Egf INFLUENCIA NA DIFERENCIAÇÃO INICIAL DAS CÉLULAS DA CNT
Dissertação de Mestrado submetida ao
Programa de Pós-Graduação em
Biologia Celular e do Desenvolvimento da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do grau de Mestre.
Orientador: Prof. Dr. Ricardo Castilho Garcez
Florianópolis 2018
Este trabalho é dedicado ao Deus que de maneira tão amorosa me trouxe até aqui, e me presenteou me dando a chance de apreciar um pouquinho do milagre da vida.
AGRADECIMENTOS
Ao meu Orientador, Ricardo Garcez, pela oportunidade de integrar seu grupo de pesquisa, pela paciência, pela confiança, pelo incentivo a cada etapa do trabalho. Dono de uma mente brilhante e de um coração imenso, é admirado por todos que o cercam. Muito obrigada Prof., eu não estaria aqui se não fosse seu indiscutível talento como pesquisador, professor e amigo.
Aos meus colegas de bancada Alessandra Barauna, Gabriel Pescador e Jaqueline Issopo. Nem todos os bolos do mundo expressariam minha gratidão pelo companheirismo, compreensão e todos os “galhos quebrados”. Também a caçulinha Dani, que em tão pouco tempo, conquistou a todos nós.
A minha querida amiga e parceira de “cafés sem café” Priscilla Barros Delben, pela amizade incondicional, conversas profundíssimas sobre a vida. Pri, você sempre vai estar aqui, do lado esquerdo do peito, à sete chaves.
A minha consultora em horários inoportunos, Bianca Teixeira. Obrigada mesmo! Você me salvou muitas vezes (e com paciência!) em momentos que achei que não tinha mais como resolver a situação. Torço por você em todas as esferas da vida!
Aos meus estimados amigos do Lacert: Débora, Juliano, Diana, Talita, Helena, Adri, Gi, Maiara, Augusto, Cami e Daniel. Cada um ao seu jeitinho fez a diferença nos meus dias, me apoiando, me divertindo, enfim, fazendo parte dessa caminhada. Desejo que encontrem o que buscam em seus experimentos e na vida.
Aos professores Andrea Trentin, Giordano Calloni, Claudia Nedel, que sempre me dispensaram toda a atenção que precisei, ajudando em diferentes momentos no desenvolvimento desse trabalho.
À Sara Ribeiro Motter e Caroline Weiner, do setor de diluição da Central de Misturas Intravenosas do Cepon, que tão gentilmente me atenderam e colaboraram de maneira essencial para a execução dos experimentos.
Aos meus queridos colegas Malton Fuckner e Elen Prado, também à direção do Colégio Adventista de Florianópolis – Unidade Centro e Estreito, Profª Lacy Bubna, Gisele Freitas, Rovena Carniatto e Carlos Maciel. Por compreender, apoiar, ajudar em todo o tempo. O mérito deste trabalho, também pertence a vocês. Obrigada!
Aos meus pais, Paulo e Vera, por tanto amor e tempo dedicado a mim e minha família. Pai e Mãe, nunca existirão palavras que possam
expressar minha gratidão. Com vocês aprendi o que é amor incondicional, e se há algo bom no que fiz ou no que sou, devo a vocês.
Ao meu dedicado esposo, Alexandre, que suportou bravamente todas as minhas ausências, os atrasos, as horas de madrugadas em claro. Muito obrigada! Sem o seu apoio, sem o seu abraço nos momentos difíceis, o que seria de mim?
Às minhas filhas, Ana e Giovana, sempre me esperando com um sorriso na porta, um beijinho e um abraço apertado. Amo vocês infinitamente, mais do que a mim mesma. Vocês são meu orgulho e a razão de eu nunca ter desistido.
Ao Meu Deus, que colocou todas essas pessoas no meu caminho, para o meu crescimento e fortalecimento. Que conhece todos os meus defeitos e ainda assim todos os dias me renova, me coloca de pé, me enche da certeza que nem a morte pode me separar do Seu amor.
RESUMO
A crista neural (CN) é uma população de células que se originam nas bordas dorsais do tubo neural, durante o desenvolvimento dos vertebrados. Essas células perdem seu caráter epitelial e assumem a natureza mesenquimal, sendo dotadas de uma impressionante capacidade migratória. As células da CN formam neurônios periféricos, melanócitos, células musculares lisas, condroblastos, osteoblastos, entre outros. Essa ampla capacidade de diferenciação é regulada, em partes, pelos fatores presentes no microambiente de cada uma das rotas de migração. O Egf é um dentre muitos dos fatores que têm sido reconhecido como capaz de modular a diferenciação de progenitores da CN. Nosso grupo demostrou que in vitro, as células da CN truncal (CNT) tratadas com Egf direcionam sua diferenciação para neurônios e melanócitos, no entanto os mecanismos associados a esse efeito não são conhecidos. Nesse trabalho, foi avaliado o efeito do Egf e do bloqueio do seu principal receptor ErbB1 sobre a expressão de fatores de transcrição e fatores solúveis relacionados a diferenciação inicial das células da CNT. Foi observado que o Egf aumenta o número de células indiferenciadas estacionadas no dorso do tubo neural, essas células não apresentam alteração na expressão de FoxD3 mas aumentam a expressão de Sox10. O bloqueio do ErbB1 também não altera a expressão de FoxD3, mas altera a localização da expressão de Sox10, tornando-se associada a formação de estruturas semelhantes a gânglios de raiz dorsal (GRD). Quando analisada a expressão de Isl1, fator de transcrição que ativa o início da diferenciação de neurônios sensoriais, foi observado que o Egf reduz a expressão de Isl1 e o bloqueio do ErbB1 aumenta a expressão de Isl1. Além disso, Egf induziu aumento na expressão dos fatores solúveis Noggin e Fgf8, ambos secretados pelos somitos e relacionados a manutenção do estado indiferenciado das células da CNT. Em conjunto, esses dados sugerem que a sinalização Egf está envolvida com a manutenção de um estado indiferenciado das células da CNT. Compreender o papel do Egf na diferenciação e das células da CNT, além de auxiliar na construção do conhecimento científico básico, também é fundamental para projetar caminhos realistas para a prevenção terapêutica de neurocristopatias.
ABSTRACT
The neural crest (NC) is a population of cells that originate at the dorsal edges of the neural tube during the development of vertebrates. These cells lose their epithelial character and assume the mesenchymal nature, with an remarkable migratory capacity. NC cells form peripheral neurons, melanocytes, smooth muscle cells, chondroblasts, osteoblasts, among others. This broad capacity for differentiation is regulated, in parts, by the factors present in the microenvironment of each of the migration routes. Epidermal growth factor (Egf) is one of many factors that have been acknowledged as capable of modulating the differentiation of progenitors of NC. Our group demonstrated that in vitro, Egf-treated trunk neural crest (TNC) cells direct their differentiation to neurons and melanocytes. However, the mechanisms associated with this effect are not known. In this work, we evaluated the effect of Egf and the blockade of his receptor, ErbB1 on the expression of transcription factors and soluble factors related to the initial differentiation of TNC cells. It has been observed that Egf increases the number of undifferentiated cells stationary on the back of the neural tube, these cells show no change in FoxD3 expression but increase the expression of Sox10. ErbB1 blockade also does not alter FoxD3 expression, but alters the localization of Sox10 expression, making it associated with the formation of structures similar to dorsal root ganglion (DRG). When we analyzed the expression of Islet1 (Isl1), a transcription factor that activates the onset of the differentiation of sensory neurons, it has been observed that Egf reduces Isl1 expression and ErbB1 blockade increases Isl1 expression. In addition, Egf induced an increase in the expression of Noggin and Fgf8 soluble factors, both secreted by the somites and related to maintenance of the undifferentiated state of TNC cells. Together, these data suggest that Egf signaling is involved in maintaining the undifferentiated state of the TNC cells. Understanding Egf's role in differentiation and the role of NTC cells, in addition to assisting in the construction of basic scientific knowledge is also critical in designing realistic pathways for the therapeutic prevention of neurocristopathies.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Formação da CN durante o fechamento do TN...18
Figura 2 Diferentes populações de células de crista neural e sua
contribuição na formação de tecidos e órgãos adultos...20 Figura 3 Ilustração dos dois cenários possíveis para explicar a
capacidade das células da CN pré-migratórias contribuírem como progenitores de diferentes células...21 Figura 4 Diferentes vias das células da CNT em distintas ondas de
migração...23
Figura 5 Mecanismo de inibição e ativação do receptor EgfR...28
Figura 6 Imagem demonstrativa de cultura das células da CNT sob ação do Egf, com posterior obtenção de seus dos derivados
neuronais e melanocíticos...29 Figura 7 Análise da expressão proteica do receptor Egf na CNT após a
migração das células a partir do tubo neural por
imunofluorescência indireta...31 Figura 8 Análise da migração das células da CNT durante 24 horas de
cultura...32 Figura 9 Esquema representativo da metodologia utilizada para cultura
de segmentos truncais de codorna...36 Figura 10 Imunohistoquímica para Hnk-1 apresentando diferentes
padrões de migração das células da CNT em segmento truncal de embriões de codorna cultivados...43 Figura 11 Análise das células migratórias da CN em cultura de
Figura 12 Análise da expressão de Sox10 por hibridização in situ em fragmentos truncais de embriões de codorna cultivados...45 Figura 13 Análise da expressão de FoxD3 por hibridização in situ em
fragmentos truncais de embriões de codorna cultivados...46 Figura 14 Análise da expressão de Isl1 por hibridização in situ em
fragmentos truncais de embriões de codorna
cultivados...47 Figura 15 Análise da expressão de Noggin por hibridização in situ em
fragmentos truncais de embriões de codorna
cultivados...49 Figura 16 Análise da expressão de Fgf8 por hibridização in situ em
fragmentos truncais de embriões de codorna cultivados...50 Figura 17 Ilustração do efeito do Egf sobre as células da CNT e fatores
envolvidos com sua migração e
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS *
Bmp Do inglês Bone Morphogenetic Protein (Proteína Morfogenética de Osso)
Brn3 Beta-1,3-galactosiltransferase CN Crista neural
CNT Crista neural truncal CO2 Gás carbônico
CTL Controle
EDTA Do inglês Ethylenediaminetetraacetic EE Extrato de embrião
EgfR Receptor de Egf
Egr2 Do inglês Early growth response 2
Erb Do inglês Erythroblastic leukemia viral oncogene Fgf Do inglês Fibroblast Growth Factor (Fator de
Crescimento de Fibroblastos) FoxD3 Do inglês Forkhead box D3 GS Gânglios simpáticos GRD Gânglios de raiz dorsal. HCl Ácido clorídrico
Hnk1 Do inglês Human natural killer-1 ou 3-beta-glucuronosiltransferase 1 (B3GAT1)
Id2 Inibidor da proteína de ligação ao DNA Id2
Islet1 Do inglês Islet of Langerhans (Ilhotas de Langerhans) – Proteína potencializadora do gene da insulina.
