UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE
FUNGOS ENDOFÍTICOS ISOLADOS DE
FUNGOS ENDOFÍTICOS ISOLADOS DE
PLANTAS DE ECOSSISTEMAS DE
PLANTAS DE ECOSSISTEMAS DE
IPUCAS NO ESTADO DO TOCANTINS
IPUCAS NO ESTADO DO TOCANTINS
LIA CARDOSO ROCHA SARAIVA TEIXEIRA
LIA CARDOSO ROCHA SARAIVA TEIXEIRA
BELO HORIZONTE
BELO HORIZONTE
2007
Lia Cardoso Rocha Saraiva Teixeira
Atividade antimicrobiana de fungos endofíticos isolados de plantas de ecossistemas de Ipucas no estado do Tocantins
Dissertação apresentada ao programa de Pós- Gra duação em Microbiologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Mina s Gera is como requisito parcial para obtenção do grau de mestre em Ciências Biologias
Áre a de concentração: Microbiologia
Orientador: Prof. Dr. Carlos Augusto Rosa Co-orientador: Luiz Henr ique Rosa - UFOP
Belo Horizonte
Instituto de Ciências Biológicas Universidade Federal de Minas Gerais
Teixeira, Lia Cardoso Rocha Saraiva
Atividade antimicrobiana de fungos endofíticos isolados de pla ntas de ecossistemas de Ipucas no estado do Tocantins. [manuscrito] / Lia Cardoso Rocha Saraiva Teixeira. – 2007. 65 f. : Il. ; 29,5 cm.
Orientador: Carlos Augusto Rosa. Co-orientador: Luiz He nrique Rosa .
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Minas Gerais, Instituto de Ciênc ias Biológicas.
1. Fungos endofíticos – Teses. 2. Produtos de ação
antimicrobiana - Teses. 3. Fungos – Teses. 4. Microbiologia – Teses. I. Rosa, Carlos Augusto. II. Rosa, Luiz Henrique. III. Universidade Federal de Minas Gerais. Instituto de Ciências Biológicas. IV. Título.
CDU: 582.28
iii
Colaboradores
Prof. Dra. Paula Benevides de Moraes1 Prof. Dr. Raphael Sanzio Pimenta1 Dr. Carlos Leomar Z ani2
Dra. Rachel Basques Caligiorne3
1. Laboratório de Microbiologia Ambiental – Universidade Federal do Tocantins 2. Laboratório de Química de Produtos Naturais – Centro de Pesquisa Re né
Rachou – Fundação Oswaldo Cruz
3. Laboratório de Pesquisas Clínicas – Centro de Pesquisa René Rachou – Fundação Oswaldo Cruz
Á Vovó Annette, Mamãe, Papai, Júlia e Bruno com todo meu amor e carinho.
“Eu e scre vo sem esperança de que o que eu escrevo altere qualque r coisa. Não altera em
nada... Porque no fundo a gente não está querendo alterar as coisas. A gente está querendo desabrochar de um modo ou de outro...”
Agradecimentos
Ao meu orientador Carlos Rosa por ter possibilitado a realizaç ão deste trabalho. Agradeço muito por todo o aprendizado desses anos e principalmente pelo “turismo
científico”, que tornou este trabalho ainda mais prazeroso.
Ao meu co-orientador Luiz Rosa, pelo apoio constante durante o desenvolvimento deste trabalho. Ajuda indispensável e empolgação contagiante ! Muito obrigada!
Ao programa de Pós-graduação em Microbiologia, em especial à coorde nadora Erna Kroon.
À Cristina e ao Douglas (e agora a Fatinha tb!), se mpre dispostos a ajudar!
Ao Departamento de Microbiologia em nome da Prof. Maria Aparecida Rezende
Aos queridos colegas do laboratório de ecologia e Biotcnologia de Leveduras: Anne Carol, Bia Borelli, Carol Líliam, César, Cristina, Fabiana, Fátima, Fatinha, Ilanna, Inayara, Isabella, Maria nas, Polly, Raquel e Susanne. Agradeço pelo companheirismo, ajuda e torcida pelo sucesso deste trabalho. Um agrade cimento espe cia l à Adriana, Lú,
Lud(myla), Michele e Renata queridas amiga s!
À Natália, Mari, Gabriela, Vivian e Fernanda pela ajuda indispensá vel na execução deste trabalho. Um agradecime nto mais que especial á querida amiga Aline, pelas
discussões valiosa s que certamente enriqueceram este trabalho.
