Angela Patricia França
Associação de cafeína e exercício físico como estratégia terapêutica nos prejuízos comportamentais e neuroquímicos observados em um
modelo animal do Transtorno do Déficit de Atenção e Hiperatividade (TDAH)
Tese submetida ao Programa de Pós-Graduação em Neurociências da Universidade Federal de Santa Catarina como requisito parcial para a obtenção do Grau de Doutora em Neurociências.
Orientador: Prof. Dr. Rui Daniel Prediger
Supervisor de estágio sanduíche no exterior: Prof. Dr. Rodrigo Cunha
Florianópolis 2018
Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor,
através do Programa de Geração Automática da Biblioteca Universitária da UFSC.
França, Angela Patricia
Associação de cafeína e exercício físico como estratégia terapêutica nos prejuízos comportamentais e neuroquímicos observados em um modelo animal do Transtorno do Déficit de Atenção e Hiperatividade (TDAH) / Angela Patricia França ; orientador, Rui Daniel Prediger, 2018.
186 p.
Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2018.
Inclui referências.
1. Neurociências. 2. TDAH. 3. Cafeína. 4. Exercício Físico. 5. SHR. I. Prediger, Rui Daniel. II. Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Neurociências. III. Título.
Este trabalho é dedicado aos meus pais Bernadete e Sebastião e ao meu noivo Davi pelo incentivo e amor incondicional.
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais Bernadete e Sebastião pelo apoio incondicional, incentivo e amor.
Ao meu noivo Davi pelo incentivo, amor, companheirismo e dedicação ao longo desses anos.
Aos meus irmãos Marcos, Te, Zeca e Bia, meus amigos da vida inteira.
Ao professor Dr. Rui Daniel Prediger a quem tenho grande admiração, pela oportunidade oferecida, pelos ensinamentos, incentivo e amizade.
Ao professor Dr. Rodrigo Cunha por sempre abrir as portas para mais um brasileiro em seu laboratório. Sou grata pela oportunidade e ensinamentos oferecidos durante o doutorado sanduíche na Universidade de Coimbra (Portugal).
A todos os integrantes do grupo de Purinas da Universidade de Coimbra, pela acolhida e bom convívio. Em especial às queridas Dra. Paula Canas, Dra. Patricia Simões e Sara Reis pela amizade e ensinamentos.
À Neusinha, Angelo, Mara, Daniel, Ana Elisa e Aderbal, pela amizade e bons momentos compartilhados em Coimbra.
Ao prof. Dr. Geison Izídio do Laboratório de Genética do Comportamento, e às suas alunas Natali, Jéssica e Ariela, que gentilmente cederam os animais para esse estudo.
Ao prof. Dr. José Eduardo da Silva Santos e a profa Áurea Elisabeth Linder, do Laboratório de Cardiologia, e seus alunos Thiago e Angélica, pela colaboração nas medidas de pressão arterial.
À professora Dra. Patricia Brocardo, do Laboratório de Neuroplasticidade, e Evelini pela colaboração nas técnicas de imuno.
À professora Dra. Alexandra Latini, do Labox, e à Debora pela colaboração nas análises de monoaminas e cafeína.
Aos integrantes e ex-integrantes do Lexdon, Andréia, Bruna, Filipe, Jofre, Josiel, Gislaine, Katiane, Marina, Marcelo, Marissa, Nei,
À Bruna, Marina e Marissa, pela amizade e auxílio na realização dos experimentos.
Aos professores que compuseram a banca da minha qualificação de doutorado Dr. Eduardo Moreira, Dra. Manuela Kaster, Dra Ana Lúcia Rodrigues pelas excelentes contribuições para a melhoria deste trabalho. Aos amigos Carol e Fernando pela amizade e troca de conhecimentos durante este período.
A todos os professores que fizeram parte de minha formação e que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho.
A Universidade Federal de Santa Catarina pela estrutura oferecida. A CAPES e ao CNPq pelo suporte financeiro.
A todos os demais que direta ou indiretamente contribuíram para o desenvolvimento deste trabalho.
“O sucesso nasce do querer, da determinação e persistência em se chegar a um objetivo. Mesmo não atingindo o alvo, quem busca e vence obstáculos, no mínimo fará coisas admiráveis.” (José de Alencar, 1829-1877)
RESUMO
O transtorno do déficit de atenção e hiperatividade (TDAH) é um transtorno do neurodesenvolvimento que afeta 5% das crianças e adolescentes e 2,5% dos adultos em todo o mundo. Além dos sintomas clássicos (desatenção e/ou hiperatividade/impulsividade), outras comorbidades psiquiátricas estão frequentemente associadas ao TDAH, como depressão e ansiedade. Atualmente, os tratamentos farmacológicos para o TDAH, como o metilfenidato, são paliativos e focados na melhoria dos déficits comportamentais, com baixa eficácia nos comprometimentos emocionais. Inicialmente, o presente estudo avaliou a influência da idade (adolescência e idade adulta) sobre o desempenho em testes cognitivos e emocionais em ratos das linhagens Wistar (linhagem controle) e ratos espontaneamente hipertensos (SHR), um modelo animal validado do TDAH. Quando comparados aos animais da linhagem Wistar, os SHRs apresentaram prejuízos comportamentais, incluindo comprometimento olfatório, déficits na memória de reconhecimento de curto prazo e memória de reconhecimento espacial. Além disso, os SHRs apresentaram comportamentos do tipo-depressivo e anedônico. A linhagem SHR também apresentou níveis reduzidos da proteína associada ao sinaptossoma 25 (SNAP-25) no hipocampo e no córtex pré-frontal (CPF) em comparação aos ratos Wistar. O comprometimento cognitivo e emocional persistiu desde a adolescência até a idade adulta. Além disso, o presente estudo também avaliou os efeitos da associação de cafeína (um antagonista não seletivo dos receptores para adenosina) e exercício físico voluntário como estratégia terapêutica sobre os prejuízos comportamentais e neuroquímicos observados em animais SHRs. Ratos adolescentes (30 dias de idade) e adultos (4-5 meses de idade) da linhagem SHR foram divididos aleatoriamente em grupos controle (sedentário) ou exercitados (equipado com uma roda de corrida). Os grupos receberam água ou cafeína (0,3 mg/ml na água de beber) durante seis semanas (n= 7-10/grupo). Em seguida foi realizada uma bateria de testes comportamentais. Após os testes comportamentais, os animais foram eutanasiados e foi realizada a coleta de amostras para ensaios bioquímicos por Western blotting e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). A cafeína e o exercício físico, de maneira independente, melhoraram a memória de curto prazo e diminuíram o comportamento tipo depressivo. A ingestão crônica de cafeína e o exercício físico não alteraram a atividade locomotora e os comportamentos de ansiedade tanto para os animais tratados na adolescência quanto na idade adulta. De maneira interessante, a
o exercício também aumentou o comportamento hedônico dos SHR adultos, mas não alterou o comportamento hedônico na adolescência. Os animais tratados na adolescência (da adolescência à idade adulta) apresentaram um aumento nos níveis de dopamina no estriado e maiores níveis de serotonina no hipocampo e no CPF. Não foram observadas diferenças nas vias mediadas pelo fator neurotrófico derivado do encéfalo (BDNF). A cafeína e o exercício físico induziram mudanças nas proteínas sinápticas, sendo observado um aumento na densidade de SNAP-25 e de sintaxina no CPF e hipocampo nos animais tratados na adolescência e idade adulta. A densidade do transportador vesicular glutamatérgico 1 (VGLUT1) aumentou no hipocampo dos animais do grupo cafeína/exercício. Os resultados do presente estudo indicam que a cafeína e o exercício físico promovem benefícios importantes na cognição e em respostas de emocionalidade, além de promover o aumento da neurotransmissão dopaminérgica e serotoninérgica e plasticidade sináptica no SNC de SHRs, o que poderia contribuir para a abordagem terapêutica no TDAH.
Palavras-chave: Transtorno do déficit de atenção e hiperatividade (TDAH), cafeína, exercício, SHR.
