CENTRO DE AQÜICULTURA
Campus de JaboticabalRESPOSTAS LOCAIS E SISTÊMICAS INDUZIDAS POR
ENDOTOXINA EM Piaractus mesopotamicus
(Holmberg, 1887) TRATADOS COM CROMO
Orientador: Prof. Dr. Flávio Ruas de Moraes
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Aqüicultura, Área de Concentração em Aqüicultura de Águas Continentais Como parte das exigências para a Obtenção do Título de Doutor.
Jaboticabal, SP Janeiro de 2002
Flores Quintana, Carolina
F634r Respostas locais e sistêmicas induzidas por endotoxinas em Piaractus mesopotámicus (Holmberg, 1887) tratados com cromo. – Flores Quintana, Carolina – Jaboticabal, 2002.
vi, 67 f.: il. ; 28 cm
Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Centro de Aqüicultura, 2002.
Orientador: Flavio Ruas de Moraes
Banca examinadora: Hugo Alberto Domitrovic, Sergio Fonseca Zaiden, Joaquim Gonçalves Machado Neto, Laura Satiko Okada Nakaghi.
Bibliografia
1. Fisiopatologia. 2. Estresse. 3. Peixe. I. Título. II. Jaboticabal- Centro de Aqüicultura.
CDU 639.31
Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação – Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação.
AGRADECIMENTOS
Ao Professor Flávio Ruas de Moraes pela orientação e por facilitar todas as minhas atividades durante este período.
A Facultad de Ciências Veterinárias, da Universidad Nacional del Nordeste (UNNE), pela liberação e apoio financeiro, e ao Projeto FOMEC pela bolsa outorgada durante os anos 1999 e 2000.
Ao programa de Pós-Graduação do Centro de Aqüicultura da Unesp, por brindarem a possibilidade de completar esta parte de minha formação.
A Josafá pela doação dos peixes utilizados neste trabalho.
A meus primeiros amigos brasileiros: Valeria Nogueira de Souza e Murilo dos Santos, pela amizade, acolhida e por facilitar nossa adaptação a este país.
A Eduardo Makoto “Twim” pela ajuda brindada durante o experimento.
Aos amigos Juliana Schober Gonçalves Lima e Flávio Daolio Gonçalves pela amizade, colaboração e apoio durante este período.
Aos amigos colombianos Ana e Miguel, por sua colaboração durante o experimento e ajuda durante as analises de laboratório.
A Rossineide Rocha pelas sugestões e incentivo constante.
Ao amigo Rodrigo Yudi Fujimoto pelos momentos de discussão e intercambio de idéias, curiosidade e vontade constante de trabalho.
A todos os colegas do CAUNESP pelos momentos compartilhados, a colaboração continua, o convívio diário.
A Piriquito, Zezé, Bel, Luis, Luisa, Michele, Lívia e Matheus, pela companhia, por momentos compartilhados, por fazermos sentir como em casa, diminuindo as saudades da Argentina.
Aos amigos da Cabritolandia da Produção Animal: Morais, Angela, Isabelle e Gustavo, pela amizade, pelos momentos compartidos, pelas sugestões e discussão que ajudaram a completar este trabalho.
A Djalma de Freitas e Rosangela pela amizade e chimarrão compartilhados. A todos os aqui não mencionados, mas que contribuíram no desenvolvimento desta jornada e continuarão presentes na minha historia.
ÍNDICE i CAPITULO 1-... 1 REFERENCIAL TEÓRICO ... 1 Estresse ... 2 Inflamação ... 6 Lipopolissacarídeo (LPS) ... 7 Cromo... 9 Referências Bibliográficas... 11 CAPÍTULO 2-... 17
RESPOSTAS SISTÊMICAS INDUZIDAS POR ENDOTOXINA EM PACU Piaractus mesopotamicus (Holmberg, 1887) SUPLEMENTADOS COM CROMO ... 17
Resumo ... 17
RESPONSES SYSTEMIC INDUCED BY ENDOTOXINA IN PACU Piaractus mesopotamicus (Holmberg, 1887) SUPPLEMENTED WITH CHROMIUM .... 18
Summary... 18
Introdução ... 19
Material e Métodos ... 21
Tabela 1. Participação porcentual dos ingredientes da ração completa. ... 22
Figura 1- Brânquias: as retas mostram os locais onde se realizaram as diferentes medidas (HE, 400 x)... 24
Resultados e Discussão ... 24
Tabela 2. Médias e desvio padrão dos parâmetros sanguíneos e hepáticos de pacu submetidos a estresse inflamatório. ... 25
Tabela 3. Médias e desvio padrão dos parâmetros sanguíneos e hepáticos, de pacu submetidos a estresse inflamatório, nos diferentes tempos de amostragem. ... 26
Tabela 4. Médias e desvio padrão da morfometria branquial, de pacu submetidos a estresse inflamatório, nos diferentes tratamentos e tempos de amostragem.... 31
Figura 2- Brânquias de pacu após 48 horas da inoculação com LPS. 1- Estrutura branquial conservada e 2-Brânquias com escassas áreas de hiperplasia na base
das lâminas secundarias. (HE, 200 x)... 32
Conclusões... 33
Refêrencias Bibliográficas... 33
CAPÍTULO 3-... 39
EFEITO DA SUPLEMENTAÇÃO COM CROMO TRIVALENTE SOBRE A INFLAMAÇÃO INDUZIDA POR ENDOTOXINA EM PACU Piaractus mesopotamicus (Holmberg, 1887) ... 39
Resumo ... 39
EFFECT OF SUPPLEMENTATION WITH TRIVALENT CHROMIUM IN THE INFLAMMATION INDUCED BY ENDOTOXINA IN PACU Piaractus mesopotamicus (Holmberg, 1887) ... 40
Summary... 40
Introdução ... 41
Material e Métodos ... 45
Tabela 1. Participação percentual dos ingredientes na ração completa... 46
Resultados e Discussão ... 48
Figura 1- Exsudato inflamatório na cavidade abdominal de pacu após 24 horas da inoculação de LPS. ... 49
(x 200 Giemsa)... 49
Tabela 2. Valores médios e desvio padrão do percentual de tipos celulares no exsudato inflamatório de pacu submetidos a injeção de LPS nos diferentes tratamentos... 49
Figura 2- Macrófagos no exsudato peritoneal. 1- células residentes (Giemsa, x 1000). 2-3-4- grupos de macrófagos com material fagocitado e citoplasma com aparência espumosa (2: Giemsa, x 400; 3 e 4: Giemsa x 1000). ... 50
Figura 3- Linfócitos presentes (L) no exsudato peritoneal, 48 horas após a inoculação de LPS. As células maiores representam formas menos diferenciadas da serie linfóide. (Giemsa. x 1000) ... 51
Tabela 3. Valores médios e desvio padrão do percentual de macrófagos e linfócitos presentes no exsudato inflamatório de pacu submetidos a aplicação de LPS nos diferentes tempos de amostragem ... 51
Tabela 4. Médias e desvio padrão da concentração de proteínas plasmáticas e do número de centros de melanomacrófagos (CMM) de pacu submetidos a injeção de LPS nos diferentes tratamentos. ... 52 Tabela 5. Médias e desvio padrão de proteínas plasmáticas e centro
melanomacrófagos (CMM) de pacu submetidos a aplicação de LPS nos
diferentes tempos de amostragem ... 53 Figura 4- Rim anterior. 1- tecido linfóide reativo (TL) em estreita relação com glândula interrenal (I). 2-3-4: pequenos centros melanomacrófagos ( ), sem cápsula e com pigmento preto distribuídos no parênquima renal, em associação com condensações linfóides e vasos sanguíneos. (HE. 1x 100; 2 , 3, 4 x 200) .. 55 Tabela 6. Médias e desvio padrão das células sanguíneas de pacu submetidos a injeção de LPS nos diferentes tratamentos. ... 56 Tabela 7: Médias e desvio padrão das células sangüíneas de pacu submetidos a injeção de LPS nos diferentes tempos de amostragem... 57 Conclusões... 60 Refêrencias Bibliográficas... 60
CAPITULO 1-
REFERENCIAL TEÓRICO
Uma complexa rede de comunicações entre os diversos tipos celulares coordena o desenvolvimento, crescimento, diferenciações e metabolismo celular em todos os órgãos. Dentro de um pequeno grupo, as células se comunicam por contacto direto de suas membranas celulares utilizando potenciais elétricos ou pontes protéicas que permitem a passagem seletiva de sustâncias mensageiras. Quando a comunicação deve atingir células localizadas a distâncias maiores, diversas moléculas atuam como sinalizadoras nos tecidos alvos desencadeando a resposta (BIANCO e RABELO, 1999).