Kit Do inglês Tyrosine Kinases Gene - codificante do receptor tirosina quinase CD117
mAb Do inglês Monoclonal Antibody (Anticorpo monoclonal) Mabt Do inglês Maleic Acid Buffer + Tween20 - Tampão de
ácido maleico com Tween20
Mash Do inglês Mammalian achaete scute homolog-1 ( Mitf Do inglês Microphtalmia-associated transcription factor NaOH Hidróxido de sódio
NaCl Cloreto de sódio. NBT Nitro-blue-tetrazólio Pax Do inglês Paired box
Pbs Do inglês Phosphate buffered saline (Salina de fosfato tamponada)
Pbt PBS com Tween 20
Phox2b Do inglês Paired like Homeobox 2b (Homebox pareado a 2b)
RTQ Receptor tirosina-quinase RV Raiz ventral
SBF Soro bovino fetal
Snail Do inglês Snail (Caracol) – Originalmente chamada de SNAI1, que pela semelhança, acabou como Snail
Slug Do inglês Slug (Lesma) – Originalmente chamado de SNAI2, sem um segmento do SNAI1, assim como a lesma é semelhante ao caracol, porém sem a concha. Sox Do inglês Sry-related HMG box – (HMG box
relacionado a Sry.
TEM Transição epitélio-mesenquimal TN Tubo neural
Tyr Do inglês Tyrosine
UFSC Universidade Federal de Santa Catarina UR Umidade relativa
Wnt Do inglês Wingless-int proteins Zic Do inglês Zinc finger of the cerebellum
αMEM Do inglês α-Modificated minimum essential medium
* Neste trabalho adotamos a regra de nomenclatura de genes e proteínas que é bastante utilizado em revistas científicas. Nomes de proteínas são escritos de maneira regular, enquanto genes são escritos em itálico. Além disso, se nos referimos a genes ou proteínas humanas, todo o nome deve vir em caixa alta. Caso contrário, apenas a primeira letra do nome deve estar em maiúscula.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Sondas de hibridização utilizadas e suas informações de corte
LISTA DE SÍMBOLOS α Alfa β Beta µg Microgramas µl Microlitros µM Micromolar ºC Grau Celsius % Por cento g Grama mg Miligrama U Unidades < Procedência menor
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO...12
1.1 A crista neural ... 18
1.1.1 Classificação das populações da CN ... 19
1.1.2 A especificação das células da CN ... 20
1.1.3 Diferenciação de acordo com o microambiente, determinando as vias de migração ... 22
1.1.4 Sinalização na diferenciação das células da CNT ... 23
1.2 O fator de crescimento epidermal e seu receptores ... 25
1.3 Bloqueador do ErbB1 - Cetuximabe ... 27
1.4EGF, EGFr e a Crista Neural ... 29
Justificativa ... 33
2 OBJETIVOS ... 34
2.1 Objetivo geral ... 34
3 MATERIAIS E MÉTODOS ... 35
3.1 Obtenção e incubação dos ovos de codornas ... 35
3.2 Cultura de segmentos truncais de embriões de codorna – cultivo ex vivo ... 35
3.3 Cultura de células da CNT ... 37
3.4 Imunohistoquímica in toto ... 38
3.5 Confecção das sondas para hibridização in situ ... 38
3.5.1 Transformação de bactérias quimiocompetentes ... 39
3.5.2 Síntese das sondas de hibridização ... 40
3.6 Hibridização in situ ... 41
3.7 Análise estatística ... 41
4.1 Egf e Ctx modificam o padrão de migração das células da CNT
em sistema de cultivo ex vivo ... 42
4.2 Egf e Ctx aumentam expressão de Sox10 nas células da CNT mas não alteram FoxD3 ... 45
4.3 Egf e Ctx alteram a expressão de Islet1 nas células da CNT ... 47
4.4 Influência do Egf e do bloqueio do ErbB1 sobre as células da CNT que expressam Noggin e Fgf8 ... 48
5 DISCUSSÃO ... 51
6 CONCLUSÕES ... 56
1 INTRODUÇÃO 1.1 A crista neural
A Crista Neural (CN) é uma população de células exclusivas de vertebrados que possuem a capacidade de migrar extensivamente e serem progenitoras de uma ampla gama de tipos celulares. Essas células originam-se nas bordas dorsais do Tubo Neural (TN) em formação, na fronteira entre a placa neural e a ectoderme. Ao final do processo de fechamento do TN, que acontece gradualmente no eixo anteroposterior do corpo, as células da CN adquirem capacidade migratória. As conexões intercelulares sofrem alterações promovendo rearranjos do citoesqueleto e consequentes alterações morfológicas que lhes permitem o desprendimento do neuroepitélio (Fig 1). Esse evento é conhecido como transição epitélio-mesenquimal (TEM). As células da CN expressam receptores de superfície celular, metaloproteases e moléculas de adesão que lhes permitem responder adequadamente às interações célula-célula e aos sinais ambientais. Tais sinais influenciam diretamente na migração e diferenciação das células da CN (GAMMILL; BRONNER-FRASER, 2003; SAUKA-SPENGLER; BRONNER-FRASER, 2008).
Fonte: Adaptado de Simões-Costa e Bronner, (2015)1.
Nota: (A) Desenvolvimento da CN começa na fase de gástrula, com a especificação da fronteira placa neural nas bordas da placa neural. (B) À medida que a placa neural fecha para formar o TN, os progenitores da CN são especificados na parte dorsal das dobras neurais.(C) Depois da especificação, as células da CN sofrem TEM descamam a partir do TN. (D) células da CN migratórias seguem caminhos estereotipados para diversos destinos, onde eles vão dar origem a derivados distintos.
Logo após o início de sua migração, as células da CNT podem permanecer estacionadas por um tempo numa região embrionária denominada MSA (do inglês - Migration Staging Area) (HORNYAK et al., 2001; WEHRLE-HALLER; WESTON, 1997; WESTON, 1991).
Depois de emigrarem a partir das bordas dorsais do TN, as células da CN seguem por rotas específicas para ocupar diferentes locais no embrião. Dependendo da origem ao longo do eixo anteroposterior, e da rota de migração adotada, diferentes tipos celulares contribuem para a formação de uma variedade de tecidos e órgãos. (Fig. 2).
