UNIVERSIDADE FEDERAL DE CAMPINA GRANDE
CENTRO DE CIENCIAS E TECNOLOGIA
PROG RAMA DE POS-GRADUACAO EM CIENCIA
E ENGENHARIA DE MATERIAIS
UFCC
KATILAYNE VIEIRA DE ALMEIDA
ARCABOUQOS DE QUITOSANA: AVALIAQAO DA INFLUENCIA DA
MASSA MOLAR E DO PROCESSO DE CONGELAMENTO NA
BIODEGRADACAO
Campina Grande-PB
Fevereiro/2013
ARCABOUCOS DE QUITOSANA: AVALIACAO DA INFLUENCIA DA
MASSA MOLAR E DO PROCESSO DE CONGELAMENTO NA
BIODEGRADACAO
Dissertacao apresentada ao Programa de
Pos-Graduagao em Ciencia e Engenharia
de Materials como requisito a obtencao do
titulo de MESTRE EM CIENCIA E
ENGENHARIA DE MATERIAIS
Orientador: Prof. Dr. Marcus Vinicius Lia Fook
Agenda Financiadora: CNPQ
Campina Grande-PB
Fevereiro/2013
A447a Almeida, Katilayne Vieira de.
Arcaboucos de quitosana: avaliacao da influencia da massa molar e
do processo de congelamento na biodegradacao / Katilayne Vieira de
Almeida. - Campina Grande, 2013.
81 f.: H. color.
DissertacSo (Mestrado em Ciencia e Engenharia de Materiais)
-Universidade Federal de Campina Grande, Centra de Ciencias e Tecnologia.
Orientador: Prof. Dr. Marcus Vinicius Lia Fook.
Referencias.
1. Quitosana. 2. Arcaboucos. 3. Peso Molecular. I. Titulo.
CPU 677.473(043)
MOLAR E DO PROCESSO DE CONGELAMENTO NA BIODEGRAQAO.
Katilayne Vieira de Almeida
Dissertagao Aprovada em 25/02/2013 pela banca examinadora constituida dos seguintes membros:
f
^u*s\
(UAJ^Js
\o
"C*-o Dr. Marcus Vinicius Lia Fook(Orientador) UAEMa/UFCG
Dr. i^msemberg Cardoso Barbosa
^( E x a m i n a d o r Externo) CERTBIO/UAEMa/UFCG
I \ Dr. Rodrigo Alex Arthur
\ \ (Examinador Externo)
bondade e a meus pais por toda doacao de vida, DEDICO.
A Deus, por simplesmente me amar e ser comigo todos os dias, atendendo aos desejos do meu coracao e possibilitando esta minha formacao.
Aos meus pais J o s e Maria de Almeida Silva e Maria de Lourdes Vieira pela dedicacao, apoio e por nao medirem esforcos para ajudarem na concretizacao de mais esta etapa.
As minhas irmas Katiane e Katiuscia por vivenciarem ao meu lado todas as emocoes dessa fase, me dando forca para nunca desistir.
Ao meu sobrinho Marcus Vinicius por todo cansaco que ele conseguiu tirar de mim, com seu sorriso e seu jeito danado de ser.
A jully por me ensinar o que e amor incondicional.
Aos meus cunhados Maxsuwell e Danilo por estarem presente em minhas decisoes e me apoiarem sem questionarem.
Ao meu orientador Prof. Dr. Marcus Vinicius Lia Fook, pela confianca, carinho e ate pelos puxoes de orelhas. Por ter me ensinado a amadurecer e a encarar os desafios da vida profissional.
A Wladymyr por ter sempre depositado sua confianca na minha capacidade como profissional e por ter feito parte de todos os dias e desafios deste mestrado. O meu eterno agradecimento.
A Marcio J o s e por estar sempre disponivel a me ajudar, me ensinando o amor a pesquisa e me incentivando como pessoa e profissional. Esta tese tern sua participacao efetiva.
As amigas que fiz durante o mestrando e que irei levar para minha vida: Rita de C a s s i a , Roberta Meira, Imarally e Valeria. E as amigas, Camila Catarina, Isabelle, Flavia e Julia pelas inumeras vezes que recusei seus convites por causa do mestrado e mesmo assim estao ao meu lado.
A Rossemberg, Roberta Pinto, Hugo Lisboa e Tiago Fideles pelas c o n t r i b u t e s diretas ao meu mestrado.
Aos amigos Klaidson, Emanuel, Italo, Rodrigo, Paulo Adolfo, Emilly, Geanne, S e u Sergio, Germano e todos que fazem parte do grupo C E R T B I O que de forma direta ou indiretamente ajudaram na minha formacao profissional.
Ao Corpo Docente de Engenharia de Materials. Ao CNPQ, pela bolsa cedida.
joensctr c
que ainda ninguemjoensou soJSre aquifo que
to do mundo ve.
As pesquisas por arcaboucos tem-se intensificado nos ultimos anos com o proposito de desenvolver estruturas tridimensionais porosas que controlem de forma efetiva a adesao, migragao, proliferacao e diferenciacao celular. As propriedades almejadas em arcabougos dependem diretamente e intimamente das propriedades da sua materia prima. A quitosana tern alcangado lugar de destaque na utilizagao como arcabougo por possuir capacidade de moldagem em diversas formas e sua habilidade para formar estruturas porosas atraves de tecnicas como a liofilizagao. Este trabalho teve como objetivo desenvolver arcabougos de quitosana liofilizados, utilizando-se de quitosana de baixo, medio e de alto peso molecular; sob duas temperaturas de congelamento a -60°C e -150°C. A materia prima foi caracterizada por Calorimetria Exploratoria Diferencial (DSC), Espectroscopia na Regiao do Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR), e Difragao de Raios X (DRX). Ja os arcabougos foram caracterizados pelas tecnicas de Calorimetria Exploratoria Diferencial (DSC), Espectroscopia na Regiao do Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR), e Difragao de Raios X (DRX), Microscopia
Eletronica de Varredura (MEV), Grau de Intumescimento, Ensaio Mecanico (Compressao) e Ensaio de Biodegradagao In Vitro. Nos resultados obtidos e possivel concluir que quitosanas de diferentes pesos moleculares e temperaturas variadas resultam em arcabougos com propriedades morfologicas diferenciadas
Research by scaffolds have intensified in recent years with the purpose of developing three-dimensional porous structures that control effectively the adhesion, migration, proliferation and differentiation. The properties in desired scaffolds depend directly and intimately on the properties scaffolds for having capacity of molding in various forms and their ability to form porous structures using techniques such as lyophilization. This study aimed to develop lyophilized chitosan scaffolds, using chitosan of low, medium and high molecular weight; under two freezing temperatures to -60 ° C and -150 0 C. The material was
characterized by Differential Scanning Calorimetry (DSC), Spectroscopy in the Region of Fourier Transform Infrared (FTIR), and X-Ray Diffraction (XRD). Already the scaffolds were characterized by the techniques of Differential Scanning Calorimetry (DSC), Spectroscopy in the Region of Fourier Transform Infrared (FTIR), and X-Ray Diffraction (XRD), scanning electron microscopy (SEM), swelling degree, Essay mechanical (compression) and in Vitro testing of Biodegradation. In the results, we conclude that chitosan's of different molecular weights and temperatures result in scaffolds with different morphological properties
SOUSA, W. J. B.; FOOK, M. V. L.; CARDOSO, M. J. B.; ALMEIDA, K. V.; FIDELES, T.. CYTOTOXICITY EVALUATION OF HITOSAN/APATITEA/ITAMIN E HYBRID FILMS. In: 9th World Biomaterials Congress, 2012, Chengdu. Innovative Biomaterials and Crossing Frontiers in Biomaterials and Regenerative Medicine, 2012.
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FOOK, M. V. L ; SOUSA, W. J. ; ALMEIDA, K. V.; FOOK, S. M. L ; PINTO, M. R. O. ; CAT AO, C. D. S.; FURTADO, G. T. F. S.; SAMPAIO, G. Y. H.; RABELLO, I. P.; AMARAL, J. N. S.; CARDOSO, M. J. B., LEAL, R. C. A., BARBOSA, R. C ; MOURA, G. M. G.; R.R.M.CAVALCANTI, M. E. ; BRAGA, N. L. M.. Manual de Registro e Cadastramento de Materials de Uso em Saude. 1. ed. Brasilia: ABDI, 2011. V. 1. 306p
Figura 1 - Representagao da estrutura tridimensional de urn arcabouco 19
Figura 2 - Utilizagao dos Biomateriais 31 Figura 3 - Representacao estrutural da cadeia polimerica da quitina e da
quitosana 35 Figura 4 - Representacao das variacoes de Quitosana utilizadas no processo
de obtencao dos arcaboucos. A = Quitosana de baixo peso molecular; B = Quitosana de medio peso molecular; C = Quitosana de alto peso molecular.. 43 Figura 5 - Fluxograma do processo de obtencao dos arcaboucos de quitosana. 44 Figura 6 - Quitosana (Quit) de baixo peso molecular congelamento (Cong) em (A) -60° C e (D) - 150° C; Quit de medio peso molecular Cong, em (B) -60° C e (E) -150° C; Quit de alto peso molecular Cong em (C) -60° C e (F) -150° C....45
Figura 7 - Representacao do DSC para a materia-prima 51 Figura 8 - Representacao grafica do FTIR das amostras de quitosana 53
Figura 9 - Representacao FTIR de uma amostra de quitosana 53 Figura 10 - Representacao do FTIR da pastilha de quitosana com KBr, e da
linha de base 54 Figura 11 - Representacao dos DRX das tres variagoes de quitosana (Quit). A
= DRX da Quit de baixo peso molecular; B= DRX da Quit de medio peso
molecular e C= DRX da Quit de alto peso molecular 57 Figura 12 - Representacao grafica do DSC dos arcabougos A; B e C a -60° C.
