Ciclo gonádico da ostra nativa Crassostrea gasar em laboratório

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS DEPARTAMENTO DE AQUICULTURA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AQUICULTURA. CICLO GONÁDICO DA OSTRA NATIVA Crassostrea gasar EM LABORATÓRIO. Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Aquicultura do Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal de Santa Catarina, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Aquicultura.. Orientador: Cláudio Manoel Rodrigues de Melo. CASSIO DE OLIVEIRA RAMOS. FLORIANÓPOLIS/SC 2011.

(2) Catalogação na fonte pela Biblioteca Universitária da Universidade Federal de Santa Catarina.

(3) Ciclo gonádico da ostra nativa Crassostrea gasar em laboratório. Por CÁSSIO DE OLIVEIRA RAMOS Esta dissertação foi julgada adequada para a obtenção do título de MESTRE EM AQUICULTURA e aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Aqüicultura.. _____________________________________ Prof. Evoy Zaniboni Filho, Dr. Coordenador do Curso. Banca Examinadora: __________________________________________ Dr. Cláudio Manoel Rodrigues de Melo – Orientador __________________________________________ Dra. Aimê Rachel Magenta Magalhães __________________________________________ Dra. Guisla Boehs.

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(5) Dedico à minha esposa, família e aos companheiros de quatro patas pelo apoio e dedicação neste trabalho..

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(7) AGRADECIMENTOS À minha esposa Katina (minha pretaaaa!!) pela paciência, participação, apoio e pelas noites mal dormidas em que me auxiliou na redação e preparação desta dissertação, principalmente fazendo com que os meus dias ficassem mais afáveis, mesmo nos momentos mais difíceis. Aos meus pais que sempre me auxiliaram e me apoiaram desde o início dos meus estudos e que mesmo estando longe me ajudaram a enfrentar os desafios do caminho. À minha sogra Iolita, peça fundamental em nossa família, por todo apoio. Ao meu orientador Prof. Dr. Cláudio Manoel Rodrigues de Melo pelo apoio, amizade e auxílio no desenvolvimento e realização deste estudo. À Profa. Dra. Aimê Rachel Magenta Magalhães pelas valiosas discussões, pelo conhecimento transmitido e pela participação na banca examinadora. À Profa. Dra. Guisla Boehs pela participação na banca examinadora. Ao pessoal e amigos do LMM que me auxiliaram na realização do experimento, sempre dispostos a ajudar e discutir, em especial ao Carlos Henrique por todo o auxílio e pelos dias dedicados ao meu experimento. Ao grande Chico pelas conversas, pelos ensinamentos e pela preocupação com meu experimento. À Jaque e ao Sino pela produção e fornecimento de microalgas, essenciais à realização deste trabalho. Ao Alexandre pelos vários “galhos quebrados”. Ao Pancho pelas dicas de engenharia e pelo fornecimento da infraestrutura para realização do experimento de alimentação. À Alexandra pela realização das análises estatísticas..

(8) À Bê pelo delicioso café de todos os dias, sempre vindo na hora certa. Aos demais, mas não menos importantes, funcionários, estagiários e amigos que de alguma forma contribuíram para a realização deste experimento. À Ana Lúcia pela maratona na confecção do material histológico, sempre prestativa e disposta a auxiliar, por maior que fosse desafio. Ao Prof. Dr. Jaime Fernando Ferreira pelo auxílio na realização deste projeto e pelos sábios ensinamentos. Ao Prof. Dr. Maurício Martins Laterça pela estrutura utilizada no laboratório AQUOS para a leitura das lâminas histológicas e pelos descontraídos churrascos vegetarianos. Ao secretário da pós-graduação, Carlito, pela prestativa e rápida ajuda administrativa. A todos os colegas de mestrado, principalmente Beto, Wesley, Felipão e Emílio pela convivência, companheirismo, discussões e descontrações. À CAPES pelo auxílio financeiro concedido através da concessão da bolsa de mestrado..

(9) RESUMO A maturação de reprodutores é uma das etapas mais importantes no processo de produção de bivalves em laboratório. Dentre os fatores que influenciam este processo em ostras, destacam-se a temperatura e a alimentação. Com o objetivo de avaliar a maturação do tecido gonádico da ostra nativa Crassostrea gasar (= Crassostrea brasiliana) em laboratório, foram realizados dois experimentos, a fim de analisar a influência da temperatura e da dieta sobre o acondicionamento de reprodutores. Foram acondicionadas 720 ostras em três temperaturas da água: 18, 22 e 26°C em laboratório e 250 ostras foram mantidas no ambiente natural por 92 dias. Em relação às dietas, um total de 96 ostras foram submetidas a três tratamentos de alimentação composto pelas microalgas Isochrysis galbana e Chaetoceros müelleri, sendo uma dieta de cada microalga e uma dieta mista das duas espécies (1:1) durante 45 dias. O sexo e o estágio de desenvolvimento do tecido gonádico foram determinados através de análises histológicas e estereológicas e o índice de condição foi avaliado. No experimento de temperatura, a proporção sexual média foi de 1,68 fêmeas para cada macho, 2,7% das ostras foram consideradas indeterminadas e 1,1% hermafrodita simultâneo. O tratamento a 18°C foi o único que não apresentou melhora na maturação das ostras. Nos tratamentos 22, 26°C e no campo ocorreu maturação do tecido gonádico das ostras, entretanto sem diferença significativa entre estes tratamentos. No experimento de alimentação, a proporção sexual foi de 1,2 machos para cada fêmea e 11,5% das ostras encontravam-se em estágio indeterminado. Não ocorreu diferença significativa na maturação do tecido gonádico das ostras entre as diferentes dietas fornecidas. Através dos resultados obtidos sugere-se que, nestas condições, em 18°C ocorre acúmulo de reservas energéticas e em temperaturas acima de 22°C ocorre a maturação dos gametas e que as dietas fornecidas não influenciaram na maturação das ostras, demonstrando, portanto que os reprodutores podem ser mantidos em ambiente natural para maturação até a indução à desova. Palavras-chave: Crassostrea gasar, desenvolvimento gonádico, Brasil.. temperatura,. microalgas,.

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(11) ABSTRACT Gonadal tissue maturation of native oyster Crassostrea gasar in laboratory Broodstock maturation is one of the most important steps in the production of bivalves in laboratory. Among the factors that influence this process stand out temperature and food. In order to evaluate the maturation of gonadal tissue of native oyster Crassostrea gasar (= Crassostrea brasiliana) in laboratory, two experiments were conducted, aiming to analyze the influence of different temperatures and diets on the conditioning of broodstock. A total of 720 oysters were stored in three water temperatures: 18, 22 and 26°C in the laboratory and 250 oysters were kept in the natural environment for 92 days. In relation to the diets, a total of 96 oysters were subjected into three feeding treatments comprised of the microalgae Isochrysis galbana and Chaetoceros müelleri, a diet of each of these microalgae and a mixed diet of both species (1:1) for 45 days. The sex and stage of development of gonadal tissue were determined using histological and stereological analysis and condition index were evaluated. In the temperature experiment, the mean sex ratio was 1.68 females per male, 2.7% of the oysters was considered indeterminate and 1.1% simultaneous hermaphrodite. The treatment 18°C was the only one that did not improve the maturation of the gonadal tissue of oysters. In treatments 22, 26°C and field occurred maturation of gonadal tissue of oysters, however, there were no significant difference between treatments. In the feeding experiment, the sex ratio was 1.2 males for each female and 11.5% of the oysters were indeterminate. There was no significant difference on maturation of gonadal tissue of the oysters between the different diets. The results obtained suggest that in these conditions in 18°C occur an accumulation of energy reserves and at temperatures above 22°C the maturation of gametes and that diets do not influence the maturation of the gonadal tissue of oysters, demonstrated therefore that oysters can be maintained in the environment for maturation until the spawning. Keywords: Crassostrea gasar, temperature, microalgae, gonadal development, Brazil..