1.1.1 Classificação das populações da CN
A divisão das diferentes populações das células da CN também foi estabelecida de acordo com o ponto de origem na extensão longitudinal do dorso do TN do embrião, são elas:
Células da CN cranial ou cefálica: serão responsáveis pela formação de uma grande porção do esqueleto facial, bem como pelos gânglios cranianos, músculo liso, adipócitos e melanócitos dermais.
Células da CN vagal: contribuem para a formação das válvulas e septos do coração e também forma gânglios parassimpáticos entéricos.
Células da CN truncal: originam os gânglios de raiz dorsal e gânglios simpáticos do sistema nervoso periférico, bem como células da medula adrenal e melanócitos.
Células da CN sacral: Forma gânglios parassimpáticos entéricos (SIMÕES-COSTA; BRONNER, 2013)
1 Disponível em< http://dev.biologists.org/content/142/2/242 >Acesso em 25/05/2018.
Figura 2 - Diferentes populações de células de crista neural e sua contribuição na formação de tecidos e órgãos adultos.
Fonte: Adaptado de Simões-Costa & Bronner, (2013)2.
Nota: Contribuições de diferentes populações de células da crista neural para tecidos e órgãos adultos. Dependendo do seu nível axial de origem e da via migratória seguida, as células da crista neural adotam diferentes destinos e contribuem para distintos tecidos e órgãos.
1.1.2 A especificação das células da CN
Durante o trajeto, desde a borda dorsal do TN até os alvos periféricos, as células da CN diferenciam progressivamente. Esse fenômeno levanta a questão de quando o destino de uma célula da CN individual é determinado. Uma hipótese sugere que estas células já estão especificadas para diferenciar ao longo de linhagens selecionadas no momento em que são determinadas, ainda no TN, portanto, possuem seu potencial de destino seria pré-especificado. Análises de linhagens celulares, realizada antes do início da delaminação da CN, demonstraram que o TN dorsal é uma região altamente dinâmica composta, sequencialmente, por progenitores de CN já especificados. Esses progenitores se organizam de maneira dorsoventral no TN, com uma ordem específica de delaminação. Primeiro, migram as células da CN que darão origem aos neurônios e células de Schwann que formarão os gânglios simpáticos (GS), ao longo da raiz ventral (RV). Na sequência migram as células da CN que formarão ao neurônios e células de Schwann dos gânglios sensoriais da raiz dorsal (GRD). As últimas células que migram, formarão os melanócitos da pele (M). A saída
2 Disponível em <https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3698500> Acesso em 25/05/2018.
contínua de células da CN é explicada por um correspondente deslocamento ventro-dorsal dos progenitores do TN. Após o término da emigração das células da crista neural, as células localizadas na porção mais dorsal do TN ocupam definitivamente essa região, formando o teto do TN (mais comumente conhecida pelo termo em inglês, “roof plate”- RP) (KRISPIN et al., 2010).
Contudo, desde a década de 70, estudos in vitro vem apontando a multipotencialidade das células da CN, através do método de clonagem celular (COHEN; KONIGSBERG, 1975; BAROFFIO; DUPIN; LE DOUARIN, 1988). Em 2009, foi identificado um progenitor multipotente, capaz de originar glia, melanócitos, neurônios, células de músculo liso, condrócitos e osteócitos. Ainda que não comprovada sua capacidade de autorrenovação, sugeriu-se que esse progenitor poderia ser uma célula tronco da CN (CALLONI; LE DOUARIN; DUPIN, 2009). A multipotência das células da CN foi ratificada por Baggiollini e colaboradores em 2015, realizando o mapeamento de destino in vivo de células NC de tronco único em estágios pré-migratórios e migratórios, ao combinar análises clonais quantitativas com marcadores definitivos de diferenciação em mamíferos (BAGGIOLINI et al., 2015; BRONNER, 2015) (Fig.3).
Figura 3 - Ilustração dos dois cenários possíveis para explicar a capacidade das células da CN pré-migratórias contribuírem como progenitores de diferentes células.
Fonte: Adaptado de Bronner, (2015)3.
Nota: À esquerda: As células da crista neural pré-migratória no do tubo neural dorsal (NT) podem ser multipotentes, com a capacidade de contribuir para numerosos tipos diferentes de células em diversos locais. Estes incluem
3 Disponível em< https://www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(15)00072-7 >Acesso em 25/05/2018.
neurônios (azul) e glia (verde) dos gânglios da raiz dorsal (GRD) e gânglios simpáticos (SG); Células de Schwann (amarelo) da raiz ventral (VR); e melanócitos (vermelho) ao longo da via dorsolateral (DLP) As células multipotentes migram para diversos locais e se diferenciam em tipos de células apropriados em resposta a estímulos ambientais locais. À direita: Alternativamente, as células da crista neural pré-migratória unipotentes podem ser uma mistura de precursores restritos, cada uma destinada a formar um único tipo de célula. Elas migram para locais apropriados e se diferenciam de acordo com seus destinos predeterminados.
Os dois modelos têm incitado controvérsias entre estudiosos das células da CN, mas ambas hipóteses aceitam que as células da CN possuem caráter que pode ser alterado para uma resposta homogênea quando expostas a fatores de crescimento instrutivos, tanto in vitro (SHAH et al., 1994), quanto in vivo (HARI et al., 2012).
1.1.3 Diferenciação de acordo com o microambiente, determinando as vias de migração
As células da crista neural são guiadas ao longo de rotas definidas espacial e temporalmente por meio de pistas de orientação ambiental. Cada via é moldada pela expressão de uma mistura distinta de proteínas que atraem e repelem as células da crista neural migratórias.
Essa hipótese sugere que o destino das células da CN é determinado pelas moléculas sinalizadoras que encontram no microambiente embrionário, durante sua migração.
Logo após a delaminação, as células da CNT embrionárias começam a migrar ao longo de três rotas diferentes (Fig. 4). As primeiras células migratórias começam a fazê-lo ao redor dos somitos epiteliais, principalmente ao longo dos vasos sanguíneos, no espaço intersomítico. Elas também migram entre os somitos e o TN (Fig. 4. B, C e D). Depois que os somitos estão bem formados, iniciam uma dissociação entre dermomiótomo e esclerótomo, e desse ponto em diante, outro conjunto de células da CNT começam a invadir o esclerótomo e migrar ventrolateralmente por meio das partes do somito (Fig. 4. A), dependendo da espécie particular de organismo (SERBEDZIJA; FRASER; BRONNER-FRASER, 1990). Uma terceira onda de células da CNT migra ao longo de uma via dorsolateral entre o ectoderma epidérmico e o dermomiotomo (ERICKSON; DUONG; TOSNEY, 1992) (Fig. 4. E). Uma quantidade crescente de evidências sugere que a transição da via ventral para a via dorsal acontece por
motivos inerentes às próprias células e não devido a mudanças no ambiente (KUO; ERICKSON, 2011; SIMKIN et al., 2013).
Figura 4 - Diferentes vias das células da CNT em distintas ondas de migração.
Fonte: Adaptado de Vega-Lopez et al., (2017)4
Nota: (A) – Células da CN movem-se ventralmente através do esclerótomo dorsal anterior para formar gânglios de raiz dorsal, gânglios simpáticos e medula adrenal; (B) Migração das células da CN entre o tubo neural e os somitos para dar origem aos gânglios simpáticos e sensoriais; (C) – Células da CN seguem ventralmente entre os somitos ao longo dos espaços intersomíticos. (D) – Depois que migração ventral é completa, as células da CN tomam o caminho dorso-lateral entre a ectoderme e o esclerótomo anterior. (E) – Migração dorso-lateral, entre o ectoderma e o dermomiótomo para dar origem as células pigmentares da pele.
1.1.4 Sinalização na diferenciação das células da CNT
Durante sua jornada, a partir das bordas dorsais do TN até seus alvos periféricos, as células da CN diferenciam progressivamente, sendo guiada por uma ordenada rede reguladora de genes composta por vias de sinalização e fatores de transcrição que orientam aquisição de propriedades específicas tais como multipotencialidade, capacidade migratória e diferenciação celular (SIMÕES-COSTA; BRONNER, 2015a).
4 Disponível em
<http://www.ijdb.ehu.es/web/paper.php?doi=10.1387/ijdb.160408gv> Acesso em 20/07/2018.
Sinais indutivos mediados por Wnts, Bmps e Fgfs estabelecem a fronteira da placa neural entre o ectoderme neural e não neural (GROVES; LABONNE, 2014). Esses sinais ativam um conjunto de fatores de transcrição, incluindo a ativação de Pax3 / 7, Msx1 / 2 e Zic1, cuja expressão ocorre na região da borda da placa neural. Tendo sido formado o TN, o dermomiótomo do somito adjacente realiza controle dos níveis de Bmp4 através da inibição de Noggin. Então, é regulada a camada seguinte de fatores de transcrição, como FoxD3, Sox9, Sox10, Myc, tfAP2 e Id2 cuja expressão inicia nos precursores da crista neural no TN de fechamento e antes da sua migração (KALCHEIM, 2015; BRONNER; SIMÕES-COSTA, 2016).