60 Figura 13 - Representagao grafica do DSC dos arcabougos A; B e C a -150° C.
60 Figura 14 - Representacao grafica do FTIR dos arcabougos A; B e C a -60° C.
61 Figura 15 - Representagao grafica do FTIR dos arcabougos A; B e C a -150° C.
61 Figura 16 - Representacao grafica do DRX dos arcabougos A; B e C a -60° C.
63 Figura 18 - Imagem das areas superficiais e transversais dos arcabougos de
quitosana A; sob congelamento de -60° C 64 Figura 19 - Imagem das areas superficiais e transversais dos arcabougos de
quitosana B; sob congelamento de - 60° C 65 Figura 20 - Imagem das areas superficiais e transversais dos arcabougos de
quitosana C; sob congelamento de -60° C 66 Figura 21 - Imagem das areas superficiais e transversais dos arcabougos de
quitosana A; sob congelamento de -150° C 66 Figura 22 - Imagem das areas superficiais e transversais dos arcabougos de
quitosana B; sob congelamento de -150° C 67 Figura 23 - Imagem das areas superficiais e transversais dos arcabougos de
quitosana C; sob congelamento de -150° C 68 Figura 24 - Grau de Intumescimento para arcabougo de baixo, medio e alto
peso molecular, tratadas a -60° C e -150° C 69 Figura 25 - Ensaio de Biodegradagao In Vitro para arcabougo de baixo, medio e
alto peso molecular, tratadas a -60°C e -150°C 70 Figura 26 - Ensaio de Biodegradagao In Vitro para arcabougo de baixo, medio e
alto peso molecular, tratadas a -60° C e -150° C 70 Figura 27 - Curva Tensao X deformagao para os arcabougos A; B e C a -60° C.
72 Figura 28 - Curva Tensao X deformagao para os arcabougos A; B e C a -150°
Tabela 1 - Caracteristicas dos Biomateriais 30 Tabela 2 - Propriedades X Caracteristica Estrutural da quitosana 38
Tabela 3 - Reagentes utilizados 40 Tabela 4 - Materials utilizados 40 Tabela 5 - Valores das variagoes dos niveis energeticos endotermicos e
exotermicos para cada amostra de quitosana 52 Tabela 6 - Percentual de desacetilagao das quitosanas A; B e C 55
Tabela 7 - Numero de meros de acordo com o peso molecular das quitosanas. 56 Tabela 8 - Intensidades nas regioes IC e IA nas amostras de quitosana 58 Tabela 9 - Percentual de indice de cristalinidade relative A = %ICR do po da quitosana (Quit) de baixo peso molecular (Molec); B = %ICR da Quit de medio
peso Molec e C= %ICR da Quit de alto peso Molec 58 Tabela 10 - Representagao do modulo de compressao em relagao ao peso
molecular e ao tamanho medio dos poros dos arcabougos na temperatura de
-60° C 73 Tabela 11 - Representagao do modulo de compressao em relagao ao peso
molecular e ao tamanho medio dos poros dos arcabougos na temperatura de
1 INTRODUgAO 16 2 OBJETIVO 18 2.1 OBJETIVO GERAL 18 2.2 OBJETIVOS ESPECJFICOS 18 3 R E V i S A O DA LITERATURA 19 3.1 ARCABOUQO 19 3.2 MATRIZ EXTRACELULAR 21
3.3 MORFOLOGIA E POROSIDADE EM ARCABOUgOS POLIMERICOS.. 22
3.4 BIODEGRADAgAO EM ARCABOUgOS POLIMERICOS 24
3.4.1 Fatores que influenciam a degradacao 24
3.4.1.1 Localizagao do Implante 24
3.4.1.2 Cristalinidade 25 3.5 APLICAgOES DOS ARCABOUgOS 25
3.5.1 Liberagao de Farmaco 25 3.5.2 Regeneracao Tecidual 26 3.5.3 Regeneragao O s s e a 26 3.6 BIOMATERIAIS 27 3.6.1 O efeito dos biomateriais no organismo 31
3.7 BIOPOLlMEROS 32
3.8 QUITINA 33 3.9 QUITOSANA 36 3.9.1 Grau de Desacetilagao (GD) da Quitosana 37
3.9.2 Biodegradagao da Quitosana 39 4 MATERIAIS E METODOS 40 4.1 LOCAIS DA PESQUISA 40
4.2 MATERIAIS 40 4.3 METODOS 41 4.3.1 Preparagao dos reagentes 41
4.3.1.2 Solucao de Hidroxido de Sodio com concentracao a 1M 41 4.3.1.3 Pastilha de quitosana com Brometo de potassio (KBr) 41
4.3.1.4 Tampao Fosfato Salino (PBS) 42
4.3.1.5 Lisozima 42 4.3.2 Preparagao da solucao de quitosana a 2% 42
4.3.3 Preparacao dos arcabougos 43
4.4 CARACTERIZAQAO 45 4.4.1 Caracterizagao da materia prima (Quitosana) 46
4.4.1.1 Calorimetria Exploratoria Diferencial (DSC) 46 4.4.1.2 Espectroscopia na Regiao do Infravermelho com Transformada de
Fourier (FTIR) 46 4.4.1.3 Difragao de Raios X (DRX) 46
4.4.2 Caracterizagao dos arcabougos 47 4.4.2.1 Calorimetria Exploratoria Diferencial (DSC) 47
4.4.2.2 Espectroscopia na Regiao do Infravermelho com Transformada de
Fourier (FTIR) 47 4.4.2.3 Difragao de Raios-X (DRX) 47
4.4.2.4 Microscopia Eletronica de Varredura (MEV) 48
4.4.2.5 Grau de Intumescimento 48
4.4.2.6 Ensaio mecanico 48 4.4.2.7 Ensaio de Biodegradagao In Vitro 49
5 R E S U L T A D O S E D I S C U S S A O 50 5.1 RESULTADOS REFERENTES A MATERIA-PRIMA 50
5.1.1 Calorimetria Exploratoria Diferencial (DSC) 50 5.1.2 Espectroscopia na Regiao do Infravermelho com Transformada de
Fourier (FTIR) 52 5.1.2.1 Representagao dos Grupos Funcionais da Quitosana 52
5.1.2.2 Determinagao do Grau de Desacetilagao (GD) 53
5.1.3 Difragao de Raios X (DRX) 56
5.1.3.1 Indice de Cristalinidade Relativa (ICR) 57
5.2 RESULTADOS REFERENTES AOS ARCABOUQOS 59
Fourier (FTIR) 60 5.2.3 Difragao de Raios X (DRX) 62
5.2.4 Microscopia Eletrdnica de Varredura (MEV) 63
5.2.5 Grau de Intumescimento (Gl) 68 5.2.6 Ensaio de Biodegradagao In Vitro 69
5.2.7 Ensaio Mecanico 71 6 C O N C L U S A O 74
1 INTRODUQAO
As relacoes estabelecidas entre propriedade estrutura e processamento na formacao de urn material constituem as bases da pesquisa da Ciencia e Engenharia de Materials, que nas ultimas decadas tern encontrado intensa sinergia com as Ciencias Medicas na perspectiva do desenvolvimento de produtos que possam ser utilizados no meio biologico com propriedades fundamentals, ou seja, biocompatibilidade. Desta relagao surge dentre outras areas de pesquisa a Engenharia de Tecidos.
A producao de arcabougos encontrou aplicagoes em defeitos corporais com ou sem presenga de celulas e/ou moleculas biologicas sinalizadoras para indugao da regeneragao in vivo; na criagao de sistemas de liberagao controlada de farmacos permitindo que moleculas biologicas auxiliem a sinalizagao celular e a eficacia terapeutica in vivo; na utilizagao da adesao e proliferagao celular, combinados com cultura de celulas para crescimento eficiente do tecido maturado e posterior reimplante; alem de servirem como barreira fisica na tentativa de manter as celulas funcionais transplantadas isoladas do ataque imunologico e servir de espago para indugao da regeneragao (BARBANTI et al., 2005; TABATA, 2005; SENEDESE, 2011).
Os biomateriais tern se destacado como ferramenta importante na produgao de arcabougos em decorrencia das propriedades de biocompatibilidade, biodegradabilidade, propriedade de adesao e proliferagao celular. Os biomateriais principalmente os da classe polimerica como e o caso da quitosana sao materiais susceptiveis a formagao de arcabougos devido a sua semelhanga com a estrutura dos tecidos que se pretende substituir alem da capacidade de moldagem em diversas formas e sua habilidade para formar estruturas porosas (SHI, 2006; WILLIAMS, 2008).