Duas décadas atrás o sistema imune era estudado independentemente de outros sistemas. Assim, imunologistas, endocrinologistas e neurologistas realizavam pesquisas isoladas, cada um na sua área. Atualmente, os resultados de vários trabalhos demonstram a relação que existe entre esses sistemas, como a presença de receptores para hormônios em células do sistema imune e a existência de receptores para citocinas em células do sistema neuroendócrino, sobre os quais está baseado o conceito de bi-direcionalidade, representando a relação entre os sistemas neuroendócrino e imune. Essa relação foi confirmada pela descoberta de que a estimulação do hipotálamo pode induzir células linfóides a sintetizar neuropeptídeos, que por sua vez regulam a atividade neuroendócrina e que citocinas e peptídeos semelhantes, produzidos pelo sistema nervoso, modulam a atividade do sistema imune, confirmam essa relação (KHANSARI et al., 1990; LIPTON e CATTANIA, 1997; STRAUB et al., 1998; BERGQUIST et al., 1998 e WEYTS et al., 1999).
Para muitos pesquisadores, todas as ações do sistema imune e neuroendócrino estão destinadas a manter o bem estar do linfócito, um dos principais componente do sistema imune, mas com muitas características de célula neuroendócrina.
Em peixes, as respostas dos diferentes sistemas têm grande similitude com os vertebrados superiores, com diferenças no número de órgãos envolvidos e no tempo dessas respostas. Assim, neuropeptídeos, hormônios e citocinas, atuam como mediadores da resposta a distintos estímulos nestes vertebrados muitas vezes denominados inferiores, sugerindo que a resposta é ancestral e que os mecanismos pelos quais é mediada foram conservados durante a evolução.
Possivelmente dos três sistemas inter-relacionados, o imune, o nervoso e endócrino, esta ultimo seja o que mais atenção recebeu nas pesquisas sobre estresse, em forma quase proporcional a intensificação da produção animal
Estresse
Segundo PICKERING (1981) poucos conceitos suscitaram tantas controvérsias como do estresse, e como resultado, existem numerosas definições na literatura. Assume-se que existam estímulos que atuam sobre os sistemas biológicos provocando respostas.
Diferentes estímulos geram respostas em distintos níveis do organismo animal destinados a manter a homeostase. O Síndrome Geral de Adaptação é um processo que opera em três fases: 1- fase de reconhecimento ou alerta, 2- fase de resposta propriamente dita, e 3- fase de exaustão ou de conseqüências.
Estímulos ou alterações no meio interno ou externo podem iniciar um estado de alerta que, ao ser reconhecido pelo sistema nervoso central, gera modificações com as quais o organismo tenta se adaptar para compensar as condições alteradas. Caso estas condições se prolonguem ou sejam muito intensas, impossibilitarão a adaptação e o organismo acaba desenvolvendo uma condição patológica. Mais que uma alteração mórbida, a resposta ao estresse deve ser considerada como um componente normal do metabolismo, destinado a re-direcionar aspectos metabólicos e elementos celulares.
Em mamíferos os efeitos do estresse são mais conhecidos que em peixes, mas mecanismos similares aparecem em ambos grupos, sendo observadas diferenças baseadas, principalmente, nos efeitos da temperatura sobre os sistemas biológicos dos vertebrados aquáticos (FRIES, 1986; BARTON et al., 1987; BLY e CLEM, 1991).
O grau do estresse é determinado pela intensidade das respostas ao estímulo estressante. Em peixes são numerosos os trabalhos que medem as respostas primárias, secundarias e mudanças na performance individual, como indicadores do estresse. Este , quando excede a capacidade de adaptação do organismo, ocasiona a morte ou, em casos menos severos, afeta o crescimento, a reprodução, predispõe a doenças e diminui a resistência a novos estresses. No entanto, as respostas em seus diferentes níveis, dependem muito da capacidade particular de cada espécie e de cada individuo.
Denominam-se respostas primárias àquelas que resultam da ativação dos eixos hormonais, dos quais os eixos hipotálamo-pituitaria-adrenal (HPA) e o simpático-cromafim, foram os mais estudados. Outros eixos, como o somatotrófico, tirotrófico, prolactínico e gonadotrófico, também são modificados.
A avaliação das respostas primárias podem ser aferidas pelos parâmetros bioquímicos, estudados na dosagem daqueles hormônios no plasma, e histopatológicos, pelas modificações estruturais de células do hipotálamo, corticotroficas da hipófise ou inter-renais que são avaliadas quanto ao tamanho celular, diâmetro do núcleo e/ou conteúdo de ácido ribonucléico.
As respostas secundárias estão referidas como mudanças metabólicas, que podem ser bioquímicas, fisiológicas e hematológicas, determinados a partir dos valores de glicogênio, glicemia, proteínas plasmáticas, osmolaridade e outras. Muitas destas respostas secundárias permanecem por vários dias após o desaparecimento da resposta primaria que a gerou.
O eixo HPA foi possivelmente o primeiro a ser reconhecido nos estudos endócrinos do estresse, sendo até hoje o mais estudado. Muitos artigos destacam a importância da ativação do eixo HPA em situações de estresse (BATEMAN, 1989; BARTON e IWAMA, 1991; RUANE, 1999) mas diferentes tipos de estresse variam quanto ao eixo ativado, como pode ser observado nos experimentos com modelos hemorrágicos, onde se verifica liberação de fator de liberação de hormônios corticotrófico (CRF), ocitocina, vasopresina e catecolaminas, enquanto que nos modelos de hipotensão é ativado o eixo simpático-cromafins (WENDELAAR BONGA, 1997; REID et al.,1998).