ABSTRACT
Attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD) is a persistent neurodevelopmental disorder that affects 5% of children and adolescents and 2.5% of adults worldwide. In addition to classic symptoms (inattention and/or hyperactivity–impulsivity) many psychiatric comorbidities are frequently associated to ADHD, such as depression and anxiety. The current pharmacological treatments for ADHD (e.g., methylphenidate) are palliative and focused in the improvement of behavioral deficits, with low efficacy on emotional impairments. The current study evaluated the influence of age (adolescence and adulthood) on cognitive and emotional responses in Wistar (control strain) and spontaneously hypertensive rats (SHR), a validated model of ADHD. When compared to Wistar strain, SHR displayed behavioral impairments, including olfactory deficit, poor performance in short-term recognition memory and spatial recognition memory. Besides, SHR exhibited depressive- and anhedonic-like behaviors. SHR strain presented low levels of synaptosome associated protein 25 (SNAP-25) in hippocampus and prefrontal cortex (PFC). Cognitive and emotional impairments were persistent from adolescence to adulthood. Moreover, the present study also evaluated the effects of the association of caffeine (a non-selective adenosine receptor antagonist) plus voluntary physical exercise as therapeutic strategy to improve behavioral and neurochemical impairments observed in SHR. Adolescent (30 days old) and adult (4-5 month old) male inbred SHR were assigned randomly to a sedentary control group or a voluntary exercise group (equipped with a running wheel). Both groups received water or caffeine (0.3 mg/ml in drinking water) during six weeks (n=7-10/group). After chronic caffeine intake plus voluntary running, a battery of behavioral tests was performed. After behavioral tests, the animals were euthanized for biochemical assays using Western blotting analysis and high performance liquid chromatography (HPLC). Caffeine and physical exercise, in an independent manner, improved short-term memory and decreased depressive-like behavior. Chronic caffeine intake plus physical exercise did not alter locomotor activity and anxiety-like behaviors in both adolescence and adult-treated rats. Interestingly, association of caffeine plus exercise recovered olfactory ability of SHR in both ages. Caffeine plus physical exercise also increased hedonic-like behavior in adult SHR, but did not alter hedonic behavior in adolescence rat. Adolescence treated rat (from adolescence to adulthood) presented an increase in dopamine levels in the striatum and serotonin levels in the hippocampus and PFC.
changes in synaptic proteins. Namely, it was observed an increase in the SNAP-25 and syntaxin density in PFC and hippocampus for both age groups. Vesicular glutamate transporter 1 (VGLUT1) density was increased in the hippocampus of caffeine plus exercise group. The present results indicate that caffeine plus physical exercise confers benefits in cognition and emotional state, and also enhance dopaminergic neurotransmission in CNS, which could contribute to the therapeutic approach of ADHD.
Keywords: Attention deficit hyperactivity disorder, SHR; caffeine, physical exercise.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Principais mecanismos cerebrais envolvidos no TDAH. ... 38 Figura 2 – Representação esquemática do desenho experimental utilizado no bloco experimental I. ... 55 Figura 3 – Representação esquemática do desenho experimental utilizado no bloco experimental II. ... 56 Figura 4 – Representação esquemática do desenho experimental utilizado no bloco experimental III. ... 57 Figura 5 – Influência da idade sobre a capacidade olfatória avaliada no teste de discriminação olfatória. ... 72 Figura 6 – Influência da idade sobre a locomoção no teste do campo aberto. ... 73 Figura 7 – Influência da idade sobre a memória de curto prazo avaliada no teste de reconhecimento de objeto. ... 74 Figura 8 – Influência da idade sobre a memória espacial avaliada no teste do labirinto em “Y”. ... 76 Figura 9 – Influência da idade sobre a memória de trabalho e de procedimento avaliadas no teste do labirinto aquático. ... 77 Figura 10 – Influência da idade sobre os parâmetros de ansiedade avaliados no teste do labirinto em cruz elevado. ... 78 Figura 11 – Influência da idade sobre o comportamento emocional avaliado no teste do nado forçado. ... 80 Figura 12 – Influência da idade sobre o comportamento hedônico e de autocuidado avaliados no teste da borrifada com sacarose. ... 81 Figura 13 – Influência da idade sobre o comportamento hedônico avaliado no teste da preferência por sacarose. ... 82 Figura 14 – Influência da idade sobre o imunoconteúdo de SNAP-25 no SNC dos animais WIS e SHR. ... 84 Figura 15 – Influência da idade sobre o imunoconteúdo de sinaptofisina no SNC dos animais WIS e SHR. ... 86
Figura 17 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre o consumo total de líquidos e consumo de cafeína. ... 90 Figura 18 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre o consumo de ração e massa corporal dos animais SHR. ... 92 Figura 19 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre o desempenho na roda de correr e teste ergométrico. ... 93 Figura 20 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre a pressão arterial sistólica. ... 95 Figura 21 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre a capacidade olfatória avaliado no teste da discriminação olfatória. ... 96 Figura 22 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre a locomoção no teste do campo aberto. ... 97 Figura 23 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre a memória de curto prazo avaliada no teste do reconhecimento de objeto. ... 98 Figura 24 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre a flexibilidade comportamental avaliada no teste do labirinto aquático. ... 99 Figura 25 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre o comportamento tipo-depressivo avaliado no teste do nado forçado. .. 101 Figura 26 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre o comportamento tipo-anedônico avaliado no teste da borrifada com sacarose. ... 102 Figura 27 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre os níveis de dopamina no SNC. ... 103 Figura 28 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre os níveis de DOPAC no SNC. ... 105 Figura 29 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre os níveis de 5-HT no SNC. ... 107 Figura 30 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre os níveis de 5-HIAA no SNC. ... 109 Figura 31 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre o imunoconteúdo de SNAP-25 no SNC. ... 111
Figura 32 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre o imunoconteúdo de sintaxina no SNC. ... 113 Figura 33 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre o imunoconteúdo de sinaptofisina no SNC. ... 115 Figura 34 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre o imunoconteúdo de VGLUT1 no SNC. ... 116 Figura 35 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre o imunoconteúdo de BDNF maduro no SNC. ... 118 Figura 36 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre o imunoconteúdo de BDNF truncado no SNC. ... 119 Figura 37 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre o imunoconteúdo de TrkB fosforilado no SNC. ... 121 Figura 38 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre o imunoconteúdo de CREB no SNC. ... 122 Figura 39 – Níveis de cafeína no soro. ... 123 Figura 40 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre o consumo de líquidos e consumo de cafeína. ... 126 Figura 41 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre o consumo de ração e massa corporal. ... 127 Figura 42 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre o desempenho na roda de correr e teste ergométrico. ... 129 Figura 43 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre a pressão arterial sistólica e batimentos cardíacos. ... 130 Figura 44 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre a capacidade olfatória avaliada no teste da discriminação olfatória. ... 131 Figura 45 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre a locomoção no teste do campo aberto. ... 132 Figura 46 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre a memória de curto prazo avaliada no teste do reconhecimento de objeto. ... 133 Figura 47 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre o comportamento tipo-depressivo avaliado no teste do nado forçado. ... 134
