CARACTERIZAÇÃO DE PROPRIEDADES ÓPTICAS E ANTIMICROBIANAS DE COMPÓSITOS EXPERIMENTAIS FORMULADOS COM QUATERNÁRIOS DE
AMÔNIO
Niterói 2016
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE ODONTOLOGIA
CARACTERIZAÇÃO DE PROPRIEDADES ÓPTICAS E ANTIMICROBIANAS DE COMPÓSITOS EXPERIMENTAIS FORMULADOS COM QUATERNÁRIOS DE
AMÔNIO
GUILHERME FERREIRA REGO
Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia da Universidade Federal Fluminense, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre, pelo Programa de Pós-Graduação em Odontologia.
Área de Concentração: Dentística
Orientador: Profa. Dra. Larissa Maria Assad Cavalcante
Niterói 2016
amônio / Guilherme Ferreira Rego; orientadora: Prof.ª Dr.ª Larissa Maria Assad Cavalcante – Niterói: [s.n.], 2016.
41 f.
Inclui gráficos e tabelas
Dissertação (Mestrado em Dentística) – Universidade Federal Fluminense, 2016.
Bibliografia: f. 38-40
1.Compósitos resinosos 2.Propriedades ópticas 3.Quaternário de amônio metacrilato I.Cavalcante, Larissa Maria Assad [orien.] II.Título
CDD 617.675
Prof(a). Dr(a). Larissa Maria Assad Cavalcante
Instituição: Faculdade de Odontologia da Universidade Federal Fluminense
Decisão: _________________________Assinatura:_________________________
Prof(a). Dr(a). Aline de Almeida Neves
Instituição: Faculdade de Odontologia da Universidade Federal do Rio de Janeiro Decisão: _________________________Assinatura:_________________________
Prof(a). Dr(a). Angela Scarparo Caldo-Teixeira
Instituição: Faculdade de Odontologia da Universidade Federal Fluminense
Aos meus pais, Angela e Dinarto, que sempre respeitaram e apoiaram minhas decisões quanto a trabalho e vida. Por terem me mostrado o valor da educação, trabalho, que sempre devem ser feitos com excelência, comprometimento e honestidade. Por terem me criado com amor, me propiciando sempre um ambiente harmonioso para meu crescimento como ser humano.
Aos meus irmãos, Marina e Gustavo, que me mostraram o que é amor fraterno, sendo meus amigos além de serem meus irmãos, compartilhando vivências que muitas vezes nossos pais não entenderiam. Por terem ampliado meus horizontes quanto à visão de mundo para estudar ou morar fora do país. Além disso, trouxeram pra minha vida mais dois amigos: Alfonso e Carol, meu cunhado e cunhada, que apoiam meus irmãos frente aos desafios da vida e trazem muitos momentos de alegria pra toda a família.
Obrigado por serem a melhor família que eu poderia ter!
Aos meus amigos, Edson, Bruno, Vitor e Giovanni por esses 10 anos de amizade verdadeira. Nos quais pudemos compartilhar de muitos momentos de diversão e descontração, mas também confiar nossos medos e segredos. Espero por muitos anos mais de amizade e que seja pra vida toda!
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora Larissa Cavalcante, que abriu as portas para que eu
descobrisse o gosto pelo meio acadêmico durante a minha iniciação científica, o que permitiu que eu desse seguimento com meu mestrado e, consequentemente, esta
dissertação. Posso dizer com certeza que além de uma orientadora, tenho uma amiga,
porque você sempre se mostrou próxima, permitindo conhecer sua família, sua casa e sua
rotina. Ser seu orientado foi uma experiência fundamental para minha vida, porque você me
mostrou como é orientar um aluno com respeito, compreensão e parceria, nunca passando
por cima das minhas afirmações e tentando entender minha opinião. Claramente posso me
espelhar em você para orientar um aluno no futuro. Obrigado por ter me ensinado esses
valores. Agradeço também a Luis Felipe Schneider, seu braço direito, pelos inúmeros votos
de Minerva e pelo socorro quando não víamos mais alternativas frente a alguma dificuldade.
Nossa amizade e parceria são para sempre!
À minha coorientadora Maristela Portela, por ter me orientado em uma série de
experimentos que foram novos pra mim. Obrigado por sua paciência para que eu
aprendesse tudo de maneira correta. Contigo pude aprender não só os testes de
microbiologia, mas também o que é a dedicação ao trabalho acadêmico e a humildade para
orientar seus alunos. Além disso, aprendi que nunca é tão cedo pra se iniciar os trabalhos
no laboratório, já que muitas vezes recebia suas orientações nas primeiras horas da manhã.
À Gil Mendes Viana, por toda dedicação e empenho no desenvolvimento dos
componentes que foram o diferencial deste meu trabalho. Obrigado pela sua colaboração!
Aos professores Eduardo Moreira da Silva, José Guilherme Antunes Guimarães,
Laiza Tatiana Poskus, Cristiane Mariote Amaral, Glauco Botelho e Jaime Noronha, pelo conhecimento que me passaram e por terem me ajudado a despertar senso crítico frente às
informações que são publicadas em artigos, mostradas em aulas e exibidas em congressos.
Reconheço o desafio que foi montar o Laboratório Analítico de Biomateriais Restauradores,
equipando-o com equipamentos de referência, e utilizados em artigos de revistas de grande
dificuldades, sempre sobrava um tempinho pra um chopp e muitas risadas. Nossa amizade
foi algo que veio naturalmente e posso dizer q foi sempre sincera, visto o apoio que
dávamos uns aos outros frente aos inúmeros seminários, à qualificação do projeto,
resultados da dissertação e defesa. Sei que posso contar com vocês sempre, e contem
sempre comigo.
Ma, obrigado pelas diversas vezes que você me abrigou em Niterói, mas saiba que
minha amizade por ti vai muito além disso. A ajuda com os experimentos e a dissertação, os
desabafos frente às situações que tiravam a gente do sério são exemplos do quanto teu
apoio foi fundamental durante o mestrado.
Aos amigos da minha “segunda turma”, André Luiz, Fabiana Simmer, Luísa
Pegado, Marcelle Garcia, Dirciane Reis, Renato Paiva, Jéssica Horta, Eduardo Maroun e
André Maia, agradeço por toda a descontração do dia a dia no laboratório, tornando todos os ensaios e análises muito menos estressantes. Fico feliz em poder ter ajudado vocês nos
seminários, experimentos e saibam que podem sempre contar comigo. Em especial,
agradeço ao André Luiz, Fabiana e Luísa, minhas “falsianes” que foram fundamentais no
meu mestrado, especialmente próximo à defesa, me apoiando e torcendo por mim.
Aos funcionários José Maria, Cleide Cabral e Leléia, que estavam prezando sempre
pelo ambiente da Pós Graduação em Dentística e Laboratório de Biomateriais
Restauradores. Onde pude aprender com José Maria como é ser um exemplo de “servidor
público”.
Agradeço também à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
RESUMO
Rego GF. Caracterização de propriedades ópticas e antimicrobianas de compósitos experimentais formuladas com quaternários de amônio [dissertação]. Niterói: Universidade Federal Fluminense, Faculdade de Odontologia; 2016.
