepção mecânica e térmica ao mesmo tempo em que aumenta as concentrações endógenas de anandamida e 2-AG e a expressão de RsCB1 nos neurônios da substância cinzenta periaquedutal. O treinamento resistido
também é capaz de induzir hiponocicepção liberando EC após uma única sessão de treinamento19.
A adenosina pode exercer um efeito significativo sobre a adaptação do organismo à prática de exercícios físicos, influencia a regulação dos mecanismos de angiogênese, a produção de eritropoietina, o fluxo de sangue, a pressão arterial sistólica, a respiração, os níveis plasmáticos de norepinefrina e epinefrina110.
Exercícios realizados em alta intensidade aumentam as concentrações de adenosina e inosina111. Também observa-se um aumento paralelo de ATP, o
músculo esquelético utiliza mais ATP do que é capaz de regenerar levando ao acúmulo de ADP e AMP dentro da célula. Para evitar um grande acumulo de AMP dentro da célula, o AMP é desaminado em monofosfato de inosina (IMP) e amônia, através da enzima AMP desaminase112. Uma fração do IMP que é formado durante
o exercício é degradado em inosina e hipoxantina esta, por sua vez atravessa a membrana celular 113. Ainda, a relação de suprimento de oxigênio para demanda
diminui durante as contrações musculares, sugerindo um limite da ressíntese de ATP aeróbia, provocando uma quebra líquida de ATP em adenosina114. Por outro
lado, embora a adenosina contribua para a vasodilatação muscular esquelética durante hipoxia sistêmica115, a saída de adenosina é suprimida através da inibição
da entrada de lactato na célula116.
O sistema adenosinérgico também está envolvido no efeito de redução da nocicepção através da prática de exercícios como mostra um estudo recente de Martins et al. (2013) 117, onde o treinamento da natação reduz a alodinia mecânica, e
que este efeito é mediado, pelo menos em parte, pela ativação de receptores para a adenosina A1.
1.1.5 Sinalização proteína G i / o /AMPC/PKA e dor
No genoma humano a PKA faz parte do grupo da superfamília de cinases AGC, caracterizada por possuir uma dobra cinase bipodal com um pequeno lóbulo amino (N-lóbulo) além de um grande lóbulo carboxi-terminal (C-lóbulo) e uma molécula de ATP, que serve como doador de fosfato durante a fosforilação118.
Proteínas cinases, como a PKA catalisam reações de fosforilação, (a fosforilação, é a adição de um radical fosfato -PO32 a uma proteína que resulta na alteração de sua conformação espacial) a carga eletronegativa promove a modificação da função da proteína, podendo, ativá-la ou desativá-la, para essa reação PKA é regulada pelo segundo mensageiro AMPc118.
A PKA é uma holoenzima tetramérica constituída por duas subunidades catalíticas (C) contendo três isoformas Cα, Cβ, Cγ e duas subunidades reguladoras (R) contendo quatro isoformas, RIα, RIβ, RIIα, RIIβ. As subunidades R da PKA controlam sua atividade exclusivamente de acordo com os níveis do AMPc. Na
ausência de AMPc, as subunidades R se ligam às subunidades C e sua atividade é suprimida (Figura 4)120,121.
Figura 4- Proteína cinase A
Legenda: A PKA inclui subunidades reguladoras (R) e (C) catalíticas e substratos alvo (tais como proteínas de ancoragem para cinase A (AKAPs) que direcionam a PKA para sítios específicos da célula em estreita proximidade com os substratos. Fonte: Adaptado de Taylor et a., 2012121.
A enzima AC sintetiza o segundo mensageiro AMPc mediante ativação de receptores acoplados à proteína G. Ocorre a catálise de GDP por GTP, a subunidade α se dissocia da β e γ e ativa a AC, que converte o ATP em AMPc. O AMPc se liga as subunidades R da PKA, induzindo uma alteração conformacional. A mudança, por sua vez, libera as subunidades catalíticas da subunidade R permitindo
Membrana plasmática Adenilil Ciclase Proteína G Heretomérica Citosol AMPc Mitocôndira AMPc Hormônio Transcrição Núcleo Quatro isoformas: Três isoformas: Substratos AMPc
que elas fosforilem o substrato (Figura 4)120,121. A subunidade catalítica tem dois
resíduos de fosforilação C-terminal, Serina (Ser338) e treonina (Thr197)122.