O fator solubilidade da quitosana esta relacionado com a quantidade de grupos amino em sua cadeia polimerica, este grupo juntamente com a quantidade de outros grupos reativos, como e o caso das hidroxilas, favorecem mudangas estruturais. Alem do mais o grau de desacetilagao e a cristalinidade da quitosana sao inversamente proporcionais a sua velocidade de degradagao, fatores estes determinados pela massa molecular (PONCIANO, 2010).
Diante do exposto, constata-se que outras variaveis na formacao de arcaboucos podem oferecer novas aplicacoes na area dos biomaterias. Assim, neste trabalho avaliou-se a biodegradagao de arcabougos de quitosana, a partir da influencia da massa molar e do processo de congelamento com o proposito de promover uma melhor adequagao na utilizagao como dispositivo medico.
2 O B J E T I V O
2.1 OBJETIVO GERAL
Desenvolver arcaboucos de quitosana e avaliar a influencia da massa molar e do processo de congelamento na biodegradagao destes.
2.2 OBJETIVOS ESPECiFICOS
• Desenvolver arcabougos de quitosana.
• Realizar estudos de biodegradagao in vitro dos arcaboucos.
• Avaliar a influencia da variagao de massa molar da quitosana nos arcabougos.
• Avaliar a influencia do congelamento nos arcabougos.
• Correlacionar as propriedades morfologicas e quimicas dos arcabougos investigando a relagao destas propriedades com a biodegradabilidade e tamanho de poros.
3 R E V I S A O DA L I T E R A T U R A
3.1 ARCABOUQO
Arcabougos (Figura 1) sao suportes biologicos ou sinteticos que apresentam estrutura tridimensional porosa, propriedades bioativas e biodegradaveis, que servem de molde para a formagao de urn novo tecido, guiar a migragao, diferenciagao e proliferagao celular (LIU et al., 2004; VUNJAK-NOVAKOVIC et al., 2006; TAYLOR et al., 2009).
Figura 1 - Representagao da estrutura tridimensional de um arcabouco
Fonte: Jong, (2005)
Os arcabougos sinteticos sao reproduzidos de forma a se assemelharem com os produzidos de forma natural pelo organismo atraves da organizagao das celulas nos tecidos, as chamadas matrizes extracelulares. O projeto de um arcabougo objetiva mimetizar o funcionamento da Matriz Extracelular (MEC) atraves de sua estrutura coordenada no tempo e organizada no espago, atraves da codificagao (indugao ou inibigao) dos sinais biologicos dentro do arcabougo a fim de controlar a adesao, migragao, proliferagao e diferenciagao celular (CAUSA et al., 2007).
Uma etapa importante no desenvolvimento de arcabougos consiste em entender o papel das propriedades ffsico-quimicas e de superffcie na adesao das proteinas ao material, uma vez que a interagao material-proteinas definira o tipo de interagao material-celula ou tecido possfvel (SANTOS et al.,2008).
A estrutura do arcabougo deve possuir cinco fatores considerados desejaveis: superffcie que permita adesao e crescimento celular; nenhum componente ou subproduto de sua degradagao deve provocar reagoes inflamatorias ou toxicas; apresentar estrutura tridimensional; porosidade que proporcione elevada area superficial para interagao celula-arcabougo e ter espago para a regeneragao da matriz extracelular (TAMAI et al., 2002).
O arcabougo deve tambem apresentar-se como sendo altamente poroso com uma rede de poros interconectados para facilitar o crescimento celular/ tecidual e transporte de nutrientes e residuos metabolicos; ser biodegradavel ou bioabsorvivel com uma controlada taxa de degradagao e reabsorgao, que pode ser determinada com base na taxa de formagao do novo tecido e o periodo normal para remodelagem do tecido no local do implante; possuir uma composigao quimica adequada para adesao, proliferagao e diferenciagao celular, possuir propriedades mecanicas semelhantes aos tecidos locais onde sera realizado o implante, uma vez que proporciona um suporte temporario a aplicagao de cargas in vivo durante o processo de regeneragao e ser processado facilmente com variedades de formas e tamanhos (BUCKLEY et al., 2004; SPECTOR, 2006).
A integridade mecanica de um arcabougo e de suma importancia quando este e aplicado na engenharia de tecido, pois atua como suporte fisico temporario no sitio de implantagao, resistindo as tensoes externas e internas na regiao. Dessa forma as propriedades mecanicas do arcabougo devem ser similares ao tecido neoformado e no final do processo de regeneragao, toda carga suportada pelo arcabougo sera transferida para o novo tecido, que ocupara o local do arcabougo degradado (CHEUNG, 2007).
A adesao celular e fundamental para a construgao de celulas em tecidos e para a manutengao de sua integridade. A fim de formar uma estrutura tridimensional, as celulas devem aderir, nao so umas as outras, mas tambem a superffcie da estrutura de suporte subjacente. A semelhanga fisico quimica nao
e de fato necessaria para que ocorra adesao, mas e desejavel para a interagao eficaz no local de implantacao (SENEDESE, 2011).
Diante do exposto, a substituigao de um mecanismo sintetico tridimensional que atenda as mesmas funcoes desempenhadas pela MEC se faz possivel para o caso de ocorrencia de danos, o que remetera a alteracoes na arquitetura tecidual, interferindo a migragao celular e a polaridade correta a remontagem das estruturas de multicamadas.
3.2 MATRIZ EXTRACELULAR
A matriz extracelular (MEC) e definida como uma organizagao supramolecular de diversas proteinas estruturais e polissacarideos nos tecidos conjuntivos, que preenchem os espagos extracelulares e sao responsaveis por modularem a estrutura, fisiologia e biomecanica dos tecidos. Compreendida por proteinas estruturais fibrosas: colageno e elastinas, que promovem resistencia a tensao e retragao; glicoproteinas adesivas que conectam os elementos da matriz uns aos outros e as celulas e os proteoglicanos e acido hialuronico que fornecem elasticidade e lubrificacao (SCHUPPAN et al., 1994).
Os componentes da MEC sao essenciais, pois fornecem a rede para migragao celular, mantem a correta polaridade celular para o rearranjo de estruturas estratificadas e participam da formacao de novos vasos sanguineos. E as celulas na MEC produzem fatores de crescimento, citocinas e quimiocinas que sao importantes para regeneragao e reparo (ROBBINS; COTRAN, 2010).
Dentre as proteinas e polissacarideos presentes na MEC, merecem destaque: Colageno, uma familia de proteinas fibrosas encontradas em todos os animais multicelular constituindo 25% da pele e dos ossos e particularmente presente em todo tecido conjuntivo. Sua principal caracteristica e a estrutura longa e rfgida de sua fita tripla helicoidal e sua constituigao rica em prolina e glicina. O colageno do tipo I e o mais comum e o principal em pele e ossos, juntamente com os do tipo II, III, V e XI constituem os colagenos fibrilares que apresentam estrutura semelhante a uma corda com pouca ou nenhuma interrupgao. Os colagenos do tipo IX e XII sao denominados de colagenos associados a fibrilas, pois sao responsaveis pela ligagao das fibrilas umas as
outras e a outros componentes na matriz extracelular. Ja o colageno do tipo IV e o colageno formador de rede constituindo a maior parte da membrana basal. (HARRISON, 2007).
A elastina, principal componente de uma rede de fibras elasticas na matriz celular fornece resistencia aos tecidos e permite que eles retornem a forma original apos uma distensao temporaria. E a protefna de matriz extracelular predominante nas arterias (VEISEH et al.,2008).
Os glicosaminoglicanos conhecidos como GAGs sao cadeias polissacaridicas nao-ramificadas compostas de unidades dissacaridicas repetidas, (A/-acetilglicosamina ou A/-acetilgalactosamina).Exceto o acido hialuronico que possui a fungao de resistencia e forgas de compressao nos tecidos e nas articulacoes, os GAGs estao ligados a uma proteina central, formando moleculas chamadas proteoglicanos que possuem como fungao organizar a MEC, regulam a estrutura e permeabilidade do tecido conjuntivo. (ALBERTS et al., 2010).
O acido hialuronico e o maior das GAGs e o unico nao sulfatado. E constituido por monomeros de acido D-glicuronico unidos a N-acetil-D-glicosamina por ligacoes glicosidicas alternadas ((3-1,3 e 3-1,4). Possui como fungao a resistencia a forca de compressao nos tecidos e articulacoes, alem de preenchimento de espago durante o desenvolvimento embrionario. Em invertebrados, plantas e fungos, outros tipos de polissacarideos dominam a matriz extracelular como e o caso da celulose (poliglicose) e da quitina (poli-A/-acetilglicosamina) (HARRISON, 2007; VEISEH et al.,2008; ALBERTS et al., 2010).
3.3 MORFOLOGIA E POROSIDADE EM ARCABOUQOS POLIMERICOS
A morfologia dos arcabougos que inclui tamanho de poros, porosidade e interconectividade sao fatores essenciais para a atividade biologica de biomateriais, uma vez que eles permitem a migragao, a adesao e a proliferagao celular, bem como a vascularizagao.
Os principais fatores que controlam a morfologia sao a composigao das cadeias polimericas e a densidade de reticulagao e/ ou emaranhamento da
rede. O tamanho dos poros dos arcabougos pode ser modulado pela temperatura de congelamento e sua orientagao pela geometria dos gradientes termicos durante o congelamento (WU et al.2004).