sacarose. ... 135 Figura 49 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre o imunoconteúdo de SNAP-25 no SNC. ... 137 Figura 50 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre o imunoconteúdo de sintaxina no SNC. ... 139 Figura 51 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre o imunoconteúdo de sinaptofisina no SNC. ... 141
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 – Efeitos da cafeína associada ao exercício físico sobre as alterações comportamentais observadas em animais SHR. ... 149 Quadro 2 – Efeitos da cafeína associada ao exercício físico sobre os níveis de monoaminas no SNC de animais SHR. ... 151 Quadro 3 – Efeitos da cafeína associada ao exercício físico sobre o imunoconteúdo de proteínas sinápticas no SNC de animais SHR. ... 153
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Resumo de estudos clínicos sobre os efeitos da cafeína em pacientes com TDAH. ... 44 Tabela 2 – Lista de anticorpos utilizados nas análises de Western blotting. ... 67 Tabela 3 – Quantificação de cafeína nos tecidos (pmol/mg proteína). 124 Tabela 4 – Massa das adrenais, coração e gastrocnêmio dos animais (g/100 g de peso vivo). ... 124
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AMPA – Ácido-alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-isoxosol-4-propiônico (do inglês: α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid)
ANOVA – Análise de variância
BDNF – Fator neurotrófico derivado do encéfalo (do inglês:
brain-derived neurotrophic factor)
BO – Bulbo olfatório
BSA – Albumina de soro bovino (do inglês: bovine serum albumin) CaMK I – Cinase cálcio/calmodulina dependente II
CEUA – Comissão de Ética para o uso de animais CPF – Córtex pré-frontal
CREB – Elemento de resposta ao AMP cíclico (do inglês: cAMP
responsive elemento-binding)
DAT – Transportador de dopamina (do inglês: dopamine transporter) DOPAC – Ácido 3,4 diidroxifenilacético (do inglês: 3,4-dihydroxyphenylacetic acid)
DTT – Ditiotreitol (do inglês: Dithiothreitol)
EDTA – Ácido etileno-diamino-tetra-acético (do inglês:
Ethylenediaminetetraacetic acid)
EPM – Erro padrão da média
HPLC – Cromatografia líquida de alta eficiência (do inglês: high
performance liquid chromatography)
LEXDON – Laboratório Experimental de Doenças Neurodegenerativas LTP – Potenciação de longa duração (do inglês: long term potentiation) MAPKI – proteína cinase induzida por mitógeno I
MAPKII – proteína cinase induzida por mitógeno II NA – Noradrenalina
PN – Pós-natal
PMSF – Fenilmetilsulfonilfluoreto (do inglês: phenylmethylsulfonyl
fluoride)
PVDF – Fluoreto de polivinilideno (do inglês: polyvinylidene Fluoride) SDS – Dodecil sulfato de sódio (do inglês: sodium dodecyl sulfate) SHR – Ratos espontaneamente hipertensos (do inglês: spontaneous
hypertensive rat)
SNAP-25 – Proteína associada ao sinaptossoma (do inglês: synaptosomal
nerve-associated protein 25)
SNC – Sistema nervoso central
SNP – Polimorfismos de nucleotídeo único (SNP, do inglês: single
nucleotide polymorphisms)
TDAH – Transtorno do déficit de atenção e hiperatividade
TrkB – Receptor tirosina cinase B (do inglês: tropomyosin receptor
kinase B)
UFSC – Universidade Federal de Santa Catarina
VGLUT1 – Transportador vesicular glutamatérgico do tipo 1 (VGLT1, do inglês: vesicular glutamate transporter 1)
WIS – Wistar
5-HT – Serotonina (5-hidroxitriptamina)
5-HIAA – Ácido 5-hidroxindolacético (do inglês: 5-Hydroxyindoleacetic
acid)
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 31
1.1 TRANSTORNO DO DÉFICIT DE ATENÇÃO E
HIPERATIVIDADE ... 31 1.2 EPIDEMIOLOGIA ... 34 1.3 ETIOLOGIA ... 35 1.4 NEUROBIOLOGIA ... 37 1.5 TRATAMENTO FARMACOLÓGICO ... 39 1.6 MODELOS ANIMAIS PARA O ESTUDO DO TDAH ... 41 1.7 CAFEÍNA ... 42 1.7.1 Os efeitos da cafeína no TDAH ... 44 1.8 O EXERCÍCIO FÍSICO ... 48 1.9 JUSTIFICATIVA E HIPÓTESE ... 49 2 OBJETIVOS ... 51 2.1 OBJETIVO GERAL ... 51 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 51 3 MATERIAL E MÉTODOS ... 53 3.1 ANIMAIS... 53 3.1.1 Exercício físico ... 53 3.1.2 Solução de cafeína ... 54 3.2 PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS ... 54 3.2.1 Delineamento do bloco experimental I ... 54 3.2.2 Delineamento do bloco experimental II ... 55 3.2.3 Delineamento do bloco experimental III ... 57 3.2.4 Avaliação da massa corporal ... 57 3.2.5 Avaliação do consumo de líquidos e ração ... 57 3.2.6 Teste de ergométrico ... 58
3.3 TESTES COMPORTAMENTAIS ... 59 3.3.1 Teste de discriminação olfatória ... 59 3.3.2 Teste do campo aberto ... 60 3.3.3 Teste do reconhecimento de objeto ... 60 3.3.4 Teste do labirinto em “Y” modificado ... 61 3.3.5 Teste do labirinto aquático ... 61 3.3.6 Teste do labirinto em cruz elevado ... 62 3.3.7 Teste do nado forçado ... 63 3.3.8 Teste da borrifada com sacarose ... 63 3.3.9 Teste da preferência pela sacarose ... 64 3.4 ENSAIOS EX VIVO ... 64 3.4.1 Coleta de estruturas encefálicas, adrenais, coração e gastrocnêmio ... 64 3.4.2 Coleta de sangue... 65 3.4.3 Preparo da fração total ... 65 3.4.4 Preparo de sinaptossomas ... 66 3.4.5 Imunodetecção de proteínas - Western blotting ... 66 3.4.6 Quantificação dos níveis cafeína no soro e tecido cerebral . . ... 68 3.4.7 Quantificação de dopamina, DOPAC, 5-HT e 5-HIAA ... 68 3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 68 4 RESULTADOS ... 71 4.1 BLOCO EXPERIMENTAL I ... 71 4.1.1 Teste da discriminação olfatória ... 71 4.1.2 Teste do campo aberto ... 72 4.1.3 Teste do reconhecimento de objeto ... 73 4.1.4 Teste do labirinto em “Y” modificado ... 75
4.1.5 Teste do labirinto aquático ... 76 4.1.6 Teste do labirinto em cruz elevado ... 77 4.1.7 Teste do nado forçado ... 78 4.1.8 Teste da borrifada com sacarose... 81 4.1.9 Teste da preferência pela sacarose ... 82 4.1.10 Imunodetecção de proteínas - Western Blotting ... 83 4.1.10.1 Imunoconteúdo de SNAP-25 ... 83 4.1.10.2 Imunoconteúdo de sinaptofisina ... 85 4.1.10.3 Imunoconteúdo de sintaxina ... 87 4.2 BLOCO EXPERIMENTAL II ... 89 4.2.1 Avaliação do consumo total de líquidos e consumo de cafeína ... 89 4.2.2 Avaliação do consumo de ração e massa corporal ... 91 4.2.3 Avaliação da distância total percorrida na roda de correr e desempenho no teste ergométrico ... 93 4.2.4 Pressão arterial sistólica (PAS) ... 94 4.2.5 Teste da discriminação olfatória ... 95 4.2.6 Teste do campo aberto ... 96 4.2.7 Teste do reconhecimento de objeto ... 97 4.2.8 Teste do labirinto aquático ... 98 4.2.9 Teste do nado forçado ... 100 4.2.10 Teste da borrifada com sacarose... 102 4.2.11 Quantificação dos níveis de dopamina, serotonina e metabólitos por HPLC ... 103 4.2.11.1 Quantificação dos níveis de dopamina e DOPAC ... 103 4.2.11.2 Quantificação dos níveis de 5-HT e 5-HIAA ... 106 4.2.12 Imunodetecção de proteínas – Western Blotting ... 110 4.2.12.1 Imunoconteúdo de SNAP-25 ... 110
4.2.12.3 Imunoconteúdo de sinaptofisina ... 114 4.2.12.4 Imunoconteúdo de VGLUT1 ... 116 4.2.12.5 Imunoconteúdo de BDNF ... 117 4.2.12.6 Imunoconteúdo de BDNF truncado ... 118 4.2.12.7 Imunoconteúdo de TrkB fosforilado ... 120 4.2.12.8 Imunoconteúdo de CREB ... 122 4.2.13 Quantificação dos níveis de cafeína no soro e tecidos cerebrais . ... 123 4.2.14 Avaliação da massa das adrenais, coração e gastrocnêmio . . ... 124 4.3 BLOCO EXPERIMENTAL III ... 125 4.3.1 Avaliação do consumo total de líquidos e consumo de cafeína . ... 125 4.3.2 Avaliação do consumo de ração e massa corporal ... 127 4.3.3 Avaliação da distância total percorrida na roda de correr e desempenho no teste ergométrico ... 128 4.3.4 Pressão arterial sistólica (PAS) ... 130 4.3.5 Teste da discriminação olfatória ... 131 4.3.6 Teste do campo aberto ... 131 4.3.7 Teste do reconhecimento de objeto ... 132 4.3.8 Teste do nado forçado ... 133 4.3.9 Teste da borrifada com sacarose ... 135 4.3.10 Imunodetecção de proteínas – Western Blotting ... 136 4.3.10.1 Imunoconteúdo de SNAP-25 ... 136 4.3.10.2 Imunoconteúdo de sintaxina ... 138 4.3.10.3 Imunoconteúdo de sinaptofisina ... 140 5 DISCUSSÃO ... 143
5.1 INFLUÊNCIA DA IDADE SOBRE OS PREJUÍZOS COGNITIVOS, EMOCIONAIS E ALTERAÇÕES NEUROQUÍMICAS OBSERVADOS EM SHRs ... 143 5.2 EFEITOS DA INGESTÃO CRÔNICA DE CAFEÍNA ASSOCIADA AO EXERCÍCIO FÍSICO SOBRE OS PARÂMETROS COMPORTAMENTAIS E NEUROQUÍMICOS ... 148 6 CONCLUSÃO ... 159 REFERÊNCIAS ... 161
1 INTRODUÇÃO
1.1 TRANSTORNO DO DÉFICIT DE ATENÇÃO E HIPERATIVIDADE
O transtorno do déficit de atenção e hiperatividade (TDAH) é um transtorno crônico do neurodesenvolvimento que tem normalmente início na infância, e caracteriza-se por um padrão persistente de desatenção, hiperatividade e impulsividade (BIEDERMAN e FARAONE, 2005; FARAONE et al., 2015).