A ativação do eixo HPA, que em peixes se denomina HPI (hipotálamo-pituitaria-interrenal), tem como resultado a elevação do cortisol, sintetizado nas células interrenais dos peixes, situadas na porção cefálica do rim. O rim dos peixes é um órgão misto, composto por elementos hematopoiéticos, reticuloendoteliais, endócrinos e excretores, que participam na osmorregulação, hematopoieses, imunidade, metabolismo endócrino e excreção (MATTY, 1985). Esta complexidade funcional é devida à localização de glândulas interrenais, células cromafins, folículos tireóideos e ampla rede vascular e nervosa, num órgão anatomicamente simples. Esta característica demonstra a importante relação entre sistemas imune, endócrino e nervoso, presente em espécies que são filogenéticamente inferiores.
Quando acontece a liberação de cortisol no sangue, 90 a 95% dele não está disponível, encontrando-se inativo por estar ligado a proteínas específicas, modificando-se a relação fração livre/ativa quando as concentrações destas diminuem. Postula-modificando-se que no estresse crônico, a quantidade destas proteínas específicas de união esta aumentada e a inativação do cortisol é maior (MOMMSEN et al., 1999).
O cortisol afeta o metabolismo de carboidratos, lipídeos e proteínas e sua ação metabólica ocorre por meio de mecanismos rápidos, não genômicos ou por mecanismos lentos, com modificação genômica e duração mais prolongada. A liberação do cortisol influencia a adaptação do organismo ao estresse com conseqüentes modificações no estoque glicogênio hepático, na glicemia e no índice hepatossomático.
O glicogênio constitui uma forma de armazenamento de glicose desenvolvida pelo organismo, que apresenta a característica de ser rapidamente mobilizável. Frente a insuficiente quantidade de glicose na dieta ou quando as exigências estão aumentadas, o glicogênio hepático é rapidamente convertido em glicose. Os principais depósitos de glicogênio estão situados no músculo esquelético e no fígado, apesar de que todas as células possam armazena-lo em pequenas quantidades.
O glicogênio muscular serve como combustível de reserva para a síntese de ATP durante o processo de contração muscular, enquanto as reservas hepáticas são utilizadas para manter as concentrações de glicose no sangue.
As enzimas para os processos de glicólise, ciclo do acido tricarboxílico, “shunt” de pentose fosfato, gliconeogênese e síntese de glicogênio já foram demonstradas em peixes (WILSON et al., 1983). A síntese e degradação do glicogênio são processos intimamente relacionados e suas vias metabólicas são reguladas pela ação hormonal, a qual responde à níveis de metabólitos presentes e às necessidades de energia (CHAMPE e HARVEY, 1997).
Modificações no estoque de glicogênio hepático repercutem em alterações nos valores sanguíneos de glicose. A variação da glicemia e parâmetro auxiliar na avaliação da magnitude do estresse, oferece a vantagem de fácil determinação e faixa de elevação mais estreita que a do cortisol, aumentando cerca de duas vezes frente às 100 vezes observadas para o cortisol (POTTINGER, 1999).
Em situações de aumento de exigências energéticas, os carboidratos estocados como glicogênio são suficientes apenas para as primeiras horas, pelo que o organismo deve começar a degradar proteínas e lipídeos. A utilização de gorduras ocorre com eficiência, porém, às vezes não consegue suprir o cérebro com a glicose necessária,
razão pela qual o organismo recorre às proteínas, através da gliconeogênesis hepática, gerando hiperglicemia temporária.
O efeito protetor da hiperglicemia é oneroso para o organismo e para diminuir este custo energético é aumentada a resistência temporária dos tecidos periféricos a insulina, reduzindo a utilização total de glicose, processo mediado por hormônios contrarreguladores como catecolaminas, cortisol e glucagon (CHAMPE e HARVEY, 1997; MOMMSEN et al., 1999).
Os estímulos hormonais para utilização de glicogênio, lipídeos e proteínas agem diretamente sobre o fígado dos peixes, ocasionando modificações do peso deste órgão, avaliadas por índices criados para comparar diferentes condições de vida e identificar situações de bem-estar. Assim surgiram o fator de condição, o tamanho relativo das gônadas, o tamanho relativo do fígado e do baço, que oferecem informações que deverão ser avaliadas dentro do contexto em que foram obtidas.
O fígado dos peixes constitui o sítio principal de armazenamento de glicogênio e lipídeos e suas modificações quantitativas alteram o índice hepatossomático (IHS) obtido pela relação entre o peso do fígado e o peso do peixe. Também diferentes condições fisiológicas como estado de nutrição, sexo, fase do ciclo reprodutivo ou diversos processos infecciosos, podem modificar este índice. Além disto, Selye (1939, citado por MATTERY et al., 2000), estabeleceu os primeiros índices morfológicos do estresse ao observar em mamíferos o aumento da glândula adrenal, atrofia de órgãos linfóides e surgimento de úlceras gastrintestinais.
A administração de cortisol em peixes induz atrofia de mucosa gástrica, diminuição da absorção de nutrientes, menor eficiência de conversão alimentar e perda de peso. Há ainda diminuição do hormônio T3, que regula a entrada de nutrientes (BERTÓK, 1998). Posteriormente outros autores incorporaram modificações estruturais observadas nas brânquias dos peixes, em ambientes contaminados (AUDET e WOOD, 1993), durante a adaptação a águas pobremente mineralizadas (LAURENT et al., 1994) e em outras situações de estresse como mudanças na temperatura, pH, acidez, e outras. (WENDERLAAR BONGA, 1997).
As alterações hemodinâmicas das brânquias podem variar desde edema parcial ou geral que separa o epitélio das lâminas branquiais, aumentando a distância de difusão, ou serem mais severas, como congestão ou telangiectasia. MALLAT (1985) agrupa a este tipo de modificações nas brânquias como não específicas, já que representam um dano mas também são parte da própria resposta compensatória.
As respostas compensatórias ou mesmo adaptativas incluem hipertrofia e hiperplasia do epitélio e das células clorídricas, diminuição de células mucosas e infiltração de células inflamatórias. Em algumas situações estas respostas não são observadas pois a quantidade de células existentes no tecido branquial encontra-se em equilíbrio entre o processo de formação e de apoptose, apesar de que estes processos estão acontecendo num ritmo muito mais acelerado que o normal. O cortisol influencia diretamente estes processos, estimulando a diferenciação e a migração celular (WENDERLAAR BONGA, 1997).
Inflamação
Assim como a resposta ao estresse, o processo inflamatório constitui uma reação à agressão, caracterizada por uma serie de alterações que tendem a limitar os efeitos do agressor, sendo um processo benéfico para o organismo.
Todo processo inflamatório tem vários componentes, que estão presentes em todos os vertebrados: células teciduais fixas, leucócitos e trombócitos, mediadores da reação inflamatória e proteínas plasmáticas. No entanto, o avanço no conhecimento da dinâmica do processo inflamatório nos peixes, não tem acompanhado a evolução dos estudos do mesmo processo nos mamíferos.