Ao Carlos Zani por disponibilizar seu laboratório para a realizaç ão de alguns experimentos deste trabalho. Aos colegas do Laboratório de Química de Produtos
Naturais do Centro de Pesquisa René Rachou pela receptividade e colaboração.
À Rachel Caligiorne e Sabrina Campolina pela ajuda fundamental e indispensável no sequenciame nto das amostras. Aos colegas do laboratório de Pesquisas Clínicas do
Ce ntro de Pesquisa René Rachou pela receptividade e colaboração.
À Paula Moraes e Raphael Pimenta por todo o apoio durante as coletas realizadas. Agradeço ta mbém aos colegas do Laboratório de Microbiologia Ambie ntal da UFT pela
receptividade e ajuda nesse período.
À minha Vó Annette por todo o incentivo e por sempre acreditar em mim! Agradeço a toda a minha família, Vô, Tios e Primos, muito queridos!
À Mamis, Papai, Júlia e Bruno, família que eu a mo e mesmo de longe esteve 100% presente.
Ás minhas queridas amigas e irmãs Aninha, Bia e Fernanda pelo incentivo, boas risadas, conselhos... enfim... por estarem sempre por perto. Amo vocês!!!
Aos amigos mais que especiais: Nara, Marah, Raoni, Cris, Rafa, Nando, Pedrinho, Lumbriga, Fé Caldas, Bê.
Á FAPEMIG e CNPq pelo financiamento.
Á todos aqueles que de alguma contribuíram para a re alização deste trabalho!
Conteúdo Lista de Figuras... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. 2 Lista de tabelas ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. 3 Resumo ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. 4 Summary ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. 6
1 – Relevância e Justif icativa ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. 7
2 – Revisão biblio gráfica ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 9
2.1 – Fungo s end ofíticos . ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. 9
2.2 – Substâncias bioativas produzidas po r fungo s endo fíticos ... ... ... ... ... . 12 2.2.1 – Substâncias antimicro bianas ... ... ... ... ... ... ... ... ... . 15 2.3 – Ecossistemas de ipucas .... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 17 3 – Objetivos ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
... 21
3.1 – Objetivo geral . ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . 21
3.2 – Objetivos esp ecíficos ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 21
4 – Material e Métodos ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . 22
4.1 – Área de estudo ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . 22
4.2 – Iso lamento dos fungos endofíticos ... ... ... ... ... ... ... ... ... . 22 4.3 – Cultivo dos fungo s e preparo dos extratos . ... ... ... ... ... ... ...
27
4.5 – Determinação da atividade antimicrob iana... ... ... ... ... ... ... 27 4.6 – Identificação dos fungos endofítico s ... ... ... ... ... ... ... ... . 28 5 – Resultados e discussão . ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 31
5.1 – Iso lamento e obtenção dos extratos .. ... ... ... ... ... ... ... ... . 31
5.2 – Ativid ade antimicrob iana . ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 36
5.3 – Identificação de isolados ativos ... ... ... ... ... ... ... ... ... . 46 6 – Conclu sões .... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 51 7 – Bibliografia ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 52
Lista de Figuras
Figura 1 – Estrutura qu ímica das sustâncias b ioativas produzid as por fu ngos endofítico s . 13
Figura 2 – Vista externa d e uma Ipuca...18
Figura 3 – Aspecto do interior de uma Ipuca ... ... ... ... ... ... ... ... . 19
Figura 4 – Localização da área d e estudo (Fonte – MARTINS, 2002) .... ... ... ... 23
Figura 5 – Calophyllum brasiliense ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 24
Figura 6 – Sclerolobium sp. . ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 25