Os primeiros relatos acerca do TDAH na literatura médica datam de 1775, e foram realizados pelo médico alemão Melchior Adam Weikard, que discorreu sobre os distúrbios da atenção (BARKLEY e PETERS, 2012; FARAONE et al., 2015). No entanto, o reconhecimento e o tratamento farmacológico desse transtorno datam da segunda metade do século XX (POLANCZYK et al., 2014).
A terminologia do TDAH sofreu alterações significativas ao longo do tempo (POLANCZYK et al., 2007). Somente na década de 1940, a sintomatologia do TDAH foi associada às modificações no sistema nervoso central (SNC), sendo descritas na época como danos cerebrais mínimos. Com o advento da terceira edição do Manual Diagnóstico e Estatístico dos Distúrbios Mentais (DSM-III) na década de 1980, criou-se o primeiro critério de diagnóstico operacional para o TDAH (ASSOCIATION., 1980; FARAONE et al., 2015).
Até o momento não existem marcadores biológicos, eletrofisiológicos ou por neuroimagem para o diagnóstico do TDAH (POLANCZYK et al., 2012). O diagnóstico é estabelecido a partir do histórico clínico do paciente (TRIPP e WICKENS, 2009), o que muitas vezes é alvo de críticas, visto como subjetivo e com menor credibilidade quando comparado a testes laboratoriais utilizados em outras especialidades médicas (BIEDERMAN e FARAONE, 2005).
As diretrizes para a análise clínica são determinadas pelo DSM-V. Dentre as especificações estabelecidas, pelo menos seis sinais de desatenção e/ou hiperatividade/impulsividade, com duração mínima de seis meses, devem estar presentes. Além disso, o DSM-V preconiza que esses sintomas devem se manifestar antes dos 12 anos de idade, em mais de um ambiente (escola, trabalho, casa), de uma maneira que resulte em prejuízos ao indivíduo (ASSOCIATION., 2013).
Atualmente o TDAH é classificado em três subtipos, baseado na presença e predomínio dos sintomas de desatenção e hiperatividade-impulsividade:
• Apresentação combinada: ambos os sintomas, desatenção e hiperatividade-impulsividade estão presentes;
• Predominantemente desatento: caracterizado pela presença de desatenção, mas não hiperatividade-impulsividade;
• Predominantemente hiperativo-impulsivo: caracterizado pela presença de hiperatividade-impulsividade, mas sem sintomas de desatenção (ASSOCIATION., 2013).
O TDAH é caracterizado por déficits em múltiplos domínios cognitivos, como comprometimento na memória de trabalho verbal e visual-espacial, vigilância e planejamento (FARAONE et al., 2015), além de alterações no funcionamento executivo que podem implicar no mau desempenho durante a tomada de decisões e no comportamento de flexibilidade comportamental (WILLCUTT et al., 2005).
Os prejuízos funcionais associados ao TDAH, como mau gerenciamento do tempo, procrastinação e distração, afetam diretamente as atividades sociais, acadêmicas e ocupacionais, tendo impacto na qualidade de vida dos indivíduos em todas as idades (BIEDERMAN e FARAONE, 2005; FARAONE et al., 2015). A manifestação do TDAH está associada a dificuldades na escola, conflitos familiares, aumento da incidência de lesões, comportamento antissocial e aumento dos acidentes de trânsito (BIEDERMAN e FARAONE, 2005; MATZA et al., 2017). Além disso, adultos com TDAH apresentam maiores dificuldades em manter relacionamentos, administração das finanças pessoais, dificuldades no controle do humor e temperamento (PITTS, MANGLE e ASHERSON, 2015).
Outros prejuízos são observados nos processos de recompensa, pacientes com TDAH tendem a preferir recompensas imediatas às recompensas com atraso, além disso, tendem a tomar decisões precipitadas, sem uma análise aprofundada da problemática (SONUGA-BARKE e FAIRCHILD, 2012; FARAONE et al., 2015).
Adolescentes e adultos com TDAH apresentam frequentemente menor nível de escolaridade, baixo desempenho ocupacional e baixo status socioeconômico (BIEDERMAN e FARAONE, 2006). Além disso, comparado a população em geral, apresentam um aumento no risco de desenvolver tabagismo e transtornos associados ao uso de substâncias de abuso, especialmente entre pacientes que possuem também o transtorno de conduta (GROENMAN et al., 2013). O consumo de álcool foi
recentemente associado à manutenção e ao aumento dos sintomas do TDAH na idade adulta (KARAM et al., 2017).
Nos últimos anos, a avaliação da função olfatória em indivíduos com TDAH tem despertado interesse uma vez que os comprometimentos olfatórios são sintomas comuns em diversas doenças neurodegenerativas (DOTY et al., 1991; DOTY, 2017), transtornos neuropsiquiátricos (SCHECKLMANN et al., 2011), bem como no declínio cognitivo leve (DJORDJEVIC et al., 2008). Ademais, o processamento olfatório é mediado por um conjunto de estruturas neuroanatômicas e neuroquímicas que estão implicadas na fisiopatologia do TDAH (KARSZ et al., 2008; GHANIZADEH et al., 2012).
Alguns estudos clínicos têm demonstrado que crianças com TDAH apresentam déficits olfatórios (tanto na identificação quanto no limiar de detecção de odores) (KARSZ et al., 2008; GHANIZADEH et al., 2012). Entretanto, outro estudo realizado por ROMANOS e colaboradores apontou um aumento na sensibilidade a odores em crianças com TDAH, o que foi normalizado pelo tratamento com metilfenidato (ROMANOS et
al., 2008). Em adultos sob tratamento com metilfenidato, a interrupção da
medicação levou a um aumento na discriminação olfatória (SCHECKLMANN et al., 2011). No geral, não há um consenso na literatura acerca do comprometimento olfatório no TDAH.
Outro fator que contribui significativamente para os prejuízos funcionais associados ao TDAH é a presença de comorbidades psiquiátricas e não psiquiátricas. As comorbidades podem ser observadas na maioria das crianças, adolescentes e adultos com TDAH (TAURINES
et al., 2010), independentemente do gênero (NOVIK et al., 2006).
Atribui-se ao TDAH um aumento no risco para o desenvolvimento de transtornos psiquiátricos, tais como depressão, transtorno bipolar, transtornos de ansiedade, transtorno do estresse pós-traumático, fobias, distúrbios de personalidade, comportamentos antissociais, dentre outros (STEINHAUSEN et al., 2006; BERNARDI et al., 2012).
Um estudo realizado em crianças e adolescentes com TDAH (de 4 a 17 anos) mostrou que 52% da população estudada apresentava pelo menos um transtorno psiquiátrico e 26,2% apresentavam dois ou mais transtornos psiquiátricos (JENSEN e STEINHAUSEN, 2015).
A maioria das comorbidades aparece após o início do TDAH, durante o curso da doença. Alguns distúrbios se manifestam durante as fases iniciais da infância, enquanto outros – incluindo transtornos de ansiedade, reações ao estresse e transtorno de conduta – aparecem em
fases tardias da infância ou no início da adolescência (JENSEN e STEINHAUSEN, 2015).
A presença de transtornos ansiedade e distúrbios afetivos, como a depressão, estão entre os grupos de comorbidades mais frequentemente estudado no TDAH, uma vez que a coexistência desses transtornos resulta em grave comprometimento na vida cotidiana, com consideráveis problemas funcionais e psicossociais (TAURINES et al., 2010). A presença de comorbidades associadas ao TDAH implica em expectativas negativas com relação ao prognóstico e ao tratamento.
1.2 EPIDEMIOLOGIA
A prevalência estimada do TDAH em crianças e adolescentes é de 5.3 % em todo o mundo (POLANCZYK et al., 2007; POLANCZYK
et al., 2014). Outro estudo, baseado exclusivamente nos critérios de
diagnóstico do DSM-IV, relatou uma taxa de prevalência mundial de 5,9-7,1% para indivíduos com idade <18 anos, com predomínio do subtipo desatento em todas as idades, exceto na idade pré-escolar (3-5 anos), no qual o subtipo hiperativo-impulsivo foi mais presente. O subtipo combinado teve um aumento da prevalência entre 3-12 anos de idade e em seguida apresenta um declínio em adolescentes e adultos (WILLCUTT, 2012).