As principals pesquisas nesta area tern sido realizadas pelo grupo de pesquisa liderado por Mikos et al. (1993) da Universidade de Rice, EUA. Com diversos trabalhos e patentes relacionadas a metodologia de preparo de suportes bioreabsorviveis e suas aplicagoes. O autor propos, no infcio da decada de 90, que a taxa de penetragao e crescimento celular em suportes porosos esta diretamente relacionada com o tamanho e distribuigao dos poros no material.
A presenga da porosidade nos materials aumenta o contato com o tecido receptor, alem de favorecer a invasao tissular para dentro do implante. Esta migragao celular a partir da superffcie de contato aumenta a adesividade do implante, melhora a vascularizagao no local e minimiza os riscos de infecgao ou colonizagao bacteriana. A resistencia de um material pode chegar a diminuir com a presenga destes poros, porem, promove formacao de interface de adesao chamada bioatividade, onde as propriedades mecanicas desta interface estabilizam o implante no local receptor, formando um complexo integrado entre implante e tecido hospedeiro. (WU et al.2004).
Uma matriz preparada para utilizagao como arcabougos deve ser suficientemente porosa para promover a difusao de nutrientes e a eliminagao de residuos; ter interconectividade, para favorecer a difusao celular, e possibilitar que elas expressem suas atividades metabolicas. A literatura tern apresentado trabalhos com resultados positivos para regeneragao ossea, com tamanhos de poros variando entre 100 e 400 um. No caso de arcabougos com finalidade de liberagao de farmacos, poros variando entre 150 e 200 um mostraram resultados positivos. (WHANG et al., 1995; OLIVER et al., 2004; KIM et al., 2004 YONEDA et al., 2005).
Com a finalidade de penetragao celular em camadas profundas de implantes, Oliver et al. (2004) sugere que, o tamanho otimo de poros interconectados deve variar entre 150 e 500 um com interconectividade maior que 40 um.
A porosidade dos arcaboucos influencia o desenvolvimento das celulas e, em combinacao com as condicoes de cultura, a funcionalidade dos tecidos formados in vitro. Uma porosidade adequada e uma elevada superffcie de contato promovem a distribuicao uniforme de celulas, o crescimento dos tecidos, e a interconexao entre os poros de modo a ocorrer a difusao de nutrientes e resfduos (GOMES et al., 2003; KARAGEORGIOU et al., 2005; NWE et al., 2009; SENEDESE.2011).
3.4 BIODEGRADAQAO EM ARCABOUQOS POLIMERICOS
A taxa de biodegradacao em um arcabougo deve ser similar com a taxa de regeneragao dos novos tecidos com o proposito de nao comprometer a integridade do novo tecido. Se a taxa de desintegragao do arcabouco e alta, o tecido recem-formado sera subitamente exposto a maiores forgas do que as que ele pode tolerar, sendo prejudicado. Por outro lado, se a taxa de degradagao e extremamente lenta, pode resultar em uma tensao compressiva sobre o tecido em crescimento, formando uma barreira entre ele e as forgas que se destinam a fortalece-lo durante o seu desenvolvimento (BURG et al.; KARANDE et al. 2008).
3.4.1 Fatores que influenciam a degradagao
Dentre os fatores que poderao influenciar a taxa de degradagao dos polfmeros bioreabsorvfveis pode-se destacar:
3.4.1.1 Localizagao do Implante
A velocidade de degradagao e influenciada pela localizagao do implante de acordo com sua solicitagao mecanica e area de vascularizagao. Locais com alta vascularizagao ou grande solicitagao mecanica sao descritos como aceleradores da degradagao (HOLLINGER et al.,1986).
3.4.1.2 Cristalinidade
A influencia da cristalinidade na velocidade de degradagao dos polimeros bioreabsorviveis foi relatada por Fischer et al. (1973). A degradacao de polimeros parcialmente cristalinos ocorre, fundamentalmente, em duas etapas:
Devido a disposigao espacial das cadeias polimericas, o efeito da cristalinidade influi na taxa de absorcao de agua pelo polimero. O primeiro estagio de degradacao consiste na penetragao e difusao das moleculas de agua nas regioes amorfas do material, e subsequente cisao hidrolftica das ligacoes esteres das cadeias polimericas. O segundo estagio se da quando parte consideravel da regiao amorfa esta degradada, e prossegue no centra dos domfnios cristalinos. Dessa forma, para polimeros parcialmente cristalinos, a literatura descreve um aumento percentual da porgao cristalina devido a absorcao dos fragmentos pela rede cristalina e pela formagao de novos cristais, atraves do rearranjo das cadeias de menor massa molar originadas no processo de degradagao (FISHER et al., 1973; LI et al.; DUEK et al., 1999).
Adequar o tempo de degradacao do polfmero a regeneragao do tecido ou a liberagao controlada e desejada, uma vez que o metabolismo humano e muito variavel e a correlagao das propriedades fisico-quimicas com a taxa de degradagao e pouco conhecida.
3.5 APLICAgOES DOS ARCABOUQOS
Arcabougos como ja foi mencionado eram utilizados na substituigao da matriz extracelular. Atualmente com os avangos tecnologicos encontramos arcabougos em proteses de quadril acetabular, implantes dentarios, discos invertebrais, hernias ventrais. Mas as principais atividades dos arcabougos tern se concentrado na regeneragao tecidual, regeneragao ossea e liberagao controlada de farmaco.
3.5.1 Liberagao de Farmaco
O termo Liberagao de Farmaco e a Tecnologia de Liberagao Controlada de Farmaco surgiram durante os anos 80 e logo se tomou uma tecnologia
comercial. A realizagao de uma liberacao previsivel e reprodutivel de um agente em um ambiente especifico durante um tempo prolongado tern um merito significativo para liberacao controlada e proporciona um ambiente terapeutico desejavel com resposta satisfatoria, efeitos secundarios minimizados e eficacia prolongada. (HEJAZI et al., 2003)
Sistemas de liberacao controlada (SLC ou drug delivery systems - DDS) tern como principio ativo de interesse a inclusao de um material (carreador), ou a ele ligado, e o conjunto principio-ativo/carreador e adicionado a um veiculo. Alem de ser de fundamental importancia ampliar o entendimento da interagao entre os materiais carreadores e as substancias ativas, o ajuste de degradabilidade in vivo e o desenvolvimento de processos de fabricacao reprodutiveis sao fatores essenciais no SLC e podem ser obtidos atraves do uso de arcaboucos (ILLUM, 1998).
3.5.2 Regeneragao Tecidual
Para regeneragao tecidual o papel dos arcabougos funciona como substrato para a fixagao, proliferagao e diferenciagao celular. Alem disto, para que ocorra a morfogenese tecidual, os componentes celulares devem estar presentes e serem capazes de originar um novo tecido seja por fonte exogena ou recrutados no sitio do implante. A utilizagao de um material apropriado para regeneragao tecidual deve ser compatfvel com o ambiente natural dos tecidos apresentando propriedades mecanicas condizentes com o tecido em reconstrugao, induzir respostas celulares mais rapidas ou ainda possufrem intrinsecamente propriedades diretamente relacionadas com a remodelagem dos tecidos (PARTRIDGE et al., 2002).
3.5.3 Regeneragao O s s e a
No processo de regeneragao ossea, o preenchimento por arcaboucos possibilitam que a formacao ossea ocorra por dois mecanismos distintos, a osteocondugao onde o arcabougo funciona como um agente condutor passivo que vai se degradando gradativamente e sendo substituido por osso novo que
cresce a partir das margens da falha e pela osteoinducao onde ocorre recaitamento de celulas imaturas, que sao atrafdas para o sitio do implante por agentes bioativos, onde sofrerao diferenciagao em celulas osteoprogenitoras e posteriormente osteoblasts, que sao celulas encarregadas da produgao de matriz ossea que dara origem ao tecido osseo maduro (ELLINGSEN et.ai, 2003) .
Para o desenvolvimento de arcabougos os principais materiais estudados sao a base de Polimeros naturais, tais como: colageno, glicosaminoglicano, amido, quitina e quitosana e polimeros sinteticos tais como: acido polilactico (PLA), acido poliglicolico (PGA) e seus copolimeros (PLGA), e Ceramicas, tais como hidroxiapatita (HA) e (3-fosfato tricalcio ((3 - TCP) (BUCKLEY et al., 2004) .
3.6 BIOMATERIAIS
Compreendem os Biomateriais, qualquer material usado de modo a funcionar em intimo contato com o tecido vivo ou substituir partes e fungoes do corpo humano de maneira segura e fisiologicamente aceitavel, tendo como objetivo principal melhorar a saude humana, restaurando a fungao dos tecidos vivos naturais e orgaos do corpo. Para isto, torna-se essencial a compreensao das relagoes entre as propriedades, fungoes e estruturas dos materiais biologicos (PARK et al, 2007).
As utilizagoes dos biomaterias sao relatadas desde a epoca antes de Cristo. Herodoto de Halicarnassus, que viveu por volta de cinco seculos a . C , registrou a arte egfpcia de proteses bucais, confeccionadas em chumbo, ouro, marfim ou madeira, nos quais se encaixavam os dentes de animais e dentes humanos, amarrados com fios aos elementos dentais remanescentes. Ja nos registros dos povos antigos e possivel encontrar relatos a cerca da preocupagao com a reconstrugao estetica e funcional dos orgaos e tecidos mutilados como, por exemplo, no museu de Arlington na Inglaterra onde e possfvel encontrar exposto em uma mumia um antebrago artificial, e no museu
de Manchester, esculturas sinteticas de pes (DISCOVERING ARCHAEOLOGY, 1999; CASTRO et al., 2000).