Figura 7 – Vochysia sp. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . 26 Figura 8 – Número d e extratos de fungos endofíticos ativos contra micr organismos alvo em relação ao meio de cultivo u tilizado. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ...35
Figura 9 – Porcentagem d e fungos ativo s para cada meio de cu ltivo testado. .. .. .. ...37
Figura 10 – Número d e fungo s end ofíticos com ativid ade antimicrobiana para um ou mais microrganismo s alvos. ...38
Figura 11 – Halo s de inibição produzidos po r três extratos de fungos endofíticos co ntra C. sphaero spermum. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . 41 Figura 12 – Halo de inib ição produzido co ntra Candida albicans pelo extrato do fungo endofítico UFMGCB 763 crescido em ágar b atata-sacar ose (PDS). ... ... ... 42
Figura 13 – Fungos ativo s e su as plantas hospedeiras...45
Figura 14 – Halo de inib ição contra Staphylococcus aureus produzido pelo extrato do fungos endofítico G. fugikuroi UFMGCB 1416 crescid o em ágar batata (PDA). ... . 48
Lista de tabelas
Tabela 1 – Número de indivíd uos de três espécies de p lantas amostradas e nú mero de
fungos endofíticos isolad os...32
Tabela 2 – Medida dos halos de inib ição em milímetro s dos extratos de fungos endofítico s
que apresentar am atividade antimicrobiana em cada meio de cu ltura testado...39
Tabela 3 – Tabela 3 - Identif icação dos fungos endofíticos pela análise da seqü ência d a
região transcrita interna (ITS) no "Genb ank". ...47
3
Resumo
Micror ganismos endo fítico s, aqueles que vivem no s tecidos de plantas vivas, são relativamente pouco estudados e são fontes po tenciais de molécu las que podem ser utilizadas na med icina, agricultura e indústria. O ob jetivo desse trabalho foi detectar a presença de sub stâncias com atividade antimicrobiana p roduzid as por fungo s endo fíticos isolad os de plantas p resentes em fragmento s florestais naturais, “Ipu cas”, no Cerrado do estad o do Tocantins. Para isso foram coletadas amostras de folhas de Calophyllum
brasiliense, Vochysia sp. e Sclerolobium sp., presentes nas Ipucas, para o isolamento dos
fungos. Os mo rfotipos isolados for am depositados na coleção de fungos do Laboratório de Ecologia e Biotecnolo gia de Levedu ras do Dep artamento d e Microbio logia da Universidad e
Feder al de Minas Gerais. Os fungos foram cultivado s em microplacas de 2 4 poços e a obtenção dos extratos fo i realizad a utilizando a extração com metano l. Para a detecção da atividade antimicro biana foi u tilizad a a técnica d e d ifusão em disco par a o s seguintes microrganismo s alvos: Candida albicans ATCC 18804, C. krusei ATCC 2159, Escherichia
coli ATCC 25922 e Staphylococcus aureus ATCC 12600. Para o fungo Cladosporium sphaero spermum CCT 1740 foi utilizada uma suspensão de esporos que foi borrifada em
um papel filtro com os extratos previamente aplicado s. Para a identificação dos isolados ativos fo i realizado o seqüenciamento d a região transcrita interna (ITS) do DNA ribossomal
nuclear. Foram co letadas amostras de folhas de 281 espécimes de plantas, e, a partir destas,
foram isolado s 121 fungos endofíticos. Destes fungos fo ram produ zidos 436 extr atos, dos quais 42 (9,06%) apresentaram atividade antimicrobiana para um ou mais microrganismos-
alvo s. Esses extratos correspondem a 33 isolados distinto s de fungo s, representand o 27,27% do total de microrganismo s testados. Dentre os extratos ativos, 19 (45 %)
apr esentaram atividad e co ntra C. sphaerophorum, 11 (26 %) contra C. albicans, 10 (24%) contra C. kru sei e ap enas dois ( 5%) extratos foram ativos co ntra S. aureus. Nenhum dos extratos foi cap az de inibir E. coli. Seis isolado s ativos fo ram id entificado s pelo
seqüenciamento d a região ITS do DNA ribosso mal. As espécies encontradas foram
Giberella fugikuroi, Curvularia aff. sp ., C. eragrostides, Pseudallescheria boydii e
endofítico s das três plantas estudadas de Ipucas podem representar u ma fonte po tencial de substâncias bioativas com atividade antimicrob iana.