O objetivo deste estudo foi determinar a influência da adição de dois monômeros derivados de sais de quaternário de amônio (QAM), contendo diferentes tamanhos de cadeia molecular e aplicados em diferentes concentrações, sobre a capacidade antimicrobiana e as propriedades ópticas de compósitos resinosos experimentais. Resinas modelo foram obtidas a partir da mistura BisGMA-TEGDMA e a adição de um sistema fotoiniciador/co-iniciador. Dimetilaminododecil metacrilato (DMADDM) e dimetilaminohexadecil metacrilato (DMAHDM) foram sintetizados e incorporados nas concentrações de 5% e 10%. Um grupo controle (sem quaternários de amônio) também foi sintetizado para comparação de suas propriedades com os demais grupos. Partículas de carga foram adicionadas na proporção de 50% em massa para a obtenção de compósitos. Análises de viabilidade e produção de ácido lático do biofilme, brilho e rugosidade superficial foram realizadas 24h após a confecção das amostras e repetidas após simulação de escovação e pós-polimento. A estabilidade de cor foi determinada pelo método CIELab a partir de mensurações consecutivas antes e após ciclos de escovação e imersão em café. Os resultados foram submetidos à análise de variância e ao teste de Tukey (95% de significância). Os resultados mostraram que quanto maior a cadeia da molécula do quaternário de amônio e a concentração, menores foram a viabilidade e a produção de ácido lático pelo biofilme. Além disso, os valores encontrados para brilho e rugosidade foram semelhantes para todos os grupos. A estabilidade de cor dos compósitos contendo DMADDM e DMAHDM foi maior do que o grupo controle, e os grupos contendo maiores concentrações dos agentes antimicrobianos tiveram melhores resultados de cor. Deste modo, a adição dos QAM em ambas as concentrações testadas pareceu não afetar a retenção de brilho e rugosidade dos compósitos experimentais quando comparados ao grupo controle. Além disso, a estabilidade de cor e translucidez foi superior à do controle, especialmente ao se aumentar a concentração dos quaternários de amônio. O tamanho de cadeia da molécula dos QAM afetou principalmente o desenvolvimento do biofilme e produção de ácido lático, de modo que maiores cadeias promoveram melhores propriedades antimicrobianas e não afetando de maneira significativa as propriedades ópticas testadas.
Palavras-chave: compósitos resinosos, propriedades ópticas, quaternário de amônio metacrilato, inibição de biofilme.
Universidade Federal Fluminense, Faculdade de Odontologia; 2016.
The objective of this study was to determine the influence of the addition of two monomers derived from quaternary ammonium salts (QAM), containing different molecular chain sizes and applied at different concentrations, on the antimicrobial properties and optical properties of experimental resin composites. Model resins were obtained from BisGMA-TEGDMA mixture and the addition of a photoinitiator / co-initiator system. Dimethylaminododecyl methacrylate (DMADDM) and dimethylaminohexadecyl methacrylate (DMAHDM) were synthesized and incorporated in concentrations of 5% and 10%. A control group (without quaternary ammonium) was also synthesized for comparison of its properties with the other groups. Filler particles were added at a ratio of 50% mass for composites obtainment. Biofilm viability and lactic acid production, gloss retention, and surface roughness analyses were performed 24 hours after the preparation of the samples and repeated after brushing simulation and after polishing. The color stability was determined by CIELab method from consecutive measurements before and after cycles of brushing and immersion in coffee. The results were submitted to ANOVA and Tukey's test (95% significance). The results showed that the longer the chain of quaternary ammonium molecule and the higher its concentration, the lower was the viability and the production of lactic acid by the biofilm. Furthermore, the values found for gloss and surface roughness were similar for all groups. The color stability of the composites containing DMADDM and DMAHDM was higher than the control group, and groups containing larger concentrations of antimicrobials had better color results than GC. Thus, the addition of QAM in both tested concentrations did not affect gloss retention and roughness of the experimental composites compared to the control group. Furthermore, color stability and translucency were higher than the control, especially when increasing the concentration of quaternary ammonium. The chain length of the quaternary ammonium molecules mainly affected the biofilm development and production of lactic acid, so that longer chains promoted better antimicrobial properties, not significantly affecting the optical properties tested.
Keywords: resin composites, optical properties, quaternary ammonium methacrylate, biofilm inhibition.
SUMÁRIO
1 – Introdução...10
2 – Metodologia...13
3 – Artigo Produzido...19
1 - INTRODUÇÃO
Os compósitos resinosos são os materiais de escolha para restaurações diretas de dentes anteriores e posteriores afetados por cárie, fratura ou desgaste, e vêm passando por melhorias significativas em sua composição desde sua introdução no mercado há mais de cinquenta anos. Dentre as mais importantes, destacam-se a incorporação de partículas de carga, o tratamento destas com o agente de união silano e a composição monomérica da matriz orgânica. Estas mudanças em sua composição proporcionaram melhores características físicas, mecânicas e estéticas aos compósitos restauradores, como maior resistência ao desgaste, menor contração de polimerização, melhor resistência à flexão e melhor polimento. Deste modo, os compósitos são capazes de mimetizar a estrutura dentária perdida, resistindo às tensões da mastigação e restabelecendo a estética.
Apesar desta evolução, diversos estudos na literatura evidenciam alto índice de falha de restaurações com compósitos resinosos e, em alguns casos, o número de repetições deste procedimento ultrapassa o de restaurações feitas pela primeira vez. As cáries secundárias destacam-se como um dos principais motivos de falha na utilização de compósitos. Opdam et al 2014, analisaram estudos sobre longevidade de restaurações posteriores feitas em compósitos resinosos comerciais utilizando método de revisão sistemática e metanálise. Através dos levantamentos realizados, observaram que o risco de desenvolvimento de cáries secundárias é maior em pacientes com médio e alto índice de cárie, além de que quanto maior o número de faces envolvidas, maior a probabilidade de falha (cerca de 30 a 40% maior).
O biofilme formado na superfície da resina é capaz de promover sua degradação através da liberação de enzimas, levando a maior rugosidade superficial e a uma crescente adesão de bactérias. Assim, estas podem invadir a interface e formar uma nova cavidade. Além disso, os monômeros não reagidos da matriz resinosa estimulam o crescimento bacteriano. Para combater o desenvolvimento do biofilme, e consequente desenvolvimento de uma nova cavidade, estudos sugerem a incorporação de agentes antimicrobianos na formulação de materiais restauradores. Uma alternativa sugerida seria a adição de monômeros metacrílicos derivados de sais de quaternário de amônio (QAM) à matriz orgânica. Estes monômeros provocam um desequilíbrio no balanço elétrico da membrana celular de bactérias
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através do contato de suas moléculas carregadas positivamente com a célula carregada negativamente, gerando ruptura de sua membrana e morte celular. Além disso, o quaternário de amônio apresenta baixa citotoxicidade com as células da cavidade oral, cerca de vinte vezes menor que o Bis-GMA, monômero amplamente utilizado em resinas compostas disponíveis no mercado.