O início da diferenciação das células da CNT em melanócitos depende da ação dos fatores de transcrição Sox10 e Pax3/7. A expressão desses fatores de transcrição é controlada pelos fatores solúveis Wnt, Endotelinas e Kit. O comprometimento das células da CN com o fenótipo melanocítico é dependente da expressão do fator de transcrição Mitf. Devido a sua importância, Mitf é comumente referido como gene mestre da diferenciação dos melanócitos, sendo utilizado como um marcador de especificação da linhagem melanocítica (HOU; PAVAN, 2008).
A diferenciação das células da CN em neurônios e células gliais é iniciado pela expressão do fator de transcrição Sox10 (SIMÕES-COSTA; BRONNER, 2015a). Os principais fatores solúveis e ligantes extracelulares que controlam a diferenciação neural das células da CN são as neuregulinas e os ligantes de Notch, que induzem as células progenitoras da crista neural a adotar um destino glial periférico, enquanto a sinalização Bmp promove a diferenciação neuronal (STEMPLE; ANDERSON, 1993). As células que dão origem aos neurônios simpáticos também são controladas pela sinalização Bmp, segregada pela aorta dorsal (SAITO et al., 2012), porém em conjunto com Sox10 para ativar a expressão dos genes especificadores dos neurônios simpáticos Phox2B, Mash 1 (também conhecido como Ascl1) (MORIKAWA et al., 2009). Os fatores de transcrição Mash1 e Phox2b são também considerados essenciais no desenvolvimento dos neurônios simpáticos (STANKE; STUBBUSCH; ROHRER, 2004). O início da diferenciação dos precursores dos neurônios de raiz dorsal também é controlado por Bmp e Sox10, mas estudos realizados com camundongos e aves determinaram que a fase inicial da neurogênese sensorial é diretamente dependente da expressão dos fatores de transcrição de Neurogenina 1 e 2 em todos os níveis axiais, seguida da co-expressão
dos fatores de transcrição Islet1 e Brn3 (MA et al., 1999; SUN et al., 2008; DYKES et al., 2011).
Com o intuito de entender melhor a influência de outros fatores de crescimento sobre os processos de diferenciação das células da CN da região truncal (CNT), um trabalho anterior do nosso grupo demonstrou, in vitro, que Egf é capaz de estimular a diferenciação para o fenótipo neuronal e melanocítico e que Fgf2 estimulou a diferenciação para o fenótipo glial (GARCEZ et al., 2009). No entanto, não se sabe ainda qual é o efeito do Egf e do Fgf2 sobre os fatores de transcrição conhecidamente envolvidos na formação das células derivadas da CNT. 1.2 O fator de crescimento epidermal e seu receptores
O Fator de Crescimento Epidermal (Egf) é um polipeptídeo com 53 aminoácidos com 6.045 daltons, descoberto em 1962 pelo Dr. Stanley Cohen enquanto estudava o fator de crescimento de nervo (NGF) (COHEN, 1965). Os estudos relacionados ao Egf e sua via de sinalização se estenderam a uma ampla gama de investigações sobre seus papéis biológicos. O Egf foi detectado numa variedade de fluidos corporais, tais como leite (NOJIRI et al., 2012), saliva e plasma (CARPENTER; COHEN, 1979), urina (FISHER; SALIDO; BARAJAS, 1989), fluido intestinal (NAIR; WARNER; WARNER, 2008), fluido amniótico (HOFMANN; ABRAMOWICZ, 1990) e outros (FISHER; LAKSHMANAN, 1990). A sinalização Egf tem papel importante no desenvolvimento de doenças humanas como cânceres de ovário, mama, bexiga, pulmão, (BLUME-JENSEN; HUNTER, 2001; APPERT-COLLIN et al., 2015), doença renal (ZENG; SINGH; HARRIS, 2009), hipertensão arterial (BEŁTOWSKI; LOWICKA, 2009) e no controle do envelhecimento (SIDDIQUI et al., 2012).
Foi rapidamente reconhecido que o Egf é o membro de uma família de fatores de crescimento que ativam os receptores de Egf (ErbB1, Egfr ou Her1) e que desempenham um papel importante na proliferação, diferenciação e migração de uma variedade de tipos de células epiteliais e mesenquimais (STEIDLER; READE, 1980; ZENG; HARRIS, 2014). O ErbB1 foi o primeiro receptor de tirosina-quinase (RTQ) a ser descoberto (CARPENTER; KING; COHEN, 1978). Além disso, a maior parte dos princípios e paradigmas que estão na base da ação das tirosina-quinases receptoras, foram primeiro estabelecidos para o ErbB1 (SCHLESSINGER, 2000).
A ligação do ligante ao domínio extracelular de um receptor de tirosina quinase (RTQ) induz a dimerização, a ativação do domínio quinase intracelular e a autofosforilação por um mecanismo intermolecular. Os resíduos fosforilados em tirosina servem como locais de ligação de alta afinidade para proteínas contendo o domínio de ligação SH2 ou fosfotirosina e permitem a modulação de vias de sinalização intracelular (GRAUS-PORTA; BEERLI; HYNES, 1995).
Muitos dos mecanismos de ativação e recrutamento de vias de sinalização intracelulares após a estimulação do fator de crescimento foram descobertos em estudos de sinalização através de receptores de Egf (PAWSON; SCHLESSINGERT, 1993). Após a identificação de ErbB1, foram identificados três membros adicionais da mesma família de receptores, ErbB2/Her2, ErbB3/Her3 e ErbB4/Her4. Além do Egf, estes receptores também podem ser ativados por ligantes conhecidos que atuam como agonistas diretos para o ErbB1, o HB-Egf, TGFα, anfirregulina, neuregulinas 1-4, betacelulina, epirregulina e epigênio (ZHANG et al., 2007; FANTAUZZO; SORIANO, 2015). O ErbB1 é um dos poucos, entre os sistemas de receptores, que serve como um local de integração molecular para múltiplos tipos de estímulos, incluindo: ligantes peptídicos, íons metálicos, radiação ultravioleta e gama, choque osmótico, despolarização da membrana, radicais oxidativos (GSCHWIND et al., 2001), e drogas sintéticas como Gefitinib e Cetuximabe (RAMALINGAM et al., 2008).
Um nível adicional de complexidade na sinalização mediada por ErbB foi trazido à tona pela descoberta de que a ligação de um ligante específico não apenas desencadeia a formação de homodímeros de receptores, mas também heterodímeros. Por exemplo, o Egf induz a fosforilação da tirosina de ErbB-2 através da formação de dímeros de ErbB-1 / ErbB-2 (KING et al., 1988; GRAUS-PORTA; BEERLI; HYNES, 1995). De modo semelhante, o fator de diferenciação Neu (FDN) estimula a fosforilação da tirosina de ErbB-2, presumivelmente através da formação dos dímeros de ErbB-3 / ErbB-2 e ErbB-4 / ErbB-2 (PLOWMAN et al., 1993; BEERLI et al., 1995). Uma consequência importante da heterodimerização dos receptores Egf e FDN com ErbB-2 é uma afinidade dramaticamente aumentada para o respectivo ligando (WADA; QIAN; GREENE, 1990; CARRAWAY et al., 1994; CHEN et al., 1996). No entanto, a heterodimerização também pode servir para diversificar a natureza do sinal intracelular desencadeado por um fator de crescimento específico. O exemplo típico que suporta esta noção é a observação de que o Egf estimula a associação de fosfatidilinositol
(PtdIns) 3-quinase com ErbB-3, presumivelmente através da heterodimerização de ErbB1 / ErbB-3 seguida de fosforilação cruzada (KIM; SIERKE; KOLAND, 1994; SOLTOFF et al., 1994).
1.3 Bloqueador do ErbB1 - Cetuximabe
Evidências experimentais e clínicas convincentes sugerem que o ErbB1, desempenha um papel importante na patogênese de uma variedade de cânceres humanos; portanto, fornecendo uma forte razão para o desenvolvimento de antagonistas de receptores como estratégias terapêuticas eficazes e específicas para o tratamento de cânceres que expressam ErbB1.
