Bioespectroscopia Intro

1 Energia e interação com a matéria

Fundamentos e aplicações analíticas

Prof. Luís Maurício T. R. Lima

Laboratório de Biotecnologia Farmacêutica - pbiotech

http://farmacia.ufrj.br/mauricio/ 2

3 4

Espectro de energia

5

Resposta instrumental

• Cada detector possui resposta diferente para cada comprimento de onda

• Olho humano vs CCD vs PMT

• Diferentes CCD’s ou PMT’s (ou olhos) respondem de modo diferente em sensibilidade (diferentes limites de detecção, faixa de trabalho, etc)

Re sp o st a , % Concentração, nM 6

7

E = h

n

= hc/

l

200 50000 300 33333 400 25000 500 20000 600 16667 700 14286 800 12500 900 11111 1000 10000 1500 6667 2000 5000 3000 3333 4000 2500 5000 2000 6000 1667 7000 1429 8000 1250 9000 1111 10000 1000 15000 667 20000 500 50000 200 8 Monocromadores e fontes luminosas

Prof. Luís Maurício T. R. Lima

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Monocromadores: dispersivo vs grade

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Grade de difração

• Grade de difração é um elemento ótico que separa (dispersa) luz policromática em seus elementos constituintes (“cores”).

• A luz policromática incidente sobre a grade é dispersa de modo que cada comprimento de onda seja refletido pela grade, emergindo em ângulos ligeiramente diferentes. • A dispersão provem da divisão da frente de onda e interferência da radiação incidente pela estrutura periódica da grade.

•Grades são compostas de sulcos paralelos, igualmente espaçados, sobre uma superfície reflexiva e depositada sobre um substrato.

• A dispersão e eficiência de uma grade são dependentes da distância entre os sulcos adjacentes e do ângulo dos sulcos.

• Grades geralmente são melhores que prismas, mais eficientes, produzem uma dispersão linear dos comprimentos de onda e não sofrem efeitos de absorção típicos de prismas, o que limita o uso destes.

11

A equação de grade holográfica

onde: ‘n’ é a ordem da difração, ‘λ’ é o comprimento de onda difratado, ‘d’ é a constante da grade (a distância entre sulcos sucessivos), ‘θi’ é o ângulo de incidência medido a partir da normal, e ‘θd’ é o ângulo de difração medido a partir da normal.

• O diagrama mostra as ordens de difração dos comprimentos de onda. Igualmente para a ordem positiva, a luz pode ser difratada no sentido oposto (i.e. n = -1, -2 etc.). Ordens superiores também podem aparecer, mas com grande decréscimo em intensidade. Usualmente, as primeiras ordens de linhas (n=1 or n=-1) são as mais intensas.

Grade de difração

• A dispersão por uma grade é governada pela equação de grade, que usualmente é escrita como:

12 www.ssioptics.com/ planeblazedgratings.html

http://www.jobinyvon.com/

13

http://oldsite.vislab.usyd.edu.au/projects/photonicsA/spectrum.html

14

http://oco.jpl.nasa.gov/Observatory/Instrument/

15

Fontes luminosas -

http://www1.union.edu/newmanj/lasers/Light% 20Production/producing_ light.htm

16

Fontes luminosas -

•Led

http://jp.hamamatsu.com/products/light-source/pd024/index_en.html

17 Schematic drawing of the Cermax arc

lamp and lamp housing in ISS spectrofluorometers (www.iss.com)

Cermax and conventional Xenon lamp.

Lâmpadas

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19 Absorção UV/VIS

Prof. Luís Maurício T. R. Lima

Laboratório de Biotecnologia Farmacêutica - pbiotech

http://farmacia.ufrj.br/mauricio/ 20 Faixas de l do UV/VIS: -UV de vácuo – 190 – 200 nm -UV próximo – 200 – 380 nm -Visível – 380 –750 nm 21 E = hn nm Abs Em 22

ABSORÇÃO DA ENERGIA RADIANTE

ENERGIA TOTAL DA MOLÉCULA:

Etotal = Erotacional + Evibracional + Eeletrônica Erotacional = Rotação total da molécula

Evibracional = Movimento dos átomos dentro da molécula Eeletrônica = Movimento dos átomos ao redor do núcleo A molécula absorve energia, os elétrons passam de E0  E1.

O retorno a E0 ocorre entre 10-9 a 10-8 Seg, com a perda das energias

de vibração e rotação dentro da mesma molécula.

23

Análise Quantitativa

Se a substância transmite parte da E.R. que recebe, pode-se determinar características qualitativas e quantitativas.

LEI DE LAMBERT-BEER

T= I/I0 A= log10(1/T) log10(Io/I) = kbc = A k pode ser a ou 

24 Terminologia

Absorbância (A) – s/unidade – quantidade de energia radiante

absorvida pela molécula.

Transmitância (T) – s/unidade - quantidade de energia radiante

transmitida pela molécula. Concentração do soluto (c)

Comprimento do caminho ótico através da amostra (b) – cm

Absotividade (k) - constante característica do soluto.