FINN & NIELSSEN (1971) estudaram a resposta inflamatória em truta arco íris, a temperaturas de cinco e 15 graus centígrados, demonstrando a existência de fenômenos vasculares que afetam a permeabilidade, marginação leucocitária, fagocitose por polimorfonucleares e macrófagos, falta de formação de pus e abscessos, achando uma resposta similar aos mamíferos, porém com diferenças em tempo e extensão. ELLIS et al. (1976) investigaram as propriedades fagocíticas do tecido linforreticular em Pleuronectes platessa, com a injeção intraperitoneal de carvão coloidal, destacando a importante atividade fagocítica dos elipsóides do baço, discutindo a significância da associação de estruturas linfóides no contexto dos mecanismos de defesa dos peixes. Estes mesmos autores relatam a baixa capacidade fagocítica dos neutrófilos sobre as partículas de carvão, fato já destacado por KLONTZ (1972), que reportou a falta de atividade fagocítica dos neutrófilos de truta arco íris em infecções bacterianas.
Por outro lado, FINN e NIELSSEN (1971) observaram a atividade fagocítica em neutrófilos de truta arco íris com inflamação bacteriana e SUZUKI (1986) destaca a alta
atividade fagocítica dos neutrófilos no exsudado peritoneal de Cyprinus carpio e
Oreochromis niloticus, após a injeção intraperitoneal de parafina líquida. McARTHUR
(1984) monitorou a cinética de aparição dos diferentes tipos celulares em Pleuronectes platessa, obtendo em primeiro lugar, uma marcada elevação de leucócitos (neutrófilos e fagócitos mononucleares) nos dois a três dias iniciais, resposta mais prolongada que a observada em animais homeotermos, e em segundo lugar, uma notável diminuição com a aplicação de cortisol. MATUSHIMA e MARIANO (1996) estudaram a cinética da reação inflamatória inoculando carragenina na bexiga natatória de tilápia do Nilo (O.
niloticus), que se caracterizou pela abundância de trombócitos e menor quantidade de
macrófagos.
Muitas das características anatômicas e funcionais dos vertebrados homeotermos estão presentes em teleósteos. Porém, algumas diferenças chamam a atenção, como a falta de medula óssea, que é substituída pela parte anterior do rim, e de centros germinativos em órgãos do sistema imune. Segundo ZAPATA (1992), observa-se demora na resposta à segunda exposição a antígenos, baixa afinidade nos mecanismos de defesa, pouca heterogeneidade e memória imunológica, além da interferência da temperatura em tais processos. Porém, apresentam linfócitos B, T, células citotóxicas semelhantes aos linfócitos NK e células dendríticas com capacidade de reter complexos imunes.
Os resultados apresentados por diferentes autores sobre a inflamação em peixes são controvertidos, devido à diversidade de espécies estudadas e técnicas empregadas. Além disso, os padrões morfológicos utilizados para classificar os tipos celulares são de mamíferos e não se conhecem os valores fisiológicos de diferentes parâmetros, que possam ajudar a determinar a magnitude das modificações. Existe grande confusão entre linfócitos e trombócitos, semelhantes morfologicamente mas não funcionalmente. Inclusive alguns trabalhos ignoram a presença de trombócitos, outros os incluem nas fórmulas leucocitaria e alguns autores como RANZANI PAIVA (1991) questionam a presença de monócitos em animais sadios.
Lipopolissacarídeo (LPS)
A inoculação de endotoxinas para estudar a cinética da resposta deixou em evidência a resistência dos peixes a este tipo de substâncias. As endotoxinas são
componentes estruturais da parede celular de bactérias Gram negativas, que apresentam uma fração antigênica O específica, que serve para o reconhecimento imune e outra fração não específica, o lipídeo A, que é pobremente reconhecida pelo sistema imune específico.
Está demonstrado que o lipídeo A, denominado lipopolissacarídeo ou LPS, é responsável pelos efeitos tóxicos das endotoxinas, que se evidencia já em doses inferiores a um nanogramo, capazes de produzir febre, leucocitose e outras respostas de fase aguda em humanos
Quando LPS entra no organismo une-se a LBP, proteína plasmática sintetizada no fígado, que aumenta sua concentração entre 100 e 1000 vezes. O complexo LPS-LBP se une a receptores específicos denominados CD14, na superfície dos monócitos e macrófagos. O LPS estimula os fagócitos mononucleares a sintetizar citocinas, tais como o factor de necrose tumoral-alfa (TNFα),interleucina1 (IL-1), seis (IL-6), oito (IL-8), interferão (IFN),oxido nítrico(NO), mas excessos na secreção destes mediadores, especialmente TNFα e IL-1, são responsáveis pelo fenômeno de choque endotóxico, muitas vezes com complicações fatais (WRIGHT et al. 1990). TNFα estimula o eixo HPA, que responde imediatamente elevando a secreção de catecolaminas e ACTH, que por sua vez estimula a glândula adrenal, aumentando a secreção de glicocorticoides (BERTÓK, 1998).
TNFα estimula a migração de neutrófilos, os que ao serem ativados secretam
NO, destruindo células endoteliais, com exposição de colágeno, ativação da cascata da coagulação, com diminuição do tempo de coagulação (EIGLER, et al., 1997).
Os peixes respondem de forma diferente ao LPS, mostrando-se refratários aos efeitos endotoxémicos, não apresentando coagulopatias, hipotensão ou mortalidade, depois da administração de doses de 20 a 100 mg/kg de LPS (CONGLETON et al., 1991 e ROBERTSEN, 1999). Apesar disto, algumas evidências sugerem que o modelo de fase aguda da inflamação observado em mamíferos, pode ser aplicado a peixes. LPS em doses de cinco-10 mg/kg, são reportados como aceleradores da glicogenólise em salmão, elevadores das concentrações de cortisol sérico em truta e estimuladores de neutrofilia em enguias (HINE e WAIN, 1988.). Mas recentemente foi demonstrado que LPS induz a produção de componente C3 (YANO, 1996).
LPS induz numerosas modificações metabólicas em peixes, observando-se aumento dos níveis circulantes de cortisol e proteína C reativa (CRP), sendo difícil as
comparações entre os resultados dos distintos pesquisadores, pois, segundo WHITE et al. (1984), o tempo que demora para que aconteçam ditas modificações depende da fonte de LPS utilizada, do método empregado para seu isolamento e da via de aplicação da endotoxina. Estes autores compararam a via intraperitoneal e endovenosa, encontrando diferenças em relação a via e tipo de LPS empregado
A inoculação de LPS na bexiga natatória de tilápias causou a formação de exsudato, constituído principalmente por neutrófilos (96%) ás 24 horas da aplicação (ENDO et al. 1997) e diminuição da concentração plasmática de ferro em truta , pela liberação de lactoferrina das granulações de neutrófilos, que é interpretado como mecanismo de defesa do organismo que faz desaparecer o ferro necessário para o crescimento bacteriano (CONGLETON et al., 1991).