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(13) LISTA DE ILUSTRAÇÕES CAPÍTULO 1 Figura 1: Fotomicrografias dos estágios de desenvolvimento do tecido gonádico de espécimes machos da ostra nativa Crassostrea gasar...................................................................................................... 52 Figura 2: Fotomicrografias dos estágios de desenvolvimento do tecido gonádico de espécimes fêmeas da ostra nativa Crassostrea gasar ..................................................................................................... 52 Figura 3: Fotomicrografias dos estágios de desenvolvimento do tecido gonádico da ostra nativa Crassostrea gasar. A. Indeterminado e B. Hermafrodita ................................................................................. 37 Figura 4: Porcentagem dos estágios de desenvolvimento do tecido gonádico da ostra nativa Crassostrea gasar acondicionadas sob diferentes temperaturas, obtidas através das análises histológicas e estereológicas ....................................................................................... 52 Figura 5: Índice de condição (IC) médio da ostra nativa Crassostrea gasar nos diferentes tratamentos de temperatura: T18, T22 e T26 e no tratamento campo ............................................................................ 52. CAPÍTULO 2 Figura 1: Fotomicrografias dos estágios de desenvolvimento do tecido gonádico de espécimes machos da ostra nativa Crassostrea gasar ..................................................................................................... 60 Figura 2: Fotomicrografias dos estágios de desenvolvimento do tecido gonádico de espécimes fêmeas da ostra nativa Crassostrea gasar ..................................................................................................... 52 Figura 3: Fotomicrografias dos estágios de desenvolvimento do tecido gonádico da ostra nativa Crassostrea gasar. A. Indeterminado ...................................................................................... 61.

(14) Figura 4: Porcentagem dos estágios de desenvolvimento do tecido gonádico da ostra nativa Crassostrea gasar submetidas a diferentes dietas microalgais, obtidas através das análises histológicas e estereológicas ....................................................................................... 63 Figura 5: Média do índice de condição da ostra nativa Crassostrea gasar submetidas a diferentes tratamentos de alimentação ................. 64.

(15) LISTA DE TABELAS CAPÍTULO 1 Tabela 1: Descrição dos estágios de desenvolvimento gonádico da ostra nativa Crassostrea gasar ............................................................. 31 Tabela 1: Continuação.......................................................................... 32 Tabela 2: Frequência absoluta, relativa e proporção sexual de espécimes machos (M), fêmeas (F), indeterminados (I) e hermafroditas (H) da ostra nativa Crassostrea gasar nos diferentes tratamentos de temperatura .................................................................. 35 Tabela 3: Análise de “deviance” (ANODEV) para avaliar diferenças entre os tratamentos de temperatura, nas diferentes datas de coleta, para as análises histológicas e estereológicas ...................... 35 Tabela 4: Estimativas e, entre parênteses, intervalos de confiança (95%) para os interceptos (β0) e a covariável data de coleta (β1) na análise da regressão multinomial logística para a análise histológica .. 38 Tabela 5: Estimativas e, entre parênteses, intervalos de confiança (95%) para os interceptos (β0) e a covariável data de coleta (β1) na análise da regressão multinomial logística para a análise estereológica ......................................................................................... 39 Tabela 6: Análise de “deviance” (ANODEV) para avaliar diferenças entre os tratamentos de temperatura, nas diferentes datas de coleta, para o índice de condição ..................................................... 52 Tabela 7: Estimativas e, entre parênteses, intervalos de confiança (95%) para o intercepto (β0) e a covariável data de coleta (β1) na análise da regressão linear generalizada para o índice de condição ..... 52 CAPÍTULO 2 Tabela 1: Descrição dos estágios de desenvolvimento gonádico da ostra nativa Crassostrea gasar ........................................................... 528.

(16) Tabela 1: Continuação ....................................................................... 529 Tabela 2: Análise de “deviance” (ANODEV) para avaliar diferenças entre as dietas microalgais, nas diferentes datas de coleta, para as análises histológicas e estereológicas ...................................... 62 Tabela 3: Análise de “deviance” (ANODEV) para avaliar diferenças entre os tratamentos de alimentação para o índice de condição ............................................................................................... 64.

(17) SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ................................................................................ 19 2. OBJETIVOS ..................................................................................... 25 2.1 Objetivo geral ............................................................................. 25 2.2 Objetivos Específicos ................................................................. 25 3. CAPÍTULO 1 Maturação da ostra nativa Crassostrea gasar submetidas a diferentes temperaturas ......................................................................... 26 Resumo ............................................................................................. 27 Abstract............................................................................................. 27 Introdução......................................................................................... 28 Material e métodos ........................................................................... 29 Resultados......................................................................................... 33 Discussão .......................................................................................... 43 Agradecimentos ................................................................................ 46 Referências ....................................................................................... 47 4. CAPÍTULO 2 Maturação da ostra nativa Crassostrea gasar submetidas a diferentes dietas..................................................................................... 52 Resumo ............................................................................................. 53 Abstract............................................................................................. 53 Introdução......................................................................................... 54 Material e métodos ........................................................................... 55 Resultados......................................................................................... 57 Discussão .......................................................................................... 64 Agradecimentos ................................................................................ 67 Referências ....................................................................................... 67 5. CONCLUSÃO GERAL .................................................................... 75 6. CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................ 75 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DA INTRODUÇÃO ............ 75.

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(19) 19. 1. INTRODUÇÃO As ostras são animais ideais para a aquicultura (FAO, 2006) por não necessitarem de outro alimento a não ser fitoplâncton, o que lhes garante uma melhor taxa de conversão alimentar (NASCIMENTO; PEREIRA, 2004). Além disso, os custos relativamente baixos para instalação dos cultivos, com materiais de fácil obtenção e o rápido retorno do capital fazem desta atividade uma alternativa para a pesca artesanal ou mesmo para manutenção e reposição dos estoques naturais (CHRISTO, 2006). As áreas costeiras da maior parte do litoral brasileiro caracterizam-se pela presença de extensos manguezais, considerados ecossistemas altamente produtivos (NASCIMENTO; PEREIRA, 2004), o que torna estes ambientes propícios para a ostreicultura de espécies nativas. O cultivo de moluscos no Brasil tem como principais estados produtores Santa Catarina, São Paulo, Rio de Janeiro, Paraná, Espírito Santo e Sergipe (VICENTE, 2010). Dentre estes estados, Santa Catarina possui presença destacada, sendo responsável por 90% da produção nacional de ostras cultivadas com a espécie Crassostrea gigas (Thunberg, 1793), conhecida como ostra japonesa ou do Pacífico (EPAGRI/CEPA, 2010). Os 10% restantes da produção nacional ocorrem com as espécies nativas Crassostrea gasar (Adanson, 1757) e Crassostrea rhizophorae (Guilding, 1828). Embora o cultivo de moluscos no Brasil esteja baseado em C. gigas, espécie característica de águas frias e salinas e que se adaptou bem ao cultivo na região Sul, o clima, predominantemente tropical na maior parte da costa brasileira com altas temperaturas médias da água durante todo o ano, não é apropriado para o cultivo desta espécie (POLI, 2004). Desta forma, para um bom aproveitamento dos diversos ambientes costeiros brasileiros, pesquisas vêm sendo desenvolvidas visando o aumento da produção através da utilização de espécies nativas, que possuem potencial extraordinário, com contínua fecundidade, garantindo a disponibilidade de sementes ao longo do ano (NASCIMENTO, 1991). No Brasil ocorrem três espécies de Crassostrea: C. gigas (Thunberg, 1793), introduzida na década de 70 e duas espécies nativas: C. gasar (= Crassostrea brasiliana (Lamarck, 1819)) e C. rhizophorae. Estudos demonstraram por biologia molecular (MELO et al., 2010) que C. brasiliana (Lamarck, 1819) e C. gasar são idênticas, devendo ser.