Dentre os monômeros derivados de sais de quaternário de amônio destacam-se o dimetilaminododecil metacrilato (DMADDM) e dimetilaminohexadecil metacrilato (DMAHDM), geralmente incorporados em concentrações de 5% e 10% em massa em sistemas adesivos e compósitos. As moléculas do DMADDM e DMAHDM apresentam um núcleo amino, uma terminação metacrilato e cadeias longas de hidrocarbonetos (cadeia de 12 alquilas para DMADDM e de 16 para o DMAHDM). O núcleo amino é responsável pela carga positiva da molécula e consequente ação antimicrobiana; a terminação metacrilato garante a incorporação do monômero à cadeia polimérica, permitindo ação inibitória em longo prazo. Quanto à cadeia de hidrocarbonetos, estudos mostram a relação entre comprimento de cadeia e ação bactericida, de modo que cadeias mais longas promovem maior hidrofobia, levando a maior penetração na membrana bacteriana e consequente inibição do biofilme.
Apesar das vantagens hipotéticas acima listadas não existem estudos descritos na literatura relacionados ao efeito da adição de QAM sobre as propriedades ópticas e de superfície de compósitos restauradores. Assim, o objetivo do presente estudo foi o de determinar o efeito da concentração e tamanho de cadeia dos quaternários de amônio sobre: (a) viabilidade do S. mutans induzido e (b) a formação de ácido lático sobre os compósitos; (c) a rugosidade superficial; (d) a retenção de brilho e (e) a estabilidade de cor de compósitos odontológicos experimentais, imediatamente após a polimerização, simulação de escovação e repolimento das superfícies.
As hipóteses de estudo foram a de que quanto maior a concentração e tamanho de cadeia dos quaternários de amônio,
i. menor será a viabilidade do biofilme induzido sobre os compósitos;
ii. menor será a formação de ácido lático pelo S. mutans sobre os compósitos;
iii. menor será rugosidade superficial das resinas; iv. maior será a retenção de brilho das resinas; e
v. maior a estabilidade de cor e translucidez dos compósitos experimentais testados.
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2 – METODOLOGIA
2.1 Síntese de monômeros antimicrobianos
Os monômeros antimicrobianos foram sintetizados utilizando a reação de Menschutkin. Nesta reação de adição são inseridos uma amina terciária e um haleto orgânico em iguais quantidades (10 mmol) em um frasco transparente com 3 g de etanol, misturados a 60°C por 24 h. Com o auxílio de vácuo moderado (7 kPa), os reagentes residuais e solventes foram removidos, isolando assim o monômero antimicrobiano desejado. Para cada monômero, um diferente haleto orgânico foi utilizado (Tabela 1), já a amina terciária foi sempre o 2-N,N-dimetilaminoetil metacrilato (DMAEMA).
Amina terciária Haleto Orgânico Monômero Antibacteriano 2-N,N-dimetilaminoetil
metacrilato (DMAEMA) 1-bromododecano DMADDM
2-N,N-dimetilaminoetil
metacrilato (DMAEMA) 1-bromohexadecano DMAHDM
Tabela 1 – Amina terciária e haletos orgânicos utilizados na síntese de cada monômero antibacteriano
2.2 Formulação de compósitos com ação antimicrobiana
Para a produção de cada compósito foi utilizado Bis-GMA e TEGDMA (Esstech Inc., EUA, Lote TSMPOO4397) na proporção de 1:1 em massa, 1% de canforoquinona (Esstech Inc., EUA; Lote TSNP004397) e 1% de amina EDMAB (Sigma Aldrich, Lote MKBB3614). Além disso, foram adicionadas diferentes concentrações (5% ou 10%) de um dos monômeros antimicrobianos acima listados. Foram adicionadas partículas de carga inorgânicas com a intenção de se obter um compósito contendo 50% de carga em massa, sendo empregadas 15% em massa de partículas de sílica esféricas pré-silanizadas de tamanho 40 nm (Aerosil R 812, Lote 3523102) e 85% de partículas de vidro de bário borosilicato pré-silanizadas de tamanho 0,7 µm (V-258-4107, Lote 699-17, Esstech Inc.). Assim, foram formulados cinco compósitos, contendo diferentes agentes antimicrobianos em diferentes concentrações e um grupo controle, que não possuía monômeros antimicrobianos. (Tabela 2)
Grupos Monômero Antimicrobiano Grupo G12.5 DMADDM 5% Grupo G12.10 DMADDM 10% Grupo G16.5 DMAHDM 5% Grupo G16.10 DMAHDM 10% Grupo GC Controle
Tabela 2 – Divisão dos grupos de acordo com o monômero empregado e sua concentração
2.3 Confecção das amostras
Os compósitos experimentais foram inseridos em incremento único em uma matriz metálica com dimensões de 8 mm de diâmetro por 2 mm de espessura. Uma tira de poliéster e uma lâmina de vidro foram posicionadas sobre o conjunto matriz-compósito, sendo aplicado um peso metálico de 65g por 30s, com a finalidade de planificar e escoar os excessos de resina. Posteriormente, foram fotoativados com uma fonte de luz LED (Demi LED, Kerr, Wisconsin, EUA) por 40 segundos em cada face, a uma irradiância de 800 mW / cm2, verificada com radiômetro ao término da confecção de cada espécime. Foram confeccionados dez espécimes de cada grupo experimental para os testes de rugosidade superficial, retenção de brilho e inibição de biofilme (n=10). Para o teste de estabilidade de cor e translucidez foram confeccionados cinco espécimes por grupo (n=5). Ao final desta etapa, foi padronizada uma face do compósito para serem realizadas as leituras e procedimentos de envelhecimento.
2.4 Indução de biofilme
O biofilme maduro utilizado foi composto exclusivamente de Streptococcus
mutans. Este organismo foi selecionado porque é um dos principais
micro-organismos relacionados à doença cárie e é de fácil cultivo em laboratório.
Para esterilização da superfície dos espécimes, estes foram expostos à luz ultravioleta na capela de fluxo laminar por 30 min. Após esta etapa, foram fixados nos poços de placas de cultura celular com meio de cultura ágar “Brain Heart Infusion” (BHI).
Isolados de “American Type Culture Collection” (ATCC) foram utilizados para a indução do biofilme de S. mutans sobre os espécimes. Para isso, alíquotas de
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suspensões celulares com 2 x 105 células/ml em um meio de cultura suplementado com 2% de sacarose foram inoculadas sobre os espécimes e mantidos por 48h em microaerofilia a 37°C.
2.4.1 Análise da atividade metabólica (Concentração de lactato)
Após o período de incubação de 48h, os espécimes foram lavados com água de cisteína peptona (CPW) para remover células soltas, e transferidos para placas contendo 1,5 ml de solução de peptona tamponada (BPW) suplementada com 2% de sacarose (v/v). Para permitir a formação de ácido, as placas foram incubadas anaerobicamente por 3h a 37°C. Depois deste período, a solução de BPW foi analisada através da concentração de lactato, determinada usando método enzimático padrão pela enzima lactato desidrogenase.
2.4.2 Análise da viabilidade bacteriana
Para o estudo da viabilidade bacteriana, foi empregada a análise colorimétrica do metilbrometo de tiazolil azul de tetrazolio (MTT), que mede a redução do MTT em cristais de formazan pelo biofilme viável e metabolicamente ativo.