Os biomaterias passaram por uma ordem cronologica de tempo, onde suas caracteristicas foram aperfeicoadas e novas descobertas a partir da necessidade do homem surgiram. A chamada primeira geracao dos Biomateriais e caracterizada pela fase dos implantes osseos, tendo em 1961 a primeira articulagao artificial de anca desenvolvida. Eram materiais tidos como bioinertes, ou seja, nao interagem ou interagem minimamente com o tecido. A segunda geracao teve initio pelos anos 70 e marca a utilizacao de materiais bioativos e era voltada para a estrutura do material. Ja a chamada terceira geracao estende-se ate a atualidade. Inclui os materiais capazes de estimular respostas celulares especificas no nfvel molecular e preocupa-se nao so com a biocompatibilidade, mas tambem com a biofuncionalidade do material. Nesta geracao encontra-se a Biomimetica e a Engenharia de Tecidos. (OREFICE et al., 2006).
Os Biomateriais apresentam classificacao de acordo com a composigao quimica em materiais sinteticos metalicos, ceramicos, polimericos, compositos e naturais como: colageno, elastina, quitina e de acordo com o comportamento fisiologico em bioinerte, biotoleravel, bioativo, biorreativo e bioabsorvivel. Portanto, os biomateriais sao substantias de origem natural, sintetica ou combinacao delas, produzidas atraves da interagao fisica ou por reacoes quimicas, que atuam nos sistemas biologicos de forma parcial ou total (WILLIAMS, 1999).
Segundo Park e Lakes, 1992 de acordo com a composicao quimica os biomateriais podem ser de origem:
• Metalica: cujos materiais ou combinacao de elementos metalicos, apresentam boa condutividade eletrica, termica e excelentes propriedades mecanicas, caracteristicas que fazem destes serem utilizados como biomateriais para substituigao de tecidos duros, proteses de quadril e joelhos, como dispositivos de fixacao da coluna vertebral, alem de:
parafusos, placas osseas e como parte em implantes dentarios.
• Ceramica: que devido a sua inercia em relagao aos fluidos corporais, elevada resistencia a compressao, baixo coeficiente de atrito, alta resistencia ao desgaste, boa isolagao eletrica e propriedades dieletricas as
ceramicas sao muito utilizada como biomaterial em coroas dentarias e reforgo de componentes para implante.
• Polimerica: os materiais polimericos tern sido amplamente utilizados em fontes medicas devido a facilidade de fabricacao na variedade de formas, processabilidade, custo favoravel e disponibilidade aliadas a propriedades fisicas e mecanicas desejadas. Os biomaterias polimericos estao presentes em dispositivos de dialise, cateteres, conectores e canulas, seringas descartaveis, enxertos vasculares artificials e malhas artificiais.
• Compositos, que possuem como vantagem em comparacao com os materiais homogeneos o controle consideravel sobre as propriedades dos materiais. Podem ser utilizados como: compositos de enchimento dentario, cimento osseo reforcado com metil metacrilato e polietileno de ultra alto peso molecular e implantes ortopedicos com superficies porosas (PARK, 1992).
Em relagao ao comportamento fisiologico, os biomateriais, podem ser classificados de acordo com Hench e Wilson (1994), como:
S Bioinertes: sao materiais que apresentam resposta interfacial minima nao
resultando em rejeicao por parte do tecido hospedeiro, mas com uma quase que inexistente formacao de envoltorio fibroso.
s Biotoleraveis: materiais apenas tolerados pelo organismo, sendo isolado dos tecidos adjacentes pela formacao minima de capsula fibrosa, induzida pela liberacao de compostos quimicos, ions, produtos de corrosao, por parte do implante, sem rejeicao e isolada do tecido hospedeiro.
S Bioativos: materiais que promovem ligagoes de natureza qufmica entre o
material e o tecido osseo. Esta similaridade permite a osteocondugao por meio do recobrimento por celulas osseas.
S Biorreativos: materiais que formam na superffcie uma camada fina e
aderente de oxido agindo, portanto como uma interface.
S Bioreabsorviveis: materiais que sao degradados, solubilizados ou
fagocitados apos determinado perfodo de tempo em contato com os tecidos sem que haja necessidade de intervengao cirurgica para retirada do material implantado (HENCH, et al., 1994).
Existem varios fatores importantes a serem considerados na selecao de um material para aplicacao como biomaterial, ilustrado na Tabela 1 (RAMAKRISHNA et al., 2001).
Tabela 1 - Caracteristicas dos Biomateriais
Fatores Descricao Caracteristicas qu (micas/ biologicas Caracteristicas fisicas Caracteristicas mecanicas/ estruturais 1° Nivel de propriedade dos materiais Composicao quimica Densidade
• M6dulo Elastico Modulo de Cisalhamento • Coeficiente de Poison • Resistencia ao Escoamento • Resistencia a Tracao • Compressao • Forca 2° Nivel de propriedade dos materiais Adesao Topologia da Superffcie Textura/ Rugosidade • Dureza • Modulo de Flexao • Resistencia a Flexao Requisitos funcionais especificos (com base na aplicacao) Biofuncional Bioinerte Bioativo Bioestabilidade Biodegradacao Comportamento Forma e geometria Coeficiente de expansao termica Condutividade eletrica Estetica/cor hdice de Refracao Opacidade ou Translucidez Rigidez • Tenacidade a Fratura • Resistencia a Fadiga • Resistencia a Fluencia • Resistencia ao Atrito e ao Desgaste • Aderencia • Resistencia ao Impacto • Prova ao stress • Resistencia a Abrasao Processamento e Fabricacao
Qualidade, reprodutibilidade, esterilizacao, embalagem secundaria, processabilidade.
Caracteristica de implementacao: orgao, tecido, especie, idade, sexo, raca, condicao de
saude, atividade, resposta sistemica.
Periodo de Medicina / procedimento cirurgico, de aplicagao / utilizacao. Custo
A ciencia dos Biomateriais e, portanto, o estudo fisico e biologico dos materiais e das suas interacoes com o organismo vivo. Com o estudo e o desenvolvimento dos Biomateriais, e possivel verificar o envolvimento de profissionais das mais diversas areas, sendo assim esta, considerada uma ciencia interdisciplinar, com expansao na utilizacao dos avancos na medicina e em tecnicas cirurgicas resultado da interacao de diversos profissionais como medicos, engenheiros, fisioterapeutas, biologos, entre outros. Consequentemente, o intenso desenvolvimento tern direcionado as pesquisas para a sintese, otimizacao, caracterizacao, e as interacoes biologicas entre materiais-hospedeiro dos biomateriais. A Figura 2 ilustra algumas das utilizacoes dos biomateriais.
Lente Intraocular. Lente de Contato e Bandagem de
Cornea
Figura 2 - UtilizacSo dos Biomateriais
Orgaos Artificiais Proteses de Vasos Sanguineos Cateteres. Vasos Sanguineos e Valvula Cardiaca Articuiacao de Joelhos. Quadril e Ligamentos e Tendoes Artificiais Implante Dentario e Cimento Osseo Pinos e Reparos de Defeito Osseo Reparapao de Pele Fonte: Pr6pria
3.6.1 O efeito dos biomateriais no organismo
Grande parte dos Biomateriais ao serem introduzidos no corpo humano produz uma reacao inespecifica de ordem biologica, para tanto, uma definicao
essencial para a compreensao dos objetivos da ciencia dos biomateriais e a de biocompatibilidade (COSTA, 2001).
A biocompatibilidade e urn termo que abrange varios aspectos do material, incluindo desde suas propriedades ffsicas, mecanicas e qufmicas ate seu potential citotoxico, alergenico e mutagenico, nao apresentando efeitos toxicos ou causando injurias na funcao biologica. Trata-se, portanto, da relacao entre urn material e o organismo, de tal forma que ambos nao produzam efeitos indesejaveis (LEMMONS et al. 1986; SCHMALZ, 2002).
3.7 BIOPOLlMEROS
Biopolimeros sao polimeros organicos de origem natural e biologica ou aqueles que sao suscetiveis a digestao por microorganismos ou decomposicao quimica no ambiente. Dentre os biopolimeros encontra-se o colageno, a elastina, o acido hialuronico, a dextrana, a celulose e a quitina. Sendo os polissacarideos os biopolimeros estruturais e de reserva energetica mais importante (JOHNSON et al., 2003; AMARAL et al., 2003).
Os polimeros naturais tern sido utilizados como alternativas aos biomateriais para aplicacoes medicas gracas ao seu baixo custo, resultando da disponibilidade da materia - prima abundantemente, propriedades facilmente alteradas por diferentes metodos fisicos e quimicos tais como capacidade de absorcao de agua, cinetica de degradacao e propriedades mecanicas com especificacoes apropriadas e determinadas aplicacoes (DUMITRI et al.,1996; KAPLAN e t a l . , 1998).
Aos materiais polimericos existe ainda a possibilidade de alterar urn ou outro grupamento quimico pertencente a arquitetura macromolecular das cadeias, para viabilizar, por exemplo, o estabelecimento de alguma interacao especifica entre o biomaterial e o tecido hospedeiro. Alem de serem funcionalmente ativos, ou seja, cumprirem com sucesso suas funcoes dentro do corpo (OREFICE et al., 2006; RATNER et al., 2005; JALILI et al., 2009).