Em 1980, Mendelsohn e Sato em seus estudos na Universidade da Califórnia propuseram a hipótese de que um anticorpo monoclonal (mAb) que se liga ao ErbB1 e previne a conexão do ligante, podendo inibir a ativação da tirosina quinase do receptor e prevenir a proliferação de células cancerígenas que expressam fortemente este receptor (KAWAMOTO et al., 1983; GILL et al., 1984). De fato, quase todas as características do câncer descritas por Hanahan e Weinberg, em sua publicação de referência em 2000, foi atenuada quando a ativação de ErB1 foi bloqueada pelo tratamento de células e xenoenxertos de tumor humano com agentes anti-ErbB1, como o Cetuximabe (HANAHAN; WEINBERG, 2000; MENDELSOHN et al., 2015).
Esses mAb, via bloqueio das interações ligante/receptor, exercem sua atividade biológica via múltiplos mecanismos, incluindo inibição da progressão do ciclo celular, potencialização da apoptose celular, inibição do reparo do DNA, inibição da angiogênese, invasão e metástase de células tumorais e, potencialmente, indução de mecanismos efetores imunológicos (Fig. 5). A ligação do Cetuximabe ao ErbB1 induz internalização do receptor; portanto, efetivamente tirando o
receptor da superfície da célula tumoral (ZHU, 2007). O Cetuximabe também induz a apoptose em algumas linhas celulares de tumor que sobre expressam ErbB1
Figura 5 - Mecanismo de inibição e ativação do receptor EgfR.
Fonte: Adaptado de The International Genetically Engineered Machine Competition, (2015)5
Nota: (A) - Inibição do Cetuximabe. Quando o Cetuximabe se liga ao domínio extracelular do ErbB1, impede a ativação e subsequente dimerização do receptor, inibição da transdução de sinal e efeitos antiproliferativos. Além disso, este agente pode inibir o crescimento e metástase de tumores dependentes de ErB1. (B) - Em primeiro lugar, a ligação do ligando no domínio extracelular do ErbB1 levará à ativação da dimerização. A dimerização induz a ativação do domínio da tirosina quinase (TQ), levando à autofosforilação dos receptores em múltiplos resíduos de tirosina. Essa fosforilação desencadeia o recrutamento de uma série de proteínas adaptadoras, seguidas por uma série de cascatas de sinalização intracelular que finalmente afetarão a proliferação celular, a apoptose, a invasão, a metástase e a angiogênese.
5Disponível em < http://parts.igem.org/Part:BBa_K1694004> Acesso em 25/05/2018
1.4 EGF, Egfr e a Crista Neural
Embora não seja um assunto amplamente explorado, alguns trabalhos relacionando o Egfr, o Egf e as células da CN foram realizados, mostrando em diferentes contextos, a interação entre eles.
O trabalho que mais diretamente relaciona o Egf às células da CN em sua fase inicial, foi realizado por Garcez e colaboradores em 2009, revelando que o Egf exerce efeito sobre as células da CN (cultivo in vitro), direcionando-as para um fenótipo neuronal e melanocítico (Figura 6) (GARCEZ et al., 2009)
Figura 6 – Imagem demonstrativa de cultura das células da CNT sob ação do Egf, com posterior obtenção de seus dos derivados neuronais e melanocíticos.
Fonte: Adaptado de Garcez et al., (2009).
Nota: O tratamento com Egf promove alteração na diferenciação das células da CN truncal in vitro. (A) Melanócitos obtidos pela cultura de células da CNT; Condição controle. (B) Imunocitoquímica identificando neurônios na condição controle. (C) Aumento do número de melanócitos em 2,8X, após tratamento com Egf. (D) Imunocitoquímica demonstrando aumento de neurônios em 3,8X. Barra= 50µm.
Dados não publicados de nosso grupo também demonstraram que o Egf modula fatores de transcrição expressos no início da especificação e migração das células da CN, como Sox10 e FoxD3, em um período de 6 horas de cultivo (PESCADOR, 2016). As 'Neuregulinas', são fatores do tipo Egf que sinalizam via receptores ErbB, usadas frequentemente para comunicação celular durante o desenvolvimento do sistema nervoso (BRINKMANN et al., 2008). A neuregulina-1, através dos receptores ErbB2 e ErbB3, contribuem para a formação do sistema nervoso simpático (BRITSCH et al., 1998). Sabe-se também que o TGFα que apresenta certa homologia ao Egf e pode ligar-se aos mesmos receptor (TWARDZIK et al., 1982). O TGFα e o Egf exibem atividades biológicas semelhantes e são igualmente mitogênicos para várias linhagens celulares (KATO et al., 1988). Entretanto, o TGFα, pode atuar como fator de sobrevivência e manutenção em neurônios sensoriais de ratos, enquanto que esse efeito não é observado para o Egf (CHALAZONITIS et al., 1992).
Com relação à expressão de receptores da família Erb em células migratórias da CN, um trabalho realizado pelo nosso grupo demonstrou que células da CN truncal expressam o receptor ErbB1 e esse apresenta-se ativado nas primeiras 24h de migração (Figura 7) (TEIXEIRA, 2011).
Figura 7 - Análise da expressão do receptor Egf na CNT após a migração das células a partir do tubo neural por imunofluorescência indireta.
Fonte: Teixeira, (2011).
Nota: (A-B) Marcação das células da CNT com anti-EgfR na condição controle. (C-D) Marcação das células da CNT com anti-EgfR após tratamento com 10ng/mL de Egf. (A e C) Padrão de marcação no halo de migração. Aumento de 100x. (B e D) Marcação de células dispersas pela placa de cultura. Aumento de 200x. Inserto: núcleos totais corado com DAPI.
No tocante à presença desses receptores em melanócitos maduros, dados conflitantes têm sido publicados. Enquanto alguns pesquisadores defendem que o Egfr está ausente dos melanócitos normais (GRAHN; RIVKAH ISSEROFF, 2004), há aqueles que apresentam dados argumentando não apenas a presença de Egfr em melanócitos humanos, mas também sua sinalização mediada por tirosina quinase em resposta ao ligante (GORDON-THOMSON; MASON; MOORE, 2001). Já
quanto à presença de Egfr em células de linhagem neural, estudos afirmam que as células de Schwann e células satélite do gânglio de raiz dorsal, possuem expressão de receptores de Egf. (WERNER et al., 1988; AHMED et al., 2010).
A respeito da influência do Egf sobre o número de células da CN, nosso grupo realizou experimentos que possibilitaram verificar, in vitro, que o tratamento com Egf, não alterou significativamente a proliferação dessas células. Mesmo na condição de bloqueio do receptor ErbB1, o número de células migratórias permaneceu muito próximo do número relatado da condição controle (Figura 8) (Dados não publicados – Produzidos por Alessandra Maria Baraúna, 2017).
Figura 8 - Análise da migração das células da CNT durante 24 horas de cultura.
Fonte: Produzido por Fernanda de Freitas, a partir de dados de Alessandra Baraúna, (2018).
Nota: Representação gráfica que expressa o número de células migratórias da CNT durante 24h de cultivo de tubos neurais, em 5 experimentos independentes. Ctl: Controle. Egf: Tratamento com 10ng/ml de Egf. Ctx: Tratamento com 5mg/ml de Cetuximabe. Os resultados apresentam a proporção da média ± erro padrão. *p<0,05
Justificativa
Muito têm se estudado a respeito da Crista Neural, e das moléculas envolvidas na sua formação. Apesar disso, o conhecimento deste processo ainda apresenta lacunas importantes. A aquisição de novos conhecimentos nesse campo e a realização de experimentos de maneira imparcial e transparente, possibilita o desenvolvimento de teorias que podem ajudar a compreender o papel dos fatores que regulam a CN e sua inter-relação. Além disso, muitas doenças resultam de uma ruptura da especificação, migração ou diferenciação das células da CN, afetando tecidos muito específicos. Na maioria dos casos, as propostas terapêuticas para o controle dessas doenças, não são completamente satisfatórias. A inabilidade de se tratar adequadamente esses transtornos reside, principalmente, na falta de conhecimento sobre os mecanismos moleculares que controlam o desenvolvimento normal das células da CN. De maneira geral, os sistemas biológicos respondem a esses danos, desencadeando uma série de eventos moleculares que visam reverter essa condição. O repertório molecular empregado nesses processos é, comumente, muito semelhante ao utilizado durante o desenvolvimento embrionário dos tecidos envolvidos. Uma melhor compreensão do mecanismo de ação dos fatores que controlam o funcionamento da CN, além de gerar o conhecimento sobre os processos do desenvolvimento embrionário, poderia permitir, ainda, a aplicação desse conhecimento no tratamento de várias doenças
2 OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral
Avaliar a influência do Egf e do bloqueio do receptor ErbB1 sobre a expressão da fatores de transcrição relacionados à diferenciação inicial da CNT, em modelo de aves.
