7. ANÁLISE ESTATÍSTICA:
8.10. Efeito do Laser de Baixa Potência (LBP) 780 nm na liberação da enzima Lactato Desidrogenase (LDH) de células endoteliais
submetidas à lesão por veneno B. jararaca.
Da mesma forma, avaliamos a perda da integridade da membrana após incubação com veneno e tratamento com laser pela análise da liberação no meio de cultura da enzima citoplasmática LDH. As células que receberam o veneno apresentaram aumento nos níveis de LDH no sobrenadante, nos tempos de 30 e 60 min, comparado ao grupo que recebeu somente meio de cultura (controle). O LBP 780 nm (luz infravermelho) foi capaz de promover uma redução na liberação de LDH de 28% e 54 % aos 60 e 120 min, respectivamente (fig. 15). O mesmo efeito estatisticamente significativo não foi observado no tempo de 30 min no comprimento de onda de 780 nm (fig. 13).
52 0.0 0.5 1.0 1.5 C C + LBI V V + LBI 10g/mL 30 min L D H ( D .O .) 0.0 0.5 1.0 1.5 C C + LBI V V + LBI 10g/mL 60 min * # L D H ( D .O .) 0.0 0.5 1.0 1.5 C C + LBI V V + LBI 10g/mL 120 min * # L D H ( D .O .)
Figura 13. Efeito do laser de baixa potência (LBP) 780 nm na liberação de LDH de células endoteliais submetidas a lesão por veneno de B. jararaca. Células endoteliais tEND foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por 48 horas para adesão celular. Após esse período o veneno (10 µg/mL) foi adicionado à cultura de células e foram imediatamente irradiadas com o LBI 780 (infravermelho) e incubadas por 30, 60 e 120 minutos. O sobrenadante foi recolhido e a liberação de Lactato Desidrogensase (LDH) foi determinada pela liberação de NADH. C: controle; V: veneno; LBP: laser de baixa potência. Cada valor representa a média ± EPM de três experimentos independentes, * p< 0,05 vs controle; # p< 0.05 vs veneno.
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9. DISCUSSÃO
Apesar da eficiência da soroterapia em neutralizar os efeitos sistêmicos causados pelos venenos botrópicos, as reações locais causadas por esses venenos são apenas parcialmente ou não são neutralizadas por esse tratamento. Isso ocorre pelo fato das manifestações locais ocorrerem rapidamente após a picada e o soro não ser capaz de reverter às lesões já estabelecidas ou desencadeadas (Rosenfeld, 1971). O fato da soroterapia ser pouco eficaz no tratamento das reações locais induzidas por venenos botrópicos estimula a procura de tratamentos complementares que possibilitem a melhora deste quadro. Assim, este trabalho visou o melhor entendimento da aplicação do laser de baixa potência, em células endoteliais, após lesão pelo veneno de Bothropoides jararaca.
Estudos sugerem que os venenos e toxinas hemorrágicas isoladas afetam, principalmente, a integridade de vasos de pequeno calibre (Ohsaka, 1979; Ownby, 1990; Borkow et al., 1993). Este efeito foi atribuído à proteólise da membrana basal dos vasos, levando a saída de eritrócitos. Considerando que as SVMPs de veneno de serpente são responsáveis por hemorragia local, pelo menos nove delas foram isoladas a partir do veneno B. jararaca (Mandelbaum et al., 1976; Maruyama et al., 1992, Maruyama et al., 1993 e Paine et al, 1992), e concluiu-se que as toxinas hemorrágicas causam uma série de alterações morfológicas e degenerativas em células endoteliais que progridem para formação de fendas intercelulares permitindo a saída de hemácias (Ownby, 1990, Lomonte et al., 1994).
Ainda, estudos revelam uma diferença significativa na produção de hemorragia pelas SVMPs in vivo, comparado aos estudos com cultura de
54 células endoteliais, uma vez que o descolamento foi observado somente in vitro (Gutiérrez et al., 2005). Neste estudo buscou-se compreender, inicialmente, os efeitos do veneno de B. jararaca sobre a integridade e viabilidade de células endoteliais.