Intrinsicamente os polimeros naturais possuem a capacidade de serem degradados por enzimas, garantindo que a utilizacao destes como implante seja metabolizada por meio de mecanismos fisiologicos. Esta propriedade tern
interesse em aplicacoes na qual se pretende uma funcao especifica por urn curto perfodo de tempo, seguido do qual e esperado que o implante degradasse completamente por processos metabolicos normais (STACY et al.,1989).
Por estas razoes os polimeros de ordem natural como, por exemplo, a quitina e de fato a classe de materiais mais apropriada para serem utilizada no desenvolvimento de materiais biomedicos devido a sua semelhanca estrutural com os componentes dos tecidos vivos uma vez que apresentam mondmeros semelhantes, ou mesmo identicos, aos encontrados nas matrizes organicas dos organismos reduzindo, portanto, a possibilidade de ocorrencia de problemas associados a toxicidade dos materiais, aos seus produtos de degradacao ou a estimulacao das reacoes inflamatorias cronicas (KAPLAN et. al.1998).
3.8 QUITINA
A quitina e o segundo polissacarideo mais abundante na natureza. Os polissacarideos sao macromoleculas com centenas ou ate milhares de unidades de acucares simples unidos por ligacoes glicosidicas p (1-»4),e constituem urn dos grupos de compostos mais abundantes e diversificados na natureza. Podem ser encontrados em plantas, animais e microorganismos (fungos e bacterias), nos quais servem para armazenamento de energia ou como material estrutural (Mc MURRY, 1996; ASPINALL, 1985).
A diversidade estrutural dos polissacarideos esta associada a grande variedade de estruturas primarias possiveis e, adicionalmente, a existencia de estruturas de ordem superior. Assim, as propriedades dos polissacarideos estao fortemente associadas as suas caracteristicas estruturais, tais como constituicao quimica, carga, grau de distribuicao, massa molar e sua distribuicao, a adocao de conformacoes ordenadas e as interacoes entre suas proprias cadeias, com outros polimeros e com especies de baixa massa molar (YALPANI, 1988).
O termo quitina, deriva da palavra grega chiton, e significa urn revestimento protetor para invertebrados (ABRAM; HIGUERA, 2004;
ROBERTS, 1992). A quitina atua como uma substantia estrutural para crustaceos, insetos e algumas especies de fungos, sendo degradada pela enzima quitinase. Na natureza, a quitina e encontrada como urn material esbranquicado, duro e anelastico, com baixissima solubilidade e reatividade quimica e nao imunogenico. Por ser altamente nitrogenada, e utilizada rotineiramente como material quelante em reacoes qulmicas As cascas secas de crustaceos possuem 15-20% de quitina, 25-40% de proteina e 40-55% de carbonato de calcio, alem de pigmentos e lipideos em pequena quantidade (MUZZARELLI, 1973; KURITA et al., 1993).
A quitina e separada de outros componentes da carapaca por urn processo quimico que envolve as etapas de desmineralizagao e desproteinizacao das carapacas com solucoes diluidas de HCI e NaOH, seguida de descoloragao com KMn04 e acido oxalico, por exemplo. A quitina obtida, o biopolimero contendo grupos acetil (NHCOCH3), e desacetilada com solucao concentrada de NaOH, produzindo a quitosana. Assim, o isolamento da quitina envolve normalmente tres operacoes basicas: 1) desproteinizacao, 2) desmineralizagao e 3) despigmentacao (DINESH, et al., 2000; THARANATHAN, 2007).
A quitina e insoluvel em solucao aquosa e em solventes organicos devido a sua alta cristalinidade, em sua estrutura predominam as unidades de 2-acetamido-2-deoxi-Dglicopiranose (ROBERTS, 1992; MATHUR, 1990).
Dependendo da sua origem, a quitina pode existir sob tres formas diferentes, definidas de acordo com a disposicao das cadeias que constituem o polimero. Na a-quitina, a forma mais estavel e mais abundante as cadeias polimericas apresentam-se em disposicao antiparalela, na (3-quitina apresentam-se em disposicao paralela o que resulta em urn material menos densamente empacotado e na y-quitina verifica-se urn misto das duas disposicoes (JAWORSKA et al., 2003).
A quitina apresenta uma estrutura cristalina altamente organizada desta forma, apresenta uma afinidade limitada por solventes organicos devido a forte ligacao hidrogenio intermoleculares e tern baixa reatividade qufmica. Sua solubilidade em alguns solventes esta relacionada com o tipo de materia-prima utilizada para sua obtencao. (GOYCOOLEA et al., 2004)
A quitina foi isolada pela primeira vez em 1811, mas so recebeu este nome em 1823, e pesquisas e estudos envolvendo aplicagoes da quitina e da quitosana so foram intensificados por volta de 1970. Estes polissacarideos sao considerados de elevado potencial para o seculo XXI e acredita-se que num futuro muito proximo muitos materiais atualmente em uso irao perder seu lugar para estes biopolimeros por apresentarem certas vantagens tais como: custo baixo, quantidade abundante na natureza e biodegradabilidade (SANDFORD et al.,1989; MONTEIRO et al., 2000).
A quitina apresenta grande variedade de usos, inclusive para aplicacao em biomateriais devido ao grupamento acetamina bastante similar a ligacao amida presente nas proteinas que constituem o tecido vivo, presente em maior quantidade em sua estrutura tornando a quitina biocompativel, seus oligdmeros sao totalmente absorviveis pelo organismo sendo metabolizados por enzimas humanas e por esta razao e considerado urn material biodegradavel. Entretanto, sua maior aplicacao encontra-se na producao de quitosana, que pode ser utilizada em diversas aplicagoes (DALLAN, 2005; SILVA; SANTOS; LIMA FERREIRA, 2006).
A Figura 3 ilustra a representagao grafica da estrutura polimerica para quitina e quitosana onde: uma percentagem > 50% da estrutura X na cadeia, indica se tratar de uma quitina, e uma percentagem > 50% da estrutura Y na cadeia, indica se tratar de uma quitosana.
Figura 3 - RepresentacSo estrutural da cadeia polimerica da quitina e da quitosana
C H2O H : - -;O H
OH
HO
I
J= dl
3.9 QUITOSANA
A quitosana, poli-R-(1-4)-d-glucosamina e um polissacarideo de cadeia linear, cationica, produzida comercialmente pela desacetilacao da quitina, com a hidrolise dos agrupamentos acetamida (NHCOCH3) para grupamentos amina
(NH2). Embora nao exista uma nomenclatura definitiva que estabelega uma
diferenca entre quitina e quitosana, 0 termo "quitosana" geralmente representa copolimeros de 2-amino-2-desoxi-D-glicose e 2-acetamido-2-desoxi-D-glicose, nos quais 0 grau medio de desacetilacao (GD), que representa a percentagem de grupos N H2 livres, e maior que 60% (VARMA, DESHPANDE; KENNEDY,
2004; NG, CHEUNG; MCKAY,2002; QIN, 1993).
A quitosana, diferentemente da quitina, oferece possibilidades adicionais para modificacoes quimicas, devido a grande quantidade de grupos amino reativos em sua cadeia. Alem disso, a quitosana apresenta reacoes tfpicas de aminas, principalmente N-acilacao e reagao de Schiff. Alem do mais, a molecula da quitosana apresenta tres grupos caracterfsticos, 0 grupo amino e dois grupos hidroxilas nas posicoes C(2), C(3) e C(6) respectivamente. O grupo amino e tipicamente basico por isto e facilmente protonado, melhorando a solubilidade do material. A natureza quimica da quitosana tambem possibilita modifocagoes covalentes e ionicas, as quais permitem fazer adequacoes de suas propriedades mecanicas e biologicas de acordo com a aplicacao. A quitosana pode ser combinada com uma variedade de outros biomateriais como, por exemplo, a parte cationica e responsavel pelas interacoes com glicosaminoglicanos, proteoglicanos e outras moleculas negativamente carregadas e esta propriedade e de grande interesse, visto que um grande numero de citocinas esta ligado as glicosaminaglicanas. (PETER, 1995; SUH et al., 2000; KIM et al., 2008).
A solubilidade da quitosana depende da distribuicao dos grupos amino livres e N-acetila. Sendo normalmente insoluvel em meios neutros e basicos, os grupos amino livres sao protonados e a molecula se torna soluvel Quanto maior a quantidade deste grupo, maior 0 numero de interagoes eletrostatiicas repulsivas entre as cadeias e tambem maior solvatagao em agua. Assim sendo,
ela pode ser moldados em diferentes formas, como pos, filmes, geis, arcaboucos e fibras (SANTOS et al., 2003; SHI et al, 2006; e RINAUDO, 2006)
A alta hidrofilicidade da quitosana devido ao grande numero de grupos hidroxilas e grupos amino presentes em sua cadeia constituem numa classe emergente com aplicacao em varios campos biomedicos, tais como: regeneracao tecidual, particularmente para cartilagem; dispositivo de liberacao controlada de farmacos e sistemas de imobilizacao de celula gel (WANG et al., 2005; LIU et al., 2006).