Os espécimes foram levados a tubos Falcon contendo 1 ml de solução tampão fosfato salina estéril (PBS) e agitados em vortex durante 1 min por 3 vezes. O PBS tem a função de promover o descolamento do biofilme da superfície dos espécimes para que seja misturado com o MTT. O PBS contendo o biofilme foi aspirado e transferido para eppendorfs, e então levados à centrífuga. Após a centrifugação, o biofilme isolado no fundo do eppendorf foi mantido e o PBS restante, aspirado e descartado. Foram adicionados 100 µl de MTT em cada
eppendorf e incubados em microaerofilia em estufa a 37°C por 1 h. Após este
período, foram acrescidos 100 µl de dimetilsulfóxido (DMSO) e mantidos por 20 minutos em agitação e ao abrigo da luz. Por último, o conteúdo dos eppendorfs foi transferido para uma placa de 96 poços para leitura em um leitor de microplacas, com absorbância de 540 nm.
A análise de rugosidade superficial foi realizada utilizando um rugosímetro (SJ-201 – Mitutoyo, Japão) que realiza leituras através de uma ponta de diamante com velocidade constante de 1,0 mm/s e força aplicada de 6 mN. A ponta percorreu uma distância de 2 mm e foram feitas 6 avaliações por espécime, das quais foi calculada uma média para obtenção de um valor por espécime, dado em µm. O parâmetro utilizado foi o Ra (média aritmética dos picos e vales de uma superfície).
2.6 Retenção de brilho
A retenção de brilho foi avaliada com um medidor de brilho (Glossmeter tri-angle ZGM 1110 – Zehntner, Sissach, Suíça), devidamente calibrado de acordo com as instruções do fabricante. Foram realizadas três medições na porção central do espécime, sendo feita a média aritmética para obtenção de um valor por espécime. O ângulo de incidência utilizado foi o de 60°. As medidas feitas foram dadas em G.U. (do inglês gloss units, unidades de brilho). Com o objetivo de que fossem sempre realizadas no mesmo ponto da superfície, uma matriz guia foi empregada para o posicionamento dos corpos de prova.
Os ensaios de indução de biofilme, atividade metabólica, viabilidade bacteriana, rugosidade superficial e retenção de brilho serão realizados 24h após a confecção das amostras, repetidos após 20.000 ciclos de simulação de escovação e novamente após o polimento.
2.7 Abrasão por escovação
Um simulador de ciclos de escovação (Simulação de escovação - MEV2, Odeme, Brasil) foi utilizado para realizar a abrasão na superfície dos espécimes. Escovas dentais (Oral-B Indicator® Plus cerdas macias) foram acopladas à máquina de forma que apresentassem íntimo contato com a superfície das resinas. A simulação da escovação se deu através da aplicação de uma carga vertical de 2,5 N, com movimentos horizontais. A proporção de água destilada/dentifrício (Colgate Total 12 Clean Mint) utilizada foi de 1:1. Para cada espécime, foram adicionados inicialmente 3 ml da mistura água/dentifrício (“slurry”) e a cada 1000 ciclos, mais 1 ml da mistura era adicionado. Posteriormente, as amostras foram removidas da
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máquina, lavadas com água corrente e levadas a cuba ultrassônica por 10 minutos, para remoção de possíveis resíduos do slurry.
2.8 Polimento dos espécimes
As amostras foram polidas empregando uma politriz (Aropol E, Arotec, Brasil), acoplada com lixas de granulação #600 e #4000 a 150 rpm com água corrente. O tempo para cada lixa foi de 60 s.
2.9 Estabilidade de cor e translucidez
A estabilidade de cor e translucidez foram analisadas através de um espectrofotômetro (modelo CM2600d - Konica Minolta Sensing Inc, Osaka, Japão) empregando o parâmetro CIELab e o iluminante D65, a um ângulo de 10° com máscara SAV acoplada. Antes de cada ensaio, a calibração do equipamento foi realizada com a superfície branca padrão que acompanha o dispositivo. As leituras do espectrofotômetro foram realizadas com as amostras posicionadas sobre um padrão cerâmico branco e outro preto (Ceramic Colour Standard, CERAM Research Ltd, Reino Unido).
O parâmetro CIELab é composto de três eixos:
1. Eixo L: avalia o grau de luminosidade, e pode variar de 0 (preto) à 100 (branco).
2. Eixo a: pode variar de valores negativos (verde) até valores positivos (vermelho).
3. Eixo b: pode variar de valores negativos (azul) até valores positivos (amarelo).
O estudo inicial das alterações de cor foi realizado 24 horas após a fotoativação das amostras. Os espécimes foram então submetidos a ciclos de escovação e imersão em solução corante – 2500 ciclos de abrasão por escovação, seguidos de 72h de imersão em café. Estes ciclos foram repetidos por 4 semanas, que simulam o consumo de café e escovação dentária por aproximadamente 2 anos. (28, 29) Ao final dos ciclos, a leitura de cor e translucidez foi repetida.
Para o preparo da solução corante, foram misturados 3,6 g de café em pó (Pilão Extra Forte, D.E. Cafés do Brasil, São Paulo, Brasil) a 300 ml de água
destilada fervente, e agitados com o auxílio de um agitador magnético (Q261A11, Quimis, Brasil) por 10 minutos. Após esse período, o composto foi filtrado utilizando coador e filtro de papel. Para cada espécime, foi adicionado 2 ml da solução em sua superfície.
A variação total (ΔE) de cor foi determinada pela fórmula:
ΔE = [(ΔL)2 + (Δa)2 + (Δb)2]1/2
A qual considera a variação dos valores em cada eixo do parâmetro CIELab entre a primeira avaliação e a última leitura realizada.
O parâmetro de translucidez (TP) foi calculado pela fórmula:
TP = [(LB – LW)2 + (a*B – a*W)2 + (b*B – b*W)2]1/2
Onde “B” e “W” representam as leituras das coordenadas do CIELab contra o fundo preto e fundo branco, respectivamente.
2.10 Análise estatística
Os resultados serão submetidos à análise de variância de dois fatores com medidas repetidas no tempo e teste de Tukey (95%).
3 - ARTIGO PRODUZIDO (a ser submetido na Journal of Dentistry)
Characterization of optical and antimicrobial properties of experimental composites formulated with quaternary ammonium derivatives
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School of Dentistry, Federal Fluminense University, Niterói, Rio de Janeiro, Brazil
Guilherme Ferreira Regoa Marina Lermenn Vidala Gil Mendes Viannab
Luis Felipe Jochims Schneidera,c Maristela Barbosa Portela a
Larissa Maria Assad Cavalcantea,c
a School of Dentistry, Federal Fluminense University, Niterói, RJ, Brazil.
b Department of Drugs and Pharmaceutics, Faculty of Pharmacy, Federal University of Rio de Janeiro
c Nucleus for Dental Biomaterials Research, Veiga de Almeida University, Rio de Janeiro, RJ, Brazil.