(20) 20. mantida a nomenclatura C. gasar, por ser a mais antiga. Existe ainda o registro de uma quarta espécie do gênero Crassostrea (Crassostrea sp. canela) para o Norte do Brasil, Ilha Canela, no estado do Pará, considerada exótica que possui forte relação com espécies do IndoPacífico (VARELA et al., 2007). Esta espécie foi também relatada em estudo na região Sul do Brasil, na Baía da Babitonga, litoral Norte do estado de Santa Catarina (TURECK, 2010). As espécies nativas possuem enorme semelhança morfológica, além de fixarem-se no mesmo substrato e possuírem o mesmo habitat (VILLARROEL et al., 2004). São típicas de zonas tropicais e ocorrem principalmente fixadas às raízes aéreas do mangue vermelho Rhizophora mangle, ou sobre zonas entremarés e costões rochosos (NASCIMENTO, 1983), entretanto, C. gasar apresenta melhor desempenho de crescimento em cultivo quando comparada com C. rhizophorae (PEREIRA et al., 2003). As ostras de maior importância econômica pertencem ao gênero Crassostrea, devido ao alto valor alimentício da carne e do uso da concha como matéria prima na fabricação de produtos industriais e medicinais (COSTA, 1985). São consideradas eurialinas e euritérmicas e desovam intermitentemente ao longo do ano (YONGE, 1960; GALTSOFF, 1964; QUAYLE, 1988; GALVÃO et al., 2000). Segundo Nascimento e Lunetta (1978), as ostras deste gênero são dióicas, entretanto alguns autores as consideram hermafroditas sequenciais, pois nelas ocorre reversão sexual durante a vida, com tendência à protandria, ou seja, iniciam sua fase reprodutiva como macho podendo tornar-se fêmeas posteriormente (MACKIE, 1984; GOSLING, 2003; VILLARROEL et al., 2004). Quando encontram-se em estágio avançado de maturação, o tecido gonádico ocupa grande parte da massa visceral e constitui-se de uma rede de tubos ramificados que se inserem entre os órgãos do corpo. Segundo Gosling (2003), em Crassostrea gigas, o tecido gonádico pode representar um terço do tecido mole corporal. A reprodução é um dos processos fisiológicos mais importantes no ciclo de vida de qualquer espécie de bivalve (ENRÍQUEZ-DÍAZ et al., 2009). O ciclo reprodutivo é o conjunto de eventos a partir da ativação do desenvolvimento do tecido gonádico até a produção das células sexuais maduras (gametogênese) e sua posterior liberação no ambiente (ALVAREZ, 1991). Este processo, principalmente a fase da gametogênese, requer muita energia e a mobilização dos nutrientes ingeridos até a gônada é essencial para o desenvolvimento e maturação do tecido gonádico (ALVAREZ, 1991). O ciclo reprodutivo é influenciado por condições ambientais como temperatura, salinidade e.

(21) 21. níveis nutricionais e por características genéticas (ALVAREZ, 1991; CHÁVEZ-VILLALBA et al., 2001). A determinação da influência dos fatores ambientais sobre a fisiologia do desenvolvimento da gônada permite estabelecer épocas precisas do desenvolvimento gonádico (ROGERS; GARCIA-CUBAS, 1981). O acondicionamento de bivalves em laboratório pode ser feito pela manipulação de fatores ambientais, físicos e nutricionais, que afetam o desenvolvimento gonádico e aceleram ou retardam a gametogênese, em várias épocas do ano (LOOSANOFF; DAVIS, 1952; WALNE, 1979; GALLAGER; MANN, 1986; UTTING; MILLICAN, 1997). De acordo com Gabbott (1983), atividades metabólicas sazonais em moluscos são decorrentes de complexas interações entre a disponibilidade de alimento, condições ambientais, crescimento e ciclo gametogênico. Em geral, a energia é armazenada antes da gametogênese, na forma de glicogênio, lipídios e proteínas. A importância destes substratos, onde são armazenados e o momento de sua utilização varia entre as espécies, bem como entre populações da mesma espécie (GIESE, 1969; BAYNE, 1976; SASTRY, 1979). Em bivalves, o glicogênio é considerado a reserva mais importante (WHITE et al., 1990) e é estocado em vários tecidos do corpo. Para uma boa maturação em ostras, deve-se ter grande quantidade de glicogênio estocado (LOOSANOFF; DAVIS, 1952). Este carboidrato é armazenado a partir do alimento ingerido, sendo mobilizado para fornecer energia durante a gametogênese (EBLE; SCRO, 1996). O glicogênio é utilizado principalmente na síntese de lipídeos durante a vitelogênese (UTTING; MILLICAN, 1997) e disso depende todo o processo de maturação final de gametas, o que por sua vez garantirá uma boa taxa de fecundação e formação de larvas (BREESE; MALOUF, 1975). Nascimento e Miraglia (1983) observaram que durante o desenvolvimento do ciclo sexual de Crassostrea rhizophorae, as reservas orgânicas aumentam gradativamente até a fase de maturação das gônadas, diminuindo durante a eliminação de gametas. Dentre os fatores que influenciam o acúmulo de glicogênio em ostras, pode-se destacar a temperatura (MURANAKA; LANNAN, 1984; SHPIGEL et al., 1992) e a composição qualitativa e quantitativa do alimento (WAKAMATSU, 1973). Estudos com Crassostrea gigas mostraram correlação positiva entre o índice gonadossomático, a temperatura e o conteúdo de clorofila do ambiente (RUIZ et al., 1992). Nesta espécie, a manipulação destes fatores é rotineiramente observada em laboratórios de produção, sendo a temperatura utilizada para induzir.

(22) 22. a maturação de gametas, enquanto que diferentes qualidades e quantidades de microalgas são utilizadas para incrementar a fecundidade (LUBET, 1976; DUPUY et al., 1977; UTTING, 1993; UTTING; MILLICAN, 1997; BUCHANAN et al., 1998, PRONKER et al., 2008). Variações da temperatura da água estão intimamente relacionadas ao desenvolvimento das atividades gametogênicas e ao início da desova (LOOSANOFF; DAVIS, 1952), além de ter função preponderante nos processos de maturação estrutural e fisiológica dos gametas (VÉLEZ; EPIFANIO, 1981). Em espécies que habitam regiões de latitudes altas, onde as estações do ano são relativamente definidas, os organismos tendem a apresentar picos de eliminação de gametas nos períodos de temperatura elevada (GIESE; PEARSE, 1974; ANDREWS, 1979). Espécies de ostras de ambientes tropicais possuem ciclo sexual contínuo, alternando o acúmulo de glicogênio com constantes períodos de eliminação de gametas (NASCIMENTO; LUNETTA, 1978). No litoral do estado do Paraná, ocorre redução na eliminação de gametas de espécies nativas de Crassostrea em períodos de inverno (ABSHER, 1989; CHRISTO, 2006). Em São Paulo, a desova de Crassostrea brasiliana (= Crassostrea gasar) ocorre intensamente no período de novembro a maio e intermitentemente ao longo do resto do ano (AKABOSHI; PEREIRA, 1981; PEREIRA et al., 2001). Na mesma localidade, Galvão et al. (2000) também observaram que próximo ao final do ano ocorre desova mais intensa desta espécie. Em laboratório, Loosanoff e Davis (1952) estudaram o tempo necessário para detectar a maturação sob diferentes temperaturas em Crassostrea virginica e utilizaram equações para predizer a maturação dos gametas em determinada temperatura. Estes autores mantiveram as ostras em temperaturas que variaram de 10 a 30ºC para determinar o número de dias necessários para o desenvolvimento dos primeiros gametas maduros, que variaram entre 26,5 dias a 15ºC e 4,9 dias a 30ºC. Os dados calculados pelas equações, entretanto, nem sempre coincidem com os dados empíricos. Os mesmos parâmetros analisados em populações de C. gigas demonstraram que ostras do sexo feminino necessitaram de 19 semanas para atingir a maturação em 15 e 21ºC e 15 semanas a 25ºC (MANN, 1979). Em Crassostrea gigas de diferentes localidades existe maior frequência de ostras maduras em locais onde a temperatura atinge 17ºC e raramente onde a temperatura máxima é de 16ºC (RUIZ et al., 1992). Chávez-Villalba et al. (2002) observaram que ocorreu influência da temperatura sobre o aumento na velocidade da gametogênese de C..