A localização da PKA determina quais substratos serão fosforilados, e a localização depende das proteínas de ancoragem conhecidas como AKAPs, elas se ligam a subunidade R da PKA118. São as AKAP que fornecem estrutura molecular e
orientam a extensão e duração da sinalização da PKA para regiões específicas próximas a substratos em diferentes tipos de células123. A maioria dos AKAPs tem
afinidade específica para a subunidade reguladora RII, algumas têm dupla especificidade e podem se ligar a RI, RII ou outras, como SKIP (que funciona como uma AKAP), são específicos para a subunidade-RI. Ao ligar-se a diferentes subunidades reguladoras, as AKAPs montam complexos que regulam diversas funções (Figura 4)119,123.
A rota de sinalização que ativa a PKA pode fosforilar CREB, que permite que ele se ligue a coativadores que estimulam a RNA-polimerase (ácido ribonucléico) e inicia a síntese de RNA, este é então processado e exportado ao citoplasma onde serve como RNA para a tradução de proteína124.
O principal evento intracelular após a ligação do agonista em um receptor acoplado a proteínas G i / o é a inibição da proteína efetora adenilato ciclase,
subsequentemente inibição do segundo mensageiro AMPc, que por sua vez inibe a atividade da PKA tendo como consequência a diminuição na fosforilação da proteína alvo. Os receptores canabinóide, CB1, opióides e para a adenosina A1, são
receptores acoplados à proteína G i / o22,23.
O aumento dos níveis de AMPc em neurônios estão geralmente associados com o aumento da nocicepção, enquanto moléculas que diminuem a síntese de AMPc tem efeitos analgésicos126. O aumento da PKA está relacionado à
sensibilização central, um evento que ocorre após a estimulação intensa ou persistente dos nociceptores. Neste evento através dos receptores ionotrópicos para o GLU do tipo NMDA ocorre um aumento do cálcio intracelular, desencadeando uma série de sinalizações dependentes de cálcio que ativam várias proteínas, entre elas a PKA. Esta cascata de eventos aumenta a excitabilidade do neurônio e facilita a transmissão de dor para o cérebro 2,32.
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar o efeito da natação de alta intensidade na nocicepção somática e hiperalgesia induzidas pelo GLU, analisando o papel de diferentes receptores e via envolvida neste efeito.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Verificar a influência de uma ou duas semanas de natação na nocicepção química somática induzida pelo GLU, em camundongos;
- Observar a influência da natação na hiperalgesia mecânica induzida pelo glutamato, em camundongos;
- Investigar o envolvimento de receptores canabinóides centrais (medula espinal) e periféricos (pata) no efeito da natação, em camundongos;
- Verificar o envolvimento de receptores opióides centrais (medula espinal) e periféricos (pata) no efeito da natação, em camundongos;
- Investigar o envolvimento dos receptores para adenosina centrais (medula espinal) e periféricos (pata) no efeito da natação, em camundongos;
- Avaliar a expressão de diferentes isoformas de PKA central (medula espinal) e periférica (pata) no efeito da natação, em camundongos.
3 MÉTODOS
3.1 ASPECTOS ÉTICOS
O número de animais utilizados e a intensidade do estímulo nocivo foram os mínimos necessários para demonstrar o efeito da possível redução da nocicepção induzida pela natação. Todos os experimentos foram realizados de acordo com as normas éticas para o estudo de dor em animais de laboratório, após o termino dos experimentos os animais passaram pela morde indolor assistida (MIA). Os procedimentos experimentais realizados foram previamente aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Unisul sob o número 13.020.4.06.IV.
3.2 ANIMAIS
Na presente pesquisa foram utilizados camundongos Swiss machos, com idade entre 45-60 dias, (30-35 g) advindos do Biotério Central da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC) que permaneceram no biotério de manutenção do Laboratório de Neurociência Experimental (LaNEx) da UNISUL, até o término dos experimentos. Os animais tiveram livre acesso à ração e água potável, foram mantidos à temperatura de 22±2oC e ciclo 12h-claro/12h-escuro (claro a partir das
6h:00min).
3.3 FÁRMACOS E REAGENTES
As seguintes substâncias foram utilizadas: Cloridrato de ácido L-glutâmico (Glutamato) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri EUA), 1-2,4-Dichlorofenill-5-4-iododenil-4-metill-N-4-morpofenil-1H-pirazole-3-carboxamida, (AM281), diluído em Dimetilsulfóxido ou sulfóxido de dimetilo (DMSO) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri EUA), Naloxona hidrochlorida diidrato, (Naloxona), diluída em solução salina isotônica (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri EUA) 1,3-dipropil-8-ciclopentilxantina (DPCPX), diluído em DMSO (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri EUA). Os reagentes
utilizados nos ensaios bioquímicos estão descritos no texto. Os antagonistas foram administrados por via intratecal (i.t.) ou intraplantar (i.pl).
