Efeito do laser de baixa potência sobre células endoteliais tEND submetidas à lesão por veneno da serpente bothropoides jararaca

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(1)UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO - UNINOVE PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO STRICTU SENSU. ANA TEREZA BARUFI FRANCO. EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA.. SÃO PAULO 2013.

(2) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO - UNINOVE PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO STRICTU SENSU. ANA TEREZA BARUFI FRANCO. EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND. SUBMETIDAS. À. LESÃO. POR. VENENO. DA. SERPENTE. BOTHROPOIDES JARARACA.. Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina da Universidade Nove de Julho, como requisito para obtenção do título de Mestre em Medicina. Orientador: Prof. Dra. Stella Regina Zamuner.. SÃO PAULO 2013.

(3) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA.


(5) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. “Se enxerguei mais longe, foi porque estava sobre os ombros de gigantes.” (Isaac Newton).. “Por que o homem quer subir a montanha mais alta do mundo? Ora, a resposta é a mais simples possível, porque ela está lá.” O desafio é uma virtude inerente ao ser humano. Foi assim que me senti diante da proposta de realizar este trabalho. Como algo totalmente novo, abracei esse repto, com o doce sabor de aventura e de fascinação, diante às novas sendas abertas por essa jornada através das fronteiras do conhecimento e da habilidade humana..

(6) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. DEDICATÓRIA. À Deus, pela minha vida e pela paz e força nos momentos em que me encontrei incapaz de prosseguir. Dedico esta tese às pessoas mais importantes para mim, minha amada mãe Maria Teresinha, e ao meu amado pai Walter, principais responsáveis pela minha vida e a quem devo meu caráter e disciplina ao trabalho; e ao meu querido namorado Eduardo, sempre paciente e generoso em meus momentos de muito estudo e ausência. Ofereço este trabalho em memória do meu avô Antonio, que sempre me guiou ao sucesso e sempre confiou em minha capacidade e que agora se encontra junto a Deus. Esta. dedicatória. se. estende. também. a. minha. amiga,. professora e orientadora Drª. Stella Regina Zamuner. A esta devo a confiança em minha capacidade como pesquisadora, além da paciência e tranquilidade para me transmitir os ensinamentos da pesquisa..

(7) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. AGRADECIMENTOS. À Universidade Nove de Julho, que aceitou me receber no programa de Mestrado e acreditou no meu profissionalismo; À PROSUP/CAPES, pela bolsa de estudos; À professora Silvia Fernanda Zamuner, que muito me auxiliou nos experimentos e na melhor compreensão de nossos questionamentos; Às minhas queridas alunas Luciana e Aline, que muito me ajudaram desde o início e me ensinaram toda a base científica que hoje eu possuo. E também pelos momentos alegres, de compreensão e amizade. Às minhas irmãs, Carolina, Ana Olívia e Malu pelo apoio. Aos meus sobrinhos, Maria Eduarda e Antonio, pelos momentos alegres e de distração. Aos demais familiares que sempre me incentivaram e torceram pela minha vitória. Aos amigos de Mestrado, de modo especial Vera, Elis, Beatriz, Fernanda, Gabriela e Vinícius pelo apoio sincero e pela agradável companhia. E a todas as pessoas que direta ou indiretamente colaboraram para o sucesso deste trabalho..

(8) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. RESUMO As serpentes do gênero Bothrops e Bothropoides são as responsáveis pelo maior número de acidentes ofídicos no Brasil, apresentando efeitos sistêmicos graves, além de induzirem um quadro fisiopatológico caracterizado por reações locais como edema, mionecrose, dor e hemorragia. A utilização do soro antibotrópico desempenha a função de neutralizar a maior quantidade possível do veneno circulante, minimizando assim seus efeitos sistêmicos, porém sua ação não se estende as manifestações locais. A laserterapia de baixa potência é uma alternativa de tratamento em situações de lesão local, devido a seus efeitos biológicos, sendo considerado um recurso bioestimulante em tecidos. O objetivo deste trabalho foi analisar o efeito do laser de baixa potência vermelho- comprimento de onda de 660 nm; e o laser infravermelhocomprimento de onda 780 nm, em monocamada de células endoteliais submetidos à lesão por veneno de Bothropoides jararaca. Os resultados obtidos mostraram que o veneno, afetou a integridade das monocamadas de células endoteliais em todas as concentrações analisada (5, 10, 12,5, 25 e 50L/mL) em todos os períodos de tempo analisados. Para avaliação do efeito protetor do laser, a dose usada de 4 J/cm2 reduziu o descolamento de células endoteliais melhorando assim a integridade celular. Esse efeito foi observado nos comprimentos de onda de 660 nm nos tempos de 60 e 120 min, o mesmo efeito não foi observado com o comprimento de onda 780 nm. Desta forma, este. estudo. permitiu. entender melhor os efeitos fisiopatológicos. do. envenenamento botrópico, bem como contribuiu para a melhor compreensão dos efeitos do laser de baixa potência e, eventualmente, favorecer medidas terapêuticas mais eficientes e/ou complementares.. Palavras chaves: endotélio, Bothropoides jararaca, laser de baixa potência..

(9) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. ABSTRACT. The Bothropoides and Bothrops gender are responsible for the largest number of snakebites in Brazil, presenting serious systemic effects that induce pathophysiological alterations characterized by local reactions such as edema , myonecrosis, pain and hemohrrage. The antivenom is used to neutralize the greatest possible amount of circulating venom, minimizing its systemic effects. But its action does not extend to local manifestations. The low level laser therapy is an alternative treatment in situations of local lesions due to its biological effects, and is considered a biostimulate resource to the tissues . The aim of this study was to analyze the effect of low power laser -red wavelength of 660 nm, and the infrared laser- wavelength 780 nm, in endothelial cells submitted to injury by Bothropoides jararaca venom. The results showed that the snake venom affected the integrity of endothelial, in all concentrations (1, 5, 10, 12,5, 25 and 50 µg/mL); and affected the viability of endothelial cell in 10 µg/ mL at all time periods analyzed . To evaluate the protective effect of the laser, the dose of 4 J/cm2 reduced the detachment of endothelial cells by improving cellular integrity . This effect was observed in a wavelength of 660 nm at 60 and 120 minutes. The same effect was not observed with the wavelength of 780 nm. So, the present study allowed us to better understand the pathophysiological effects of Bothropoides venom, and contributed to a better understanding of the effects of low power laser and eventually facilitate therapeutic measures more efficient and / or complementary.. Keywords : endothelium , Bothropoides jararaca, low level laser.

(10) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. ÍNDICE. Conteúdo. Página. Resumo 1.Introdução. 06. 1.1.Acidentes ofídicos e epidemiologia. 06. 1.2.Mecanismos de ação do veneno botrópico. 08. 1.3.A serpente Bothropoides jararaca. 09. 2.Considerações gerais sobre o endotélio vascular 2.1.O veneno botrópico e as células endoteliais. 14 16. 3.Soroterapia. 17. 4. Terapia com laser de baixa potência. 20. 4.1. LBP e acidentes ofídicos. 21. 4.2. Laser e células em cultura. 22. 5. Objetivos. 24. 5.1. Geral. 24. 5.2. Específicos. 24. 6. Material e Métodos. 25. 6.1. Veneno de serpente Bothropoides jararaca (VBj). 25. 6.2. Células endoteliais (CE). 25. 6.3. Cultivo Celular. 25. 6.4. Irradiação laser de baixa potência. 26. 6.5. Ensaio de viabilidade celular (MTT). 28. 6.6.. 29. Ensaio para a avaliação da integridade da monocamada de células. endoteliais – Descolamento Celular 6.7. Análise da liberação da lactato desidrogenase (LDH). 29. 7. Análise estatística. 31. 8. Resultados e Discussão. 32. 8.1. Efeito do veneno de B. jararaca (VBj) na integridade de células. 32. endoteliais tEND 8.2. Efeito do veneno de B. jararaca (VBj) na viabilidade de células. 34. endoteliais tEND 8.3. Efeito da exposição do veneno de B. jararaca ao Laser de Baixa Potência. 36. na integridade das células endoteliais tEND. 8.4. Efeito da exposição do veneno de B. jararaca ao Laser de Baixa Potência na viabilidade das células endoteliais tEND.. 38.