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Summary
Endop hytes are microo rganisms that live inside plant tissues without causing symp toms o f disease. They are relatively poorly studied as source of new bioactive mo lecules that could
be use in medicine, agricultu re and industr y. The pu rpose of this wor k was to screen for
antimicrobial activity the endop hytic fungi isolated from plants found in natural forest fragments, ip ucas, in the state of Tocantins, Brazil. Endop hytic fungi were isolated from three plant species, Calophyllum brasiliense, Voch ysia sp. and Sclerolobium sp. The fungal
isolates were d eposited at the culture collection of the Laboratório de Eco logia e Biotecnolo gia de Leved uras, Departamento de Microbio logia, Universid ade Federal de
Minas Gerais. Tissu e plu gs of the fungi were cultivated on the su rfaces o f agar-solid ified 24-wells in micro titer plates, and the extraction was carried out using methanol. Extr acts were tested for antimicrobial activity b y agar diffusion method against the following microorganisms: Candida albican s ATCC 18804, C. krusei ATCC 2159 , Escherichia coli ATCC 25922 and Staphylococcus aureus ATCC 12600. For Cladosporium
sphaero spermum CCT 1740 was used a susp ensio n o f sp ores that was inoculated in a paper
filter where the extracts wer e previously applied. Fungal molecular identificatio n was based
on internal transcrib ed spacer (ITS) o f nu clear ribosomal DNA. Leaf samples of 2 81 individual p lants were co llected, and a total of 121 endophyte fu ngi were isolated from these plants. A total o f 436 extracts were produ ced from which 42 (9.06%) presented antimicrobial activity for one or more microorganisms tested. These extracts corresponded to 33 d istinct fu ngal isolates, representing 27.27% o f the total isolated microorganisms. Amongst the active extracts, 19 (45%) were able to inhib ited C. sphaerophorum, 11 (26%)
C. albicans, 10 (24%) C. krusei and o nly two (5%) extracts were active fo r S. aureus. None
of the extr acts was capab le to inhibit E. coli. Six iso lates were id entif ied b y ITS
sequencing. The species fo unded were Giberella fugikuroi, Curvularia aff. sp., C.
eragro stides, Pseudallescheria boydii e Pseudocercospora aff luzardii. The analysis of the
results obtained in our work indicates that some endophytic fungi from the three plants occurring in ipu cas could rep resent a potential source of bio active compounds with antimicrobial activity.
1. Relevância e Justificativa
A busca po r sub stâncias de interesse farmacoló gico e agro -qu ímico é fo co de estudo
de diferentes grupos d e pesquisa em todo o mundo. A resistência bacteriana a fármacos, o aparecimento de no vas doenças virais, a alta incid ência de câncer e o aumento de infecções por fu ngos e bactérias mu ltiresistentes na população mundial apenas ressaltam a
imp ortância da realização de trabalho s d e prosp ecção de novas su bstâncias bioativas.
Micr organismos endofíticos, aqueles qu e vivem nos tecidos d e p lantas vivas, são relativamente p ouco estudados e são fontes potenciais de moléculas que podem ser utilizados na medicina, agr icultura e indú stria. Estima-se que existam cerca de 300 mil espécies de plantas na Terra e cada planta pode ser hosped eira de um ou mais
microrganismo endofítico. Co mo poucas plantas foram estud as em relação aos seus endofítico s, a probabilidade de se enco ntrar no vo s micro rganismos cap azes d e produzir substâncias bioativas de interesse para o homem é grande.
Diferentes estratégias são adotadas p ara a detecção e descoberta de organismo s produtores d e substâncias bioativas. Dentre elas, o estudo de ambientes com elevada riqu eza de espécies e inexplor ados são bastante promisso ras em estudos de biop ro specção . O Cerrado rep resenta u m dos p rincipais b iomas brasileiro s, com grande d iversidad e
bio lógica. A flo ra do Cerr ado é a mais rica entre as savanas do mundo, co m mais d e seis
mil espécies de plantas. Além de várias espécies serem endêmicas no Cerrad o, grande p arte
delas o correm apenas em determinadas lo calidades. Os microrganismos endofíticos desse bio ma foram pou co estudados e pod em ser fonte de novas mo lécu las bioativas.
Os produto s naturais pod em ser utilizados diretamente como fármacos quando
apr esentam estrutur as químicas complexas d e difícil ou inviável produção por síntese química. Também podem ser modificados quimicamente par a aumentar a atividade e seletivid ade. Mesmo sem qualquer atividad e biológica aparente, os produtos naturais podem servir de p ro tótipo s para o desenvolvimento de novos fármacos. Desta forma, ap esar
dos avanços no p lanejamento de fármacos utilizando modelagem química, síntese e química combinató ria, o s produ tos natu rais são impo rtantes modelos para estudos celulares e moleculares, e para o desenvo lvimento de no vas substâncias de interesse clínico.
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Atualmente, dif erentes espécies de fungos são estudadas como fontes d e substâncias
com ativid ades antimicro bianas, antivirais, antitumorais, antinflamatór ias, antio xid antes, citotó xica, imu no moduladoras, tripanosso micid a, fitotóxicas, inseticid as, analgésicas, entre outras. Desta forma, a p erda da b iodiversidade causada pela crescente destruição dos ecossistemas natu rais r eforça a necessidade de estudo s relacio nados ao registro da r iqueza de espécies de fungos endofíticos nos amb ientes tropicais, a mo ntagem de coleções de culturas e o estudo de seus metabólitos b ioativos.
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