O grau de desacetilacao, distribuicao de massa molar e conteudo de impurezas da quitosana dependem das fontes naturais de materia-prima e dos metodos de preparacao. A massa molar media da quitina nativa e geralmente maior do que 106Daltons, enquanto a quitosana comercial tern uma massa
molar media na faixa de 1,0 x 105 - 1,2 x 1 06 Daltons (ROBERTS e LI et
al.,1992).
3.9.1 Grau de Desacetilacao (GD) da Quitosana
As aplicacoes e caracterfsticas da quitosana dependem fundamentalmente do grau de desacetilacao e do tamanho da sua cadeia polimerica, influenciando de forma direta as propriedades fisico-quimicas, incluindo a conformacao da molecula de quitosana, a deformacao e a tensao de ruptura e a biodegradabilidade e atividade imunologica (HSU et al., 2004).
Na Figura 4 e possivel ver a relacao entre o GD e outras propriedades da quitosana.
Tabela 2 - Propriedades X Caracteristica Estrutural da quitosana.
PROPRIEDADE CARACTERISTICA ESTRUTURAL* Solubilidade t GD
Cristalinidade 1 GD
Biodegradabilidade 1 GD 4 Peso Molecular Viscosidade t GD
Biocompatibilidade t GD
Mucoadesao t GD f Peso Molecular
Analgesica t GD Antimicrobiana
Antioxidante t GD 4 Peso Molecular Hemostatica t GD
t diretamente proporcional a propriedade ^ inversamente proporcional a propriedade
Fonte: Adaptado de DASH et al., 2011
Um aumento na proliferacao celular e na resistencia mecanica e observado para uma quitosana com maior grau de desacetilacao. Ja a taxa de degradacao in vivo apresenta-se de forma inversamente proporcional ao grau de desacetilagao, podendo, portanto permanecer inalterada apos sua implantagao (Dl MARTINO et al.;2005; THEIN-HAN et al., 2008).
Para o calculo do grau de desacetilacao varios metodos sao propostos como: Titulacao Coloidal, Analise Elementar, Espectroscopia de UV, Cromatografia Gas Liquido e Espectroscopia na Regiao do Infravermelho.
Embora existam outros metodos absolutos o calculo do grau de desacetilagao por FTIR algumas vantagens como: ser relativamente rapido e ser um tipo de instrumentagao encontrado na maioria dos laboratories.
Existem pelo menos tres razoes de bandas de absorgao propostas para determinagao do grau de desacetilacao da quitosana que diferem na banda selecionada para determinagao da concentragao de grupos N-acetil ou na referenda interna.
A razao A1 65 5 / A3450 apresenta certo numero de vantagem em relacao as
demais bandas de absorcao por ser proeminente e relativamente isoladas 0 que e bastante util quando se emprega o metodo de linha base; a intensidade interna referente a banda de 3450 cm"1 nao depende do teor de N-acetilacao
tratando-se portanto de um metodo absolute Alem de se apresentar praticamente constante em uma gama de quitosanas N-acetiladas de modo que esta equacao pode ser uma extensao de outras reacoes de N-acetilagao ou derivados (ROBERTS, 1992).
3.9.2 Biodegradacao da Quitosana
Existem alguns metodos para a degradagao da quitosana, tais como a hidrolise acida, a hidrolise enzimatica, oxidacao pelo peroxido de hidrogenio e radiagao De acordo com Kim; Rajapakse (2005), os processos quimicos tern algumas desvantagens, devido ao baixo rendimento de produgao e um maior
risco de poluigao do ambiente. O custo de produgao de oligossacarfdeos de quitosana por metodos enzimaticos e geralmente mais elevado do que apelos processos oxidativos (TOMMERAAS, VARUM, CHRISTENSEN, SMIDROD, 2001; KIM; RAJAPAKSE, 2005; QIN et al., 2002; EL-SAWY et al., 2010; FENG et al., 2008).
A degradagao de quitosana utilizando peroxido de hidrogenio (H2O2) tern sido extensivamente estudada, pois se tratar de um metodo facil e sem riscos. No entanto, isto ira alterar a estrutura do anel do quitosano especialmente quando glucosidica H2O2 e utilizada em temperaturas elevadas. Por outro lado, a degradagao induzida por irradiagao da quitosana tern recebido atengao consideravel devido as suas vantagens: 0 processo e viavel, realizado a temperatura ambiente e pode ser aplicado em grande escala. No entanto, a fim de se preparar oligossacarfdeos com Mw geralmente menor de 10.000 a dose de irradiagao requerida tern de ser relativamente elevada 50-100 kGy. A velocidade de degradagao da quitosana e inversamente proporcional ao grau de cristalinidade e ao grau de desacetilagao (QIN et al., 2002; CHOI et al., 2002; HIEN, 2004; MAKUUCHI, 2010).
4 MATERIAIS E M E T O D O S
4.1 LOCAIS DA PESQUISA
A pesquisa foi realizada no Laboratorio de Avaliacao e Desenvolvimento de Biomateriais do Nordeste - CERTBIO, localizado na Unidade Academica de Engenharia de Materiais, na Universidade Federal de Campina Grande/ UFCG.
4.2 MATERIAIS
Os reagentes utilizados nesta pesquisa foram do tipo grau analftico e encontram-se relacionados na Tabela 2.
Tabela 3 - Reagentes utilizados.
Item Descricao Procedencia
01 Quitosana Alto peso molecular Sigma Aldrich
02 Quitosana Medio peso molecular Sigma Aldrich
03 Quitosana Baixo peso molecular Sigma Aldrich
04 Acido acetico glacial (C2H4O2) Vetec
05 Hidr6xido de Sodio P.A (NaOH) Biotec
06 Brometo de Potassio Dinamica
07 Phosphate buffered saline Sigma Aldrich
08 Lysozyme from hen egg white Sigma Aldrich
A relagao dos demais materiais utilizados nesta pesquisa encontram-se relacionados na Tabela 3.
Tabela 4 - Materiais utilizados
Item Descricao Procedencia
01 Placas do tipo Petri 20mL InLab
02 B6cker500mL/1000ml_ Iglass
03 Balao volumetrico 1000ml_ Pyrex
04 Almofariz/Pistilo Chiarotti
05 Funil de porcelana/Papel de filtro Chiarotti/Qualy
07 Prensa Hidraulica Marcon
08 Agitador mecanico Nova £tica
09 Bomba a vacuo Hipper Quimica
10 Balancaanalitica Bel Mark
11 Liofilizador Instrumentacao Cientifica
12 Biofreezer American Lab
4.3 METODOS
4.3.1 Preparacao dos reagentes
4.3.1.1 Solucao de Acido Acetico Glacial com concentracao a 1 %
Em um balao volumetrico de 1000 mL, adicionou-se cerca de 700 mL de agua destilada, 10 mL de acido acetico glacial P.A. e o volume final completado com agua destilada ate atingir o traco de afericao. A solucao foi homogeneizada e reservada para posterior utilizacao.
4.3.1.2 Solucao de Hidroxido de Sodio com concentragao a 1M
Em um balao volumetrico de 1000 mL, adicionou-se cerca de 700 mL de agua destilada e 40 g de NaOH. Homogeneizou-se com auxilio de um bastao de vidro. Apos completa solubilizacao, completou-se com agua destilada o volume final ate o traco de aferigao do balao volumetrico.
4.3.1.3 Pastilha de quitosana com Brometo de potassio (KBr)
Macerou-se em almofariz com auxilio de um pistilo de ceramica 0,1 g de KBr e 0,007 g de quitosana (estes valores foram repetidos para cada variacao de quitosana). Apos completa maceracao, houve a prensagem do material, em prensa hidraulica a 5 toneladas resultando em uma pastilha de aproximadamente 0,20 nm de espessura.
4.3.1.4 Tampao Fosfato Salino (PBS)
Em um Becker de 1000 mL dissolveu-se 1 sache de PBS em 1000 mL de agua destilada com auxilio de um agitador magnetico. Foi verificado o pH e a solucao armazenada em refrigerador.
4.3.1.5 Lisozima
Em uma solucao de 1000 mL de PBS dissolveu-se 0,1g de Lysozyme from hen egg white com auxilio de um agitador magnetico. Foi verificado o pH e a solucao armazenada em refrigerador.
4.3.2 Preparacao da solucao de quitosana a 2%
A solubilidade polimerica e um processo lento e que ocorre em duas etapas. Na primeira etapa as moleculas do solvente sao difundidas lentamente para dentro do material polimerico formando um tipo de "gel". No caso das forcas intermoleculares polimero-polimero serem fortes devido a ligagoes cruzadas, cristalinidade ou presenga de ligagoes de hidrogenio essa solubilidade e dificultada. Se a interagao polimero-solvente puder superar as anteriores, a segunda etapa acontece, o gel entao gradualmente se desfaz e forma-se uma solugao (BILLMEYER, 1992).
As solugoes de quitosana de baixo, medio e alto peso molecular (Figura 5) foram igualmente preparadas pela dissolugao de 10 g de quitosana previamente pesada em balanga analitica, dispersas cada uma em um Becker contendo 500 mL de solugao de acido acetico glacial 1 % , em temperatura ambiente e agitagao mecanica a 620 rpm por 24 h para total solubilizagao da quitosana.