(11) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. 8.5. Efeito do Laser de Baixa Potência 660 nm na integridade de células. 40. endoteliais submetidas à lesão por veneno B. jararaca. 8.6. Efeito do Laser de Baixa Potência 780 nm na integridade de células. 42. endoteliais submetidas à lesão por veneno B. jararaca. 8.7. Efeito do Laser de Baixa Potência (LBP) 660 nm na viabilidade de células endoteliais submetidas à lesão por veneno B. jararaca. 8.8. Efeito do Laser de Baixa Potência (LBP) 780 nm na viabilidade de células endoteliais submetidas à lesão por veneno B. jararaca. 8.9. Efeito do Laser de Baixa Potência (LBP) 660 nm na liberação da enzima Lactato Desidrogenase (LDH) de células endoteliais submetidas à lesão por veneno B. jararaca. 8. 10. Efeito do Laser de Baixa Potência (LBP) 780 nm na liberação da enzima Lactato Desidrogenase (LDH) de células endoteliais submetidas à lesão por veneno B. jararaca.. 44 46 48. 50. 9.Discussão. 52. 10. Considerações Finais. 59. 11. Referências Bibliográficas. 60.


(13) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. 1. INTRODUÇÃO 1.1.. Acidentes ofídicos e epidemiologia. Acidente ofídico ou ofidismo é o quadro de envenenamento decorrente da inoculação de toxinas através do aparelho inoculador de serpentes. Devido ao grande número de casos, os acidentes causados por serpentes peçonhentas constituem, ainda, um problema de Saúde Pública em regiões tropicais do mundo (Chippaux, 1998; Moura da Silva, 2012). No Brasil, o primeiro estudo epidemiológico de acidentes ofídicos foi realizado por Vital Brasil em 1901, quando levantou o número de óbitos por picadas de serpentes peçonhentas no Estado de São Paulo, registrando um número considerável de óbitos por acidentes ofídicos desde 1900 (Bochner et al, 2003), devido ao agravamento do quadro após o envenenamento, conforme Tabela 1. As serpentes responsáveis pelo maior número de acidentes ofídicos na América Latina pertencem ao gênero Bothrops e Bothopoides, da família Viperidae (Moura da Silva, 2012), e por esse motivo, esse gênero constitui o grupo mais importante, com mais de 60 espécies em todo o território e pode ser encontrada em ambientes diversos. Segundo registros das ocorrências anuais, as serpentes do gênero Bothrops e Bothropoides são responsáveis por mais de 90% dos acidentes ofídicos no Brasil (Chippaux, 1998; Moura da Silva, 2012), sendo que a maior frequência desses acidentes envolve a serpente Bothropoides jararaca (Nishijima et al, 2009).. 6.

(14) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. Tabela 1. Acidentes ofídicos e suas respectivas gravidade. Extraído de: Extraído de: Ministério da Saúde- Acidentes ofídicos http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/gve_7ed_web_atual_aap.pdf. Com relação ao gênero Bothrops e Botropoides, os acidentes causados por essas serpentes não apresentam alta letalidade (0,31 %), porém devido. à. alta. incidência,. são. consideradas. de. grande. importância. epidemiológica no país (Manual de diagnóstico e tratamentos de acidentes por animais peçonhentos, 1999), conforme exemplificado na figura.. 7.

(15) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. Figura 1 – Acidentes ofídicos ocorridos no Brasil.. 1.2.. Mecanismo de ação do envenenamento botrópico. Os venenos ofídicos constituem uma mistura complexa de proteínas e outros compostos, com as mais diversas propriedades biológicas. Acredita-se que os seus efeitos resultem da somatória dos efeitos isolados dos vários componentes, com atividades biológicas distintas ou sinérgicas (Takeya et al., 1990; Zychar et al., 2010; Bruserund, 2013). O envenenamento pela espécie Bothrops e Bothropoides leva a manifestações sistêmicas e locais, as quais incluem desde dor e edema à insuficiência renal e choque hipovolêmico (Warrell, 1996; Doin-Silva, et al., 2009; Milani Junior, et al., 1997; Carneiro, et al., 2002; Zychar et al., 2010; Bruserund, 2013). Dentre as manifestações após o envenenamento, aquelas locais se evidenciam nas primeiras horas após a picada com a presença de edema, dor e equimose na região da picada, que progride ao longo do membro acometido. 8.

(16) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. Além disso, as marcas nem sempre são visíveis no momento da picada, assim como o sangramento nos pontos de inoculação das presas. Bolhas com conteúdo seroso ou serohemorrágico podem surgir na evolução e dar origem à necrose cutânea. As principais complicações locais são decorrentes da necrose e da infecção secundária que podem levar à amputação e/ou déficit funcional do membro (Chippaux, 1998; Warrell, 1996). As manifestações sistêmicas são evidenciadas por sangramentos em pele e mucosas (gengivorragia, equimoses à distância do local da picada); hematúria, hematêmese e hemorragia em outras cavidades podem determinar risco ao paciente. A hipotensão, também presente, pode ser decorrente de sequestro de líquido no membro picado ou hipovolemia consequente a sangramentos, que podem contribuir para a instalação de insuficiência renal aguda (Chippaux, 1998; Warrell, 1996).. 1.3 A serpente Bothropoides jararaca (B. jararaca) A serpente Botropoides jararaca anteriormente classificada como Botrhops jararaca apresenta porte médio, podendo atingir até 1,5 m, com presença de escamas superiores fortemente quilhadas. As espécies desse gênero são encontradas em todo o Brasil e também nas regiões adjacentes ao Paraguai e Argentina (Barraviera, 1993), conforme figura 2 abaixo:. 9.

(17) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. Maior prevalência B. jararaca. Figura 2 – Distribuição geográfica da B. jararaca extraída de:www.cobrasbrasileiras.com.br. O veneno da serpente B. jararaca consiste de uma mistura complexa de várias classes de toxinas, sendo que a maior parte consititui-se de metaloproteinases (Moura-da-Silva, et al., 2012). Diferentemente de outros venenos botrópicos, o veneno de B. jararaca apresenta concentrações muito baixas de fosfolipase A2 e/ou miotoxinas; outra classe de protease presente no veneno de B. jararaca são as serinoproteases, as quais são capazes de induzir a liberação de bradidinina (Moura da Silva et al, 2012). Nesse sentido, o gênero B.jararaca possui veneno com maior atividade proteolítica em comparação aos demais venenos, sendo demonstrado por estudos que a hemorragia consiste na maior atividade tóxica do veneno de jararaca (Nishijima et al., 2009; Teixeira et al., 2005; Baldo et al., 2010; Mourada-Silva, et al., 2012).. 10.

(18) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. A literatura sugere que metaloproteinases do veneno da serpente (SVMPs) são responsáveis pela hemorragia local no envenenamento ofídico (Baramova et al., 1989; Kamiguti, 1996; Nishijima et al., 2009; Teixeira et al., 2005; Baldo et al., 2010; Moura-da-Silva, et al., 2012).. Ainda, as SVMPs. possuem efeito citotóxico sobre as células endoteliais, atuando principalmente no sistema homeostático (Nishijima et al, 2009). Assim, a patogenicidade envolvida no envenenamento por B. jararaca inclui a. lesão de vasos da microcirculação,. através da ação das. metaloproteinases do veneno ofídico, as quais pertencem à uma subfamília de enzimas Zn2+-dependentes (Teixeira et al, 2005; Nishijima et al, 2009; Brenes et al., 2010; Domingos et al, 2013). A lesão dos vasos ocorre quando há inoculação do veneno, que contém dentre outros componentes, SVMPs, astacinas e serralisinas, classficadas conforme a figura 03, e que agem na matriz celular por possuírem elevada afinidade com a mesma (Teixeira et al, 2005; Baldo et al, 2010), desencadeando os efeitos miotóxicos. 11.