2.2 Objetivos específicos
Analisar o efeito do Egf e do bloqueio do receptor EbrB1 sobre a migração das células da CNT.
Verificar a interferência do Egf e do bloqueio do receptor EbrB1 na expressão de fatores de transcrição que controlam os primeiros passos da diferenciação dos progenitores neurais periféricos, a saber, FoxD3 e Sox10;
Examinar a influência do Egf e do bloqueio do receptor ErbB1 sobre expressão do fator de transcrição Isl1, controlador mestre do início da diferenciação dos neurônios sensoriais periféricos;
Verificar a interferência do Egf e do bloqueio do receptor EbrB1 na expressão de fatores solúveis, secretados durante a migração inicial das células da CNT, como Noggin e Fgf8;
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Obtenção e incubação dos ovos de codornas
Ovos fertilizados de codorna (Coturnix japonica) adquiridos da Granja Dumuty (localizada na cidade de Rio do Sul, Santa Catarina) foram incubados em posição fixa, com a parte apical voltada para baixo, durante 48 horas em estufa a 38 ºC em 65% de umidade relativa.
A utilização destes animais e técnicas está de acordo com os preceitos da Lei 11.794 de 8 de outubro de 2008, com o Decreto 6.899 de 15 de julho de 2009, bem como com as normas editadas pelo Conselho Nacional de Controle da Experimentação Animal (CONCEA), e foi aprovada pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal de Santa Catarina (CEUA/UFSC) na reunião de 12/03/2018, sob o protocolo n. 6016021017.
3.2 Cultura de segmentos truncais de embriões de codorna – cultivo ex vivo
Foram utilizados embriões de codorna nos estágios 14 HH (HAMBURGER; HAMILTON, 1992), equivalente a 22-24 pares de somitos. Foi realizada a dissecção da região truncal do embrião, compreendendo a região correspondente aos 12 últimos somitos formados e região da mesoderme não segmentada, nó e linha primitiva. O limite lateral foi o final da mesoderme lateral, para melhor referência ver Figura 9A. Em seguida, os fragmentos truncais dos embriões foram retirados e aderidos em membranas de nitrocelulose cortadas em retângulos (três a quatro segmentos truncais por retângulo) – (Figura 9 B), com o auxílio de pinças e sob observação em microscópio estereoscópico (Olympus SZ61). O conjunto de segmento truncal embrionário + nitrocelulose foi colocado em placa de cultura de 24 poços (1 por poço) (Corning, NY, USA), com 400 µl de meio α-modificated (α-MEM; Gibco-BRL, Grand Island, NY), adicionado de 10% de soro fetal bovino (SFB) (Cultlab), 2% de extrato de embrião de galinha (EE), penicilina (200 U/ml) e estreptomicina (10 μg/ml) (meio básico – grupo controle). Cada cultura resultou em 3 retângulos com 3-4 segmentos truncais de embrião cada, sendo um com meio simples (grupo controle), um com Egf na concentração de 10 ng/ml (grupo tratado 1) e um com Cetuximabe na concentração de 50 μg/ml (grupo tratado 2) (Figura 9 C). A concentração de Egf foi determinada em
trabalhos anteriores do grupo (GARCEZ et al., 2009; TEIXEIRA, 2011).
Para determinar a concentração de Cetuximabe, foram consideradas as recomendações do fabricante para uso clínico. Foram ainda realizadas, em trabalhos anteriores (Dados não publicados), curvas de concentração para validação de tais concentrações. Considerando a massa molecular do Egf e do Cetuximabe, para cada ml de meio utilizado, nesse trabalho é utilizado 1,65 ηmolar de Egf e 340 ηmolar de Cetuximabe, essa grande diferença é necessária pois não é conhecida a taxa de expressão de Egf e ErbB1 endógenas do embrião.
Todos os grupos (CTL, Egf, Cetuximabe) permaneceram na mesma placa de cultura (poços distintos) em estufa a 37 ºC em ar atmosférico enriquecido com 5% de CO2 a 95% de umidade relativa,
durante 24 horas (Figura 9 D). O tempo de 24 horas foi escolhido para permitir análises relacionadas às fases iniciais de diferenciação dos derivados da CNT relacionados aos gânglios de raiz dorsal (GRD). Após esse período os segmentos truncais foram fixados e armazenados com formaldeído a 4% a 4 ºC, para serem submetidos às análises.
Figura 9 - Esquema representativo da metodologia utilizada para cultura de segmentos truncais de codorna
Fontes: Neural crest cell plasticity and its limits – Figures &Tables6;
KatlhenLorranna017 - Editado por Fernanda de Freitas, (2018)
6Disponível em
<http://dev.biologists.org/content/develop/131/19/4637/F1.large.jpg> Acesso em 14/05/2018
Nota: (A) - Desenho de embrião de codorna; o retângulo azul delimita a região de corte do segmento truncal que foi cultivado. A região anterior é delimitada por quatro somitos e caracteriza as células da CN que estão migrando mais tardiamente (rota dorso-lateral). A região posterior é definida pelos seis somitos mais recentemente formados e caracteriza as células da CN que estão migrando primeiro (rota dorso-ventral). A região dos últimos dois somitos junto com a mesoderme não-segmentada caracteriza as células da CN que ainda estão aderidas ao TN. Os embriões possuem uma grande variação de tamanho, portanto os segmentos truncais podem variar de tamanho mesmo estando dentro dos limites de corte estabelecidos. (B) – Representação da membrana de nitrocelulose aonde são aderidos os segmentos truncais. (C) - Placa de 24 poços contendo os meios de cultura onde os segmentos truncais foram cultivados. (D) - Estufa de cultura mantida a 37º em ar atmosférico enriquecido com 5% de CO2
a 95% de umidade relativa. 3.3 Cultura de células da CNT
Foram retirados dos ovos os embriões de codorna no estágio 14HH (22 a 24 somitos) e transferidos para solução salina tamponada (PBS, pH 7,4). Retirada a região truncal, foi submetida à solução de pancreatina (6,25 g/l) para a separação dos tecidos embrionários e obtenção apenas do tubo neural, com auxílio de agulhas de tungstênio e observação em microscópio estereoscópico (Olympus SZ61). Os tubos neurais isolados foram cultivados em placas de 35 mm de diâmetro (Corning, NY, USA) em 800 µl de meio de cultura α-modificated minimum essential medium (α-MEM; Gibco-BRL, Grand Island, NY), 10 % de soro fetal bovino (SBF; Cultlab), 2 % de extrato de embrião de galinha (EE), penicilina (200 U/ml; Gibco) e estreptomicina (10μg/ml; Gibco) (meio simples). Em outra placa, ao mesmo meio simples de cultura, foi adicionado Egf a 10ng/ml, (grupo tratado 1) e em uma terceira placa, 5mg/ml de Ctx sendo adicionado ao meio simples. Na sequência, colocados em estufa a 38°C, 5 % de CO2 e 65 % de UR. Foi utilizado, em média, 2 tubos neurais isolados, por condição de cultivo, em cada experimento. Após 12h foi adicionado mais 600uL dos respectivos meios.
Depois de 24 horas de cultivo, os tubos neurais foram cuidadosamente removidos. As células da crista neural que migraram
7Disponível em< http://katlhenlorranna01.blogspot.com.br/> Acesso em
permaneceram aderidas à placa de cultivo e foram deslocadas com solução de Tripsina com ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) a 0,05% (Gibco). Depois, as células foram centrifugadas a 352 G por 5 minutos e suspensas em meio básico de cultivo. As células foram quantificadas utilizando câmara de Neubauer, e plaqueadas a uma concentração de 300 células por gota de 25uL em placas de 35mm. Após 90 minutos a foi adicionado 2mL de meio complexo: α-MEM; Gibco-BRL (Grand Island, NY), 10 % de soro fetal bovino( SBF; Cultlab), 2 % de extrato de embrião de galinha (EE), hidrocortisona (0,1Ug/ml, Sigma), transferrina (10Ug/ml, Sigma), insulina (1ng/ml, Sigma), 3-3’-5 triiodo-L-thironina (T3) (0,4ng/ml, Sigma), glucagon (0,01ng/ml, Sigma), Egf (0,1ng/ml, Sigma), Fgf2 (1ng/ml, Sigma), penicilina (200U/ml, Gibco) e estreptomicina (10Ug/ml, Gibco). Após 96h as células foram fixadas com formaldeído a 4% e armazenadas com formaldeído a 0.5% para análise posterior.