3.4 NOCICEPÇÃO SOMÁTICA INDUZIDA PELA INJEÇÃO INTRAPLANTAR DE GLUTAMATO
O procedimento utilizado foi semelhante ao descrito previamente por Beirith et al. (2002)45. O aminoácido excitatório GLU (20 μl; 20 μmol/pata) preparado
em solução salina isotônica, com pH ajustado para 7,4 foi injetado subcutaneamente na superfície ventral da pata direita dos camundongos (injeção i.pl.). Em seguida, os camundongos foram colocados individualmente em funis de vidro transparente, e o tempo em que os camundongos permaneceram lambendo ou mordendo a pata injetada foi considerado como indicativo de nocicepção cronometrado por um período de 15 minutos.
3.5 MENSURAÇÃO DA HIPERALGESIA MECÂNICA INDUZIDA PELA INJEÇÃO DE GLUTAMATO
A hiperalgesia mecânica foi avaliada utilizando monofilamento de Von Frey como previamente descrito por Martins et al. (2013)18. Os valores percentuais
referentes à frequência de retirada da pata, frente a 10 estimulações da pata posterior direita com o monofilamento de Von Frey (0,4 g) (VFH, Stoelting, Chicago, USA), foram considerados como indicativo de hiperalgesia mecânica. No dia anterior à injeção, os camundongos foram submetidos ao teste de von Frey para caracterização da resposta basal. Foram selecionados apenas os animais que apresentaram porcentagens de resposta igual ou inferior 20%. Quinze minutos após à injeção intraplantar de glutamato os animais foram colocados individualmente, para ambientação, em um acrílico (9 x 7 x 11 cm), sem fundo e coberto com tampa, posicionado sobre uma plataforma com dimensões de 70 x 40 cm, que consistia em uma grade de arame (metal) com malha de 6 mm. O filamento foi aplicado na pata posterior direita (a mesma pata que recebeu a injeção de glutamato), atendendo a alguns critérios como: aplicação feita perpendicularmente à superfície plantar com pressão suficiente para proporcionar a curvatura do filamento, obtendo-se assim pressão total; os camundongos foram avaliados quando as quatro patas estavam
acomodadas sobre a tela; a resposta de retirada foi considerada positiva quando os animais removiam totalmente a pata da grade de apoio. Os testes foram realizados em 0,5, 1, 3 e 6 horas após a injeção i.pl. de GLU.
3.6 NATAÇÃO
O protocolo de natação realizado foi uma versão adaptada do previamente descrito por Mazzardo-Martins et al. (2010)17. Neste protocolo, os
camundongos nadaram por 2 semanas consecutivas. Inicialmente, os animais foram colocados em uma caixa plástica com capacidade máxima para 35 litros de água, medindo 540 x 390 x 325 mm, dividida por um acrílico, em oito compartimentos (raias) de 170 x 110 mm cada. A caixa plástica foi enchida com água até uma profundidade de 280 mm. A água foi mantida aquecida a 35ºC. Sabão líquido foi acrescentado (1 ml por compartimento, totalizando 8 ml - 229 μl/l) com o intuito de reduzir a tensão superficial da água e evitar o comportamento de flutuação. Após cada sessão de natação os camundongos foram cuidadosamente secos em maravalha limpa. No primeiro dia o grupo exercitado foi submetido a duas sessões de natação com duração de 30 segundos cada, intervaladas por 120 minutos de repouso (Figura 5). No segundo dia foram realizadas mais duas sessões de 2 minutos de duração com repouso de 120 minutos (Figura 5). No terceiro dia foram realizadas 3 sessões de natação com duração de 10 minutos, intervaladas por um período de 5 minutos de repouso (Figura 5). No quarto dia os camundongos foram submetidos a duas sessões de 15 minutos, intervaladas por 5 minutos de repouso (Figura 5). A partir do quinto dia até o nono dia de exercício eles nadaram por 30 minutos continuamente (sem repouso). Realizou-se uma pausa de dois dias e após a pausa mais 5 dias de natação com tempo total de natação de 30 minutos (Figura 5). No décimo sétimo dia (24 horas após a última sessão de natação) os camundongos foram submetidos aos testes comportamentais de nocicepção (Figura 5). Um outro grupo de animais passou pelo procedimento de adaptação (1-4 dias) seguido de 5 dias de natação, realizando somente uma semana de natação.