(19) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. Figura 3: Classificação das Metaloproteinases de venenos.. Extraído de Fox et al., 2008 Dados da literatura indicam que as SVMPs atuam sobre proteínas da matriz extracelular, com diferentes especifidades. Considerando que as proteínas presentes na matriz são importantes para manter a integridade estrutural e funcional do endotélio, foi proposto que a degradação dos seus componentes pelas metaloproteinases de venenos poderia ser o principal mecanismo envolvido na produção de hemorragia, através da proteólise da membrana basal, permitindo a formação de fendas intercelulares, culminando com a saída de hemácias (Baramova et al,1989; Teixeira et al, 2005; Nishijima et al, 2009; Baldo et al, 2010). Ainda, a literatura demonstra que as SVMPs hemorrágicas, com elevado peso molecular, que são constituídas por domínios semelhantes de disintegrina e domínios ricos de cisteína, são mais ativas na indução hemorragia em comparação à enzimas que abrangem apenas o domínio de metaloproteinases (Teixeira et al, 2005; Brenes et al., 2010). Ademais, a. 12.

(20) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. atividade hemorrágica tem sido associada, também, com a atividade proteolítica (Teixeira et al, 2005), as quais promovem degradação estrutural e funcional presente na mionecrose (Baldo et al, 2010). Diante disso, as células endoteliais têm sido estudadas como potenciais alvos das toxinas hemorrágicas (Baldo et al, 2010) sendo que o principal mecanismo de adesão de células endoteliais pode ser interrompido pela presença de SVMPs, utilizando de mecanismos dependentes ou independentes de sua atividade proteolítica. Tanto as SVMPs hemorrágicas quanto as não hemorrágicas demonstraram interferir nos componentes envolvidos na adesão entre as células endoteliais e as proteínas presentes na matriz extracelular, culminando na morte celular por apoptose (Teixeira et al, 2005).. Em. estudos experimentais,. as. SVMPs. hemorrágicas. e. não-. hemorrágicas são capazes de induzir comparável taxas de apoptose em células endoteliais, e o aparecimento da hemorragia induzida pelas SVMPs ocorre muito mais cedo do que a indução de apoptose de células endoteliais in vitro. (Baldo et al, 2010). Dentre as SVMPs presentes no veneno de B. jararaca, entre as isoladas, a jararagina é a que tem sido melhor estudada e pertence ao grupo PIIIb, uma MMP hemorrágica, e atua promovendo o influxo leucocitário e pode estimular diretamente a expressão de mRNA dos genes TNF, IL-1 e IL-6, por macrófagos licitados (Teixeira et al, 2005), o que sugere que os macrófagos constituem de alvos importante do mecanismo envolvido na ação decorrente das SVMPs no processo inflamatório (Teixeira et al, 2005; Baldo et al, 2010). A jararagina foi a primeira SVMPs isolada do veneno da B. jararaca e foi caracterizada por completo sua estrutura primária, mostrando que atua 13.

(21) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. diretamente nos vasos sanguíneos endoteliais e sub-endoteliais, na matriz proteica, plaquetas, coagulação, fatores como Fator de von Willebrand (vWF) e fibrinogênio. Ainda, atua sobre os receptores da superfície das células e sobre os fibroblastos, células epiteliais e inflamatórias, sendo capaz de promover a degradação da fibrina e aumento da fibrinólise devido ao aumento da atividade ativadora do plasminogênio tecidual e inativação do inibidor de α2 plasmina, além de interferir na função plaquetária através da inibição de colágeno e na agregação de plaquetas induzida por ristocetina (Moura-da-Silva et al., 2012). Ademais, Baldo et al. (2010), buscou comparar os efeitos hemorrágicos imediatos entre a SVMPs BnP1, extraída da B. neuwiedi, pertencente ao grupo P-Ia e, portanto, considerada de baixo potencial hemorrágico, e a jararagina, na pele de camundongos. Esse estudo teve por objetivo avaliar as alterações provocadas entre as SVMPs. A jararagina foi capaz de produzir um efeito hemorrágico intenso, enquanto que mesmo as doses mais elevadas de BnP1 não foi capaz de produzir efeito comparável. Ainda, este trabalho mostrou que a jararagina causa lesão hemorrágica na hipoderme dos animais, indicando degradação massiva de colágeno fibrilar e que a jararagina foi localizada próximo aos pequenos vasos sanguíneos. (Baldo et al, 2010).. 2. CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE O ENDOTÉLIO VASCULAR O endotélio vascular é constituído por uma camada contínua de células – células endoteliais - que revestem o lúmen dos vasos e separam o sangue dos tecidos. A sua integridade funcional e estrutural é fundamental para a manutenção da homeostasia e da função circulatória (Carvalho, 1996). 14.

(22) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. As células endoteliais de um modo geral são alongadas, poligonais e dotadas de ampla superfície. A parte luminal está continuamente exposta às células circulantes e aos componentes plasmáticos. A porção oposta, abluminal, está em contato com a matriz extracelular e tecidos adjacentes, que por meio de integrinas, liga-se a lamina basal. Esta é constituída por vários tipos de colágenos (tipo IV, V e VII), laminina, sulfato de heparan e de condroitina,. proteoglicanos,. entactina,. nidogênio. e. sialoglicoproteínas,. associados à fribonectina. Dado o alto teor de colágeno, a lâmina basal pode ser digerida por colagenases (Carvalho et al., 1996). O endotélio além da sua função como membrana semipermeável, é considerado um tecido metabolicamente ativo. Por sua capacidade de sintetizar e secretar inúmeras substâncias exerce várias funções fisiológicas: a) no metabolismo de substâncias vasoativas, por conter enzimas que transformam a angiotensina I em angiotensina II e inativam a noradrenalina, serotonina e bradicinina; b) na hemostasia, por meio da produção de substâncias coagulantes. (fator. de. Von. Willebrand;. inibidor. de. plaminogênio). e. anticoagulantes, como a prostaciclina (PGI2) c) na produção de antígenos dos grupos A e B, fibronectina, colágenos d) na modulação do tônus vascular, por sua capacidade de produzir e liberar fatores relaxantes da musculatura lisa dos vasos, como o óxido nítrico (NO) (Moncada, et al., 1988; Moncada et al., 1991). Por outro lado as células endoteliais sofrem alterações de estrutura, função e propriedades metabólicas, em resposta a fatores de crescimento, substâncias vasoativas e citocinas, que variam de acordo com o tecido em que se localizam (Thuillez, 2005). Desse modo, o endotélio ativado afeta o. 15.

(23) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. crescimento do músculo liso, por sua capacidade de gerar diversos fatores de crescimento que induzem espessamento da parede dos vasos e favorecem o desenvolvimento de doenças cardiovasculares (Carvalho et al., 1996). Em síntese, o endotélio, em condições fisiológicas, desempenham papel protetor do sistema cardiovascular, liberando substâncias que modulam a contração do músculo liso vascular, a sua proliferação, a adesão e agregação plaquetária e controlam a hemostasia. Portanto, em condições de disfunção ou lesão desse tecido, há repercussão sobre a estrutura vascular, tecido adjacente e, por fim, sobre o sistema cardiovascular.. 2.1. O veneno botrópico e as células endoteliais Os. venenos. e. as. toxinas. hemorrágicas. isoladas. afetam,. principalmente, a integridade de vasos de pequeno calibre (Ownby, 1990; Borkow et al., 1993). Lomonte et al. (1994) demonstraram que os vasos da microcirculação perdem a sua integridade em 4 a 6 minutos após exposição ao veneno de Bothrops asper. Este efeito foi atribuído, em parte, à proteólise da membrana basal dos vasos pelo veneno, levando à saída de eritrócitos por processo ainda não esclarecido. Adicionalmente, os venenos hemorrágicos, de modo geral, causam uma série de alterações morfológicas e degenerativas em células endoteliais, que progridem até a formação de fendas intercelulares, permitindo a saída de hemácias (Ownby, 1990; Lomonte et al, 1994). Estes dados sugerem uma ação direta principalmente das SVMPS, importante para o desenvolvimento da hemorragia. 16.