3.4 Imunohistoquímica in toto
Segmentos de embriões fixados com formaldeído foram primeiramente desidratados através de lavagens com um gradiente crescente de Metanol e re-hidratados gradualmente com PBS-Triton (PBS-TT). Seguidamente ocorreu o bloqueio com soro bovino fetal (SBF) 20% em PBS-TT por 1 hora. O determinante antigênico Hnk-1 foi utilizado como marcador de células da CN em migração, para isso, anticorpos específicos contra Hnk-1 (IgM – mouse. Hibridoma doado gentilmente por Nicole Marthe LeDouarin) foram utilizados sem diluição, diretamente nos segmentos de embriões por 24h a 4oC, sob
agitação. Após, no mínimo, 8 lavagens com PBS-TT e um segundo bloqueio com SBF 20%, os segmentos de embriões foram incubados com o anticorpo secundário específico na diluição de 1:1000 (anti-IgM-mouse / Alexa 488) por 24h a 4oC, sob agitação, ao abrigo da luz. Após
outro período de lavagens em PBS-TT, os segmentos de embrião foram observados e fotografados em microscópio esteroscópio de epifluorescência acoplado a um sistema de captura de imagem (Olympus MVX10).
3.5 Confecção das sondas para hibridização in situ
Todas as sondas de hibridização foram produzidas no Laboratório de Células Tronco e Regeneração Tecidual (LACERT) a partir de
plasmídeos doados de outros grupos de pesquisa (Tabela 1 – coluna Doada por), com exceção da sonda de Fgf8, que foi doada já na forma de sonda.
As sínteses das sondas de Sox10, FoxD3 Isl1 e Noggin foram feitas a partir de DNA bacteriano plasmidial. Os plasmídeos foram recebidos em papel filtro, eluídos em água livre de nucleases e utilizados para transformação de bactérias quimiocompetentes. Os procedimentos que envolvem Organismos Geneticamente Modificados – OGM foram aprovados pelo CIBio/UFSC, e encontram-se registrados sob o código: CQB #101/99 (processo 01200.004786/98-64).
3.5.1 Transformação de bactérias quimiocompetentes
Bactérias quimiocompetentes da cepa Escherichia coli DH5α foram adicionadas com 10 μL de plasmídeo, incubadas por 30 minutos no gelo e introduzidas a reação de choque térmico para permeação do plasmídeo: 40 segundos à 42 ºC e 2 minutos em gelo. Essas bactérias foram adicionadas com 1 mL de meio LB: 1% Bacto-Tryptone (BD 211705), 0,5% Bacto-Yeast Extract (BD 212750) e 1% NaCl, e incubadas por 45 minutos à 37 ºC. Após, foram semeadas em placas de LB Ágar: meio LB, ampicilina (10 μg/ml) e 1,5% Bacto Agar (BD 214010). As placas foram incubadas a 37 ºC em incubadora-shaker (Marconi MA-420) pelo período de 18 horas. As colônias menores das placas foram selecionadas e crescidas em tubos de 50 mL com 5 mL de meio LB acrescido de ampicilina (10 μg/mL), sob agitação de 300 rpm na incubadora-shaker Marconi durante 8 horas a 37 ºC. Após esse período, foram retirados 200 μL e adicionados a 100 mL de meio LB acrescido de ampicilina (10 μg/mL), incubados a 37 ºC sob agitação de 300 rpm na incubadora-shaker Marconi durante 16 horas. Uma parte das bactérias foi congelada em criotubos na proporção de 800 μL de líquido de cultura e 200 μL de glicerol estéril (Sigma G5516) e estocadas em freezer -80 ºC. As demais bactérias foram centrifugadas a 6.000 g por 30 minutos a 4 ºC e estocadas a -20 ºC para posterior extração plasmidial.
A extração dos plasmídeos foi feita com o kit Plasmid Mid Kit (QIAGEN 12145), segundo as orientações do fabricante, e diluídos em água livre de nucleases. Os plasmídeos foram subsequentemente linearizados com suas respectivas enzimas de restrição (Tabela 1 – coluna Corte AS) segundo orientações dos fabricantes, e purificadas por meio de kit Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega A9282).
3.5.2 Síntese das sondas de hibridização
A síntese das sondas foi realizada com suas respectivas RNA polimerases (Tabela 1 – coluna RNA Polimerase AS) segundo as orientações dos fabricantes, nessa etapa foram incluídas as sondas senso e antisenso de ErbB1. As sondas também foram purificadas por meio do kit Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega A9282). Após purificação, as sondas foram diluídas em mix de hibridização (Formamida 50%, SSC 20x pH 5, EDTA 5 mM pH8, Yeast RNA 50 μg/ml, PBS Tween 20 0,4%, Chaps 0,5%, Heparina 100 μg/ml) na concentração de 10 μg/ml. Após as etapas de extração dos plasmídeos, linearização e síntese da sonda, os produtos das reações foram mensurados com aparelho NanoVue Plus (GE Healthcare) pertencente ao LIAA (UFSC/CCB/BEG).
Tabela 1 - Sondas de hibridização utilizadas e suas informações de corte e síntese.
3.6 Hibridização in situ
Após a cultura de segmentos truncais de embriões com tratamento de Egf e Cetuximabe foi realizada a técnica de hibridização in situ para a análise da expressão dos fatores de transcrição, FoxD3, Sox10 e Islet1, como também a expressão dos fatores solúveis Fgf8 e Noggin. Os segmentos truncais fixados foram desidratados com metanol, e depois reidratados com PBS Tween 20 (PBT) 0,1%, para então serem tratados com proteinase K a 10 μg/ml por 20 minutos. Depois, os segmentos foram pós-fixados em solução de PBT 0,1% contendo formaldeído 4% e glutaraldeído a 0,1%. As lavagens com PBT 0,1% foram realizadas por 2 horas e substituída pelo mix de hibridização (Formamida 50%, SSC 20x pH 5, EDTA 5 mM pH8, Yeast RNA 50 μg/ml, PBS Tween 20 0,4%, Chaps 0,5%, Heparina 100 μg/ml). Os segmentos truncais foram incubados durante toda a noite a 70 ºC com as sondas de RNA, marcadas com Digoxigenina, específicas de cada proteína a ser analisada. Após a incubação com a sonda, foram realizadas lavagens por 3 horas, trocando-se a solução com a sonda de RNA pela solução tampão de ácido maleico (NaCl 150mM, NaOH 200mN e ácido maleico 100mM) contendo 0,01% de Tween 20 (MABT) ao longo das lavagens. Para detecção da sonda hibridizada foi incubado com anticorpo anti-digoxigenina por um período de 24 horas a concentração de 1:1000 a 4 ºC. Após cinco lavagens de trinta minutos em MABT, a revelação foi realizada com solução de nitro-blue-tetrazólio (NBT) e 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP) diluídos em tampão NTM pH 9,5 (Tris 100mM, NaCl 100mM, MgCl2 50mM, Tween 20 0,001%).
Para cada ensaio, todas as amostras foram analisadas e fotografadas juntas, em aumento de 4X em microscópio estereoscópico acoplado ao sistema de captura de imagem (Olympus MVX10). As imagens foram processadas pela plataforma Olympus cellSens, observando os devidos critérios para serem captadas com a mesma iluminação e grau de exposição.
3.7 Análise estatística
Os valores obtidos através da contagem das células em migração pela cultura de tubos neurais foram analisados utilizando o teste t de Student. As análises das células migratórias obtidas através da cultura de segmentos truncais tiveram sua flurescência detectada e quantificada
pelo software ImageJ. Com os dados obtidos, foi feito o uso do software estatístico GraphPadPrism5® utilizando ANOVA de uma via, seguida do teste de Bonferroni. para a elaboração dos gráficos. Para ambos os processos, foram consideradas diferenças estatísticas quando p<0,05. 4 RESULTADOS
Trabalhos anteriores do nosso grupo têm demonstrado que o Fator de crescimento epidermal (Egf), in vitro, é capaz de influenciar positivamente a diferenciação de neurônios periféricos, derivados da Crista Neural Truncal (CNT). Esse efeito pró-neurogênico do Egf é restrito às fases iniciais de migração e diferenciação das células da CNT (GARCEZ et al., 2009). Para compreender melhor como a sinalização Egf estaria atuando sobre a diferenciação inicial das células da CNT, segmentos truncais de embriões de codorna, em fase de neurulação, foram cultivados (cultivo ex vivo) e tratados com Egf e com Cetuximabe (Ctx), um bloqueador do principal receptor de Egf, o ErbB1. Em seguida as análises foram concentradas em 3 principais pontos: I) análise da migração inicial das células da CNT; II) análise da expressão de fatores de transcrição que controlam os passos iniciais da diferenciação dos derivados neurais da CNT; III) análise de um dos fatores de diferenciação de atuação específica para neurônios sensoriais; IV) análise de fatores solúveis que controlam a diferenciação inicial das células da CNT.