Alguns estudos têm demonstrado uma variação nas taxas de prevalência do TDAH, no entanto, essa grande variabilidade das taxas de prevalência resulta principalmente de diferenças metodológicas entre os estudos, critérios diagnósticos utilizados, fonte de informação e exigência de comprometimento funcional para o diagnóstico. Além disso, não há evidências de um aumento na prevalência do TDAH nas últimas três décadas (POLANCZYK et al., 2007; POLANCZYK et al., 2014; FARAONE et al., 2015).
Apesar de ter sido considerado inicialmente como um transtorno limitado à infância, estudos prospectivos realizados na década de 1980 já mostravam que alguns dos sintomas persistiam em adultos (WEISS et al., 1985). Atualmente estima-se que dois terços dos pacientes com diagnóstico de TDAH na infância continuam com o transtorno na idade adulta (BARKLEY et al., 2002; LARA et al., 2009; HOOGMAN et al., 2017). A prevalência estimada de TDAH em adultos é de 2,5% (LARA
et al., 2009; SIMON et al., 2009).
Estima-se que haja um declínio idade-dependente dos sintomas – a hiperatividade e a impulsividade tendem a diminuir ao longo do tempo de forma mais acentuada e precoce que a desatenção (SWANSON et al., 1998) –, contudo não há diminuição no comprometimento funcional
relacionado ao aumento da idade (BIEDERMAN, MICK e FARAONE, 2000; FARAONE et al., 2015). A desatenção parece ser o fator preditivo mais importante do comprometimento em adultos (MATTE et al., 2015). Em contraste, muitos pacientes na idade adulta já não se enquadram nos critérios de diagnósticos utilizados (FARAONE, BIEDERMAN e MICK, 2006). Supõe-se que a diminuição da prevalência do TDAH em adultos na população em geral, possa estar relacionada com as limitações dos critérios de diagnóstico (SIMON et al., 2009).
Evidências sugerem que o TDAH afeta predominantemente o gênero masculino comparado ao feminino. Em crianças e adolescentes essa diferença exibe uma razão de 4: 1 em estudos clínicos e 2,4: 1 em estudos populacionais (GAUB e CARLSON, 1997; POLANCZYK et al., 2007; FARAONE et al., 2015). Na idade adulta essas diferenças desaparecem (SIMON et al., 2009).
Algumas diferenças entre os sexos também são observadas em relação aos subtipos apresentados. Em um estudo de meta-análise foi observado uma proporção significativamente maior de mulheres (crianças e adultos) que preenchem os critérios para o subtipo desatento comparado aos indivíduos do sexo masculino. Em contraste, os homens com TDAH foram mais propensos a preencherem os critérios para o subtipo combinado (WILLCUTT, 2012). Meninas com TDAH apresentaram maior comprometimento intelectual, níveis mais baixos de hiperatividade e tem menor propensão a manifestar problemas na escola ou nos tempos livres. Em contraste, os meninos apresentam mais sintomas hiperativos e agressivos (GAUB e CARLSON, 1997; NEWCORN et al., 2001; BIEDERMAN et al., 2002)
Existem poucos estudos com relação às diferenças na prevalência de TDAH em função de raça, etnia e nível socioeconômico, e os resultados ainda permanecem controversos (WILLCUTT, 2012; MATTE
et al., 2015). Acredita-se que os aspectos socioculturais não estão
implicados na etiologia do transtorno uma vez que a localização geográfica não está associada à variabilidade da prevalência do TDAH (POLANCZYK et al., 2014).
1.3 ETIOLOGIA
Embora a etiologia do TDAH não esteja completamente elucidada, diversos estudos sugerem uma associação entre fatores genéticos e ambientais que emergem em diferentes estágios de desenvolvimento, desde a infância até a idade adulta (MERWOOD et al., 2014).
De acordo com estudos realizados em gêmeos, crianças e adolescentes com TDAH apresentam alta herdabilidade, com taxas entre 70-80% (FARAONE et al., 2005; CHANG et al., 2013; FARAONE e LARSSON, 2018). Adultos diagnosticados clinicamente com o transtorno também apresentam alto componente de herdabilidade (LARSSON et al., 2014). Em um estudo recente – baseado em uma classificação dos sintomas relatada pelos pais e pacientes – a herdabilidade estimada para indivíduos adultos com TDAH (entre 19 e 20 anos) foi de 78% (CHANG et al., 2013). Estudos de adoção contribuem com esses dados, uma vez que pais adotivos de crianças com TDAH são menos propensos a ter o transtorno ou doenças associadas comparado à parentes biológicos (SPRICH et al., 2000).
Os estudos mostram que cerca de um terço da herdabilidade do TDAH é devido a um componente poligênico que compreende muitas variantes comuns, cada uma com pequenos efeitos (FARAONE e LARSSON, 2018). Entretanto, os dados disponíveis na literatura com relação aos genes envolvidos são inconsistentes (GIZER, FICKS e WALDMAN, 2009). Muitos dos genes candidatos, baseados em estudos de meta-análises, parecem estar envolvidos com os sistemas de neurotransmissão monoaminérgico (principalmente dopamina e noradrenalina); sendo que estes estão relacionados com a fisiopatologia do transtorno, bem como com o mecanismo de ação de alguns fármacos usado no seu tratamento (GIZER, FICKS e WALDMAN, 2009; FARAONE et al., 2015).
Dentre os genes candidatos associados ao TDAH, os estudos prévios mostram o envolvimento de genes relacionados ao sistema dopaminérgico, como os genes SLC6A3/DAT1, que codificam o transportador de dopamina (DAT) e os genes DRD4, DRD5, que codificam os receptores para dopamina do tipo D4 e D5. Além disso, outros estudos apontam o envolvimento dos genes SNAP-25, que codificam a proteína associada ao sinaptossoma (SNAP-25), envolvida no crescimento axonal e na plasticidade sináptica. Além de genes envolvidos na transmissão serotoninérgica, como os genes 5HTT, que codificam o transportador de serotonina, e os genes HTR1B para o receptor de serotonina 5-hidroxitriptamina 1B (GIZER, FICKS e WALDMAN, 2009; FARAONE e MICK, 2010; GRIZENKO et al., 2012). Além disso, outro estudo demonstrou uma possível associação entre os polimorfismos no gene que codifica o receptor para adenosina A2A e o TDAH. Três polimorfismos de nucleotídeo único (SNP, do inglês: single nucleotide polymorphisms) do gene ADORA2A foram associados às características do TDAH (MOLERO et al., 2013). No
entanto, essas associações são pequenas e contribuem com a ideia de que a susceptibilidade genética ao TDAH é mediada por muitos genes com pequeno efeito (FARAONE e MICK, 2010).
O envolvimento de fatores ambientais, como complicações obstétricas e diversidade psicossocial pode desempenhar um papel importante no desenvolvimento do TDAH (BIEDERMAN e FARAONE, 2005). Dentre eles destacam-se: o nascimento prematuro, baixo peso ao nascer, tabagismo materno durante a gravidez, história paterna de comportamento antissocial e depressão materna (LANGLEY et al., 2007; GALERA et al., 2011).
A interação entre fatores ambientais, como o tabagismo materno e o estresse durante a gestação, foram associados a polimorfismos em genes dopaminérgicos, como DAT1 e DRD4, e podem aumentar a probabilidade de desenvolver alguns sintomas do TDAH (KAHN et al., 2003; NEUMAN et al., 2007; GRIZENKO et al., 2012). Em adultos, estudos mostram que cofatores ambientais como eventos estressantes podem aumentar a intensidade dos sintomas do TDAH de maneira independente. Além disso, variáveis funcionais no gene DRD4 podem contribuir para a susceptibilidade dos indivíduos aos fatores ambientais (SANCHEZ-MORA et al., 2015). Outro estudo apontou uma interação entre o genótipo (5-HTTLPR) e o estresse na intensidade dos sintomas hiperativo/impulsivo do TDAH (JACOB et al., 2010; VAN DER MEER
et al., 2014). Além disso, alguns estudos têm demonstrado que a
exposição a toxinas ambientais e fatores psicossociais como o estresse, durante o período gestacional e pós-natal, podem levar a alterações epigenéticas que podem estar envolvidos na patogênese do TDAH (MILL e PETRONIS, 2008).