Correspondence:
Larissa Maria Assad Cavalcante
School of Dentistry, Federal Fluminense University
Rua Mario Santos Braga, 28, Campus do Valonguinho, Centro Niterói – RJ – Brazil
CEP: 24020-140
ABSTRACT
The objective of this study was to determine the influence of the addition of two monomers derived from quaternary ammonium salts (QAM), containing different molecular chain sizes and applied at different concentrations, on the antimicrobial properties and optical properties of experimental resin composites. Model resins
were obtained from BisGMA-TEGDMA mixture and the addition of a photoinitiator / co-initiator system. Dimethylaminododecyl methacrylate (DMADDM) and dimethylaminohexadecyl methacrylate (DMAHDM) were synthesized and incorporated in concentrations of 5% and 10%. A control group (without quaternary ammonium) was also synthesized for comparison of its properties with the other groups. Filler particles were added at a ratio of 50% mass for composites obtainment. Biofilm viability and lactic acid production, gloss retention, and surface roughness analyses were performed 24 hours after the preparation of the samples and repeated after brushing simulation and after polishing. The color stability was determined by CIELab method from consecutive measurements before and after cycles of brushing and immersion in coffee. The results were submitted to ANOVA and Tukey's test (95% significance). The results showed that the longer the chain of quaternary ammonium molecule and the higher its concentration, the lower was the viability and the production of lactic acid by the biofilm. Furthermore, the values found for gloss and surface roughness were similar for all groups. The color stability of the composites containing DMADDM and DMAHDM was higher than the control group, and groups containing larger concentrations of antimicrobials had better color results than GC. Thus, the addition of QAM in both tested concentrations did not affect gloss retention and roughness of the experimental composites compared to the control group. Furthermore, color stability and translucency were higher than the control, especially when increasing the concentration of quaternary ammonium. The chain length of the quaternary ammonium monomers mainly affected the biofilm development and production of lactic acid, so that longer chains promoted better antimicrobial properties, not significantly affecting the optical properties tested.
Keywords: resin composites, optical properties, quaternary ammonium methacrylate, biofilm inhibition.
3.1 Introduction
Resin composites are the material of choice for direct restorations of anterior and posterior teeth affected by decay, fracture or wear. Since its introduction, over fifty years ago, significant improvements in its composition have been achieved, such
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as the incorporation of filler particles surrounded with a silane coupling agent (1-3) and the monomeric composition of the organic matrix. (2) These changes in composition provided better physical, mechanical and aesthetic aspects to the resin composites, such as increased wear resistance, lower polymerization shrinkage, better flexural strength and better polishing. (1-5) Thus, the compounds are capable of mimicking the lost tooth structure, withstanding mastication stresses and reestablishing aesthetics.
Despite this evolution, several studies in the literature still show high failure rate in composite restorations, (6-10) showing that, in some cases, the number of replacements exceeds the restorations made for the first time. (6, 7) Secondary caries stand out as the main reason for failure. (6-10) Opdam et al 2014 observed that the risk of development of secondary caries is higher in patients with medium and high decay rate, and the greater the number of involved faces, the higher is the probability of restoration failure (about 30 to 40% higher). (11)
The biofilm formed on the surface of the resin is able to promote its degradation by the release of enzymes, leading to increased surface roughness and an increased impregnation of bacteria, which invade the interface and form a new cavity. (12-15) Furthermore, the unreacted monomers from the resin matrix stimulate bacterial growth. (13, 15) To control biofilm growth and consequent development of a new cavity, studies suggest the incorporation of antimicrobial agents in restorative materials formulation. An alternative would be adding methacrylic monomers derived of quaternary ammonium salts (QAM) to the organic matrix. (16-19) These monomers cause a disturbance in the electrical balance of the bacterial membrane through the contact of their positively charged molecules with the negatively charged cell, causing rupture of its membrane and cell death. (16, 18-20) Quaternary ammonium methacrylates are also low cytotoxic to cells of the oral cavity, about twenty times lower than the BIS-GMA, a monomer widely used in dental composites available on the market. (17, 21)
Among the monomers derived from quaternary ammonium salts dimethylaminododecyl methacrylate (DMADDM) and dimethylaminohexadecyl methacrylate (DMAHDM) stand out. (16, 17, 20-22) They are generally incorporated in concentrations of 5% and 10% by mass, in adhesives and composite systems. (16, 22-24) The molecules of DMADDM and DMAHDM have an amine core, a methacrylate termination and a long chain of hydrocarbons (12 alkyl chain to
DMADDM and 16 to DMAHDM). The amine nucleus is responsible for the positive charge of the molecule and consequent antimicrobial action; the methacrylate termination ensures the incorporation of the monomer to the polymer chain, allowing inhibitory action in the long term. (16, 21, 25) Regarding the hydrocarbon chain, studies show the relationship between chain length and bactericidal action, so that longer chains promote increased hydrophobicity, leading to greater penetration into the bacterial membrane and consequent inhibition of biofilm. (16, 19, 20)
Despite the theoretical advantages listed above there are no studies in the literature on the effect of the addition of QAM on the optical and surface properties of dental composites. Therefore, the objective of this study was to determine the effect of concentration and chain length of the quaternary ammonium on (a) viability of induced S. mutans, (b) the formation of lactic acid on composites, (C) roughness (D) gloss retention and (e) color stability and translucency of experimental dental composites.
The study hypothesis was that the higher the concentration and chain length of quaternary ammonium,
i. the lower the viability of the biofilm induced on the composite; ii. the lower the formation of lactic acid by S. mutans on composites; iii. the lower the surface roughness of the resin;
iv. the higher the gloss retention of resins; and
v. greater color stability and translucency of the tested experimental composites.
3.2 – Materials and Methods
23
The antimicrobial monomers were synthesized using the Menschutkin reaction. (26) In this addition reaction, a tertiary amine and an organic halide were inserted in equal amounts (10 mmol) into a transparent vial with 3 g of ethanol, mixed at 60°C for 24 h. With the aid of mild vacuum (7 kPa), the residual reagents and solvents were removed, isolating the desired antimicrobial monomer. For each monomer, a different organic halide was used (Table 1), since the tertiary amine was always 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate (DMAEMA).
Table 1 – Tertiary amine and organic halide used for the synthesis of antimicrobial
Tertiary Amine Organic Halide Antimicrobial Monomer 2-N,N-dimethylaminoetyl
methacrylate (DMAEMA) 1-bromododecane DMADDM
2-N,N-dimethylaminoetyl
methacrylate (DMAEMA) 1-bromohexadecane DMAHDM
3.2.2 Formulation of composites with antimicrobial action
For each material, Bis-GMA and TEGDMA (Esstech Inc., USA, batch TSMPOO4397) were used in a 1:1 ratio by weight, 1% camphorquinone (Esstech Inc., USA; Lot TSNP004397) and 1% of amine EDMAB (Sigma-Aldrich, USA, batch MKBB3614). Furthermore, different concentrations (5% or 10%) of the antibacterial monomers listed above were also incorporated into the resin matrix. Inorganic filler particles were added in order to obtain a composite containing 50% mass load. Regarding the inorganic content, 15% of 40 nm pre-silanized spherical silica particles size (Aerosil R 812, batch 3523102) and 85% of 0.7 µm pre-silanized borosilicate barium glass particles (V-258-4107, batch 699-17, Esstech Inc.) were incorporated into the composite. Thus, four resin composites were formulated, containing different antimicrobial agents in different concentrations, and one control group that did not have antibiofilm monomers. (Table 2)
Table 2 - Division of groups according to the monomer employed and its concentration
Groups Antibiofilm
Monomer
Group 12.10 DMADDM 10%
Group 16.5 DMAHDM 5%
Group 16.10 DMAHDM 10%
Group C Control
3.2.3 Sample preparation
The experimental composites were bulk-filled in a metal mold with dimensions of 8 mm diameter and 2 mm thickness. A metal weight of 65g was placed over a mylar strip and a glass slide for 30 seconds in order to plan the sample and remove the excess of resin. Subsequently, the samples were photoactivated with a LED light source (LED Demi, Kerr, Wisconsin, USA) for 40 seconds on each side, at an irradiance of 800 mW / cm2 checked with a radiometer (LED Radiometer, Demetron SDS Kerr, Wisconsin, EUA) at the end of preparation of each specimen. Ten specimens were prepared (n = 10) for each experimental group to assess surface roughness, gloss retention, and of biofilm growth inhibition. For the color and translucency stability test, five specimens were made per group (n = 5). At the end of this step, one side of the specimen was standardized so the readings and aging procedures could be performed.