Cromo
Atualmente os programas preventivos em produção animal relacionam adequada nutrição com redução do estresse e melhoras na resposta imune. A inclusão de grandes quantidades de vitamina C, ácidos graxos enriquecidos, glucanos ou probióticos são utilizados para melhorar a habilidade dos peixes para resistir ao estresse (ALI e BADAWI, 1997).
Até 1950 se considerava 13 os elementos minerais essenciais, que compreendiam macro e micro elementos. Em 1953 acrescentou-se o molibdênio e, em 1957, o selênio (Mc DONALD, 1979). Em 1993, qualquer composto de cromo era considerado tóxico pela EPA (Enviromental Protection Agency), figurando entre os vinte elementos de maior toxicidade. Estudos do Comitê Técnico de a Organização Mundial da Saúde (1973) e o Programa Internacional de Segurança Química (IPCS-International Programmeon Chemical Safety, 1988) descreviam o cromo trivalente (Cr3) como um nutriente essencial para o homem e os animais.
O cromo é um elemento em transição, encontrado naturalmente em estado oxidado, na forma di, tri e hexavalente. O cromo hexavalente está associado a problemas de toxicidade, porém, o cromo trivalente é o que interessa do ponto de vista nutricional, pois é mais estável, tem baixa toxicidade e apresenta grande margem de segurança (CAZES, 1999).
Desde 1988 existe grande interesse no cromo trivalente devido as melhorias geradas para a saúde humana, particularmente para a prevenção da intolerância a glicose (MERTZ, 1993). OKADA et al. (1989), demonstraram que a administração de cromo estimula a síntese de RNA, sugerindo um papel regulador na síntese de ácido nucléico. Experimentalmente, animais alimentados com dietas deficientes em cromo desenvolveram intolerância a glicose, diabetes, acompanhado por hiperglicemia, infertilidade, elevação do colesterol sérico, diminuição do crescimento e da longevidade (ANDERSON, 1981).
O cromo é essencial para os animais domésticos, tendo sua função biológica associada com a insulina. Atua no crescimento, metabolismo de carboidratos e lipídios, síntese de proteínas e na melhoria da resposta imune às enfermidades (ANDERSON, 1981, MOWAT, 1993). O papel do cromo é maximizar a ação da insulina melhorando direta ou indiretamente o sistema imune. Muitos tipos de células do sistema imune necessitam de insulina para desempenhar suas funções; as células mononucleares têm receptores de insulina em sua superfície, similares aos presentes em outros tecidos. Também foi descrita a deficiência de receptores de insulina sobre as células mononucleares que exibem os pacientes diabéticos humanos, e é conhecida a tendência destes pacientes, a sofrer diversas e freqüentes infecções microbianas, devida em parte, a baixa resposta dos linfócitos e as deficiências observadas nas imunoglobulinas e no complemento (MOWATT, 1997).
As experiências de suplementação com cromo demonstraram diminuição da concentração de cortisol sérico, que tem papel importante na supressão da respostas de defesa (BORGS, 1998). O cromo aumentou a quantidade de imunoglobulinas séricas , retendo outros traços de elementos minerais (CLARK et al., 1994 e CHANG et al., 1996).
As investigações sobre as influências do cromo suplementar em peixes são escassas. Alguns estudos não apontam diferenças com a suplementação de cromo, no entanto, outros mostram que a suplementação com cromo induze aumento de peso e deposição de glicogênio no fígado (SHIAU e LIN, 1993), em que a suplementação com 2 ppm de cromo aumentou significativamente o ganho em peso e a deposição de energia e glicogênio hepático em tilápias.
O Committee on Animal Nutrition constatou , em 1997, a falta de informações científicas sobre o cromo, alertando sobre à necessidade de desenvolvimento de novos estudos sobre suplementação de cromo em dietas de peixes e outros animais.
Atualmente o estudo da influência do cromo dietético na performance da resposta imunológica em condições de estresse é de alta relevância. O estresse causado por desmame, castração, transporte, confinamento e outros tipos de situações estressantes é tema de grande interesse científico devido à que a suplementação com cromo provoca importante diminuição do cortisol sérico (ARTHINGTON et al., 1997).
O objetivo deste trabalho foi relacionar a cinética da resposta inflamatória com as modificações do sistema neuroendócrino, testando o cromo como sustância com possível efeito imunomodulador.
Referências Bibliográficas
ALI, H. e BADAWI, M. Dietary lipids modulation of performance and immune responses in nile catfish (Clareas lasora) under variable temperature in Egypt. Vet.
Med. J. Giza. 45, 3: 325-335, 1997.
ANDERSON, R.A. Nutritional role of chromium. The Science of the Total
Environment. 17:13-29, 1981.
ARTHINGTON, J.D., CORAH, L.R., MINTON, J.E., ELSASSER, T.H. e BLECHA, F. Supplemental dietary chromium does not influence ACTH, cortisol o immune response in young calves inoculated witch bovine herpesvirus. Journal of Animal
Science. 75: 217-223, 1997.
AUDET, C. e WOOD, A. Branchial morphological and endocrine response of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) to a long term subletal acid exposure in wich acclimation did not occur. Canadian J. Aquatic Sci. 50: 198-209, 1993.
BARTON, B. e IWAMA, G. Physiological changes in fish from stress in aquaculture with emphasis on the response and effects of corticosteroids. Rev. of Fish Disease, 3-26, 1991.
BARTON, B., SCHRECK, C. e BARTON, L. Effects of chronic cortisol administration and daily acute stress on growth, physiological conditions and stress response in juvenile rainbow trout. Disease of Aquatic Organism. 2:173-185, 1987.
BATEMAN, A., SINGH, A., KRAL, T. e SOLOMON, S. The immune-hypothalamic-pituitary-adrenal axis. Endocrine Reviews. 10, 1: 92-112, 1989.
BERGQUIST, J., TARKOWSKI, A., EWING, A. e EKMAN, R. Catecholaminergic suppression of immunocompetent cells. Immunology Today, 19, 12:562-567, 1998.
BERTOK, L. Endotoxins and endocrine system. Domestic Animal Endocrinology 15, 5: 305-308, 1998.
BIANCO, C. e RABELO, R. Introdução à fisiologia endócrina. In: Fisiologia. Margarida de Mello Aires. Guanabara-Koogan Ed. 741-765, 1999.
BLY, J. e CLEM, W. Temperature-mediated processes in teleost immunity in vitro immunosuppression induced by in vivo low temperature in channel catfish. Vet.
Imm. Immunopathology 28: 365-377, 1991.
BORGS, P. e MALLARD, B.A. Immune-endocrine interactions in agricultural species: chromium and its effect on health and perfomance. Domestic Animal
Endocrinology. 15, 5: 431-438, 1998.
CAZES, R.L. Cromo Organico. A Hora Veterinaria, ano 19, 110, 1999.
CHAMPE, P. e HARVEY, R. Bioquímica Ilustrada. 2 ed. Artes Médicas, 445 p. 1997.
CHANG, X., MALLARD, B.A. e MOWAT, D.N. Effects the chromium on health status phagocytosis and in vitro lymphocyte blastogenesis of dairy cows.