1.4 NEUROBIOLOGIA
O TDAH é um transtorno heterogêneo, de causalidade multifatorial, decorrente de uma associação entre alterações estruturais, funcionais e de neurotransmissores em diversas regiões do cérebro, incluindo regiões corticais e subcorticais. Quando comparados a indivíduos saudáveis, os indivíduos com TDAH apresentam as seguintes alterações estruturais:
• Menor densidade da substância cinzenta (PROAL et al., 2011); incluindo volume reduzido do núcleo accumbens, amígdala, corpo estriado (caudado e putâmen), hipocampo e volume intracraniano (HOOGMAN et al., 2017);
• Redução do volume total do cérebro (PROAL et al., 2011; HOOGMAN et al., 2012);
• Atraso na maturação cortical em crianças e adolescentes (SHAW
et al., 2007; SHAW et al., 2012);
• Redução da espessura cortical em adultos (PROAL et al., 2011; HOOGMAN et al., 2017).
Crianças com TDAH apresentam um aumento precoce na espessura no córtex motor primário (SHAW et al., 2007), que permanece até a idade adulta (DUERDEN, TANNOCK e DOCKSTADER, 2012). Essas alterações estruturais, observadas em diferentes regiões do cérebro, implicam em alterações nos circuitos de neurotransmissores envolvidos na fisiopatologia do TDAH, e estão representados na Figura 1.
Dentre as regiões corticais que desempenham um papel importante no TDAH, destacam-se o córtex pré-frontal (CPF) dorsolateral, relacionado à memória de trabalho, o CPF ventromedial, importante para a tomada de decisão complexa e planejamento estratégico, e o córtex parietal envolvido na orientação de atenção (FARAONE et al., 2015), demonstrados na Figura 1A.
Além das estruturas corticais, o TDAH envolve estruturas subcorticais do cérebro, como o córtex cingulado ventral anterior e o córtex cingulado dorsal anterior (importantes no controle executivo de componentes afetivos e cognitivos) que, junto com os núcleos da base (compreendendo o núcleo accumbens, núcleo caudado e putâmen) formam o circuito frontoestriatal (Figura 1B). Através de estudos de neuroimagem foram observadas alterações estruturais e funcionais em todas essas estruturas em pacientes com TDAH, estendendo-se até a amígdala e o cerebelo (FARAONE et al., 2015).
Fonte: Adaptado de FARAONE et al., 2015.
Os sistemas dopaminérgico e noradrenérgico, ilustrados na Figura 1C, estão entre os circuitos de neurotransmissores classicamente envolvidos no TDAH. Grande parte dos estudos baseia-se na hipofunção dopaminérgica em áreas corticais, límbicas e motoras do SNC, que incluem a via mesocortical, responsável pelo controle das funções cognitivas (memória, atenção, planejamento e flexibilidade comportamental), a via mesolímbica, associada às respostas de prazer e recompensa e a via nigroestriatal, relacionada ao controle motor. Os corpos celulares neuronais dessas vias se encontram na área tegmentar ventral (vias mesocortical e mesolímbica) e na substância negra (via nigroestriatal) (TRIPP e WICKENS, 2009; FARAONE et al., 2015).
Evidências clínicas que mostram uma melhora significativa nos sintomas de indivíduos tratados com metilfenidato – fármaco que aumenta a atividade central de dopamina e noradrenalina (NA) em regiões que incluem o córtex e o estriado – reforçam essa hipótese (SWANSON
et al., 2007; TRIPP e WICKENS, 2009; FARAONE e LARSSON, 2018).
Os circuitos dopaminérgicos e noradrenérgico integram as principais redes envolvidas no controle executivo e motivacional. Essas redes são sub-ativadas e apresentam menor conectividade funcional em indivíduos com TDAH comparado com indivíduos sem o transtorno. Mudanças nessa circuitaria refletem em alterações no funcionamento executivo, como tarefas de planejamento, memória de trabalho, flexibilidade comportamental; e no controle emocional, como em respostas de recompensa (TRIPP e WICKENS, 2009; PURPER-OUAKIL et al., 2011; FARAONE et al., 2015)
Estudos genéticos e clínicos, também sugerem o envolvimento de outros sistemas de neurotransmissão, incluindo os sistemas serotoninérgico, colinérgico, glutamatérgico, além de uma desregulação do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (FARAONE et al., 2015).
1.5 TRATAMENTO FARMACOLÓGICO
Dentre as intervenções farmacológicas utilizadas no tratamento do TDAH estão os fármacos estimulantes (metilfenidato e anfetamina), os não estimulantes (atomoxetina, guanfacina e clonidina), os antidepressivos (bupropiona, venlafaxina, reboxetina, desipramina, imipramina) e os antipsicóticos (risperidona e tioridazina) (CATALA-LOPEZ et al., 2017). De uma maneira geral, o tratamento farmacológico
no TDAH atua na melhoria da sinalização de catecolaminas nos circuitos córtico-estriatais (PURPER-OUAKIL et al., 2011).
Além do tratamento farmacológico, existem as intervenções psicológicas (como terapia comportamental, treinamento cognitivo e
neurofeedback) e intervenções complementares, como dieta, tratamento
homeopático e atividade ou exercício físico (CATALA-LOPEZ et al., 2017). Entretanto, os psicoestimulantes continuam sendo a primeira linha de tratamento farmacológico para o TDAH, sendo considerado o tratamento de primeira escolha para crianças em idade escolar, adolescentes e adultos (FARAONE et al., 2015).
O metilfenidato, principal fármaco utilizado na clínica, melhora a tríade de sintomas do TDAH em aproximadamente 70% dos pacientes, o que parece estar relacionado à normalização do funcionamento de regiões do cérebro envolvidas nas funções motoras e executivas (WILENS, 2008; RUBIA et al., 2011). Os mecanismos de ação dos estimulantes (metilfenidato e anfetaminas) incluem o bloqueio dos transportadores de dopamina e NA, a inibição da monoamina oxidase (MAO) e o aumento na liberação dopamina e NA (PURPER-OUAKIL et
al., 2011).
Estudos têm demonstrado que tanto os medicamentos estimulantes quanto os não estimulantes, reduzem efetivamente os sintomas do TDAH em crianças e adultos (FARAONE e GLATT, 2010). Entretanto, os estimulantes (anfetamina e metilfenidato) são mais eficazes do que os não estimulantes (atomoxetina, guanfacina, bupropriona e
clonidina) (SUBCOMMITTEE ON
ATTENTION-DEFICIT/HYPERACTIVITY et al., 2011).
Embora alguns sintomas comumente atribuídos como efeitos adversos ao uso de medicamentos estimulantes sejam características preexistentes em indivíduos com TDAH (ex: sentimento de tristeza, pesadelos, etc) (EFRON, JARMAN e BARKER, 1997), a terapia farmacológica com psicoestimulantes apresenta vários efeitos adversos (RUSSELL, RONCO e DODEK, 1990; CORTESE et al., 2009).
Os efeitos adversos contribuem significativamente para a interrupção do tratamento. Dentre os efeitos mais relatados estão a anorexia, provocada pelo uso de estimulantes, não estimulantes, combinações de estimulantes e não estimulantes e antidepressivos; e a perda de peso associada ao uso de estimulantes e não estimulantes. Somado aos efeitos adversos, a terapia farmacológica no TDAH é geralmente longa, e isso implica em dificuldades na adesão ao tratamento, o que pode afetar negativamente nos resultados (CATALA-LOPEZ et al., 2017).
1.6 MODELOS ANIMAIS PARA O ESTUDO DO TDAH
Grande parte do conhecimento adquirido acerca dos mecanismos subjacentes do TDAH é oriunda de estudos conduzidos em modelos animais. O uso de modelos animais, como os roedores (especialmente ratos e camundongos), é de grande importância nas pesquisas biomédicas, particularmente devido a sua semelhança com os seres humanos em processos biológicos, circuitos cerebrais e patologias. Em casos relacionados à compreensão de transtornos humanos complexos, como o TDAH, os animais desempenham um papel importante no esclarecimento de mecanismos genéticos, bioquímicos e fisiológicos envolvidos (TECOTT, 2003).
O TDAH é um transtorno heterogêneo, resultante de interações genéticas e ambientais, e da mesma forma modelos animais variados têm sido proposto para o estudo desse transtorno. Dentre os modelos, estão aqueles que apresentam modificações genéticas (ratos espontaneamente hipertensos (SHR), os ratos Naples com alta excitabilidade (NHE), camundongos knock-out de DAT, camundongos coloboma mutantes deficientes em SNAP-25), modelos quimicamente induzidos (exposição precoce a etanol, nicotina, 6-hidroxidopamina (6-OHDA), e modelos induzidos ambientalmente (como a indução de anóxia neonatal e o isolamento social) (RUSSELL, 2011).