(23) 23. gigas entre 16 e 22ºC, entretanto a velocidade da gametogênese diminuiu em 25ºC quando comparada a 22ºC. As temperaturas que permitem o desenvolvimento gonádico e a liberação de gametas são distintas (LOOSANOFF, 1949). O conhecimento destas temperaturas é importante para melhorar o acondicionamento e os procedimentos de maturação em laboratório de espécies de interesse comercial (UTTING, 1993; CHÁVEZVILLALBA et al., 2002). Além da temperatura, a maturação gonádica de moluscos depende de uma dieta adequada de microalgas, o que proporcionará ovócitos de qualidade e viabilidade larval (MURANAKA; LANNAN, 1984). O valor nutricional da dieta depende da microalga utilizada. Dietas mistas provavelmente contêm a diversidade bioquímica necessária não só para o crescimento, mas também para a gametogênese (MADRONES-LADJA et al., 2002). Os processos de acondicionamento em laboratório requerem grandes quantidades de energia e uma dieta mista de fitoplâncton para que as ostras tenham boas condições de desenvolvimento sexual (ROBINSON, 1992). Quando o alimento não é suficiente, as ostras podem até regredir quanto a sua condição energética (VÉLEZ; EPIFANIO, 1981). Uriarte et al. (2004) utilizando tratamentos de dietas enriquecidas com altos e baixos níveis de proteína e uma dieta controle de Isochrysis galbana (clone T-Iso) e Chaetoceros neogracile em Crassostrea gigas, observaram que o tamanho dos ovócitos foi significativamente afetado pelo nível de proteína nas dietas de acondicionamento. Fêmeas alimentadas com níveis de proteína normais e altos produziram ovócitos maiores que as fêmeas alimentadas com baixas cargas protéicas. A taxa de eclosão também foi afetada pela maior carga protéica, entretanto não foram encontradas diferenças na fecundidade das fêmeas. O ciclo sexual de bivalves pode ser estudado através de uma grande variedade de técnicas (BENINGER, 1987). Mudanças sazonais no tecido gonádico podem ser avaliadas através da histologia, composição bioquímica, índice de condição e observações visuais (QUAYLE; NEWKIRK, 1989). Destes, o método mais confiável para avaliar o desenvolvimento do ciclo reprodutivo em bivalves é baseado na histologia, que classifica os animais de acordo com as características apresentadas pelas células do tecido gonádico em diferentes estágios de desenvolvimento (GOSLING, 2003). Contudo, devido à complexidade e diferenciação do ciclo gametogênico das ostras, encontram-se na.

(24) 24. literatura diferentes classificações (RUIZ-DURÁ, 1974; VÉLEZ, 1976, 1977; NAGABHUSHANAN; BILDARKAR, 1977; ASIF, 1979; BRALEY, 1984; JOSEPH; MADHYASTHA, 1984; SAUCEDO; SOUTHGATE, 2008). Em estudos do ciclo sexual, métodos histológicos são considerados trabalhosos, mas sua eficácia é inquestionável. A análise histológica tende a ser subjetiva, entretanto Gosling (2003) demonstrou haver concordância entre as metodologias histológicas e os métodos quantitativos como o emprego de técnica de estereologia. Beninger (1987) também enfatizou que a subjetividade na análise histológica pode ser diminuída por métodos quantitativos, como estereologia, concomitante às observações qualitativas como as realizadas por Bayne et al. (1978), Lowe et al. (1982) e Magalhães (1998). Além da histologia, em bivalves marinhos é possível verificar a relação entre o desenvolvimento gonádico e o peso corporal através do índice de condição. Este índice é utilizado para avaliar o estado nutricional de bivalves e pode ser utilizado para observar mudanças sazonais nas reservas nutritivas, para indicar divergências na qualidade comercial de diferentes populações ou para observar diferentes poluentes ou doenças (CROSBY; GALE, 1990). O índice de condição é considerada a maneira mais prática e simples de monitorar a atividade gametogênica em bivalves (OKUMUS; STIRLING, 1998) e é diretamente proporcional à quantidade de energia armazenada (BENINGER; LUCAS 1984), sendo frequentemente utilizado em estudos com Crassostrea gigas (BAGHURST; MITCHELL, 2002). Através do método quantitativo de índice de condição, é possível avaliar indiretamente a formação de reserva de glicogênio, maturação sexual e período de desova do animal (NASCIMENTO et al., 1980; QUAYLE; NEWKIRK, 1989; GALVÃO et al., 2000; RABELO et al., 2005). Neste sentido, diversos autores têm publicado informações sobre o índice de condição de ostras nativas (NASCIMENTO; PEREIRA, 1980; ABSHER, 1989; GALVÃO et al., 2000; RABELO et al., 2005; CHRISTO; ABSHER, 2006; GOMES, 2009). Altos valores de índice de condição são determinados por uma grande quantidade de reserva de glicogênio e tecido gonádico do animal (PERDUE et al., 1983). Estudos sobre os aspectos reprodutivos tais como maturação do tecido gonádico, desova e fertilização e os parâmetros que influenciam nestes processos são importantes entre organismos de interesse econômico (CHRISTO, 2006). Conhecer as características sexuais e os estímulos ambientais que regem a maturação do tecido gonádico e a.

(25) 25. liberação dos gametas é importante para subsidiar a exploração comercial de moluscos (CLEDÓN et al., 2004). Assim, este estudo teve como objetivo avaliar a influência da temperatura da água e da alimentação sobre a maturação do tecido gonádico da ostra nativa Crassostrea gasar em laboratório. 2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral Contribuir para o conhecimento dos aspectos reprodutivos da ostra nativa Crassostrea gasar em laboratório. 2.2 Objetivos Específicos • Verificar a influência de diferentes temperaturas da água sobre a maturação de C. gasar. • Verificar a influência de diferentes dietas microalgais sobre a maturação de C. gasar. Este trabalho está dividido em dois artigos científicos, apresentados a seguir em forma de capítulos: “Maturação do tecido gonádico da ostra nativa Crassostrea gasar submetida a diferentes temperaturas em laboratório”, redigido sob as normas da revista “Aquaculture International” e “Maturação do tecido gonádico da ostra nativa Crassostrea gasar submetida a diferentes dietas microalgais em laboratório”, redigido sob as normas da revista “Brazilian Journal of Biology”..

(26) 26. 3. CAPÍTULO 1. MATURAÇÃO DA OSTRA NATIVA Crassostrea gasar SUBMETIDA A DIFERENTES TEMPERATURAS EM LABORATÓRIO. Cassio de Oliveira Ramosa, Carlos Henrique Araújo de Miranda Gomesa, Aimê Rachel Magenta Magalhães, Alexandra Inês Santosa, Cláudio Manoel Rodrigues de Meloa*. a. Laboratório de Moluscos Marinhos (LMM), Departamento de Aquicultura, Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), Beco dos Coroas, s/n, 88061-600, Florianópolis, SC, Brasil, 55 48 3232 3279.. Título abreviado: Maturação de Crassostrea gasar em diferentes temperaturas. Correspondência: cmrmelo@cca.ufsc.br, ramoscassio@gmail.com. Artigo redigido de acordo com as normas da revista “Aquaculture International”.

(27) 27. Resumo Este estudo avaliou a influência da temperatura na maturação do tecido gonádico da ostra nativa Crassostrea gasar em laboratório. Foram acondicionadas 720 ostras em três temperaturas da água: 18, 22 e 26°C. Um tratamento controle de 250 ostras foi mantido em lanternas em cultivo no ambiente (27º28’30’’S; 48º33’40’’W). A cada dez dias, vinte ostras de cada tratamento foram submetidas às análises do índice de condição e histológica, sendo dez para cada análise. Os resultados da proporção sexual média dos tratamentos durante o período amostral foi de 1,68 fêmeas para cada macho. Em 2,7% dos animais não foi possível determinar o sexo devido à ausência de gametas e 1,1% das ostras foram consideradas hermafroditas simultâneos. O estágio de gametogênese foi predominante em relação aos demais estágios em todos os tratamentos. Animais em estágio de repleção / pré desova, desova parcial e desova total foram observados em maiores porcentagens no tratamento 26°C e campo, sendo o último estágio observado apenas nestes dois tratamentos. Animais em repouso foram observados em todos os tratamentos, com redução gradativa com o decorrer do tempo. Ocorreu aumento progressivo no valor do índice de condição no tratamento 18°C e redução no tratamento 26°C com o passar do tempo. O tratamento 18°C teve diferença significativa em relação às demais temperaturas, sendo que não apresentou melhora na maturação do tecido gonádico das ostras. Nos tratamentos 22°C , 26°C e campo ocorreu maturação do tecido gonádico das ostras, entretanto, sem diferença significativa entre os tratamentos. A partir dos resultados obtidos sugere-se que em 18°C ocorre acúmulo de reservas energéticas e em temperaturas acima de 22°C ocorre a maturação dos gametas e ainda sugere-se manter os animais em ambiente natural até a indução à desova em laboratório. Palavras-chave: Crassostrea gasar, desenvolvimento laboratório, acondicionamento, temperatura.. gonádico,. Gonadal maturation of tissue of native oyster Crassostrea gasar at different temperatures in the laboratory Abstract This study evaluated the influence of temperature on gonadal tissue maturation of native oyster Crassostrea gasar in laboratory. It was conditioned a total of 720 oysters in three treatments of water temperature: 18, 22 e 26°C. A control treatment of 250 oysters was maintained in culture in the environment (27º28’30’’S; 48º33’40’’W)..