Veterinary Immunology and Immunopathology 52: 37-52, 1996.
CLARK ,C.K., ANSOTEGUI, R.P. e PATERSON, J.A. Mineral nutrition of the beef cow to the impact immunologic response. The Bovine Practitioner. 29, 1994.
Comittee on Animal Nutrition. The role of chromium in Animal Nutrition. Academy Press, 1997.
CONGLETON, J. e WAGNER, E. Acute-phase hypoferremic response to lipopolysaccharide in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Comp. Biochem.
Physiol. 98A, 2:195-200, 1991.
EIGLER, A., SINHA, B., HARTMANN, G., ENDRES, S. Taming TNF: strategies to restrain this proinflammatory cytokine. Immunology Today, 18, 10:487-492, 1997.
ELLIS, E., MUNROE, L.S. e ROBERTS, R.J. Defense mechanisms in fish. J. Fish
Biol. 8: 67-78, 1976.
ENDO, M., ARUNLERTAEE, C. e RUANGPAN, L. A new method for collecting neutrophils using swim bladder. Fisheries Sciencies. 63, 4: 644-645, 1997.
FINN, J.P. e NIELSEN, O.N. The effect of temperature variation on the inflammatory response of rainbow trout .J. Path 105: 257-268, 1971.
FRIES, C. Effects of environmental stressors and immunosuppressants on immunity in
Fundulus heteroclitus. Amer. Zool., 26: 271-282, 1986.
HINE, P. e WAIN, J. Characterization of inflammatory neutrophils induced by bacterial endotoxin in the blood of eels, Anguilla australis. J. Fish Biology 32:579-592, 1988.
IPCS. INTERNATIONAL PROGRAMMEON CHEMICAL SAFETY. Environmental Health Criteria 61 Chromium. World Health Organization, Geneva, Switzerland, 1988.
KHANSARI, D., MURGO, A. e FAITH, R. Effects of stress on the immune system.
LAURENT P., DUNEL ERB, S. e CHEVALIER, C. Gills epithelial cells kinetics in firewater teleost Oncorhynchus mykiss during adaptation to ion poor water and hormonal treatments. Fish Physiology and Biochemestry. 13, 5: 353-370, 1994.
LIPTON, J. e CATTANIA, A. Anti-inflammatory actions of the neuroimmunomodulator α-MSH. Immunology Today. 18, 3: 140-145, 1997.
MALLATT, J. Fish gill structural changes induced by toxicants and other irritants: a statistical review. Can. J. Fish Aquat. Sci. 42: 630-648, 1985.
Mc DONALD Nutrición Animal.; 93-115; 2 ed. Zaragoza. Ed. Acribia.1979.
MATTERY, R., CARROL, J. e DYER, C. Neuroendocrine responses to stress. In: The Biology of Animal Stress. Eds. MOBERG and MENCH. P 43-76. 2000.
MATTY, A. Fish Endocrinology. Ed. Timber Press, Portland. USA. 265 p, 1985.
MATUSHIMA, E.R. e MARIANO, M. Kinetics of the inflammatory reaction induced by carregeenin in the swim bladder of Oreochromis niloticus (Nile Tilapia). Braz. J.
Vet. Res. Anim. Sci. 33, 1: 5-10, 1996.
McARTHUR, J.I., FLETCHER,T.C., PIRIE, B.J., DAVINSON, R.J.L. e THOMSON, A.W. Peritoneal inflammatory cells in plaice, Pleuronectes platessa L.: effects of stress and endotoxin. J. Fish Biol. 25:69-81,1984.
MERTZ, W. Chromium in Human Nutrition A Review. American Institute of Nutrition, 1993.
MOMMSEN, T. P., VIJAYAN, M. e MOON, T. Cortisol in teleost: dynamics, mechanism of action and metabolic regulation. Reviews in Fish Biology and
MOWAT, D.. Organic chromium: a new nutrient for stressed animals. In: 9th Annual Symposium on Biotechnology in the Feed Industry. April, 1993.
MOWAT, D. Modulation of Immunity. In Organic Chromium in Animal Nutrition. Chromium Books Ed. 258 pag, 1997.
OKADA, S., TSUKADA, H. e TEZUKU, M. Effects of chromium (III) on nucleolar RNA synthesis. Biol. Trace. Elem. Res. 21: 35, 1989.
PICKERING, A. The concept of biological stress. In: Stress and Fish. PICKERING, A. Ed. Academic Press, London: 1-9, 1981.
POTTINGER, T. e CARRICK, T.. A comparison of plasma glucose and plasma cortisol as selection markers for high and low stress responsiveness in female rainbow trout.
Aquaculture. 175: 351-363, 1999.
RANZANI-PAIVA, M. Hematologia de peixes. Semana sobre histologia de peixes, 65-70. FCAVJ-UNESP, 1, Jaboticabal, FUNEP, 1991.
REID, S., BERNIER, N. e PERRY, S. The adrenergic stress response in fish: control of catecholamines storage and release. Comparative Biochemistry and Physiology
Part C. 120: 1-27, 1998.
ROBERTESEN, B. Modulation of the non specific defense of fish by structurally conserved microbial polymers. Fish Shellfish Immunology. 9: 269-290, 1999.
RUANE, N., WEENDERLAR BONGA, S. e BALM, P. Differences between rainbow trout and brown trout in the regulation of the pituitary-interrenal axis and physiological performance during confinement. General and Comparative
Endocrinology. 115: 210-219, 1999.
SHIAU, Y.S. e LIN, S.F.. Effect of supplemental dietary chromium and vanadium on the utilization of different carbohydrates in tilapia, Oreochromis niloticus X O.
STRAUB, R., WESTERMANN, J., SCHÖLMERICH, J. e FALK, W. Dialogue between the CNS and the immune system in lymphoid organs. Immunology Today. 19, 9: 409-413, 1998.
SUZUKI, K. Morphological and phagocytic characteristics of peritoneal exudate cells in tilapia, Oreochromis niloticus (Trewavas) and carp Cyprinus carpio L. J. Fish Biol. 29: 349-364, 1986.
WEYTS, F., COHEN, N., FLIK, G., VERBURG-VAN KEMENADE, B. Interactions between the immune system and the hypothalamo-pituitary-interrenal axis in fish.
Fish and Shellfish Immunology, 9: 1-20, 1999.
WENDERLAAR BONGA, S. The stress response in fish. Physiological Reviews, 77, n 3: 591-625, 1997.
WHITE, A., Mc.ARTHUR, J. e FLETCHER, T. Distribution of endotoxin and its effect on serum concentration of C reactive protein and cortisol in the plaice (Pleuronectes
platessa). Comp. Biochem. Physiol. 79C: 97-101, 1984.
WILSON, D., ERECINSKA, M. e SCHRAMM, V. Evaluation of de relationship between the intra and extramitochondrial [ATP]/[ADP] ratios using phosphoenolpyruvate carboxykinase. J. Biol. Chem. 258: 10464-10473, 1983.