Os SHR foram criados a partir da linhagem Wistar de Kyoto que apresentaram um fenótipo hipertensivo (OKAMOTO e AOKI, 1963), e constituem o modelo mais clássico utilizado no estudo do TDAH do subtipo combinado (RUSSELL, 2007; SAGVOLDEN et al., 2009). Essa linhagem apresenta as principais características comportamentais do TDAH (validade de face), atende aos critérios baseados na neurobiologia do transtorno, incluindo modificações na transmissão dopaminérgica (validade de constructo), e são capazes de prever aspectos do comportamento observado em humanos, como resposta similar ao metilfenidato (validade preditiva) (SAGVOLDEN, 2000).
Os SHR apresentam, entre outras características, hiperatividade, impulsividade, desatenção e déficits de aprendizado/memória (SAGVOLDEN, 2000; RUSSELL, 2002; DAVIDS et al., 2003; SAGVOLDEN et al., 2005b). Parte desse comprometimento parece estar associada às modificações no sistema monoaminérgico, incluindo alterações nos sistemas noradrenérgico, serotoninérgico e, especialmente prejuízos na transmissão dopaminérgica (RUSSELL, 2007).
Dentre as alterações encontradas no sistema dopaminérgico estão a redução da liberação de dopamina no CPF (RUSSELL et al., 1995), aumento na densidade de DAT e aumento da captação de dopamina em terminais frontocorticais e estriatais (WATANABE et al., 1997; PANDOLFO et al., 2013), aumento da densidade dos receptores dopaminérgicos D1 e D2 no estriado de adolescentes (KIROUAC e GANGULY, 1993) e D1 em adultos (KIROUAC e GANGULY, 1993; WATANABE et al., 1997). Outro estudo reportou um aumento da densidade de receptores A2A nos terminais nervosos frontocorticais em SHR (PANDOLFO et al., 2013).
Alguns estudos têm demonstrado que os SHR apresentam um comprometimento na transmissão sináptica glutamatérgica. Foi observada uma diminuição na transmissão sináptica mediada por receptores ácido-alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-isoxosol-4-propiônico (AMPA, do inglês: α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic
acid) em neurônios piramidais do CPF (CHENG et al., 2017) e disfunções
mediadas por receptores N-metil-D-aspartato (NMDA) sem alterações morfológicas evidentes (JENSEN et al., 2009). Além disso, foram observadas modificações na expressão de proteínas sinápticas, como a diminuição de SNAP-25 no CPF de SHR (LI et al., 2009).
Embora a hipertensão seja um fator limitante no modelo SHR, uma característica que não é necessariamente presente em humanos com TDAH (DAVIDS et al., 2003), alguns estudos mostraram melhora no desempenho cognitivo sem modificar a pressão arterial (PREDIGER, FERNANDES e TAKAHASHI, 2005; PANDOLFO et al., 2013).
Outro fator importante é o cuidado na escolha da linhagem controle, sendo observadas diferenças significativas quando comparados ao WKY/NHsd (Wistar Kyoto obtido do laboratório Harlan, UK, considerado o controle apropriado) ou outras linhagens heterogênicas. Além disso, sublinhagens de SHR também podem apresentar comportamentos diferentes (SAGVOLDEN et al., 2009).
1.7 CAFEÍNA
A cafeína é uma das substâncias psicoativas mais consumidas em todo o mundo (IOANNIDIS, CHAMBERLAIN e MULLER, 2014), faz parte do grupo dos compostos químicos denominados metilxantinas, e está presente em muitos alimentos e bebidas consumidos diariamente, como chás, cafés, chocolates e refrigerantes (FREDHOLM et al., 1999; DALY, 2007).
Devido as suas propriedades hidrofóbicas, a cafeína atravessa as membranas biológicas por difusão lipídica, e pode induzir alterações rápidas na expressão gênica e mudanças adaptativas em longo prazo, tais como efeitos neuromoduladores (FREDHOLM, 1995). Embora a cafeína e seus análogos desempenhem um papel importante na modulação de diferentes alvos biológicos, como os receptores para adenosina, fosfodiesterases e canais de liberação de cálcio em processos fisiológicos (DALY, 2007), o único mecanismo conhecido, influenciado pelas concentrações alcançadas após o consumo de doses habituais em humanos, é o antagonismo dos receptores para adenosina (FREDHOLM, 1995).
A modulação dos receptores para adenosina no SNC, efeito mimetizado pela cafeína, têm sido implicados na melhora das funções cognitivas; assumindo um papel importante nos processos de aprendizagem e memória (TAKAHASHI, PAMPLONA e PREDIGER, 2008; CUNHA e AGOSTINHO, 2010; PANDOLFO et al., 2013). A adenosina é um neuromodulador endógeno, que atua sobre quatro tipos distintos de receptores acoplados à proteína G: A1, A2A, A2B e A3 (DUNWIDDIE e MASINO, 2001). Os principais efeitos fisiológicos no SNC surgem a partir da sua interação com os receptores do tipo A1 e A2A, localizados principalmente em sinapses, em especial nas sinapses glutamatérgicas (CUNHA, 2016).
Os receptores A1 (receptores metabotrópicos acoplados à proteína Gi) estão amplamente distribuídos no cérebro, com maior expressão no córtex, hipocampo e cerebelo (FREDHOLM, 1995). Os receptores A2A (receptores metabotrópicos acoplados à proteína Gs) estão expressos predominantemente nos núcleos da base, particularmente no estriado, onde atuam na modulação negativa de receptores do tipo D2 para dopamina (CUNHA et al., 2008; FERRE et al., 2008b). Em menores densidades, estes receptores também estão presentes em regiões extra-estriatais como hipocampo , amígdala e CPF (PANDOLFO et al., 2013; CUNHA et al., 2016; SIMOES et al., 2016), nas quais desempenham um papel importante integrando a sinalização dopaminérgica, glutamatérgica e vias de sinalização mediada pelo fator neurotrófico derivado do encéfalo (BDNF, do inglês Brain derivated neurotrofic factor), essenciais no controle da neuroplasticidade e comportamentos mnemônicos e relacionados ao humor (WEI et al., 2014).
Devido à sua ação inibitória sobre os receptores para adenosina, a cafeína aumenta os níveis de neurotransmissores como a NA e dopamina
no SNC (SCOTT; FERRE et al., 2008a; FERRE et al., 2008b). Dessa forma, a neuromodulação do sistema adenosinérgico através da cafeína, surge como um alvo em potencial, tendo em vista a sua capacidade para controlar diversos sistemas de neurotransmissores (FREDHOLM e SVENNINGSSON, 2003).
1.7.1 Os efeitos da cafeína no TDAH
Os primeiros relatos acerca do uso da cafeína no TDAH foram descritos em 1973, quando Schnackenberg avaliou os efeitos da ingestão de duas xícaras de café (cerca de 200 a 300 mg de cafeína diariamente) em onze crianças hiperativas (SCHNACKENBERG, 1973). As crianças apresentaram melhora geral do comportamento, incluindo nível de atenção, impulsividade e irritabilidade. Todas as crianças apresentaram escores mais baixos em uma escala de hipercinesia após o tratamento com metilfenidato e cafeína, mas a cafeína não apresentou efeitos adversos.
Nos anos seguintes alguns pesquisadores tentaram replicar os efeitos encontrados por Schnackenberg em crianças hipercinéticas. Os principais estudos clínicos avaliando os efeitos da cafeína em indivíduos com TDAH estão sumarizados na Tabela 1.
Tabela 1 – Resumo de estudos clínicos sobre os efeitos da cafeína em pacientes com TDAH.
Indivíduos e
diagnóstico* Tratamento Principais resultados Referência
11 crianças hipercinéticas
Dois copos de café ao dia (~200-300 mg de cafeína) durante 3 semanas.
Ingestão de café melhorou os prejuízos comportamentais, sem efeitos adversos.
(SCHN ACKENBERG, 1973) 7 meninos e 1 menina (6-11 anos) com hiperatividade Cafeína: 3 mg/kg (1x ao dia) durante 1 semana, 3 mg/kg (2x ao dia) por duas semanas e 6 mg/kg durante 3 semanas.
Os efeitos da cafeína não foram diferentes do placebo.