4.1 Egf e Ctx modificam o padrão de migração das células da CNT em sistema de cultivo ex vivo
A influência dos tratamentos com Egf ou Ctx na migração das células da CNT foi analisada utilizando segmentos truncais de embriões de codorna cultivados com Egf e com Ctx. Observamos que nas amostras tratadas com Egf, houve um aumento de células positivas para Hnk-1 (marcador de CN), principalmente na região mais dorsal do tubo neural (Fig. 10 E e F). Diferente do controle, que apresenta uma linha de marcação bem evidente na região entre o tubo neural e os somitos (Fig. 10 C e D – setas brancas), quando tratado com Egf, essa marcação lateral ao tubo neural torna-se pouco evidente. Curiosamente, nas amostras tratadas com Ctx, foi observado aumento tanto na marcação de células migratórias da CNT no dorso do tubo neural como também na região entre o tubo neural e os somitos (Fig. 10 G e H).
Figura 10 - Imunohistoquímica para Hnk-1 apresentando diferentes padrões de migração das células da CNT em segmento truncal de embriões de codorna cultivados.
Fonte: Produzido por Fernanda de Freitas, (2017)
Nota: (A) – Desenho ilustrando o segmento truncal com a localização das estruturas: TN – Tubo neural; ECT – Ectoderme; SM – somito. (B) - Desenho Ilustrando corte transversal indicando as estruturas: ECT – Ectoderme; TN – Tubo neural ; SM – Somito, que internamente possui a cavidade celomática (CL); NC – Notocorda, e abaixo, a endoderme (END), que por conta do sistema de cultivo apresenta-se como uma camada achatada; MI - Mesodeme Intermediária; (C) - Marcação das células migratórias na condição controle. (D) - Corte transversal do segmento truncal representado em B (linha tracejada). (E) - Marcação das células migratórias após tratamento com 10ng/ml de Egf. (F) - Corte transversal do segmento truncal representado em E (linha tracejada). (G) - Marcação das células migratórias após tratamento com Ctx 5mg/ml (linha tracejada). (H) - Corte transversal do segmento truncal representado em G (linha tracejada). (A’) – Anterior. (P’) – Posterior. (D’) – Dorsal. (V’) – Ventral. – (TN) – Tubo Neural. (ECT) – Ectoderme. (SM) – Somito. Aumento: 4X. N=5
Ao analisar as quantificações de fluorescência das culturas de segmentos truncais de embriões de codorna, foi confirmado um aumento significativo do número de células da CNT positivas para Hnk1, nos
grupos tratados Egf (aumento de 161,8%) e Ctx (aumento de 81,1%), em relação ao controle (Fig 11).
Figura 11 - Análise das células migratórias da CN em cultura de segmentos truncais
Fonte: Produzido por Fernanda de Freitas, (2018)
Nota: Representação gráfica que expressa o número de células migratórias da CNT durante 24h de cultura de segmentos truncais de embriões, em 4 experimentos independentes. Ctl: Controle. Egf: Tratamento com 10ng/ml de Egf. Ctx: Tratamento com 5mg/ml de Cetuximabe. Os resultados apresentam a proporção da média ± erro padrão. *p<0,05
Esses dados demonstram que tanto o tratamento com Egf, quanto o tratamento com Ctx, induzem aumento nas células da CNT positivas para Hnk-1, no entanto, a localização embrionária dessas células é diferente. A localização mais dorsal das células positivas para Hnk-1, no tratamento com Egf, sugere uma característica mais indiferenciadas para essas células. A localização mais lateral (entre o TN e os somitos) das células positivas para Hnk-1 sugere maior grau de comprometimento dessas células com a diferenciação neuronal. No entanto, análises adicionais são necessárias para que tal hipótese seja confirmada.
4.2 Egf e Ctx aumentam expressão de Sox10 nas células da CNT mas não alteram FoxD3
A diferenciação inicial das células da CNT é controlada por uma complexa rede de fatores de transcrição. Sox10 e FoxD3 são os dois principais fatores de transcrição que controlam os passos iniciais de diferenciação dos derivados neurais da CNT (SIMÕES-COSTA; BRONNER, 2015b). Sabe-se também que a expressão Sox10 é essencial para o desenvolvimento inicial do sistema nervoso periférico, sendo sua expressão mantida posteriormente nas células gliais (SOUTHARD-SMITH; KOS; PAVAN, 1998). A expressão de Sox10 ainda é apontada como responsável pela transcrição de receptores da família Erb, principalmente ErbB3 (PRASAD et al., 2011). O fator de transcrição FoxD3 também é expresso no início da migração das células da CNT, permanecendo expresso nas células do gânglio de raiz dorsal (KRISPIN et al., 2010). Para verificar a influência do Egf e do bloqueio do seu principal receptor ErbB1 sobre a expressão de Sox10 e FoxD3, foram realizadas hibridizações in situ para Sox10 e FoxD3 em segmentos truncais de embriões de codorna cultivados por 24h nas condições controle, Egf 10ng/ml e Ctx 5mg/ml. Os tratamentos com Egf e Ctx induziram um aumento no domínio de expressão de Sox10, sendo, na região anterior, um aumento mais localizado entre o tubo neural e os somitos. Na região posterior, o aumento na expressão de Sox10 localiza-se tanto na região entre o tubo neural e os somitos, quanto no dorso do tubo neural (Fig. 12B e C – setas brancas). Curiosamente, nas amostras tratadas com Ctx, foi observado uma organização precoce de estruturas semelhantes aos gânglios de raiz dorsal (GRD), na região mais anterior do segmento truncal cultivado (Fig. 12C – setas pretas).
Figura 12 - Análise da expressão de Sox10 por hibridização in situ em fragmentos truncais de embriões de codorna cultivados.
Fonte: Produzido por Fernanda de Freitas, (2017)
Nota: (A) - Condição controle. (B) - Egf 10ng/ml (C) - Ctx 5mg/ml. O tratamento com Egf e Ctx induziu aumento na expressão de Sox10 (setas brancas). Em Ctx pode ser observado uma formação precoce de estruturas semelhantes aos GRD (setas pretas). (A’) – Anterior. (P’) – Posterior. (D’) – Dorsal. (V’) – Ventral. Aumento 4X. N= 9.
Esses dados demonstram que a sinalização Egf atua sobre a expressão de Sox10 de forma distinta. O Egf induz um aumento na expressão de Sox10 em células da CNT migratórias. No entanto, o bloqueio do ErbB1, através do Ctx, levou a uma aparente diferenciação e organização precoce de derivados associados ao GRD.
Na análise da expressão de FoxD3, não foram observadas modificações na expressão frente ao tratamento com Egf 10ng/ml ou com Ctx 5mg/ml (Figura 13).
Esses dados sugerem que a sinalização Egf pode estar relacionada com decisões iniciais da CNT. Quando ativa, a sinalização Egf poderia estar impedindo a diferenciação das células da CNT. Ao bloquear o principal receptor de Egf, ErbB1, essas células diferenciariam, formando estruturas semelhantes aos GRD. O fato de não observarmos alterações na expressão de FoxD3 sugere que a diferenciação para melanócitos
(inicia com redução de FoxD3), ao contrário dos GRD, não dependeria de um bloqueio na sinalização Egf.
Figura 13 - Análise da expressão de FoxD3 por hibridização in situ em fragmentos truncais de embriões de codorna cultivados.
Fonte: Produzido por Fernanda de Freitas, (2017)
Nota: (A) - Condição controle. (B) - Egf 10ng/ml (C) - Ctx 5mg/ml. Não foram observadas alterações na expressão de FoxD3 em nenhuma das condições testadas. (A’) – Anterior. (P’) – Posterior. (D’) – Dorsal. (V’) – Ventral. Aumento 4X. N= 9.
4.3 Egf e Ctx alteram a expressão de Islet1 nas células da CNT Islet1 (Isl1) é o fator de transcrição que determina o início do comprometimento das células da CNT com a diferenciação de neurônios sensoriais (SUN et al., 2008). Dados do nosso grupo demonstraram que o Egf é capaz de direcionar a diferenciação de células da CNT, in vitro, provocando um aumento de 4x no número de neurônios (GARCEZ et al., 2009). Dessa forma, testamos se o Egf ou o bloqueio do receptor ErbB1 estaria influenciando na expressão de Isl1. O tratamento com Egf suprimiu a expressão de Isl1 nas células da CNT (Figura 14 B – setas brancas). De maneira interessante, o bloqueio do ErbB1 induziu a um aumento discreto na expressão de Isl1 (Figura 14 C – setas pretas). Em conjunto com os resultados anteriores, esses dados sugerem que o Egf poderia ser importante na fase inicial de diferenciação das células da