Figura 4 - RepresentacSo das variac&es de Quitosana utilizadas no processo de obtengao dos arcaboucos. A = Quitosana de baixo peso molecular; B = Quitosana de medio peso molecular;
C = Quitosana de alto peso molecular.
Fonte: Pr6pria
Apos decorrido o tempo de preparo da solucao, estas foram flltradas em funil de porcelana contendo papel de filtro qualitativo com auxilio de bomba a vacuo para retirada da parte nao soluvel.
4.3.3 Preparacao dos arcaboucos
Apos preparacao das solucoes de quitosana, elas foram acondicionadas em placas tipo Petri volume de 20 mL cada e separadas em dois grupos de congelamento. Congelamento em Biofreezer por 24 h a temperature de -60° C, e congelamento em Biofreezer por 24 h a temperatura de -150° C .
Posteriormente as amostras congeladas foram liofilizadas por um periodo de 72 h. Os arcaboucos foram neutralizados com 20 mL de solucao de hidrbxido de sodio 1 Mol/L por 1 h e novamente congelados e liofilizados. A Figura 6 ilustra o fluxograma com as etapas de fabricacao descrita.
A Figura 7 ilustra os arcabougos preparados apos o processo de liofilizagao e de congelamento a -60C e a -150C para as tres variagdes de quitosana.
Figura 5 - Fluxograma do processo de obtenc3o dos arcaboucos de quitosana Caracterizacoes Solugao 2% q u i t o s a n a A Filtradas P l a c a s tipo Petri Biofreezer 150* C Biofreezer 60* C CH3COOH 1% Solugao 2% q u i t o s a n a B F i l t r a d a s P l a c a s tipo Petri \ CH3COOH 1% V / \ Solucao 2% q u i t o s a n a C / * \ Filtradas 4 r \ P l a c a s tipo Petri \ Biofreezer 6 0 * 0 Biofreezer -150* C
1
Biofreezer 60* C Biofreezer 150* C LiofilizadasNeutral 1 zadas NaOH
Biofreezer/Neutral 1 zadas
Figura 6 - Quitosana (Quit) de baixo peso molecular congelamento (Cong) em (A) -60° C e (D) - 150° C; Quit de medio peso molecular Cong, em (B) -60° C e (E) -150° C; Quit de alto peso
molecular Cong em (C) -60° C e (F) -150° C. Quitosana baixo peso molecular
IA)
-60 4C L0 - 150 ;C Quitosana medio peso molecular - 6 04C -150 aC Fonte: Pr6pria Quitosana alto peso molecular t C ) - 60 *CIF)
- 150 SC 4.4 CARACTERIZAQAOA materia prima (Quitosana) foi caracterizada pelas tecnicas de: Calorimetria Exploratoria Diferencial (DSC), Espectroscopia na Regiao do Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) e Difracao de raios X (DRX).
As seis variedades de arcaboucos foram caracterizados pelas tecnicas de: Calorimetria Exploratoria Diferencial (DSC), Espectroscopia na Regiao do Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR), Difracao de raios X (DRX), Microscopia Eletronica de Varredura (MEV), Grau de Intumescimento (Gl), Ensaio Mecanico, e Ensaio de Biodegradacao In Vitro.
4.4.1 Caracterlzagao da materia prima (Quitosana)
4.4.1.1 Calorimetria Exploratoria Diferencial (DSC)
A analise de Calorimetria Exploratoria Diferencial (DSC) e uma tecnica que permite medir as temperaturas e o fluxo de calor associados com as transigoes dos materiais em fungao da temperatura e do tempo. Foi utilizada na avaliagao da materia prima em razao de aquecimento de 10°C min"1,
registradas de - 10° C ate 400° C sob atmosfera dinamica de nitrogenio para verificagao qualitativa e quantitativa das mudangas fisicas e qufmicas envolvidas nos processos endotermico (absorgao de calor), exotermico (liberagao calor) ou nas mudangas na capacidade calorifica das amostras (MOTHE e AZEVEDO, 2002). Para este procedimento foi utilizado um aparelho DSCQ20 (TA Instruments, EUA).
4.4.1.2 Espectroscopia na Regiao do Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR)
O FTIR permite determinar moleculas organicas presente nos materiais atraves das vibragoes caracterfsticas destes grupos (bandas), correspondentes a niveis de energia da molecula. Onde parametros como grupos terminals, ramificagoes de cadeias, configuragao e conformagao, isomerismo geometrico e esterico podem ser investigados.
O aparelho Spectrum 400 da Perkin Elmer foi utilizado para caracterizagao da materia prima atraves da identificagao das bandas caracterfsticas da quitosana e para identificagao do grau de desacetilagao (GD) atraves da relagao com o grau de N-acetil, que envolve o uso de absorgao da amida a 1655 cm "\ e da absorgao da hidroxila a 3450 cm "1utilizando-se do
metodo de prensagem da quitosana com brometo de potassio (ROBERTS, 1992).
A caracterizacao por Difracao de Raios X serviu para avaliar o perfil semi-cristalino da materia prima, atraves da analise em temperatura ambiente em intervalo de 20 entre 10° e 70° a uma velocidade de 2°/min. Para este procedimento foi utilizado um aparelho XRD-7000 Shimadzu com radiacao Ka do cobre de 1,5418 A, tensao de 40 kV e corrente de 30 mA.
4.4.2 Caracterizacao dos arcaboucos
4.4.2.1 Calorimetria Exploratoria Diferencial (DSC)
A analise de Calorimetria Exploratoria Diferencial (DSC) foi utilizada nos arcaboucos para avaliar possiveis modificagoes nos processos endotermico e exotermicos apos seu processamento e variacoes apos variacao da temperatura de congelamento. A analise foi realizada nas mesmas condigoes da materia prima.
4.4.2.2 Espectroscopia na Regiao do Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR)
O FTIR foi utilizado na caracterizagao dos arcabougos com a proposito de se observar modificagoes nos grupos funcionais no espectro apos o processo de sintese.
4.4.2.3 Difracao de Raios-X (DRX)
A caracterizagao por DRX serviu para verificar o comportamento semi-cristalino dos arcabougos nas mesmas condigoes empregadas na materia prima com a finalidade de observar a influencia do peso molecular e do processamento do polfmero na cristalinidade do material
4.4.2.4 Microscopia Eletrdnica de Varredura (MEV)
A analise de MEV utiliza-se do fornecimento de informagoes sobre a natureza topografica do material, permitindo atraves de uma caracterizacao rapida e precisa avaliar a superffcie da amostra e sua subestrutura e foi necessaria para verificagao da morfologia, interconectividade e formagao de poros nos arcaboucos verificados sob aumentos de 50 x e 300 x. Para isso foi utilizado Microscopio Eletronico de Varredura da Shimadzu, modelo Superscan SSX-550 com resolucao de 3,5 nm e utilizacao de recobrimento metalico.
4.4.2.5 Grau de Intumescimento
O ensaio de Grau de Intumescimento avaliou o comportamento do arcabouco durante a imersao e permanencia em solugoes aquosas de concentracao ionica similar a do plasma sangufneo.
A metogologia empregada foi a descrita na literatura por Bispo, 2009 e Tigh, et.al, 2007. Para cada variedade de arcabougo foi utilizada cinco repetigoes, com area 2x2 cm, pesadas e a acondicionadas em recipiente contendo 10mL de PBS cada, mantidas por 24h sob 37°C. Ao termino do perfodo de tempo foram novamente pesadas, e submetidas ao calculo para determinagao do Gl atraves da Equagao 1.
Onde: mi = massa intumescida e ms = massa da amostra seca
4.4.2.6 Ensaio mecanico
O ensaio de mecanico avaliou as propriedades mecanicas de compressao dos arcabougos uma vez que estes proporcionam um suporte temporario durante o processo de regeneragao.
Os ensaios de compressao foram realizados de acordo com a norma ASTM D882-91 (ASTM.1991) utilizando-se de um equipamento de Ensaio Mecanico Universal Instron modelo 3360 Series Dual ColumnTable, com celula de carga de 500 N, temperatura de 25°C, a 5mm/min, com pre carga de ate 0,1 N e deformacao de 50%.
4.4.2.7 Ensaio de Biodegradagao In Vitro
O ensaio de Biodegradagao In Vitro observou a agao da solugao tampao fosfato (PBS) com e sem lisozima no processo de degradagao das membranas, atraves da perda de massa das amostras degradadas. Para esta analise os arcabougos foram expostos em solugao preparada de lisozima com PBS e em solugao contendo apenas PBS, no tempo de exposigao de 30 dias a 37° C.
A metodologia foi empregada com base na norma ASTM F1635-04
(Standard Test Method for in vitro Degradation Testing of Hydrolytically Degradable Polymer Resins and Fabricated Forms for Surgical Implants (2009).
e a ASTM F2103-01 Stamdard Guide for Characterization and Testing of
Chitosan Salts as Starting Materials Intended for Use in Biomedical and Tissue-Engeneered Medical Products Applications (2007).
Para cada variedade de arcabougo foram utilizadas cinco repetigoes, com area 2x2 cm, inicialmente pesadas e a acondicionadas em recipientes contendo 10 mL de PBS e/ou 10 mL de PBS com Lisosima, mantidas por 30 dias sob 37° C e monitoramento constante do pH. A cada 7 dias as solugoes eram renovadas. Ao termino do periodo de tempo as amostras que nao foram completamente degradadas foram novamente pesadas.