(CONN ERS, 1975) 18 crianças (12 meninos e 6 meninas, média= 8,5 anos) Cafeína (~300 mg), anfetamina (20 mg) MFD (40 mg) diariamente durante 1 sem. MFD e anfetamina foram superiores à cafeína; Os efeitos da cafeína foram similares ao placebo; A cafeína não apresentou efeitos adversos.
(HUEST IS, ARNOLD e SMELTZER, 1975)
25 crianças (5-13 anos) hipercinéticas Placebo, cafeína (50 a 200 mg), MFD (2,5 a 10 mg), anfetamina (1,5 a 5 mg), 2x ao dia; e imipramina (10 a 25 mg) 1 dose à noite.
A cafeína (249 mg/dia) não apresentou efeitos benéficos; As crianças apresentaram piora dos sintomas após o tratamento com cafeína;
MFD, anfetamina e imipramina apresentaram melhora dos sintomas.
(GROSS , 1975) 8 meninos (6-10 anos) diagnosticados com disfunção mínima cerebral Placebo (200 mg), cafeína (160 mg) ou MFD (20 mg) 1x ao dia durante 2 semanas. MFD apresentou efeitos superiores à cafeína. (GARFI NKEL, WEBSTER e SLOMAN, 1975a) 8 meninos (6-10 anos) com disfunção cerebral mínima Placebo (100 mg), cafeína (75 mg) ou MFD (10 mg) 2x ao dia durante 2 semanas.
MFD foi superior à cafeína nos sintomas de impulsividade e hiperatividade. (GARFI NKEL, WEBSTER e SLOMAN, 1975b) 5 meninos e 1 menina (média: 9,3 anos) hipercinéticos Cafeína (6 mg/kg) ou placebo foram administrados antes do teste.
A cafeína melhorou a atenção dos indivíduos hipercinéticos.
(REICH ARD e ELDER, 1977) 10 meninos (9-11 anos) com dificuldades em leitura Cafeína (300 mg) 1 h antes do teste. Comparada ao placebo a cafeína reduziu os erros de esquecimento nas crianças hipercinéticas;
A cafeína não melhorou os déficits de atenção. (KUPIE TZ e WINSBERG, 1977) 12 crianças (8 meninos, 4 meninas, média: 7,26 anos) com sintomas hipercinéticos e transtorno de impulsividade Café (~175-200 mg de cafeína por dia) e café descafeinado 2 x ao dia durante 3 semanas.
Os efeitos da cafeína foram superiores ao placebo e ao café descafeinado. (HARV EY e MARSH, 1978) 20 meninos hiperativos (5-12 anos) Cafeína (150 mg) 2 x ao dia durante duas semanas. A cafeína melhorou os sintomas de impulsividade. (FIREST ONE, POITRAS-WRIGHT e DOUGLAS, 1978) 21 crianças hiperativas (17 meninos e 4 meninas), 6-12 anos Placebo, cafeína (300 e 500 mg) ou MFD (20 mg) diariamente durante 3 semanas. MFD melhorou os sintomas de impulsividade e hiperatividade; Os efeitos da cafeína não foram superiores ao placebo.
(FIREST ONE et al., 1978) 29 crianças (22 meninos e 7 meninas) idade entre 5 e 12 anos
Uma a seis cápsulas de cafeína (80 mg), MFD (10 mg) ou anfetamina (5 mg) durante 3 semanas.
O MFD e a anfetamina apresentaram efeitos superiores
17 crianças hipercinéticas (8-11 anos) tratadas com estimulantes
Tratamento agudo com placebo ou cafeína (3 ou 6 mg/kg).
Foi observada uma tendência na melhora comportamental, porém sem diferença significativa. (CONN ERS, 1979) 6 meninos (6-10 anos) com hiperatividade, déficit de atenção e impulsividade Placebo, cafeína (158,6 ou 308,6 mg) durante 15 dias. MFD (10 mg) administrado em combinação com a cafeína durante os últimos 5 dias.
Os efeitos da cafeína em doses baixas (158,6 mg) foram superiores ao placebo e a cafeína em doses maiores; A associação com MFD aumentou os efeitos da cafeína nas duas doses.
(GARFI NKEL, WEBSTER e SLOMAN, 1981) 15 meninos (6-10 anos) com hiperatividade Anfetamina (1,6 ou 5 mg), cafeína (300 mg) administrada sozinha ou em combinação com anfetamina (1,6 mg) 2x ao dia durante 2 semanas. A cafeína melhorou os sintomas de hiperatividade, mas apresentou efeitos adversos, incluindo insônia.
(SCHEC
HTER e
TIMMONS, 1985)
* Diferenças na nomenclatura e critérios de diagnóstico. MFD: metilfenidato.
De maneira geral, os resultados da cafeína no TDAH descritos em estudos clínicos foram inconsistentes. Enquanto alguns estudos mostraram melhora dos sintomas outros não encontraram efeitos positivos significativos. Os efeitos da cafeína em alguns casos foram melhores do que os efeitos obtidos com o placebo, ou em combinação com outros estimulantes comparados ao uso do estimulante sozinho (ver Tabela 1). Entretanto, os efeitos da cafeína parecem ser inferiores aqueles obtidos com os psicoestimulantes utilizados na clínica (para revisão ver FRANÇA et al., 2018).
Em um estudo de meta-análise, Leon e colaboradores apontaram algumas das principais limitações nos estudos clínicos envolvendo o uso da cafeína e TDAH. Além do pequeno número de estudos realizados, o tamanho médio das amostras por estudos foram pequenos (14,4 indivíduos/estudo) e houve uma grande variabilidade na dose de cafeína utilizada (LEON, 2000).
Nos últimos anos, os efeitos da cafeína têm sido avaliados em modelos animais do TDAH. Em animais SHR adultos, o uso da cafeína e de antagonistas seletivos dos receptores para adenosina do tipo A2A melhoraram o desempenho dos roedores avaliados através de diferentes tarefas de aprendizagem e memória (TAKAHASHI, PAMPLONA e PREDIGER, 2008).
Em estudos prévios do nosso grupo, o tratamento agudo com cafeína (3 e 10 mg/kg/dia i.p.) foi capaz de reverter os prejuízos de memória social apresentados por animais SHR adultos (PREDIGER, FERNANDES e TAKAHASHI, 2005). O mesmo efeito foi obtido após a administração aguda de um antagonista seletivo dos receptores A2A (ZM241385, 0,5 e 1 mg/kg, i.p.). Por outro lado, a administração de um antagonista seletivo dos receptores A1 (DPCPX, 1 e 3 mg/kg, i.p.) não apresentou efeito sobre essa tarefa; sugerindo um efeito seletivo dos receptores A2A sobre a memória social em ratos SHR (PREDIGER, FERNANDES e TAKAHASHI, 2005). O tratamento agudo com cafeína também promoveu melhorias na capacidade de reconhecimento de objetos em ratos SHR adultos, efeito similar ao obtido após o tratamento com metilfenidato (PIRES et al., 2009). O tratamento agudo com cafeína também melhorou, de forma dose-dependente, os déficits de aprendizagem em um modelo de TDAH induzido pelo isolamento social (OUCHI et al., 2013).
De maneira interessante, o tratamento crônico com a cafeína (3 mg/kg, i.p.) durante a fase da adolescência promoveu benefícios sobre a habilidade de reconhecimento de objeto em animais SHR na idade adulta (PIRES et al., 2010). O tratamento crônico com cafeína (2 mg/kg, i.p., duas vezes ao dia durante 21 dias) durante a adolescência normalizou a função dopaminérgica ao reduzir a recaptação de dopamina no estriado e no córtex frontal (PANDOLFO et al., 2013). Estes resultados sugerem que o tratamento crônico com a cafeína durante a adolescência confere benefícios cognitivos de longo prazo em ratos SHR (PIRES et al., 2010).
Em um estudo recente, Nunes e colaboradores demonstraram que a ingestão crônica de cafeína (0,3 g/L), desde a infância até a adolescência, foi capaz de reverter os prejuízos de memória de reconhecimento em ambos os sexos, recuperar a memória espacial em SHR fêmeas. No entanto, a ingestão de cafeína também provocou um aumento na locomoção das fêmeas. Esse estudo também demonstrou que os SHR apresentaram níveis elevados de BDNF no hipocampo, e a cafeína promoveu a normalização desses níveis em machos (NUNES et
al., 2018).
Estes resultados obtidos em modelos animais do TDAH fornecem uma evidência clara de que a cafeína pode normalizar tarefas de aprendizagem discriminativa e reconhecimento espacial, reforçando a ideia de que o consumo crônico de cafeína normaliza a função dos circuitos cerebrais provavelmente através de sua ação sobre os receptores