3.2.4 Induction of biofilm growth
The mature biofilm used was composed exclusively of Streptococcus mutans. This microorganism was selected because it is one of the main microorganisms involved in caries initiation and progression.
Specimens were exposed to ultraviolet light in a laminar flow cabinet for 30 min to be sterilized. After this step, they were fixed in wells of agar culture "Brain Heart Infusion" (BHI) plates.
Isolates of "American Type Culture Collection" (ATCC) were used for the induction of S. mutans biofilm on the specimens. Aliquots of cell suspension with 2 x 105 cells / ml in a culture medium supplemented with 2% sucrose were inoculated onto the specimens and kept for 48 hours at 37°C in microaerophilic conditions.
25
3.2.4.1 Analysis of metabolic activity (lactate concentration)
After a 48h incubation period, the specimens were rinsed with cysteine peptone water (CPW) to remove loose cells and transferred to plates containing 1.5 ml of buffered peptone water solution (BPW) supplemented with 2% sucrose (v / v). To allow the acid formation, the plates were incubated anaerobically for 3 hours at 37°C. After this period, the lactate concentration in the BPW solution was determined using standard enzymatic method of lactate dehydrogenase. (27)
3.2.4.2 Analysis of bacterial viability
A colorimetric analysis of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) was used, which measures the reduction of MTT to formazan crystals by metabolically active and viable biofilm.
The specimens were inserted in Falcon tubes containing 1 ml of sterile phosphate buffered saline (PBS) and vortexed for 1 min for 3 times to promote detachment of the biofilm from the surface of the specimens. The PBS containing the biofilm was aspirated and transferred to Eppendorf tubes and then taken to the centrifuge. After centrifugation, the isolated biofilm on the bottom of the Eppendorf was retained and the remaining PBS was aspirated and discarted. 100 µl of MTT was added in each Eppendorf and incubated in microaerophilic conditions at 37 ° C for 1 h. After this period, they were added 100 µl of dimethylsulfoxide (DMSO) and kept for 20 minutes under stirring and sheltered from the light. Finally, the content of the
Eppendorf tubes were transferred to a 96 well plate to be read in a microplate reader
at absorbance of 540 nm.
The surface roughness was analysed using a contact profilometer (SJ-201 – Mitutoyo, Japan) using a constant speed of 1.0 mm / sec at the applied force of 6 mN. The tip covered a distance of 2 mm and 6 readings were done by specimen, calculating an average to obtain a value for each specimen, given in µm. The parameter used was the Ra (arithmetic mean of peaks and valleys of a surface).
3.2.6 Gloss retention
The gloss retention was measured with a glossmeter (Tri-Glossmeter angle ZGM 1110 - Zehntner, Sissach, Switzerland), calibrated according to the manufacturer's instructions. Three measurements were carried out in the central part of the specimen, and an average value was calculated. The angle of incidence used was 60 °. The measurements were given in G.U. (gloss units). In order to secure that the readings were always held in the same spot of the composites’ surface, a guide matrix was used for positioning of specimens.
Biofilm induction, metabolic activity, bacterial viability, surface roughness and gloss retention assays were performed 24 h after the preparation of the specimens, and repeated after 20,000 cycles of simulated brushing and after polishing.
3.2.7 Toothbrush Abrasion
A toothbrushing simulator (MEV2, Odeme, São Paulo, Brazil) was used for abrasion on the surface of the specimens. Toothbrushes (Oral-B Indicator® Plus, soft bristles) were coupled to the machine in order to present intimate contact with the surface of the resins. Toothbrushing simulation was done by applying a vertical load of 2.5 N, with horizontal movements. The ratio of distilled water / dentifrice (Colgate Total 12 Clean Mint) used was 1:1. For each specimen, 3 ml of the mixture water/dentifrice ("slurry") were initially added and 1 ml of the mixture was refilled every 1,000 cycles. Subsequently, the samples were removed from the machine, washed with tap water and taken to ultrasonic bath for 10 minutes to remove any remainder of the slurry.
27
3.2.8 Polishing of specimens
The specimens were polished (Aropol e, AROTEC, Brazil) with 600 and 4000 grid sandpaper at 150 rpm for 60s under water irrigation.
3.2.9 Color stability and translucency
Color stability and translucency were analyzed by a spectrophotometer (model CM2600d - Konica Minolta Sensing Inc., Osaka, Japan) using the CIELab parameter and the illuminant D65 at an angle of 10° with SAV mask attached. Before each test, the calibration of the equipment was performed with the standard white surface of the device. The spectrophotometer readings were performed with the samples placed on a white ceramic pattern and other black ceramic pattern (Ceramic Colour Standard, CERAM Research Ltd, United Kingdom).
The CIELab parameter is composed of three axes:
1. L* axis: assesses the degree of brightness, and ranges from 0 (black) to 100 (white).
2. a* axis: varies from negative (green) to positive (red).
3. b* axis: varies from negative (blue) to positive values (yellow).
The initial study of color change was carried out 24 hours after curing the samples. The specimens were then subjected to brushing and immersion cycles, consisting of 2500 cycles of abrasion by brushing, followed by 72 hours immersion in coffee. These cycles were repeated for 4 weeks, simulating the consumption of coffee and tooth brushing for about 2 years. (28, 29) At the end of the cycles the color and translucency reading was repeated.
To prepare the dye solution, 3.6 g of coffee powder (Pilão Extra Forte, DE cafés do Brasil, São Paulo, Brazil) were mixed to 300 ml of boiling distilled water, and stirred with the aid of a magnetic stirrer (Q261A11, Quimis, Brazil) for 10 minutes.
After this period, the solution and for each specimen, 2 ml of solution was added to its surface.
The total color variation (ΔE) was determined by the formula: ΔE = [(ΔL) 2 + (Δa) 2 + (Δb) 2] 1/2,
which considers the range of values on each axis of the CIELab parameter between the first evaluation and the last reading taken.
The translucency parameter (TP) was calculated by the formula: TP = [(LB – LW)2 + (a*B – a*W)2 + (b*B – b*W)2]1/2,
where "B" and "W" represent readings of CIELab coordinates against black and white background respectively.
3.2.10 Statistical analysis
The results will be submitted to two-way analysis of variance (ANOVA) with repeated measures and Tukey’s test (95%).