(24) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. Ainda, a mionecrose local é uma consequência comum nos envenenamentos causados pelas serpentes do gênero Bothropoides. Há evidências de que a mionecrose é causada por uma família de proteínas denominadas miotoxinas, componentes dos venenos botrópicos, as quais possuem características de fosfolipases A2 (PLA2) e atuam diretamente sobre a membrana da célula muscular, por se ligarem e alterarem a membrana plasmática (Gutierréz et al., 1984; Brenes et al., 1987).. Essas miotoxinas. induzem dano tecidual proeminente, de forma que, as alterações morfológicas são observadas a partir de 15 minutos de sua injeção (Gutierréz & Lomonte, 1995). A miotoxicidade pode, ainda, ser consequência da isquemia dos vasos da microcirculação e de artérias intramusculares (Gutierréz et al., 1984; Queiróz & Petta, 1984). Neste sentido, um mecanismo adicional envolvido na atividade das SVMPs hemorrágicas poderia estar relacionado com o acúmulo dessas SVMPs próximo de vasos capilares, através das propriedades adesivas de domínios não catalíticos promovendo a hidrólise dos componentes da membrana basal e o rompimento dos vasos sanguíneos. Este mecanismo tem sido sugerido, mas até o momento não há evidências experimentais de que isso ocorre in vivo (Baldo et al, 2010). Ainda, foi demonstrado que a BaP1, uma SVMP isolada do veneno de B. asper, causa morte celular por apoptose em célula endotelial mas que aparentemente as células endoteliais sofrem outros tipos de morte celular, o que gera efeitos citotóxicos (Brenes et al., 2010).. 3. SOROTERAPIA Devido à eficiência dos antivenenos, os coeficientes de letalidade, decorrentes do envenenamento botrópico, têm revelado tendência decrescente 17.

(25) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. ao longo do tempo. No entanto, a eficiência do tratamento do envenenamento botrópico é baseada no tempo de adminstração do antiveneno específico (Hansson et al., 2013). Estudos experimentais têm sugerido que existe uma significante, embora parcial, neutralização da hemorragia, edema e mionecrose apenas. quando. o. antiveneno. é. administrado. rapidamente. após. o. envenenamento (Battelino et al., 2003; Domingos et al, 2013). Neste sentido, Camey et al (2002), estudaram o efeito farmacológico do veneno de cinco espécies botrópicas brasileiras: B. atrox, B. leucurus, B. erythromelas, B. jararaca e B. jararacussu, e verificaram que o antiveneno foi efetivo na neutralização sistêmica da atividade tóxica de todos os venenos testados. Porém, os efeitos locais não são neutralizados pelo uso de antiveneno e os mecanismos envolvidos nesta falta de proteção, até o momento, não foi esclarecido. Assim, a neutralização dos efeitos tóxicos sistêmicos é obtida, mas a neutralização dos danos no tecido local, normalmente não ocorre. Portanto, a busca de inibidores e/ou neutralizadores complementares à soroterapia para redução dos efeitos locais causados pelo veneno se reveste de importância (Nishijima et al, 2009). No Brasil, tem sido crescente o interesse em investigar terapias coadjuvantes à soroterapia já existente, embora ainda que insipientes, já existem estudos que combinam o uso da soroterapia à aplicação de extratos de plantas medicinais e substâncias sintéticas (Biondo et al., 2003; Cavalcante et al., 2007). Nesse sentido, Domingos et al (2013) tem descrito o composto de 1,2,3triazóis como uma classe com destaque e presente no sistema heterocíclico de. 18.

(26) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. azoto de cinco membros, que apresenta diferentes perfis farmacológicos, tais como atividade antiplaquetária, anticoagulante, antiviral, antimicrobiana, entre outras funções e, foi demonstrado que tal composto foi capaz de inibir a hemólise causada por veneno de B. jararaca (50 ug/ml) e L. Muta (15 ug/ml). A inibição foi superior a 50% contra ambos os venenos. Igualmente, Faioli et al (2013), concluiu que os extratos de esponjas marinhas são capazes de inibir os efeitos in vivo, como hemorragia e edema e os efeitos in vitro, como a coagulação, atividade proteolítica e hemolítica, desencadeados pela inoculação dos venenos de serpentes de B. jararaca e L. muta. Também verificaram que a administração de veneno de B. jararaca foi letal para camundongos após duas horas e apenas extratos das esponjas marinhas, como A. fulva , A. viridis , ou P. citrina, foram capazes de aumentar as taxas de sobrevivência dos animais (Faioli et al, 2013), provavelmente pela capacidade de neutralização dos efeitos sistêmicos. Isso ocorreu devido ao fato de que os extratos de esponja foram capazes de inibir a hemólise induzida pelos venenos (Domingos et al, 2013; Faioli et al, 2013; Zychar et al, 2010). Nishijima et al (2009) descreveu que os extratos vegetais contêm uma grande diversidade de compostos químicos contendo uma grande variedade de atividades farmacológicas e buscou avaliar o potencial efeito anti-hemorrágico de extratos vegetais e flavonóides obtidas a partir de vegetais como Mouriri pusa, Byrsonima crassa, Davilla elliptica e Quina do Cerrado. Os resultados sugerem que os extratos metanólicos e flavonóides de Mouriri pusa e Davilla elliptica exerceram grande capacidade de neutralizar totalmente veneno contra a atividade hemorrágica do veneno de B. jararaca, provavelmente por conter substâncias ricas em flavonóides, que serviram como quelantes das SVMPs. 19.

(27) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. presente no veneno, sugerindo modelos para a concepção de novas moléculas para melhorar o tratamento atual preconizado para o envenenamento. Entretanto, qualquer que seja a abordagem terapêutica até hoje disponível, esta tem se mostrado ineficaz na neutralização dos efeitos locais produzidos pelo veneno botrópico, os quais são de evolução rápida e intensa. Por esses motivos, a procura por abordagens alternativas às usualmente empregadas tem sido motivo de interesse e se constituem em medidas extremamente relevantes para neutralização e/ou diminuição dos efeitos degenerativos, bem como a aceleração do processo regenerativo. Outra possibilidade que começa a ser implementada é a utilização de laserterapia.. 4. TERAPIA COM LASER DE BAIXA POTÊNCIA A palavra laser é uma sigla que corresponde “Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation, a qual significa “Amplificação da Luz por Emissão Estimulada por Radiação” (Maluf, et al., 2006; Lins et al., 2010). A ação do laser consiste na absorção da luz pelos tecidos, resultando em modificações no metabolismo celular. Quando o laser é aplicado nos tecidos a luz é absorvida por fotorreceptores localizados nas células, sendo capaz de modular as reações bioquímicas específicas dentro da célula e estimular uma série de reações em cadeia mitocondrial, resultando em síntese de ATP (Dortbudak, 2000; Stein, et al.,2005; Rénno et al.,2011). A radiação laser, também denominada de terapia fotodinâmica pode influenciar as células individualmente através da energia emitida pelo laser e absorvida pelas células (Hawkins-Evans, 2008; Szymanskj et al., 2013.). As. 20.