WRIGHT, S., RAMOS, R., TOBIAS, P., ULEVITCH, R. e MATHINSON, A. CD14, a receptor for complexes of lipopolysaccharide (LPS) and LPS binding protein.
Science. 249: 1431-1433, 1990.
YANO, T. The nonspecific immune system humoral defense. In: The fish immune
system. Iwama and Nakanishi Editor. Academic Press, London :106-140, 1996.
ZAPATA, A.G., VARAQS, A. e TORROBA, M. Seasonal variations in the immune system of lower vertebrates. Immunology Today. 13, 4: 142-147, 1992.
CAPÍTULO 2-
RESPOSTAS SISTÊMICAS INDUZIDAS POR ENDOTOXINA EM
PACU Piaractus mesopotamicus (Holmberg, 1887)
SUPLEMENTADOS COM CROMO
Resumo
Este trabalho teve por objetivos avaliar as respostas sistêmicas induzidas pela injeção intraperitoneal de 3,0 mg/kg de lipopolissacrídeo (LPS) de Escherichia coli e os eventuais efeitos da suplementação alimentar com cromo trivalente. Para tanto foram utilizados 300 pacus Piaractus mesopotamicus (Holmberg, 1887) pesando em média 80 g; distribuídos em 20 aquários e cinco tratamentos, quais sejam um grupo Controle, não suplementado e que não recebeu LPS; um grupo que recebeu somente LPS e outros três, CRa, CRb e CRc que receberam LPS e dois, quatro e seis partes por milhão de cromo trivalente na ração. Material para determinação de hematócrito, concentração plasmática de cortisol e glicose, concentração de glicogênio hepático, índice hepatossomático e avaliação histológica de brânquias foram colhidos antes e um, dois, quatro, nove, 14, 19 e 24 dias após a injeção do LPS. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, em esquema fatorial 5 x 8, com 4 repetições representadas pelos aquários.
Os resultados demonstraram que os níveis de cortisol circulantes aumentaram em todos os grupos assim como houve incremento do estoque de glicogênio hepático. O hematócrito não apresentou diferença significativa e as brânquias apresentaram ligeiras modificações estruturais.
Palavras-chaves Piaractus mesopotamicus, endotoxina, cromo, cortisol, glicemia,
RESPONSES SYSTEMIC INDUCED BY ENDOTOXINA IN PACU
Piaractus mesopotamicus (Holmberg, 1887) SUPPLEMENTED WITH
CHROMIUM
Summary
This work had for objectives to evaluate the response systemic induced by the injection intraperitoneal of 3,0 mg/kg of lipopolissacharideo (LPS) of
Escherichia coli and the eventual effects of the alimentary supplementation with mixed
trivalent chromium to the ration. Were used three hundred fish Piaractus
mesopotamicus (Holmberg, 1887), weighing 80 g on average.; distributed in 20
aquariums and five treatments, which are a group control, non supplemented and that didn't receive LPS; a group that received only LPS and other three, CRa, CRb and CRc that received LPS and two, four six parts for millions of trivalent chrome in the ration. Material for haematocrit determination, concentration cortisol plasmático and glucose, concentration of hepatic glycogen, index hepatosomático and modifications in the branchial structure were appraised by histology picked before and a, two, four, nine, 14, 19 and 24 days after the injection of LPS. The experimental design was randomized entirely, in a 5 x 8 factorial.
The results demonstrated that the levels of circulating cortisol increased in all the groups as well as there was increment of the stock of hepatic glycogen. The haematocrit didn't present significant difference and the gills presented quick structural modifications.
Keys-words: Piaractus mesopotamicus, endotoxin, chromium, cortisol, glucose,
Introdução
Várias são as causas de estresse que levam ao prejuízo econômico em piscicultura. Dentre elas incluem-se varias formas de inadequação do manejo e de alterações do meio ambiente que precedem surtos de enfermidades. A magnitude dos efeitos do estresse em piscicultura tem motivado a pesquisa intensa dos processos fisiopatológicos envolvidos.
Habitualmente os estudos de estresse em peixes, partem da idéia de estimular o sistema endócrino para avaliar suas respostas, sendo acompanhada, em alguns casos, por observações dos efeitos sobre o sistema imune. Isso é de suma importância visto que os sistemas endócrino, nervoso e imune estão intimamente relacionados, e as respostas encontradas num deles, permitem perorações sobre o que pode estar acontecendo nos outros (KHANSARI et al., 1990; OTTAVIANI e FRANCESCHI, 1998).
Outra forma de avaliar os efeitos e correlações existentes entre os sistemas, é através do estímulo do sistema imune (estresse inflamatório, infecções e outras formas) e avaliar as modificações de parâmetros endócrinos.
O estimulo inicial do sistema imune e a observação de respostas nos sistemas nervoso e endócrino, demonstram o relacionamento entre eles que até pouco tempo atrás eram estudados separadamente. Vários aspectos confirmam essa relação: a presença de receptores para hormônios em células do sistema imune, assim como a existência de receptores para citocinas em células do sistema neuroendócrino; a estratégica inervação de órgãos do sistema imune permitindo o intercâmbio imediato de sinais; as características neuroendócrinas encontradas no linfócito; o estreito contato entre o fluído intersticial do cérebro e a linfa; a permeabilidade da barreira hematoencefálica para os linfócitos; e a presença de células apresentadoras de antígeno no parênquima cerebral sustentam o conceito de bi-direcionalidade, termo que melhor representa a relação entre tais sistemas (KHANSARI et al., 1990; LIPTON e CATTANIA, 1997; STRAUB et al., 1998 e WEYTS et al., 1999, BERGQUIST et al., 1998;).
As constantes situações de estresse que ocorrem como conseqüência indesejada da produção intensiva de peixes, leva a condições de imunossupressão que facilitam o aparecimento de infecções parasitárias e bacterianas. A maioria das doenças bacterianas
em peixes são causadas por bactérias Gram negativas, que possuem lipopolissacarídeos (LPS) como componentes estruturais de sua parede. O LPS estimula os macrófagos a sintetizar e liberar citocinas como o fator de necrose tumoral alfa (TNFα),interleucina 1 (IL-1), interleucina 6 (IL-6), 8 (IL-8) e oxido nítrico (NO). Todavia a liberação desordenada e excessiva dessas substâncias provocam a morte do hospedeiro como ocorre na endotoxemia e septicemia (WRIGHT et al., 1990).
As respostas à agressão produzida pelo LPS em peixes, são similares às observadas em mamíferos, porém quantitativamente seus efeitos nocivos são menos intensos, demonstrando a resistência relativa dos peixes ao LPS (CONGLETON e WAGNER, 1991). Isto pode estar relacionado com a menor quantidade de mediadores e proteínas de fase aguda que são liberados no processo inflamatório (WHITE et al., 1984), como também a influência da temperatura que provoca modificações no tempo de aparecimento das respostas.
A entrada de LPS no organismo de mamíferos pode provocar o inicio das respostas em poucas horas. Em peixes, esta cinética é mais demorada, com elevação dos níveis circulantes de cortisol após 24 horas, de proliferação celular após três dias (WHITE et al., 1984), de proteínas de fase aguda em 48 horas, de hipoferremia após 72 horas sendo que a hiperglicemia ocorre por glicogenólise e não por gliconeogênese (CONGLETON & WAGNER, 1991).