3.3 Results
3.3.1 Analysis of bacterial viability
The results of bacterial viability are shown in Figure 1. The groups that had higher initial viability of biofilm were G12.5 and G12.10, followed by G16.5 and G16.10. The control group (GC) had the highest biofilm growth. This initial pattern changed after brushing simulation, where all groups had a statistically similar increase in biofilm development. After polishing, all groups had similar viability values, with no statistical difference.
29
Fi gure 1 - Analysis of bacterial viability of composites containing quaternary ammonium and control group. Material p = 0.000; Time p = 0.000; Material * Time p = 0.000; Uppercase letters determine analysis by conditions and lowercase letters among materials. Different letters indicate significant statistical difference.
3.3.2 Analysis of metabolic activity (lactate concentration)
The results of the metabolic activity are shown in Figure 2. Composites containing quaternary ammonium showed lower initial values of lactate production compared to the control group (GC). Among the groups containing QAM, G12.5 showed the highest initial value. After brushing simulation, G12.5 and G12.10 had an increase in lactate concentration, statistically similar to GC. After polishing, all groups showed high activity of lactate dehydrogenase. Only G16.10 had a statistically different result, compared to the other groups.
Bb ABb Aa Aa Aa Aa Aa Cb Bc Bc Aa Aa Bb ABb ABb
Figure 2 - Analysis of the metabolic activity of S. mutans biofilm induced on composites containing quaternary ammonium and control group. Material p = 0.000; Time p = 0.000; Material * Time p = 0.003; Uppercase letters determine analysis by conditions and lowercase letters among materials. Different letters indicate significant statistical difference.
3.3.3 Surface roughness
Figure 3 shows the roughness measurements in three different stages: initial, after brushing and after polishing. No statistical differences were observed among groups for the initial condition. After toothbrush abrasion, G12.5 and G16.10 presented rougher surfaces compared to the control group (GC).
After the polishing procedures, no statistical differences were detected among the groups, and numerical roughness values were similar to the initial condition. Bab Aa Aa Aa Aa Ab Aa Bb Bb Bb ABa Ba Aa Bb Bb
31
Figure 3 - Surface roughness of the groups containing QAM and control group. Material p = 0.011; Time p = 0.000; Material * Time p = 0.000; Uppercase letters determine analysis by condition and lowercase letters among materials. Different letters indicate significant statistical difference.
3.3.4 Gloss retention
Figure 4 shows the gloss measurements according to each time of assessment. No statistical differences were observed among groups for the initial condition, gloss values ranged from 65.9 to 78.3 GU. After toothbrush abrasion, all groups had a statistically similar decrease in gloss retention.
After polishing, G12.5, G16.5 and G16.10 presented gloss values similar to the initial condition, while G16.5 and GC had a significantly decrease in gloss.
Figure 4 - Gloss retention of groups containing QAM and control group. Material p = 0.013; Time p = 0.000; Material * Time p = 0.069; Uppercase letters determine analysis by condition and lowercase letters among materials. Different letters indicate significant statistical difference.
3.3.5 Color stability and translucency
Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Ba Ba Ba Ba Ba Ca Ca Gloss Unit - GU B Aa B B Aab B B Aab B B Aa B B Ab B Ra Values - µm
The ΔE and translucency parameter values are shown in Table 1. The highest delta value was observed in the control group. The lower delta values were those of groups G12.10 and G16.10, which have shown a better color stability after cycles of toothbrush simulation and immersion in coffee
By the analysis of the translucency parameter (TP), the resins containing quaternary ammonium showed lower initial values, and the highest result was for the GC group. Such behavior was also observed in the reading performed after immersion and brushing cycles. The largest change in translucency was observed in the control group.
ΔE TP G12.5 24.28 (0.38) B Initial Final G12.10 22.61 (0.43) C G12.5 15.4 (0.9) Ab 16.9 (1.0) Ab G16.5 24.4 (1.16) AB G12.10 15.8 (0.4) Ab 16.9 (0.7) Ab G16.10 23.31 (0.43) BC G16.5 15.2 (0.5) Ab 16.7 (1.1) Abc GC 25.74 (1.00) A G16.10 14.5 (0.5) Ab 15.2 (0.7) Ac GC 17.9 (0.5) Ba 21.1 (1.0) Aa Table 1. Color variation and translucency parameter results of the evaluated composites. ΔE: Material p = 0.000; TP: Material p = 0.000; Time p = 0.000; Material * Time p = 0.011; Uppercase letters determine analysis horizontally and lowercase letters, vertically. Different letters indicate significant statistical difference.
The initial and final results of coordinates L *, a* and b * of CIELab parameter are shown in Table 2. For L *, the lower initial value was found in the control group, while the groups containing QAM obtained higher measures with no statistically significant difference among them. After cycles, all groups showed an increase in L*, with G12.10 having the lowest value of L*. For the a* values, GC had higher initial measurement compared to the groups containing QAMs. After the aging procedure, all groups showed a reduction in this coordinate, whereas the G12.10 group had an increase of a*. In the analysis of b*, the highest initial result was found to GC compared to other materials. The G16.10 group showed the lowest initial value of b*. After simulated aging, there was a reduction of b* values for all groups, with no statistical difference among resins.
33 L* Initial Final G12.5 71.1 Ba (0,6) 95.2 Aa (0,6) G12.10 70.3 Ba (0,5) 92.9 Ab (0,7) G16.5 70.3 Ba (0,9) 94.6 Aa (0,7) G16.10 71.9 Ba (0,7) 95.1 Aa (0,3) GC 68.5 Bb (0,5) 94.1 Aa (0,6) b* Initial Final G12.5 18.9 Aab (0.8) 16.2 Aa (1.9) G12.10 19.2 Aab (0.7) 19.0 Aa (2.4) G16.5 19.3 Aab (0.6) 17.6 Aa (2.4) G16.10 18.5 Ab (0.7) 16.9 Aa (2.5) GC 21.4 Aa (0.2) 18.8 Aa (0.7)
Table 2. Initial and final values of the coordinates of CIELab parameter. L *: Material p = 0.000; Time p = 0.000; Material * Time p = 0.000; a *: Material p = 0.000; Time p = 0.000; Material * Time p = 0.000; b *: Material p = 0.004; Time p = 0.000; Material * Time p = 0.414; Uppercase letters determine analysis horizontally and lowercase letters, vertically. Different letters indicate significant statistical difference. 3.4 Discussion a* Initial Final G12.5 0.2 Ab (0.1) 0.1 Ab (0.2) G12.10 0.1 Bb (0.1) 0.6 Aa (0.2) G16.5 0.2 Ab (0.0) -0.2 Bb (0.4) G16.10 0.3 Ab (0.1) 0.2 Ab (0.1) GC 1.2 Aa (0.1) -0.1 Bb (0.4)
Dental restorative composites nowadays have high versatility in their clinical indications, being used in anterior and posterior teeth to restore form, function and aesthetics of elements affected by carious lesions, wear and fracture. However, they still have a relatively high failure rate, especially due to secondary caries. (6-10) In this study, methacrylate monomers derived from quaternary ammonium salts with antibiofilme properties were synthesized as dimethylaminododecyl methacrylate (DMADDM) and dimethylaminohexadecyl methacrylate (DMAHDM) and incorporated into experimental composites in concentrations of 5% and 10%.