(28) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. estruturas celulares possivelmente envolvidas nesses mecanismos são as mitocôndrias, as quais fornecem energia para as células, e que possuem uma série de enzimas que participam nas reações redox que ocorrem na cadeia respiratória, e que possivelmente constituem o principal mecanismo envolvido nas reações metabólicas que ocorrem em uma célula (Szymanskj et al., 2013.). Adicionalmente, a terapia a laser de baixa potência (LBP) é considerada como um recurso bioestimulante em tecidos, por meio de seus efeitos biológicos, tais como analgésicos, antiinflamatórios e cicatrizantes (Lins, et al., 2010). Irradiação por laser de baixa potência são amplamente utilizados no tratamento de doenças crônicas e também como terapia de reabilitação (Vladimirov, 2012). O laser vermelho e infravermelho pode ser usado in vitro para estimular a função das células, por promover um aumento no número de células, e estimular a síntese de RNA, promovendo também a diferenciação das células (Firestone et al, 2012; Dortbudak, 2000). Khanna et al (1999), examinaram a influência de radiação laser de HeNe (632,8 nm) sobre o proliferação celular e sobre fatores angiogênicos de VEGF e secreção de TGF-β por cardiomiócitos. Os resultados desse estudo in vitro mostram aumentos estatisticamente significativos na proliferação celular com potência de 5 W/cm2 e tempo de radiação de 15 e 20 minutos em comparação com o grupo de controle. A expressão de VEGF e TGF-β aumentou significativamente quando expostos a 10, 15 e 20 minutos de radiação com LBP. Igualmente, o efeito estimulante do LBP tem sido amplamante estudado sobre proliferação de células endoteliais humanas, além do aumento nos níveis. 21.

(29) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. de VEGF e TGF-β de secreção (Arany et al, 2007; Hakki et al, 2012; Kipshidze et al, 2001). As conclusões dos estudos demonstram claramente a capacidade da irradiação com o LBP para modular a expressão do gene e a liberação de fatores de crescimento e citocinas a partir de células em cultura (Khanna et al, 1999).. 4.1.. LBP e acidentes ofídicos. Até o momento, poucos trabalhos foram publicados utilizando o LBP para a avaliação do efeito local causado por veneno ofídico. Dourado, et al., estudou o efeito da irradiação laser Ga-As (Arseneto de Galium), em mionecrose, induzida pelo veneno de serpente Bothrops moojeni. autores. observaram. que. o. tratamento. com. esse. laser. Esses diminuiu. consideravelmente a mionecrose, inibindo a habilidade do veneno de desfazer a integridade da membrana plasmática (Dourado et al., 2003). Ainda, Barbosa, et al., demonstraram a eficácia do LBP na resposta inflamatória local após lesão por veneno de Bothrops jararacussu no músculo gastrocnêmio de ratos, onde foram submetidos à laserterapia combinada com antiveneno, resultando em diminuição de edema e redução do influxo leucocitário após a lesão (Barbosa et al., 2008).. Doin-Silva, et al. (2009),. utilizaram a aplicação do LBP, no músculo tibial anterior de ratos 60 minutos após a administração do veneno de B. jararacussu, e observaram que houve diminuição na concentração de creatina quinase e redução das áreas de mionecrose do músculo. Ademais, dados do nosso grupo também demonstram uma redução significativa de mionecrose induzida por veneno de B. jararacussu e as 22.

(30) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. miotoxinas BThtx I e II, após tratamento utilizando LBP, (Barbosa, et al., 2009; Barbosa, et al., 2010). Além disso, demonstramos que o LBP reduz a hemorragia e dor induzidas pelo veneno de B. moojeni (Nadur-Andrade, 2012, 2013). Estes dados sugerem o LBP como uma ferramenta terapêutica eficaz para o tratamento local em casos de envenenamento botrópico.. 4.2.. Laser e células em cultura. Ao correlacionar a utilização do LBP em células de cultura, Alghamdi, et al., (2011), corrobora que o LBP foi capaz de causar aumento no número de células, síntese de DNA e RNA e aumento na taxa de ATP em células-tronco e em outras linhagens celular. Ainda, foi sugerido utilizar o valor da densidade de energia entre 0.5 a 4.0 J/cm2 e um espectro visível entre 600 e 900 nm de LBP demonstrando ser úteis para melhorar a proliferação celular (Alghamdi, et al., 2011). A aplicação do LBP Arseneto de Gálio Alumínio em osteoblastos cultivados em disco de Titânio, utilizando o comprimento de onda de 780 nm e dose de 3 J/cm2 , demonstrou estimular a diferenciação osteoblástica (Petri, et a.,l 2010). O uso desta técnica terapêutica demonstrou ser também eficaz no crescimento de células epiteliais de rim de macaco cultivado em situação de carência nutricional (2% de SFB), quando aplicadas irradiações repetidas de LBP (InGaAlP) (Eduardo, et al., 2007). Por tais motivos, determinar parâmetros como comprimento de onda, densidade de energia, potência e tempo de aplicação do laser é importante para se obter uma resposta celular adequada ao tratamento. Hawkins et al. (2006), também relataram que a aplicação do LBP apresentou um efeito 23.

(31) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. estimulante na resposta celular de fibroblastos alterados, resultando no aumento de migração celular, viabilidade e proliferação celular e atividade de ATP.. 24.

(32) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. 5. OBJETIVOS 5.1.. Geral. Analisar a influência da laserterapia de baixa potência sobre células endoteliais tEnd, após lesão com o veneno de Bothropoides jararaca.. 5.2.. Específicos. Através de ensaios in vitro, foram avaliados os efeitos da irradiação laser de baixa potência sobre células endoteliais submetidas aos efeitos do veneno de Bothropoides jararaca quanto a: I- Viabilidade das células (MTT); II- Integridade; III- Liberação de marcador de lesão celular (LDH). 25.

(33) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. 6. MATERIAL E MÉTODOS Este estudo foi realizado no laboratório de cultivo celular do curso de Mestrado em Medicina da Universidade Nove de Julho (UNINOVE).. 6.1. Veneno de serpente Bothropoides jararaca (VBj): Os venenos utilizado foram extraídos de vários exemplares adultos de serpentes B. jararaca, provenientes do Instituto Butantan. Os venenos foram reunidos em um mesmo tubo, homogeneizados, submetidos à liofilização e mantidos a - 20oC até o momento de sua utilização.. 6.2. Células endoteliais (CE): Utilizou-se células endoteliais murinas (hibridomas) da linhagem tEnd (thimic endothelium), gentilmente cedidas pelo Dr. Bruno Lomonte, do Instituto Clodomiro Picado, da Universidade da Costa Rica, Costa Rica.. 6.3. Cultivo Celular: As CE obtidas foram cultivadas em frascos de poliestireno de 25 cm² (COSTAR), contendo 5 mL de meio de cultura DMEM (SIGMA), suplementado com soro fetal bovino (SFB) 10%, gentamicina (40 πg/mL) e L-glutamina (2 mM/L) e mantidas em incubadora, em atmosfera de 5% C02, a 37°C. O meio de cultura foi trocado a cada 24 horas e as células foram, então, subcultivadas. Para tanto, o meio de cultura DMEM foi aspirado com pipeta Pasteur e as células lavadas com 2 mL de uma solução salina balanceada (PBS). Em seguida, 2 mL de uma solução de tripsina 0.05%/ EDTA 0.02% foram adicionados ao frasco de cultura, o qual retornou à estufa de cultura (5% CO2), a 37°C, por um período de até 5 minutos. Decorrido esse. 26.