(28) 28. Every ten days, twenty oysters of each treatment were subjected to condition índex and histological analysis, ten for each analysis. The mean sex ratio of treatments throughout the sampling period was 1.68 females per male. In 2.7% of the animals was not possible to determine the sex because of an absence of gametes and 1.1% of the oysters were considered hermaphrodites. The stage of gametogenesis was predominant in relation to other stages in all treatments. Animals in repletion / pre spawning stage, partial spawning and total spawning were observed in higher percentages in the treatment field and 26°C, the latter stage observed only in these two treatments. Animals at rest stage were observed in all treatments, with a gradual decrease with time. Progressive increase occurred in the value of condition index in the treatment 18°C and reduction in treatment 26°C in the course of time. The treatment 18°C was the only that did not improve the maturation of gonadal tissue of oysters. In treatments 22°C, 26°C and field occurred maturation of gonadal tissue of oysters, however, there were no significant differences between treatments. The results obtained suggest that in 18°C occur an accumulation of energy reserves and at temperatures above 22°C occur the maturation of gametes and its suggested to maintain animals in the environment until the spawning in laboratory. . Keywords: Crassostrea gasar, gonadal development, laboratory, broodstock conditioning, temperature. Introdução Ostras nativas do gênero Crassostrea são importantes fontes de renda para populações costeiras, sendo extraídas do ambiente natural para o consumo e venda local (Harry 1985; Arakawa 1990; Eldredge 1994). Com a crescente demanda, laboratórios de larvicultura têm sido estabelecidos nas principais áreas de cultivo destes organismos (Day et al. 2000). A ostra nativa Crassostrea gasar (Adanson, 1857) possui ampla distribuição geográfica, extendendo-se ao longo da costa da África Ocidental Central (Angell 1986; Lapègue et al. 2002) e da América do Sul desde a Guiana Francesa até o Sul do Brasil (Lapègue et al. 2002; Lazoski et al. 2011). Ao redor do mundo tem-se observado o declínio nas populações de ostras nativas e essa tendência ocorre também na América do Sul (Kirby 2004), sendo observada a degradação dos estoques naturais no.

(29) 29. Brasil. As áreas costeiras da maior parte do litoral brasileiro caracterizam-se pela presença de extensos manguezais, considerados ecossistemas altamente produtivos (Nascimento e Pereira 2004), o que torna estes ambientes propícios para a ostreicultura de espécies nativas. Apesar da espécie nativa Crassostrea gasar apresentar potencial para a ostreicultura, ainda não há constância na produção de sementes desta espécie em laboratório. Desta forma, para um bom aproveitamento dos diversos ambientes costeiros brasileiros, pesquisas vêm sendo desenvolvidas visando garantir a disponibilidade contínua de sementes (Nascimento 1991), sendo necessário obter-se reprodutores sexualmente maduros, aptos a desovarem durante o ano inteiro. O acondicionamento dos moluscos em laboratório tem o objetivo de produzir gametas de alta qualidade a fim de obter o maior número de larvas viáveis (Utting e Millican 1997). Durante este processo, é importante o controle de parâmetros físicos, dentre os quais destaca-se a temperatura, por ser um fator determinante na regulação da reprodução em bivalves (Sastry 1968; Robinson 1992; RodríguezJaramillo et al. 2001). Aumentos na temperatura da água favorecem o processo de gametogênese, a fecundidade e a qualidade dos ovócitos em moluscos (Utting e Millican 1997). O desenvolvimento do tecido gonádico e a liberação de gametas em ostras ocorrem em temperaturas distintas (Loosanoff 1949). O conhecimento destes valores é de fundamental importância para melhorar o acondicionamento e os procedimentos de maturação em laboratório (Utting 1993; Chávez-Villalba et al. 2002). Assim, este estudo teve como objetivo avaliar a influência da temperatura no desenvolvimento do tecido gonádico da ostra nativa C. gasar em laboratório. Material e Métodos Setecentos e vinte ostras da espécie C. gasar, produzidas no Laboratório de Moluscos Marinhos (UFSC) com idade aproximada de 27 meses, foram submetidas a três tratamentos (n=240) de temperatura de água: 18 (T18), 22 (T22) e 26°C (T26), em laboratório, entre outubro/2010 e janeiro/2011, durante 94 dias. Um tratamento controle (n=250) foi mantido em sistema de lanternas em ambiente natural, no cultivo na praia do Sambaqui, Baía Norte (27º28’30’’S; 48º33’40’’W), Florianópolis/SC, local em que foi instalado um registrador contínuo de temperatura, a 1m de profundidade. Em laboratório, cada tratamento foi mantido em tanques de 3000 L, delineamento hierárquico com três repetições, em sistema de.

(30) 30. fluxo contínuo de água e alimento (2.200 ml/min) e aeração constante. A alimentação consistiu das microalgas Chaetoceros müelleri e Isochrysis galbana na densidade de 16.104 células/ml-1, na proporção de 1:1. A cada 10 dias, 20 ostras de cada tratamento foram coletadas aleatoriamente, medidas, pesadas e, posteriormente, analisadas quanto à quantidade de glicogênio e estágio de desenvolvimento gonádico através das análises do índice de condição e análises histológicas, respectivamente, sendo 10 animais para cada análise. O índice de condição (IC) foi calculado de acordo com metodologia descrita por Crosby e Gale (1990). Para o preparo das amostras, os animais foram medidos quanto à altura (eixo dorso-ventral), utilizandose um paquímetro digital com precisão de 0,01 mm e pesados (peso vivo total) com o auxílio de uma balança com precisão de 0,001 g. Em seguida, após a secção do músculo adutor e remoção das partes moles, pesou-se a carne e a concha separadamente, para obtenção do peso úmido, as quais foram posteriormente mantidas em estufa a 68ºC por 48h, para obtenção do peso seco, conforme Lawrence e Scott (1982). Para as análises histológicas, foi realizada uma secção da gônada no sentido ântero-posterior de aproximadamente 0,7cm e fixada em solução de Davidson (Shaw e Battle 1957) por 48 horas. Lâminas histológicas foram confeccionadas com cortes de 7µm de espessura, coradas com Hematoxilina de Harris e Eosina (HE) (Howard e Smith 1983)e analisadas sob microscópio óptico para determinação do sexo e dos estágios do desenvolvimento gonádico. O sexo dos indivíduos foi determinado da seguinte maneira: macho (M), fêmea (F), hermafrodita (H) e indeterminado (I). A determinação dos estágios foi baseada nas classificações qualitativas de Saucedo e Southgate (2008) (Tabela 1) e quantitativas através da técnica de análise estereológica, utilizando o sistema de teste M-42 (Weibel no 2) (Weibel et al. 1966). A classificação estereológica foi realizada através da utilização de gratícula de Weibel sendo a imagem sobreposta nas lâminas histológicas. Em cada lâmina foi realizada a contagem das células em 42 pontos de cincos áreas distintas. Após a contagem foi realizada a média das cinco áreas para posterior classificação. Para a contagem foi determinado sete tipos celulares: gônada madura, gônada em desenvolvimento, espaço intracelular, espaço extracelular, parede do folículo, tecido conjuntivo e gônada colapsada. Posteriormente os estágios foram classificados conforme descrito abaixo:.