- Absortividade (a) – cm-1_{.l/g c= g/l}

A = abc

- Absortividade molar () – cm-1_{.l/mol c= moles/l}

A= bc

- Absorbância específica (A1% _{) – g}-1_{.dl /cm c=1g/100ml} 1cm

A= A1% _bc

25 Determinação de Concentração de Proteínas

1) Bradford (1959) – Comassie Blue 2) Lowry (1951) – Cu2+

3) Coeficiente de Extinçao Molar (em 6,0 M GdmHCl/H2O) A = .c.l

- Pace et al, 1995, Protein Science, 4, 2411

 (280, água, M-1 _cm-1_{) = (#Trp)(5.500) + (#Tyr)(1.490) + (#Cistina)(125)} - Gill & von Hippel, 1989, Anal. Biochem., 1812, 319

- Edelhoch, 1967, Biochemistry 6, 1948-1954) 26

- Análise Multicomponente - Filtro Interno

- Análise Derivativa

27

Universidade Federal do Rio de Janeiro Faculdade de Farmácia

absorção infravermelho

Luís Maurício Trambaioli R. Lima

Laboratório de Biotecnologia Farmacêutica http://farmacia.ufrj.br/mauricio/

28

ESPECTROFOTOMETRIA NO

INFRAVERMELHO IV

• A região que tem interesse para fins analíticos é a região do

infravermelho médio a que vai de 2,5 a 25 m, isto é, do número de onda 4000 a 400 (em ondas por centímetro, cm-1₎

• os espectros de infra-vermelho são provocados pelos

diferentes modos de vibração e de rotação de uma molécula. Nos comprimentos de onda abaixo de 25 m a radiação tem energia suficiente para provocar modificações nos níveis de energia vibracional da molécula, e estas modificações são acompanhadas por alterações nos níveis de energia rotacional

29 • É um sistema óptico capaz de fornecer uma

radiação aproximadamente monocromática na

região de 2,5 m a 15 m ou, até, 50 m e por um dispositivo permitindo a leitura da relação entre as intensidades da radiação transmitida e da radiação incidente.

• Com a absorção da luz no IV as ligações atômicas vibram promovendo: Estiramentos Deformações

ESPECTROFOTOMETRIA NO

INFRAVERMELHO IV

Estiramento e Deformação

31

ESTIRAMENTO

•

Estiramentos são alongamentos periódicos da ligação ao longo do eixo da ligação

32

DEFORMAÇÃO

Alongamentos são deslocamentos que ocorrem em ângulo reto com o eixo da ligação

33

• Fora do plano

• + + + -

•

DEFORMAÇÃO

ESPECTRO DE INFRAVERMELHO

Fatores que Podem Interferir no

Espectro Infravermelho

IDENTIFICAÇÃO

INFRAVERMELHO

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Espectro do Lorazepam

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Universidade Federal do Rio de Janeiro Faculdade de Farmácia

Espectroscopia de fluorescência e fosforescência

Luís Maurício Trambaioli R. Lima

Laboratório de Biotecnologia Farmacêutica http://farmacia.ufrj.br/mauricio/ 39 Diagrama de Jablonski Alexsander Jablonski 40 E = hn

energia de emissão: menor que a de absorção: "Stokes shift” - rendimento quântico

nm Abs Em

41 Diagrama Esquemático de Níveis Energéticos

Timescale

S0 Sn absortion (10-15 sec)

Sn S1 internal conversion (10-11 - 10-14 sec)

S1 S0 + hn fluorescence (10-7 - 10-9 sec)

S1 Tn intersystem crossing (10-8 sec)

S1 S0 internal conversion (10-5 - 10-7 sec)

T1 S0 + hn phosphorescence (10 - 10-3 sec)

T1 S0 internal conversion (10 - 10-3 sec)

S - Singlete T - Triplete S0 - Estado fundamental

Relaxação de solvente ( ~ 10-10 _seg) 42

 Em cada nível eletrônico, o fluoróforo pode existir em um número de níveis vibracionais energéticos 0, 1, 2, etc.

 Transições eletrônicas ocorrem em ~ 10-15 _{seg, o que não chega a deslocamento significativo do} núcleo (princípio de Franck-Codon).

 Absorções ocorrem tipicamente a partir de moléculas com menor energia vibracional.

DE (S0-S1) é muito grande, por isso usa-se luz e não calor para excitação.

 Espaçamento energético entre os vários níveis energéticos vibracionais (0, 1, 2, etc) podem ser detectados na forma de bandas espectrais de emissão.

Características

Momento de dipolo() → depende da separação de cargas no fluoróforo;

Momento de transição → parâmetro quantum-mecânico que descreve a direção da transição eletrônica dentro de um fluoróforo.

43 Excitation and emission spectra (λmax(ex)=554 nm, λmax(em)=579 nm) of Rhodamine B in water. Data was acquired on PC1™ using a 300W Xenon lamp.

Rhodamine B (Abs em etanol) Rhodamine B isothiocyanate

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Fluorescência intrínseca de macromoléculas

Rendimento quântico

Q = no _{fótons emitidos/ n}o _{fótons absorvidos}

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Espectros de absorção e emissão de aminoácidos