(34) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. período, as células foram observadas ao microscópio de luz invertida (Carl Zeiss), para a verificação do destacamento das mesmas. Em seguida, as células, tripsinizadas e homogeneizadas, foram colocadas em um tubo de 50 mL (COSTAR) e centrifugadas a 1200 x g, por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e as CE foram ressuspendidas em meio DMEM/SFB. A partir daí, as células foram semeadas em frascos de cultura de 75 cm² com meio DMEM/SFB, previamente ambientalizado na estufa de cultura.. 6.4. Condições de tratamento: Os experimentos foram realizados em um ambiente com obscuridade parcial para não sofrer interferência da luz externa. A cultura de células endoteliais foram divididas em oito grupos, conforme tabela abaixo: Tabela 03- Grupos experimentais e aplicabilidade NOME. Grupo 1. GRUPOS CELULARES Controle. TRATAMENTO Células + meio de cultura DMEM. Grupo 2. Células + LBP. Células + 660nm. Grupo 3. Células + LBP. Células + 780nm. Grupo 4. Veneno. Células + Veneno Bj. Grupo 5. Veneno irradiado. Veneno irradiado 660nm + células. Grupo 6. Veneno irradiado. Veneno irradiado 780nm + células. Grupo 7 Grupo 8. Células + Veneno. Células + veneno- tratadas. + Laser. com laser 660nm. Células + Veneno. Células + veneno- tratadas. + Laser. com laser 780nm. 27.

(35) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. Conforme supracitado, os grupos 1, 2 e 3 foram avaliados como controle. Para avaliação do efeito do veneno sobre as células endoteliais tEND, foram divididos os grupos 4, em que somente o veneno foi adicionado às células; grupo 5 e 6, em que o veneno foi previamente irradiado a 660nm e a 780nm, respectivamente, e posteriormente adicionado às células, sem tratamento posterior; no grupo 7 e 8, o veneno sem irradiação foi adicionado às células e as mesmas foram tratadas com o laser a 660nm e a 780nm, respectivamente. A cultura foi irradiada imediatamente após a adição do veneno na cultura, e foi aplicada, no poço, de forma pontual inferior, de modo a atingir a monocamada de células endoteliais, conforme a figura:. 6.4. Irradiação com laser de baixa potência: Utilizou-se o Laser da marca DMC® modelo Twin Laser, com comprimento de onda de λ 660 nm, potência de 70 mW (densidade de potência de 105 W/cm2), área do feixe de 0,028cm2, e, comprimento de onda de λ 780 nm, potência de 40 mW (densidade de potência de 0,60 W/cm2), área do feixe de 0,028cm2, em meio. 28.

(36) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. ativo de Arseneto de Gálio e Alumínio (AsGaAI), com densidade de energia de 4 joules/cm2 e tempo de 10 segundos, conforme resumo na tabela abaixo:. Tabela 2- Protocolo para aplicação do laser vemelho e infra-vermelho Equipamento: Twin Laser ® Parâmetros. Laser Vermelho. Laser Infra-vermelho. Comprimento de onda (nm). 660. 780. Densidade de energia(J/cm2). 4. 5. Energia total (J). 1,3. 2. Potência (mW). 70. 20. Densidade de Potência. 105. 90. Área irradiada (cm 2). 0,3. 0,3. Área do feixe (cm2). 0,028. 0,028. Modo de aplicação. Pontual. Pontual. Tempo de irradiação (s). 10. 10. (W/cm2). 6.5. Ensaio de viabilidade celular (MTT): Após a incubação das células (1X104cel/poço) com o veneno nas respectivas concentrações (5, 10, 12,5, 25 e 50 g/mL), em meio de cultura (controle), e posteriormente irradiadas e incubadas por 30, 60 e 120 minutos, foram avaliadas a viabilidade celular pelo método MTT. As células foram lavadas com 200 µl de PBS 1X. Em seguida, foram adicionados 50 µl de MTT (0,5 ug/ml em tampão) (3-[4,5-Dimethylthiazol2yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide; Thiazolyl blue –SIGMA) e incubadas por 3h a 37°C. Terminado o tempo de incubação, a solução foi removida cuidadosamente e foram adicionados 100 µl de isopropanol para ressuspender e solubilizar o precipitado. Por fim, será realizada a leitura da absorbância a. 29.

(37) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. 620nm com auxilio de um leitor de placas (2020, Anthos, Eugendorf, Áustria) (Mosmann, 1983). Após a determinação da curva dose-resposta, o repetiu-se o método de viabilidade celular (MTT), utilizando-se a dose de 10µl/mL, em grupos divididos conforme a Tabela 03.. 6.6.. Ensaio para a avaliação da integridade da monocamada de. células endoteliais – Descolamento Celular: As células endoteliais foram plaqueadas 1x104 cel/poço em placas de 96 poços e incubadas por 48 horas para adesão celular. Após esse período as células receberam o veneno nas concentrações supracitadas, em meio de cultura (controle) e imediatamente foram irradiadas com laser, em seguida as células foram incubadas por 30, 60 e 120 minutos. Após cada período de incubação, os sobrenadantes das culturas foram retirados e as monocamadas lavadas com 100 µl de PBS 1X. Em seguida, foram adicionados 40µL de cristal violeta (0,5%) em ácido acético (30%) por poço. Decorridos 15 minutos, as placas foram lavadas e colocadas para secar. A seguir, 100µL de metanol absoluto (MERCK) foram adicionados em cada poço e a leitura da densidade óptica (D.O.) foi realizada em leitor de ELISA a 620 nm. A lesão causada foi definida como a porcentagem de descolamento celular, observada na monocamada submetida à ação do veneno em relação à monocamada endotelial não estimulada pelos mesmos.. 6.7. Análise da liberação da lactato desidrogenase (LDH): A atividade enzimática da LDH, presente no sobrenadante das culturas, foi tomada como parâmetro de lesão celular (Thomas, et al., 1993; Yildiz, et al., 1999; Zhao et al,. 30.

(38) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. 2013; Wang et al, 2013). Após cada período de incubação, descritos no item 6.5, o sobrenadante foi retirado e centrifugado a 200 x g, por 6 minutos. A seguir, 20 µL do sobrenadante foram adicionados a outras placas de cultura de 96 poços, acompanhados da adição de 130 µL do substrato/poço, em tampão fosfato contendo: NaCl 200mM, NADH 0,2 mM, piruvato 1,6 mM/poço. Foi feita então, a leitura da D.O., a 340 nm, no intervalo de tempo entre 0 e 10 minutos. Os resultados foram expressos pelo decréscimo da D.O., resultante da oxidação do NADH, na presença de piruvato, em relação ao tempo zero.. 31.

(39) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. 7. ANÁLISE ESTATÍSTICA: Os resultados obtidos foram expressos como média ± desvio padrão da média e analisados estatisticamente pelo teste “t” de Student ou Análise de Variância (ANOVA), complementado por testes de significância apropriados. Os dados foram analisados com auxílio do software “GraphPad Prism 5.0”, considerando que nos experimentos curva dose-resposta adesão, viabilidade e descolamento celular foi utilizado o pós teste Dunnet e a significância estatística aceitável quando p ≤ 0,05. Foram realizados três experimentos independentes e todas as amostras foram feitas em triplicata.. 32.

(40) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. 8. RESULTADOS. 8.1.. Efeito do veneno de B. jararaca (VBj) na integridade de células endoteliais tEND. A capacidade do VBj em afetar a integridade das monocamadas das células endoteliais tEND, em cultura, foi avaliada pelo descolamento das monocamadas, após sua incubação com a tEND, por 30, 60 e 120 minutos, em diferentes concentrações (5, 10, 12,5, 25 e 50 µg/mL) em comparação às monocamadas contendo apenas meio de cultura (controle). Na concentração de 5 µg/mL, o veneno causou um descolamento da ordem de 32 %, aos 120 minutos; nos demais períodos de tempo, não houve alteração da integridade das monocamadas. Nas concentrações de 10, 12,5, 25 e 50 µg/mL, o veneno foi capaz de causar descolamento das monocamadas em todos os períodos de tempo analisados. No tempo de 120 min as concentrações de 25 e 50 µg/mL causaram um descolamento das monocamadas, que foi estatisticamente significante, das concentrações 5, 10 e 12,5 µg/mL (Fig. 4).. 33.