(31) Machos Dentro dos folículos junto à parede, é possível distinguir várias linhagens de células germinativas. Os espermatozóides se acumulam no lúmen e as caudas eosinófilas ficam evidentes nesta direção. A quantidade de tecido conjuntivo decresce entre os folículos em virtude da expansão deste, pelo acúmulo de espermatozóides. As células germinativas praticamente desaparecem ficando restritas a uma pequena margem na parede celular. Os folículos se encontram distendidos, preenchidos com densas aglomerações de espermatozóides com flagelo orientado para o lúmen. Ausência praticamente total do tecido conjuntivo. O espermatozóide é expelido dos folículos, que assumem uma aparência frouxa ficando parcialmente vazios e com as paredes com aparência de quebradas. Pouco tecido conjuntivo interfolicular presente, com presença de espaços intrafoliculares.. Fêmeas. Paredes dos folículos não justapostas com espaços intra e interfoliculares. Ovócitos em diferentes estágios de desenvolvimento, apresentando-se em sua maioria pedunculados e ligados à parede. Os ovócitos livres apresentam formato mais esférico. Presença de tecido conjuntivo entre os folículos.. Folículos justapostos, densamente preenchidos com gametas maduros sem espaços intra e interfoliculares. Os ovócitos apresentam-se em sua maioria destacados da parede com formato poligonal. Pouco ou nenhum tecido conjuntivo visível entre os folículos.. Muitos folículos contêm ovócitos que se encontram normalmente livres no lúmen. Pouco tecido conjuntivo presente com espaços intra e interfoliculares. Paredes dos folículos com aparência de fragilidade.. Estágios. Gametogênese. Repleção / prédesova. Desova parcial. Tabela 1 Descrição dos estágios de desenvolvimento gonádico da ostra nativa Crassostrea gasar de acordo com Saucedo e Southgate (2008).. 31.

(32) Células do epitélio germinativo indiferenciadas, podendo não ser possível distinguir os sexos. Raramente há evidência de tecido gonádico. O tecido conjuntivo ocupa a maior parte entre os folículos colapsados.. Desova total. Repouso ou indeterminado. Folículos colapsados com gametas remanescentes, espermatozóides se degenerando. Inicia-se a reabsorção dos espermatozóides não expelidos. Tecido conjuntivo começa a se desenvolver entre os folículos.. Folículos colapsados total ou parcialmente vazios com gametas remanescentes. Inicia-se a reabsorção dos ovócitos não expelidos. Tecido conjuntivo começa a se desenvolver entre os folículos.. Tabela 1 Continuação. 32.

(33) 33 • • • • •. Gametogênese: lâminas apresentavam área superior a 10% de células em desenvolvimento; Repleção: lâminas apresentavam área superior a 20% de células maduras; Desova parcial: lâminas apresentavam área superior a 10% de células com aparência de colapsadas; Desova total: lâminas apresentavam área superior a 75% de células com aparência de colapsadas; Repouso: lâminas apresentavam área superior a 40% de células de tecido conjuntivo.. Os dados obtidos através das análises histológicas, estereológicas e IC foram analisados utilizando a metodologia de Modelos Lineares Generalizados (Nelder and Wendderburn 1972). A função de ligação utilizada para o modelo multinomial (dados histológicos e estereológicos) foi a cumulative logit. Para o modelo normal (dados de IC), foi utilizada a função de ligação identidade.A análise de “deviance” (ANODEV) foi realizada por meio do procedimento GENMOD do programa SAS®, para testar o efeito dos tratamentos sob a maturação do tecido gonádico dos animais.O modelo ajustado inclui os efeitos de tratamento, data de coleta e interação entre esses fatores. No caso de efeito significativo de interação foram realizadas análises de regressão multinomial logística ou regressão linear generalizada, no caso de distribuição normal, por meio do mesmo procedimento (PROC GENMOD). Os coeficientes estimados da regressão foram comparados por meio de intervalos de confiança, baseados em máxima verossimilhança, para determinação das diferenças específicas entre os tratamentos. O grau de correlação entre as análises histológicas e estereológicas foi calculado utilizando-se o coeficiente de correlação de Pearson (< 0,05). Resultados A altura média (± desvio padrão) das ostras ao longo do período experimental foi de 42 ± 0,63mm e o peso total médio (± desvio padrão) foi de 13,39 ± 4,68g. As temperaturas médias (± desvio padrão) da água nos tanques dos tratamentos foram de 18,77ºC ± 1 em T18, 21,59ºC ± 1,13 em T22, 25,52ºC ± 2,11 em T26 e da água do mar no tratamento campo foi 26,3ºC ± 2,43. A proporção sexual média das ostras (número de machos: número de fêmeas) nos tratamentos durante o período amostral foi de 1:1,68. Em 2,7% dos animais não foi possível determinar o sexo devido.

(34) 34. à ausência de gametas e 1,1% das ostras eram hermafroditas (Tabela 1). Em todos os tratamentos, ocorreu predominância de fêmeas, com proporções sexuais de 1:1,4 no tratamento campo, 1:1,42 em T18, 1:2,14 em T22 e 1:1,75 em T26 (Tabela 2). A análise de “deviance” indicou efeitos significativos entre os tratamentos, as datas das coletas e suas interações nas análises histológicas e estereológicas (Tabela 3). Houve correlação significativa (ρ = 0,72) entre as duas metodologias (histologia e estereologia). Fotomicrografias dos cortes transversais de Crassostrea gasar nos diferentes estágios de desenvolvimento do tecido gonádico são apresentadas nas Figuras 1, 2 e 3. As análises da estimativa dos parâmetros da regressão multinomial logística para a histologia e estereologia são apresentadas nas Tabelas 4 e 5, respectivamente. Os coeficientes de regressão dos efeitos de data de coleta (β1) não foram significativos para os tratamentos T18 e T26 na análise de histologia. Porém na análise de estereologia, apenas o tratamento T18 não teve coeficiente de regressão significativo. Os estágios de maturação foram diferentes ao longo do período amostral, sendo que o tratamento T18 foi o único que apresentou diferença significativa em relação aos demais, mantendo-se em estado constante de gametogênese durante todo o período amostral, sem melhora na maturação do tecido gonádico. No início do experimento as ostras encontravam-se nos estágios de repouso (80%) e maturação (20%). O estágio de gametogênese foi predominante em relação aos demais estágios em todos os tratamentos, sendo observada redução deste estágio com o passar do tempo com exceção dos animais mantidos a 18oC, em que foram observadas 71% das ostras neste estágio durante todo o período amostral (Figura 4). Ostras no estágio de repleção / pré-desova foram observadas após 10 dias em T18 (20%), 21 dias em campo (30%), 31 dias em T26 (40%) e 42 dias em T22 (10%). No campo e T26 foram observadas ostras no estágio de repleção / pré-desova a partir do 10º e 21º dia, respectivamente, sendo observados animais neste estágio em todas as coletas subsequentes até o final do período amostral, sendo as maiores porcentagens de ostras neste estágio entre todos os tratamentos observadas no tratamento campo após 63 dias (60%) e em T26 após 73 dias (70%) (Figura 4)..

(35) M 40 32 27 35 134. F 56 56 58 50 220. I 2 1 4 3 10. H 1 1 1 1 4. TOTAL 99 90 90 89 368. M 40,4 35,6 30,0 39,3 36,3. F 56,6 62,2 64,4 56,2 59,8. I 2,0 1,1 4,4 3,4 2,7. Frequência relativa (%) H 1,0 1,1 1,1 1,1 1,1. Proporção sexual (M:F) 1:1,14 1:1,75 1:2,14 1:1,42 1:1,68. Intercepto Tratamentos Datas de coleta Interação Tratamento x Data * GL: graus de liberdade.. Fonte de Variação. 3 8 22. GL. *. HISTOLOGIA Deviance χ2 1434,14 1372,13 31,01 1305,75 33,19 1237,42 34,16. <0,01 <0,01 0,01. Pr > χ. 2. 3 8 16. GL. *. ESTEREOLOGIA Deviance χ2 Pr > χ2 1781,77 1759,57 11,1 0,01 1676,70 41,43 <0,01 1519,39 78,66 <0,01. Tabela 3 Análise de “deviance” (ANODEV) para avaliar diferenças entre os tratamentos de temperatura, nas diferentes datas de coleta, para as análises histológicas e estereológicas.. CAMPO T26 T22 T18 TOTAL. TRATAMENTO. Frequência absoluta. Tabela 2 Frequência absoluta, relativa e proporção sexual de espécimes machos (M), fêmeas (F), indeterminados (I) e hermafroditas (H) da ostra nativa Crassostrea gasar nos diferentes tratamentos de temperatura.. 35.