The initial results of biofilm viability showed that composites containing DMAHDM presented lower S. mutans biofilm development than the other evaluated groups. This can be explained by the longer alkyl chain present in this monomer compared to DMADDM. Several studies indicate that longer chains increase the hydrophobicity of the molecule and the tendency of penetration into the bacterial membrane, causing its rupture. (16, 19, 20, 22) A lower biofilm development was also observed by increasing the concentration of antimicrobial agents. By increasing the concentration from 5% to 10%, the charge density in the resin matrix is also increased, resulting in higher biofilm inhibition capacity. (18, 20-22) These charges present in the amine portion of the molecule of QAM promote attraction and interaction with the bacterial membrane and its rupture. In addition, charges could damage bacterial DNA, disturbing the flow of essential ions and disrupting protein activity. (20)
After toothbrushing and polishing simulations, there was an increase in viable biofilm in contact with samples containing quaternary ammonium monomers. This is due to the positioning of a polyester strip and the weight placed above during specimens’ preparation, creating a “matrix rich” surface layer. (30-33) Thus, after abraded by brushing, part of this region has been lost, exposing filler particles (which have no antibiofilm capacity) and reducing the amount of antimicrobial monomers in the composite surface. This fact was even worse after polishing of the specimens, promoting further reduction of the antimicrobial capacity of the composites. For the control group, the initial values were high due to the absence of antimicrobial monomers in its composition. After toothbrushing simulation, we observed an increase in viable biofilm, since the composite surface became rougher and uneven, increasing the area available for biofilm adhesion and development. (34, 35) After
35
polishing the resin surface, it became smoother and more uniform, and the pattern of viable biofilm was similar to the initial value. Thus, the first hypothesis was partially accepted, since composites with higher concentrations and longer chains of antimicrobial monomers reduced biofilm formation. However, this property was attenuated after brushing and polishing.
The results of bacterial metabolism by lactic acid production of
Streptococcus mutans biofilm are related to the viability results, since the specimens
containing quaternary ammonium promoted the bacteria death and interruption of its metabolism. However, after the brushing simulation, there was a reduction of antimicrobial monomers, increasing the viability of the biofilm and the formation of lactic acid. After polishing, the highest results of bacterial metabolism was observed. For the control group, the lactic acid production followed the same pattern of MTT, with similar values found in each of the sampled specimens, increasing after toothbrushing, due to increased surface roughness and consequent bacterial adhesion. Thus, the second hypothesis was partially accepted, whereas composites containing QAM at higher concentration and with longer alkyl chains promoted lower lactic acid production. This ability was reduced, however, after simulated brushing and polishing.
Regarding roughness measures, all groups presented similar baseline and final values. However, the results were different after toothbrushing, where the control group presented smoother surfaces. This is due to a more wear-resistant matrix in the control composite, because of its higher density of cross-links, since all the monomers employed were dimethacrylates. The groups containing quaternary ammonium methacrylates showed more susceptibility to surface degradation because of the presence of monomethacrylate monomers in these groups which may weaken the resin matrix, since its long alkyl chain forms weak bonds with other monomers and result in a less complex and dense polymer chain in the final composite. (36) Furthermore, the filler particles could easily come off the matrix, increasing the roughness and porosity of the material. (33, 37, 38) Consequently, the third hypothesis was partially accepted, since all groups containing QAM showed lower roughness only in initial and after polishing conditions.
Gloss retention results showed that all materials presented satisfactory initial gloss values (about 70 G.U.), (39) and had a similar variation in the three time
periods, with the G12.10 and GC groups having final results lower than their initial gloss values. The values obtained are probably related to roughness, since the surface of the specimens became rougher due to brushing simulation. Thus, there was a diffuse reflection of the glossmeter light beam, generating low gloss values and a visual sensation of a matte surface. In contrast, the initial measurements and those after polishing were higher since their surfaces were smoother and more polished, respectively, leading to a more uniform reflection of the light beam, and the visual sensation of higher gloss. (38, 40, 41) Therefore, the hypothesis for gloss retention was rejected, since all the groups had similar gloss values in the three evaluated conditions, independently of concentration and QAM chain size.
The color stability of a composite is directly related to its monomeric composition, size and amount of filler particles, photoinitiator type used and the degree of polymerization. (40-44) The organic resin matrix directly affects color stability due to the water uptake. A more hydrophilic matrix allows greater uptake of water and dyes of the oral environment, providing greater color change. (33, 42, 43, 45-48) Additionally, it facilitates the occurrence of the plasticization phenomenon of the matrix, which generates a separation of the molecules of the polymer chain and reduces its secondary interactions. (33, 36) For this reason, the more hydrophilic matrix facilitates the formation of microcracks and microvoids, that enhance the uptake of pigments and consequent color change. (42, 46, 47)
In this study, the composites which contained quaternary ammonium had less color change (ΔE). This may be due to their higher tendency of wear by toothbrush abrasion, as observed in the roughness results. In this way, the pigments recently absorbed from the coffee were removed after toothbrush simulation. However, as the control group was less prone to toothbrush wear, they also presented a higher pigment retention and consequent color alteration.
Also, composites containing QAM have lower amounts of hydrophilic monomers such as Bis-GMA and triethyleneglycol dimethacrylate (TEGDMA). (33, 37, 40, 42, 45-48) The hydrophilicity of these monomers is related to the presence of hydroxyl groups and ethoxy groups in their molecules, respectively, that form hydrogen bonds with water. (40, 42, 46) Consequently, the control group, which has only these before mentioned monomers in their matrix, was the composite with the highest variation of color and translucency.
37
A material considered with clinically appropriate color stability is one that has a value of Δ ≤ 3.3. (37, 45, 47, 48) The results for all groups extrapolate this limit, since this is an experimental material and the incorporated filler proportion compared to the matrix was low. Jasse et al claim that it is impossible to reproduce in laboratory the characteristics of a material present in the market, especially due to the lack of details provided by manufacturers. (38) Moreover, many components found in commercial resins, such as inhibitors, stabilizers and dyes were not incorporated in the experimental composites studied in the current investigation. Another important factor is the filler ratio used, since studies have shown that a higher amount of matrix in relation to the amount of filler particles promotes a less color stability of the material. (33, 47-49) Thus, the hypothesis for color stability and translucency was accepted since the resins containing quaternary ammonium monomers had higher color stability and translucency when compared to the control group.
As noted above, inhibition of S. mutans biofilm was reduced as the surface of composites containing the QAM was abraded and polished. However, it is possible that this property is maintained at the adhesive interface of a restored cavity, since this region is not abraded or polished, and it is a crucial area for secondary caries development. Thus, further studies are needed to assess the behavior of these materials in a simulated cavity, and the integrity of its interface with the tooth structure after the abraded surface of the resin.
3.5 Conclusion
Composites containing QAM with longer alkyl chain length showed greater biofilm inhibition and their optical properties were similar to the control group. Furthermore, the inhibition of S. mutans was higher in the resins with quaternary ammonium concentrations of 10%, without major impact on the optical properties. Thus, quaternary ammonium monomers are promising components for inhibiting the formation of secondary caries, while ensuring the maintenance of the optical and surface properties of resin composites.
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