(41) Descolamento celular (%). 100 80 60. * 40 20 0. C. 5. *. *. *. 10. 12,5. 25. 50. 100 80 60. *# *. 40. *. *. 10. 12,5. 20 0. 5. C. VBj (g/mL). 25. 50. VBj (g/mL). 30 min. 60 min. Descolamento celular (%). Descolamento celular (%). EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. 100. * #  * # . 80. *. 60 40. *. *. 5. 10. 20 0. C. 12,5. 25. 50. VBj (g/mL) 120 min. Figura 4. Efeito do veneno de B. jararaca (VBj) na integridade de células endoteliais tEND. Células endoteliais tEND foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por 48 horas para adesão celular. Após esse período, foi adicionado veneno nas concentrações de 5, 10, 25 e 50 µg/mL ou somente meio de cultura (controle) e incubadas por 30, 60 e 120 minutos. A integridade celular foi determinada pelo método Cristal Violeta. Cada valor representa a média ± EPM de três experimentos independentes. Anova *p<0,05 vs controle; #p<0,05 vs 5 . µg/mL; p< 0,05 vs 10 µg/mL ; p< 0,5 vs 12,5 µg/mL .. 34.

(42) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. 8.2.. Efeito do veneno de B. jararaca (VBj) na viabilidade de células endoteliais tEND. A viabilidade celular foi avaliada aos 30, 60 e 120 minutos após a incubação das células tEND com o veneno, em diferentes concentrações (5, 10, 12,5, 25 e 50 µg/mL) ou meio de cultura (controle). Os resultados demonstraram a diminuição estatisticamente significativa na integridade celular em todas as concentrações (5, 10, 12,5, 25 e 50 µg/mL) e nos períodos de tempo de 60 e 120 minutos, quando comparado com o grupo controle No tempo de 30 min não houve alteração na viabilidade das células quando incubadas com o veneno. Não houve diferença estatística da viabilidade celular entre as concentrações estudadas, no tempo de 60 min. Aos 120 min, as concentrações de 10, 12,5, 25 e 50 µg/mL causaram a diminuição na viabilidade celular em comparação com a concentração de 5 µg/mL (Fig. 5).. 35.

(43) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. 120. Viabilidade Celular (%). Viabilidade celular (%). 120 100 80 60 40 20 0. C. 5. 10. 12,5. 25. 100. *. 60. *. *. *. 12,5. 25. 50. 40 20 0. 50. *. 80. C. 5. 10. VBj (g/mL). VBj (g/mL). 60 min. 30 min. Viabilidade celular (%). 120 100. *. 80. *#. 60. *#. *#. 40. *#. 20 0. C. 5. 10. 12,5. 25. 50. VBj (g/mL) 120 min. Figura 5. Efeito do veneno de B. jararaca (VBj) na viabilidade de células endoteliais tEND Células endoteliais tEND foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por 48 horas para adesão celular. Após esse período, foi adicionado veneno nas concentrações de 5, 10, 25 e 50 µg/mL ou somente meio de cultura (controle) e incubadas por 30, 60 e 120 minutos. A viabilidade celular foi determinada pelo método MTT. Cada valor representa a média ± EPM de três experimentos independentes, Anova, *p<0,05 vs controle, # p<0,05 vs 5 µg/mL.. 36.

(44) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. 8.3.. Efeito da exposição do veneno de B. jararaca ao Laser de Baixa Potência na integridade das células endoteliais tEND.. Para o estudo da ação do laser de baixa potência, foi escolhida a dose de 10 µg/mL de VBj. Esta foi a concentração o qual causou um efeito na integridade e viabilidade das células sem ser máximo, sendo que um eventual efeito do LBP pode ser verificado. Para avaliar se a irradiação LBP seria capaz de modificar componentes do veneno, o veneno foi irradiado antes de ser incubado com a tEND. Para isso, também utilizou-se como grupo controle, células irradiadas a 660 e 780nm, sem receber inoculação de veneno. Os experimentos demonstraram que não houve diferença estatística no grupo incubado com o veneno e o grupo veneno irradiado, em ambos os comprimentos de onda, sugerindo que a irradiação não afeta as moléculas do veneno (Fig. 6).. 37.

(45) Descolamento celular (%). Descolamento celular (%). EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. 100 80 60 40. *. *. *. 20 0. laser 660 nm laser 780 nm. -. + Controle. +. -. +. + -. 100. *. 80. *. *. 60 40 20 0. -. laser 660 nm laser 780 nm. VBj (10 g/mL). +. + -. -. + -. +. VBj (10 g/mL). Controle. 30 min. Descolamento celular (%). 60 min. 100 80. *. *. *. 60 40 20 0. laser 660 nm laser 780 nm. -. + Controle. +. -. + -. +. VBj (10 g/mL) 120 min. Figura 6. Efeito do veneno B. jararaca (VBj) irradiado sobre a integridade de células endoteliais. Células endoteliais tEND foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por 48 horas para adesão celular. Após esse período o veneno foi previamente irradiado nos comprimentos de onda de 660 nm e 780 nm e, posteriormente, foi adicionado à células tEND na concentração de 10 µg/mL ou somente meio de cultura (controle) e células com meio de cultura irradiadas nos mesmo comprimentos de onda e incubadas por 30, 60 e 120 minutos. O descolamento celular foi determinado pelo método Cristal Violeta. Cada valor representa a média ± EPM de três experimentos independentes, Anova, *p<0,05 em relação ao controle.. 38.

(46) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. 8.4.. Efeito da exposição do veneno de B. jararaca ao Laser de Baixa Potência na viabilidade das células endoteliais tEND.. Da mesma maneira que avaliou-se a viabilidade das células com o veneno irradiado antes de ser incubado com as mesmas, também avaliamos se o veneno irradiado modificaria a viabilidade das células tEND. Para isso, também utilizou-se como grupo controle, células irradiadas a 660 e 780nm, sem receber inoculação de veneno. Os resultados demonstraram a diminuição estatisticamente significativa na viabilidade celular após exposição das células endoteliais tEND ao VBj irradiado, em ambos os comprimentos de onda (660nm e 780nm), que não foi diferente da viabilidade causada pelo veneno sem irradiação, mais uma vez demonstrando que a irradiação não afeta as moléculas do veneno (Fig 7).. 39.

(47) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. 120. Viabilidade celular (%). Viabilidade celular (%). 120 100 80. *. *. *. 60 40 20 0. Laser 660 nm Laser 780 nm. -. + -. +. -. + -. 100 80 60 40. 0. +. Laser 660 nm Laser 780 nm. -. +. + -. VBj (10 g/mL). Controle. *. *. *. -. + -. +. 20. VBj (10 g/mL). Controle. 30 min. 60 min. Viabilidade celular (%). 120 100 80 60 40. *. *. *. -. + -. +. 20 0. Laser 660 nm Laser 780 nm. -. + -. +. VBj (10 g/mL). Controle 120 min. Figura 7. Efeito do veneno B. jararaca (VBj) irradiado na viabilidade de células endoteliais. Células endoteliais tEND foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por 48 horas para adesão celular. Após esse período o veneno foi previamente irradiado nos comprimentos de onda de 660nm e 780nm e, posteriormente, foi adicionado à células tEND na concentração de 10 µg/mL ou somente meio de cultura (controle) e células com meio de cultura irradiadas nos mesmo comprimentos de onda incubadas por 30, 60 e 120 minutos. A viabilidade celular foi determinada pelo método MTT. C: controle; L: laser de baixa potência; V: veneno; VI: veneno irradiado. Cada valor representa a média ± EPM de três experimentos independentes, Anova Dunnet *p<0,01.. 40.