(36) 36. A. B. C. D. Fig. 1 Fotomicrografias dos estágios de desenvolvimento do tecido gonádico de espécimes machos da ostra nativa Crassostrea gasar. A. Gametogênese; B. Repleção / pré-desova; C. Desova parcial e D. Desova total. Barra: 100 µm. A. B.

(37) 37. C. D. Fig. 2 Fotomicrografias dos estágios de desenvolvimento do tecido gonádico de espécimes fêmeas da ostra nativa Crassostrea gasar. A. Gametogênese; B. Repleção / pré-desova; C. Desova parcial e D. Desova total. Barra: 100 µm. A. B. Fig. 3 Fotomicrografias dos estágios de desenvolvimento do tecido gonádico da ostra nativa Crassostrea gasar. A. Indetermidado e B. Hermafrodita. Barra: 100 µm. Ostras no estágio de desova parcial foram observadas em maior proporção no tratamento T22 (32%), seguido de T26 (25%) e campo (20%). O estágio de desova total não foi observado nos tratamentos T18 e T22 durante todas as coletas. Animais neste estágio foram observados nos tratamentos T26, após 84 e 94 dias e em animais de campo após 42, 84 e 94 dias do início do experimento. No início do experimento foram observados ostras em estágio de repouso em todos os tratamentos, com redução de animais neste estágio nas coletas subsequentes (Figura 4). Neste estudo, observou-se correlação significativa (ρ = 0,72) entre as análises histológicas e estereológicas..

(38) ns: não significativo.. β1. β04. β03. β02. β01. Coeficiente. T26 -5,3762 (-7,8297 - -2,9227) -3,9344 (-5,6926 - -2,1762) -1,8111 (-3,278 - -0,3442) 0,0098 (-1,3918 – 1,4115) 0,1807 ns (-0,045 – 0,4065). Campo. -6,6921 (-9,1656 - -4,2186) -4,7633 (-6,4367 - -3,0899) -2,9487 (-4,3679 - -1,5296) -1,6725 (-2,9744 - -0,3707) 0,3325 (0,1402 – 0,5248). -4,279 (-6,2837 - -2,2743) -4,0807 (-6,0522 - -2,1091) -1,5615 (-3,2814 – 0,1584) -0,9872 (-2,6776 – 0,7033) 0,2312 (-0,0006 – 0,463). T22. -3,8195 (-5,6709 - -1,968) -3,5819 (-5,3821 - -1,7816) -2,2795 (-3,8876 - -0,6714) -2,1923 (-3,7903 - -0,5943) 0,1506 ns (-0,0658 – 0,367). T18. Tabela 4 Estimativas e, entre parênteses, intervalos de confiança (95%) para os interceptos (β0) e a covariável data de coleta (β1) na análise da regressão multinomial logística para a análise histológica.. 38.

(39) -4,2327 (-5,6299 - -2,8355). -3,9237 (-5,2619 - -2,5855. -2,1172 (-3,2553 - -0,9791). -0,9041 (-1,949 – 0,1409). 0,2358 (0,0751 – 0,3965). β01. β02. β03. β04. β1. ns: não significativo.. Campo. Coeficiente -5,6495 (-7,4862 - 3,8129) -5,1097 (-6,796 - 3,4234) -2,9109 (-4,2802 - 1,5415) -1,2187 (-2,4382 – 0,0008) 0,3259 (0,1424 – 0,5095). T26. 0,2434 (0,0802 – 0,4067). -1,0308 (-2,1355 – 0,0739). -1,815 (-2,9884 - -0,6416). -3,6444 (-4,9816 - -2,3072). -3,7493 (-5,0987 - -2,3999). T22. -0,0465ns (-0,0658 – 0,3670). -. -0,1849. -0,7059. -1,7457 (-3,0936 - -0,3979). T18. Tabela 5 Estimativas e, entre parênteses, intervalos de confiança (95%) para os interceptos (β0) e a covariável data de coleta (β1) na análise da regressão multinomial logística para a análise estereológica.. 39.

(40) 40. No início do experimento, o IC não diferiu entre os tratamentos. A análise de “deviance” para o IC mostrou que o efeito de data de coleta não foi significativo, porém houve interação entre tratamento e data de coleta (Tabela 6). Ocorreu aumento progressivo no valor de IC no tratamento T18, sendo observado neste tratamento o maior valor em relação aos demais no 73º dia de acondicionamento (10,98 ± 1,40%). Em contrapartida, no tratamento T26 ocorreu redução no valor de IC com o passar do tempo e o menor índice em relação aos demais tratamentos observado no 84º dia (5,69 ± 0,89%) (Figura 5). Não ocorreu diferença significativa no valor de IC nos demais tratamentos (Tabela 7). Para o IC os coeficientes de regressão não foram significativos para os tratamentos campo e T22, indicando que, nestes casos, não houve alterações significativas nos estágios de maturação do tecido gonádico ao longo do experimento..

(41) 3 1 3. GL*. 2 Log Likelihood -1437,791 -1374,374 -1373,371 -1338,488 63,42 1 34,88. Chi-Sq. <0,01 0,32 <0,01. Pr. ns: não significativo.. β1. β0. Coeficiente. T26 9,673 8,6989 – 10,6472) -0,3528 (-0,502 - -0,2037). Campo. 8,2412 (7,4395 – 9,0429) -0,0159 ns (-0,1387 – 0,1068). 8,1899 (7,4332 – 8,9466) 0,0959 ns (-0,0197 – 0,2115). T22. 8,6602 (7,9528 – 9,3676) 0,139 (0,0307 – 0,2473). T18. Tabela 7 Estimativas e, entre parênteses, intervalos de confiança (95%) para o intercepto (β0) e a covariável data de coleta (β1) na análise da regressão linear generalizada para o índice de condição.. Fonte de Variação Intercepto Tratamentos Datas de coleta Interação Tratamento x Data * GL: graus de liberdade.. Tabela 6 Análise de “deviance” (ANODEV) para avaliar diferenças entre os tratamentos de temperatura, nas diferentes datas de coleta, para o índice de condição.. 41.

(42) 42. Histologia. Estereologia Campo. 100%. 100%. 80%. 80%. 60%. 60%. 40%. 40%. 20%. 20% 0%. 0% 1. 10. 21. 31. 42. 52. 63. 73. 84. 94. 1. 10. 21. 31. 42. 52. 63. 73. 84. 94. 1. 10. 21. 31. 42. 52. 63. 73. 84. 94. 1. 10. 21. 31. 42. 52. 63. 73. 84. 94. 1. 10. 21. % de animais. T26 100%. 100%. 80%. 80%. 60%. 60%. 40%. 40%. 20%. 20% 0%. 0% 1. 10. 21. 31. 42. 52. 63. 73. 84. 94. T22 100%. 100%. 80%. 80%. 60%. 60%. 40%. 40%. 20%. 20%. 0%. 0%. 1. 10. 21. 31. 42. 52. 63. 73. 84. 94. T18 100%. 100%. 80%. 80%. 60%. 60%. 40%. 40%. 20%. 20%. 0%. 0% 1. 10. 21. 31. 42. 52. 63. 73. 84. 94. 31. 42. 52. 63. 73. 84. 94. Tempo (dias). Fig. 04 Porcentagem dos estágios de desenvolvimento do tecido gonádico da ostra nativa Crassostrea gasar acondicionadas sob diferentes temperaturas obtidas através das análises histológicas e estereológicas..

(43) IC. 43. Tempo (dias) Fig. 05 Índice de condição (IC) médio da ostra nativa Crassostrea gasar nos diferentes tratamentos de temperatura: T18, T22 e T26 e no tratamento campo (as barras representam o desvio padrão). Discussão Nas ostras do gênero Crassostrea, um mesmo indivíduo pode ser macho ou fêmea, de acordo com as condições ambientais (Wakamatsu 1973; Nascimento 1978) podendo ser observados animais que apresentam tanto gônadas masculinas como femininas. No processo de reversão sexual ocorre desde a dominância clara de um dos sexos até a predominância do sexo oposto, passando por uma série de estágios, inclusive aquele em que as células gametogênicas dos dois sexos são igualmente representadas (Nascimento 1978). No presente estudo, adotou-se o termo “hermafrodita simultâneo” para indivíduos em processo de alternância de sexo, como vem sendo amplamente empregado por diversos autores (Galtsoff 1964; Vilela 1975; Nascimento 1978). A frequência de hermafroditismo varia com a idade e o ambiente (Galtsoff 1964). Em diferentes populações de Crassostrea brasiliana (=Crassostrea gasar) coletadas do ambiente na região estuarino-lagunar de Cananéia, SP, a taxa de hermafroditismo foi de 0,6% (Galvão et al., 2000). Nascimento (1978) também notou baixa.