Os efeitos do veneno de B. jararaca na integridade e viabilidade de células endoteliais tEND in vitro. Os resultados obtidos mostraram que o veneno, afetou a integridade das monocamadas de células endoteliais nas concentrações a partir de 10 L/mL em todos os períodos de tempo analisados. O efeito máximo ocorreu aos 120 minutos de incubação. Resultados similares foram demonstrados a capacidade do B. jararaca em causar descolamento de células com concentrações maiores que 10 L/mL (Gallagher et al., 2003).
Também Nishijima et al. (2009), em um estudo in vivo, buscou determinar a dose ideal capaz de induzir a hemorragia após administração do veneno de B. jararaca e concluiu que dose de 8,1 µg foi ideal capaz de alterar a homeostase dos vasos sanguíneos. Adicionalmente, a BaH-1, uma SVMPs isolada do veneno de B. asper, com potente atividade hemorrágica, causa um descolamento moderado de células endoteliais murinas (Lomonte et. al., 1994).
Ainda, investigou-se a capacidade do veneno em afetar a viabilidade celular, para melhor compreender a ação do veneno sobre a integridade do endotélio. Para tanto, avaliou-se a citotoxicidade pela atividade metabólica mitocondrial (método MTT). Os resultados obtidos mostraram que o veneno reduziu a viabilidade celular em todas as concentrações nos tempo de 60 e 120 min após a incubação com o veneno, alterando a viabilidade das células endoteliais e sugerindo que o descolamento das monocamadas pode estar
55 relacionado à citotoxicidade do veneno, provavelmente por agir nas moléculas de adesão.
A literatura tem sugerido que a terapia com LBP é uma alternativa eficaz para o tratamento de acidentes causados por serpentes devido a sua capacidade de diminuir a inflamação, hemorragia e mionecrose após envenenamento botrópico experimental (Dourado et al., 2003; Barbosa et al., 2009; Nadur- Andrade et al., 2012). No entanto, os mecanismos biológicos envolvidos na proteção local pela irradiação laser contra a ação local do veneno botrópico ainda não são compreendidos.
Neste estudo, investigou-se alguns mecanismos envolvidos na capacidade da terapia LBP em proteger células endoteliais contra o veneno da serpente B. jararaca. O efeito da terapia com LBP na citotoxicidade causada pelo veneno foi avaliada usando o laser na densidade de energia de 4 J/cm2 em dois comprimentos de onda, um vermelho no comprimento de onda 660 nm e infravermelho no comprimento 780 nm, após a adição do veneno nas células endoteliais tEND.
A dose do laser escolhida foi baseada na literatura mostrando, em cultura celular, um efeito benéfico do laser vermelho e infravermelho em doses baixas 3 ou 5 J/cm2. Neste mesmo estudo, os autores demonstraram que em doses altas (16 J/cm2) pode apresentar efeito prejudicial (Huang et al., 2009; Kim et al, 2011).
Com o intuito de verificar se o laser seria capaz de alterar os componentes do veneno e assim diminuir sua citotoxicidade, o veneno foi irradiado usando os mesmos parâmetros do laser usado para irradiar as células endoteliais tEnd. O veneno B. jararaca irradiado mostrou o mesmo efeito
56 citotóxico quando comparado ao veneno não irradiado. Este resultado indica que a irradiação laser não modificou os componentes do veneno. Resultado semelhante foi encontrado por Barbosa et al., (2008), usando um modelo in
vivo no qual o veneno irradiado causou o mesmo nível de edema muscular
quando comparado ao veneno não irradiado.
Os resultados obtidos em nosso estudo mostraram que a dose usada de 4 J/cm2 reduziu o descolamento de células endoteliais melhorando assim a integridade celular. Esse efeito foi observado nos comprimentos de onda de 660 nm nos tempos de 60 e 120 min. Porém, o mesmo efeito não foi observado com o comprimento de onda 780 nm, sugerindo atuação do laser na matriz extracelular e assim, protegendo a célula contra os efeitos deletérios do veneno.