Figura 5 - Esquema representando a execução do protocolo de natação e o dia do teste nociceptivo.
Legenda: NAT: Tempo da natação, REP: Tempo em repouso, NAT T: Tempo total de execução da natação.
3.7 MENSURAÇÃO DA INTENSIDADE DO EXERCÍCIO DE NATAÇÃO
Com o objetivo de determinar a intensidade da natação os grupos de animais não-exercitados e exercitados (duas semanas de natação), na última sessão de exercício do grupo exercitado foi realizada coleta de lactato sanguíneo. Neste mesmo experimento o grupo de animais não-exercitado foi submetido a 30 minutos de natação e o sangue foi coletado. As coletas foram realizadas em dois momentos, no décimo e no trigésimo minuto de natação. Para as análises foi retirada uma gota de sangue da cauda dos camundongos até o preenchimento da fita de coleta do lactato126, assim por meio de um lactímentro portátil
(Accutrend® Roche, Basel, Suiça), foi realizada a mensuração do nível sanguíneo de lactato.
3.8 ANÁLISE DO MECANISMO BIOLÓGICO DO EFEITO DA NATACÃO
Conforme resultados positivos obtidos no modelo de nocicepção somática anteriormente descrito, a próxima etapa deste trabalho foi analisar o mecanismo que poderia estar envolvido na redução da nocicepção induzida pela natação. Para este fim, foi utilizado o modelo de nocicepção induzida pelo glutamato, sendo que o tempo de exercício escolhido foi de duas semanas de natação, finalizado 24 horas antes da realização dos experimentos. As doses das drogas utilizadas foram selecionadas com base em dados da literatura ou então baseadas em resultados prévios do laboratório. Os experimentos foram realizados seguindo o esquema de tratamentos ilustrado na figura 6.
Figura 6: Esquema de tratamento utilizado para avaliar o mecanismo neurobiólogo.
Legenda: Receptores a serem bloqueados: canabinóide, CB1, opióides e adenosinérgicos A1.
Tratamento: exercitado ou não exercitado. Antagonista ou veículo, injeções: (i.t. volume 5 l. i.pl. volume 20 l, AM281 concentração 10 g/i.pl e 2 g/i.t, Naloxona concentração 5 µg/i.pl., 5 µg/i.t., DPCPX 10 nmol/i.pl., 10 nmol/i.t.), Glutamato: teste nociceptivo induzido pela injeção i.pl. de glutamato. i.t.: Intratecal; i.pl.: intraplantar.
3.8.1 Análise da participação dos receptores canabinóides 1 (CB1) na redução
da nocicepção induzida pela natação
No intuito de analisar o papel dos receptores CB1, tanto espinais quanto
periféricos, sobre a redução da nocicepção causada pela natação, o AM281 (um antagonista seletivo para receptores CB1) foi administrado por via i.pl. (10 µg/i.pl.) ou
i.t. (2 µg/i.t.)127, 15 minutos antes da última sessão de natação e 24 horas após a
última sessão de natação (15 min antes do teste nociceptivo) (ver Figura 6). O procedimento utilizado para a injeção intratecal foi similar ao descrito previamente por Hylden e Wilcox (1980) 128. Após tricotomia da pele do dorso, os camundongos
foram imobilizados manualmente e uma agulha conectada a uma microseringa de 25 μl foi inserida através da pele no espaço subaracnóideo entre as vértebras espinais L5-L6. A resposta nociceptiva ocasionada pela administração i.t. do volume de 5 μl dos antagonistas.
Para avaliar a participação dos receptores CB1 periféricos os
camundongos foram imobilizados dentro de um cone de 15 cm durante alguns segundos para a realização da administração do antagonista para receptores CB1. O
volume de 20 μl foi administrado na superfície ventral da pata direita.
3.8.2 Análise da participação dos receptores opióides na redução da nocicepção induzida pela natação
Com o objetivo de evidenciar a participação do receptores opióides, tanto espinais quanto periféricos sobre a redução da nocicepção causada pela natação, naloxona (um antagonista não seletivo para receptores opióides) foi administrada por via i.pl. (5 µg/i.pl.) ou i.t. (5 µg/i.t.)129, 15 minutos antes da última sessão de
natação e 24 horas após a última sessão de natação (15 min antes do teste nociceptivo). Os procedimentos utilizados para as injeções i.t. e i.pl. foram similares aos descritos no item 3.8.1.