(44) 44. ocorrência de hermafroditismo (0,52%) em Crassostrea rhizophorae coletadas ao longo de 2 anos na mesma localidade. Heffernan et al. (1989) e Brousseau (1995) observaram índices semelhantes de hermafroditismo em Crassostrea virginica (0,2% e <1%, respectivamente). Corroborando estes autores, neste estudo observou-se pequena quantidade de hermafroditas, totalizando apenas 1,1% dos animais analisados. Em relação à proporção sexual, Galvão et al. (2000), observaram predominância de machos em C. gasar (1M:0,76F). Em Crassostrea gigas, os machos apresentam maiores proporções em grupos mais jovens (Dinamani 1987). Em Crassostrea rhizophorae, Lenz e Boehs (2011) observaram predominância de fêmeas em dois pontos da Baía de Camamu no estado da Bahia. Christo e Absher (2006) observaram proporção de 1,4 fêmeas para cada macho de C. gasar na Baía de Guaratuba/PR. Corroborando os resultados encontrados por Christo e Absher (2006) e Lenz e Bohes (2011), neste estudo observouse maior incidência de fêmeas em todos os tratamentos, com proporção sexual média de 1,68 fêmeas para cada macho. O início das atividades gametogênicas está intimamente relacionada às variações de temperatura da água (Loosanoff e Davis 1952), além de ter função preponderante nos processos de maturação estrutural e fisiológica dos gametas (Vélez e Epifanio 1981) e ser considerada um dos fatores determinantes na regulação da reprodução de bivalves (Sastry 1968; Robinson 1992; Rodríguez-Jaramillo et al 2001). Aumentos relativos de temperatura comumente favorecem o processo de vitelogênese em moluscos (Robinson 1992) e temperaturas baixas influenciam o início do processo de desenvolvimento sexual, que inclui acúmulo de reservas, gametogênese, maturação e eliminação de gametas (Loosanoff 1945; Bayne 1976; Alvarez 1991; Ruiz et al. 1992). Entretanto, em Crassostrea gigas, a gametogênese cessa em temperaturas inferiores a 10ºC (Mann 1979). Em estudo realizado com esta espécie, observou-se que o desenvolvimento de ovócitos sempre ocorre em temperaturas acima de 10ºC e que ostras maduras podem ser obtidas dentre animais mantidos em temperaturas acima de 16ºC (Ruiz et al. 1992). Em Crassostrea virginica mantida em diferentes temperaturas, o tempo necessário para a maturação variou entre os tratamentos, demonstrando haver relação entre o aumento da temperatura e o tempo de maturação (Loosanoff 1945). Reprodutores de C. gigas acondicionados em temperatura de 24oC produzem gametas semanas.

(45) 45 antes do que aqueles produzidos quando mantidos a 20oC (Robinson 1992). No presente estudo, houve uma tendência de aumento da maturação do tecido gonádico em Crassostrea gasar com o aumento da temperatura, entretanto, não houve diferença significativa entre os tratamentos T22, T26 e campo, sendo todos superiores ao T18. Em Crassostrea gigas acondicionadas em temperaturas entre 22 e 25ºC ocorreu maturação dos ovócitos em tempo menor de exposição à temperatura do que quando mantidas a 19ºC (1 e 2 semanas, respectivamente) (Chávez-Villalba et al. 2002). A influência da temperatura sobre a gametogênese foi evidente em ostras mantidas entre 16-22ºC. No presente estudo, o estágio de gametogênese foi predominante em todos os tratamentos em relação aos demais estágios, com redução da porcentagem de ostras neste estágio com o passar do tempo, exceto no tratamento T18 em que a porcentagem de ostras manteve-se elevada em todo o período amostral. Loosanoff e Davis (1952) acondicionaram Crassostrea virginica em temperaturas que variaram entre 10 e 30ºC para determinar o número de dias necessários para o desenvolvimento dos primeiros gametas maduros. Os resultados mostraram que o tempo de desenvolvimento variou de 26,5 dias a 15ºC para 4,9 dias a 30ºC. Ostras da espécie C. gigas do sexo feminino necessitaram de 19 semanas para maturar à temperatura de 15 e 18ºC e 15 semanas a 21ºC (Mann 1979). Estes autores observaram que ostras expostas à temperatura de 16ºC apresentaram os primeiros gametas maduros após quatro semanas de acondicionamento e não apresentaram o estágio maduro após oito semanas, demonstrando que estes animais, provavelmente, necessitam de uma exposição de temperatura mais prolongada para chegar a este estágio. No presente estudo ostras em estágio de repleção/pré-desova foram observadas após 10, 21, 31 e 42 dias no tratamento T18, no campo, T26 e T22, respectivamente, porém as maiores porcentagens de ostras neste estágio foram observadas após 63 e 73 dias nos tratamentos campo e T26, respectivamente. A interação entre temperatura e tempo de exposição dos reprodutores está diretamente relacionada com as taxas de acúmulo de glicogênio e desenvolvimento sexual em ostras (Shpigel 1989; Ruiz et al. 1992). Em regiões temperadas, durante o inverno se inicia o acúmulo de glicogênio na ostra, o qual constitui a maior parte do tecido gonádico (Rupp 1997). Com o aumento da temperatura na primavera, as gônadas proliferam e os folículos são progressivamente preenchidos pelas células germinativas, as quais vão utilizando o glicogênio do tecido. Quando madura, a ostra já não apresenta glicogênio nas gônadas, os folículos.

(46) 46. estão preenchidos pelos gametas e ocorre a diminuição do peso da ostra após a liberação dos gametas. Períodos de gônadas maduras foram relatados coincidindo com altos valores de IC por diversos autores (Nascimento 1978; Nascimento e Pereira 1980; Galvão 2000; Christo e Absher 2006). Em C. gigas, altos valores de IC foram verificados no inverno, período em que as reservas de energia são acumuladas nos tecidos para serem posteriormente utilizadas durante a gametogênese (Dridi et al. 2007). Altos valores de IC foram observados em C. gigas quando estas foram submetidas a condições de inverno, fato atribuído a ausência de desova neste período (Fabioux et al. 2005). Ao contrário, reduções do IC podem refletir períodos de estresse envolvendo a utilização de reservas ou eliminação de gametas (Bayne et al. 1985). Corroborando estas afirmações, no presente estudo ocorreu aumento progressivo no valor de IC no tratamento T18, no qual foram observadas baixas porcentagens de ostras em estágio de desova parcial e não foram observadas ostras em estágio de desova total. Em contrapartida, no tratamento T26 ocorreu redução do valor de IC com o passar do tempo, com o menor valor de IC observado no mesmo período em que foram observados os primeiros animais no estágio de desova total. Em ostras da Baía de Paranaguá o IC foi utilizado para estimar períodos de maturação sexual (Absher e Christo 1993), sendo que este índice pode ser um indicativo do período reprodutivo (Aswani et al. 2004) e/ou estado nutricional dos indivíduos, como descrito em Crassostrea rhizophorae (Nascimento e Pereira 1980); Crassostrea gasar (Diadhiou e Le Pennec 2000); Crassostrea brasiliana (=C. gasar) (Galvão et al. 2000); Crassostrea virginica (Ren et al. 2003) e Crassostrea gigas (Orban et al. 2004). A partir dos resultados obtidos através deste estudo, observouse aumento na maturação do tecido gonádico de ostras nativas C. gasar com o aumento da temperatura, sendo que nestas condições, sugere-se que em 18ºC ocorre acúmulo de reservas energéticas e em temperaturas acima de 22ºC ocorre a maturação dos gametas. Neste estudo animais mantidos em campo, mantiveram a mesma condição de maturação dos animais mantidos em laboratório, sugerindo-se que estes podem permanecer em ambiente natural até a indução a desova em laboratório. Agradecimentos Os autores agradecem à Dra. Guisla Boehs pela revisão crítica do manuscrito antes da submissão e à Capes pela bolsa de mestrado concedida a CO Ramos..