(48) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. 8.5.. Efeito do Laser de Baixa Potência 660 nm na integridade de células endoteliais submetidas à lesão por veneno B. jararaca.. Para a avaliação do efeito de LBP na integridade das monocamadas de células, o mesmo foi aplicado diretamente na tEND, no comprimento de onda vermelho de 660 nm, imediatamente após a adição do veneno. Nos grupos experimentais utilizando o LBP no comprimento de onda 660 nm, verificamos que não houve diferença significativa na integridade celular no tempo de 30 min. No entanto, a aplicação do LBP causou uma redução no descolamento celular na ordem de 20% e 18%, nos tempos de 60 e 120 min, respectivamente, quando comparado com o grupo veneno (Fig 8).. 41.

(49) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. 100. Descolamento celular (%). Descolamento celular (%). 100 80 60. *. 40. *. 20 0. C. C + LBP. V. 80 60. * 40. *#. 20 0. V + LBP. C. C + LBP. (10 g/mL). V. V + LBP (10 g/mL). 30 min. 60 min. Descolamento celular (%). 100 80. *. 60. *#. 40 20 0. C. C + LBP. V. V + LBP (10 g/mL). 120 min. Figura 8. Efeito do laser de baixa potência (LBP) 660 nm na integridade de células endoteliais submetidas à lesão por veneno de B. jararaca. Células endoteliais tEND foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por 48 horas para adesão celular. Após esse período foi adicionado o veneno (10 µg/mL), as células foram imediatamente irradiadas com LBP usando densidade de energia (4 J/cm 2) no comprimento de 660 nm e foram incubadas por 30, 60 e 120 minutos. A integridade celular foi determinada pelo método Cristal violeta. C: controle; V: veneno; LBP: laser de baixa potência. Cada valor representa a média ± EPM de três experimentos independentes, Anova. * p< 0,05 VS controle; #P<0,05 vs veneno.. 42.

(50) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. 8.6.. Efeito do Laser de Baixa Potência 780 nm na integridade de células endoteliais submetidas à lesão por veneno B. jararaca.. Para a avaliação do efeito de LBP na integridade das monocamadas de células, o mesmo foi aplicado diretamente nas células tEND, no comprimento de onda infravermelho de 780 nm, imediatamente após a adição do veneno. Nos grupos experimentais utilizando o LBP, verificamos que não houve diferença significativa na integridade celular em nenhum dos tempos testados após a aplicação do LBP 780 nm infravermelho, quando comparado com o grupo veneno (Fig 9).. 43.

(51) 100. 100 Descolamento celular (%). Descolamento celular (%). EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. 80 60. *. 40. *. 20 0. 80 60. *. 40 20 0. C. C + LBP. V. *. C. V + LBP. C + LBP. V. V + LBP (10 g/mL). (10 g/mL) 60 min. 30 min. Descolamento celular (%). 100 80. *. 60. *. 40 20 0. C. C + LBP. V. V + LBP (10 g/mL). 120 min. Figura 9. Efeito do laser de baixa potência (LBP) 780 nm na integridade de células endoteliais submetidas à lesão por veneno de B. jararaca. Células endoteliais tEND foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por 48 horas para adesão celular. Após esse período foi adicionado o veneno (10 µg/mL), as células foram imediatamente irradiadas com LBP no comprimento de 780 nm e foram incubadas por 30, 60 e 120 minutos. A integridade celular foi determinada pelo método Cristal violeta. C: controle; V: veneno; LBP: laser de baixa potência. Cada valor representa a média ± EPM de três experimentos independentes, Anova. * p< 0,05 comparado ao grupo controle.. 44.

(52) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. 8.7.. Efeito do Laser de Baixa Potência (LBP) 660 nm na viabilidade de. células. endoteliais. submetidas. à. lesão. por. veneno. B. jararaca.. Para a avaliação do efeito de LBP na viabilidade das monocamadas de células, o mesmo foi aplicado diretamente nas células tEND, imediatamente após a adição do veneno. Nossos resultados demonstraram um aumento de 60 % na viabilidade celular no período de 60 minutos após a aplicação do LBP, com comprimento de onda de 660 nm (luz vermelha). O mesmo efeito não foi observado nos tempos de 30 e 120 min (fig. 10).. 45.

(53) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. 120. Viabilidade Celular (%). Viabilidade Celular (%). 120 100 80 60 40 20 0. C. C + LBP. V. #. 100 80 60. *. 40 20 0. V + LBP. C. C + LBP. (10 g/mL). V. V + LBP. (10 g/mL). 30 min. 60 min. Viabilidade Celular (%). 120 100 80 60. *. 40. *. 20 0. C. C + LBP. V. V + LBP. (10 g/mL) 120 min. Figura 10. Efeito do laser de baixa potência (LBP) 660 nm na viabilidade de células endoteliais submetidas à lesão por veneno de B. jararaca. Células endoteliais tEND foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por 48 horas para adesão celular. Após esse período foi adicionado o VBj (10 µg/mL), as células foram imediatamente irradiadas com LBI no comprimento de 660 nm e foram incubadas por 30, 60 e 120 min. A viabilidade celular foi determinada pelo método MTT. C: controle; V: veneno; LBP: laser de baixa potência. Cada valor representa a média ± EPM de três experimentos independentes, Anova. * p< 0,05 vs controle; # p< 0.05 vs veneno.. 46.

(54) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. 8.8.. Efeito do Laser de Baixa Potência (LBP) 780 nm na viabilidade de células endoteliais submetidas à lesão por veneno B. jararaca.. Para a avaliação do efeito de LBP na viabilidade das monocamadas de células, o mesmo foi aplicado diretamente nas células tEND, imediatamente após a adição do veneno. Nossos resultados demonstraram um aumento de 51 % na viabilidade celular no período de 60 minutos após a aplicação do LBP, com comprimento de onda de 780 nm (luz infravermelho). O mesmo efeito não foi observado nos tempos de 30 e 120 min (fig.11).. 47.

(55) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. 120 100 80 60 40 20 0. C. C + LBP. V. V + LBP. Viabilidade Celular (%). Viabilidade Celular (%). 120. #. 100 80 60. *. 40 20 0. C. (10 g/mL). C + LBP. V. V + LBP. (10 g/mL). 30 min. 60 min. Viabilidade Celular (%). 120 100 80 60. * *. 40 20 0. C. C + LBP. V. V + LBP. (10 g/mL) 120 min. Figura 11. Efeito do laser de baixa potência (LBP) 780 nm na viabilidade de células endoteliais submetidas à lesão por veneno de B. jararaca. Células endoteliais tEND foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por 48 horas para adesão celular. Após esse período foi adicionado o veneno (10 µg/mL), as células foram imediatamente irradiadas com LBI no comprimento de 780 nm e foram incubadas por 30, 60 e 120 minutos. A viabilidade celular foi determinada pelo método MTT. C: controle; V: veneno; LBP: laser de baixa potência. Cada valor representa a média ± EPM de três experimentos independentes, Anova. * p< 0,05 vs controle; # p< 0.05 vs ao veneno.. 48.

(56) EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA. 8.9.. Efeito do Laser de Baixa Potência (LBP) 660 nm na liberação da enzima Lactato Desidrogenase (LDH) de células endoteliais submetidas à lesão por veneno B. jararaca.. A perda da integridade da membrana após incubação com veneno e tratamento com laser foi monitorado pela análise da liberação no meio de cultura da enzima citoplasmática LDH. As células que receberam o veneno apresentaram aumento nos níveis de LDH no sobrenadante, nos tempos de 30 e 60 min, comparado ao grupo que recebeu somente meio de cultura (controle). O LBP 660 nm (luz vermelho) foi capaz de promover uma redução na liberação de LDH de 33% e 49 % aos 60 e 120 min, respectivamente. O mesmo efeito significativo não foi observado no tempo de 30 min neste comprimento de onda. (fig. 12).. 49.