Isso porque, conforme Szymanska et al, 2013, a radiação com LBP pode influenciar as células através da absorção da energia emitida pelos fotorreceptores localizados no interior das células. Sugere-se que, dentre tais fotorreceptores, as mitocôndrias, que fornecem energia para as células, contém uma série de enzimas que participam nas reações redox da cadeia respiratória, tornando-se o principal mecanismo das reações metabólicas ocorridas em uma célula, além do citocromo c oxidase e superóxido dismutase- NADH, que demonstraram alteração após emissão de fótons, alterando o nível de oxidação e alterando a fluência dos elétrons de uma molécula, capazes de aumentar a síntese de DNA e RNA (Karu, 1999; Szymanska et al, 2013) .
Ainda, os resultados obtidos em nosso estudo mostraram que a concentração usada de 4 J/cm2 reduziu a citotoxicidade, avaliada pelo método MTT, em células endoteliais no período de 60 min após a adição do veneno,
57 tanto com o laser vermelho como o infravermelho, não tendo efeito em outros períodos avaliados. Essa diferença encontrada entre o laser vermelho e infravermelho pode estar relacionada com a penetração da luz no tecido (El Sayed et al., 1990; Tacon et al., 2011; Kim et al, 2011; Colombo et al, 2013) uma vez que já foi demonstrado que o laser vermelho penetra mais no tecido que o laser infravermelho.
Adicionalmente, investigou-se a capacidade do veneno em afetar a viabilidade celular, pela liberação da lactato desidrogenase pelas células endoteliais, uma enzima citoplasmática estável, utilizada como parâmetro de lesão e/ou morte celular, quando presente no sobrenadante de culturas de células (Thomas, et al., 1993; Yildiz, et al., 1999). Os resultados demonstraram que o LBP causou uma redução da liberação de LDH nos tempos de 60 e 120 min pelas células endoteliais após a incubação com o veneno. Essa discrepância nos testes avaliados para determinar a citotoxicidade poder estar relacionada a maior sensibilidade do método LDH.
Convém ressaltar que, esta diferença é curiosa, pois estudos anteriores de nosso laboratório demonstram um efeito protetor do LBP em células musculares in vitro, avaliado tanto pelo método MTT como pela liberação de LDH em todos os períodos de tempo avaliados (dados enviados a publicação). A dose do laser utilizada foi a mesma utilizada para as células musculares, é possível que a dose utilizada não seja a ideal para a proteção em células endoteliais. No entanto, Szymanska et al (2013), avaliou células endoteliais in
vitro, utilizando LBP nos comprimentos de onda vermelho e infravermelho e
concluíram que a utilização do comprimento de onda de 635 nm (com densidade de potência de 1,875 W/cm2) estava associado com um aumento
58 estatisticamente significativo na proliferação das células endoteliais. Ainda, a utilização das densidade de energia de 2, 4 e 8 J/cm2 promoveram aumentos significativos na proliferação, sendo que de 4 J/cm2 foi a que mais significativa em relação a proliferação celular, sugerindo que a densitometria utilizada no nosso trabalho é adequada para se utilizar em células endoteliais.
Além disso, os efeitos diretos ou indiretos da interferência do laser visível vermelho e infravermelho com os componentes mitocondriais da cadeia respiratória é parte do sinal de transdução (Tiphlova et al, 1989; Karu et al, 1993; Lubart et al, 1996; Kim et al, 2011). Nesse sentido, estudos de Kipshidze
et al, 2001; Agaiby et al, 2000, abordaram a possível indução de fatores pró-
angiogênicos pela exposição ao laser. Até o momento, tais fatores têm sido detectados imediatamente após a irradiação do laser, e apenas em cultura de outras linhagens celulares que não as células endoteliais.
Bouma et al. (1996), demonstraram melhora na regulação da secreção espontânea de células endoteliais humanas, avaliada pela liberação de citocinas, como interleucina (IL) -6 e IL-8 após a radiação pulsada de laser infravermelho. sugerindo efeito direto na estimulação na proliferação das células endoteliais (Schindl et al, 2003).
Em nosso estudo não avaliamos a proliferação celular, no entanto a redução da hemorragia observada em estudo in vivo do nosso laboratório (Nadur-Andrade et al, 2012) e proteção da mionecrose (Barbosa et al., 2008) sugere que a proteção observada pelo LBP nas células endoteliais pode estar relacionada a uma melhora da proliferação celular e consequente diminuição da mionecrose.
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