Mudanças nos níveis plasmáticos do cortisol são mundialmente empregados como índices de ativação da resposta neuroendócrina ao estresse (LAIDLEY e LEATHERLAND, 1988; BARTON e IWAMA, 1991 e POTTINGER e CARRICK, 1999). Os valores do cortisol plasmático podem se elevar a mais de 100 ng/ mL no estresse agudo e retornar a valores normais, de 10-20 ng/mL após períodos variáveis, mesmo que a causa do estresse persista (PICKERING, 1981). As elevações do cortisol produzem mobilização do glicogênio e lipídeos armazenados no fígado, ocasionando aumento da glicemia e diminuição do peso deste órgão, o qual se reflete no índice hepatossomático (IHS).
Os microminerais são usados com o objetivo de modular as respostas ao estresse e há indicações de que o cromo (Cr) trivalente reduz os níveis os níveis de cortisol e eleva a concentração de imunoglobulinas no sangue de bovinos estressados pelo transporte (CLARK et al., 1994; CHANG et al. e 1996 BORGS e MALLARD, 1998). Entre as propriedades do cromo figuram a potencialização dos efeitos da insulina, o que
melhora a resposta inflamatória e por tanto favorece os mecanismos de defesa e recuperação frente a agressões (ANDERSON, 1981).
Em peixes os estudos de suplementação com cromo estão relacionados ao desempenho, verificando-se maior deposição de glicogênio hepático com as conseqüentes modificações do índice hepatossomático (IHS). Em 1982, Tacon e Beveridge foram os primeiros a mencionar deficiências de cromo em truta arco íris (NRC OF FISH, 1993). A influencia do cromo como agente imunomodulador ainda não recebeu atenção necessária na área de piscicultura. Assim, considerando-se a facilidade de incorporação deste mineral às rações e os benefícios obtidos em outras espécies, este trabalho teve como objetivo avaliar as respostas ao estresse de tipo inflamatório em pacu e os efeitos imunomoduladores do cromo.
Material e Métodos
Este ensaio foi realizado no Centro de Aqüicultura da Unesp (Caunesp) e no Centro de Pesquisas em Sanidade Animal (CPPAR) da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, campus de Jaboticabal da Universidade Estadual Paulista (Unesp).
Utilizaram-se 300 exemplares de pacu (Piaractus mesopotamicus), com peso vivo (PV) médio de 80 gramas, distribuídos em 20 aquários, com 15 peixes por aquário. Os peixes foram mantidos em aquários de cimento amianto com capacidade para 500 litros, com fluxo contínuo de água. Os valores de temperatura, oxigênio dissolvido e pH foram registrados diariamente.
Os tratamentos utilizados foram os seguintes:
- LPS: animais inoculados com LPS e sem suplementação de cromo orgânico;
- CRa: inoculados com LPS e suplementados com 2 ppm de cromo - CRb: inoculados com LPS e suplementados com 4 ppm de cromo; - CRc: inoculados com LPS e suplementados com 6 ppm de cromo
- Controle: animais que não foram inoculados com LPS e nem suplementados com cromo.
Realizada a pesagem inicial para seleção e distribuição dos peixes nos aquários, foi utilizada uma semana para a adaptação dos animais ao local do experimento, após este período iniciou-se a suplementação com cromo para os animais dos tratamentos
CRa, CRb e CRc. Durante todo o experimento, a alimentação foi oferecida duas vezes por dia, em proporção de três por cento da biomassa total de cada aquário.
Esta suplementação foi realizada incorporando o cromo à ração completa (Tabela 1), na forma de carboquelato de cromo, fornecido pela empresa TORTUGA, com concentração de 28,5 mg de Cr/g, sendo calculada para fornecer 2, 4 e 6 ppm de cromo por kg de ração para o CRa, CRb e CRc, respectivamente.
Tabela 1. Participação porcentual dos ingredientes da ração completa.
Ingredientes % Farinha de peixe 17,6 Farinha de soja 20,7 Farelo de arroz 10,0 Farelo de trigo 12,0 Milho 36,0 Óleo vegetal 2,5 Sal 0,4 Suplemento vitamínico 0,5 Suplemento mineral 0,3
Depois de duas semanas de iniciada a suplementação, todos os animais foram pesados e nesse momento foram inoculados com 3,0 mg de LPS/kg de PV, para os tratamentos LPS, CRa, CRb e CRc. Os peixes do tratamento Controle foram inoculados com solução salina estéril.
A aplicação de 3,0 mg de LPS/kg de PV, foi definida em ensaio prévio, onde se aplicaram doses crescentes de LPS: 0,5; 1,0; 2,0 e 3,0 mg/kg em pacu, com o intuito de determinar a dose que produziria respostas possíveis de serem avaliadas, com base no infiltrado celular observado às 24, 48 e 96 horas pós-inoculação.
Antes de serem inoculados, os peixes foram anestesiados por imersão em solução de benzocaína em proporção de um gramo para 10 litros de água, durante aproximadamente dois minutos, tempo suficiente para que apresentem perda de equilíbrio e escassos movimentos operculares.
O inóculo empregado foi constituído de lipopolissacarídeos (LPS) de E. coli preparados por extração com fenol (Serotype 0111:B4, Sigma, St. Louis, MO), sendo diluído no momento da inoculação com solução fisiológica estéril. A inoculação foi realizada diretamente na cavidade abdominal, com agulhas e seringas de tuberculina estéreis, e os peixes devolvidos aos respectivos aquários.
Foram colhidas amostras de quatro peixes por tratamento, nos seguintes tempos: 0 (antes da inoculação), 1, 2, 4, 9, 14, 19 e 24 dias após inoculação.
Em cada amostragem, os peixes foram pesados e então foi colhido o sangue por punção dos vasos caudais, com agulhas e seringas heparinizadas. Com a amostra de sangue determinou-se o hematócrito pelo método de microhematócrito, utilizando-se dois capilares heparinizados, centrifugados a 5000 r.p.m. por cinco minutos em centrífuga apropriada. A média dos dois valores de cada animal, foi expressa em percentual do volume total de sangue.
A determinação de glicemia foi feita pelo método colorimétrico de KING e GARNER (1947) com sangue desproteinado.
Uma parte da amostra de sangue foi centrifugada obtendo-se o plasma que foi congelado em freezer a –200C, para determinação dos níveis de cortisol plasmático por radioimunoensaio (Coat-a-Count®, “Diagnostic Products Coorporation”).
Para extração das vísceras foi feita abertura completa da cavidade abdominal, desde o poro urogenital até os opérculos. O fígado foi pesado e o índice hepatossomático foi determinado pela relação entre o peso hepático e o corporal, em porcentagem. Posteriormente uma porção embalada em papel de alumínio, congelada em gelo seco e mantida em freezer a –200C foi utilizada para dosagem de glicogênio pelo método descrito por MOON et al. (1989).
O primeiro e segundo arco branquial do lado direito foram colhidos e fixados em Bouin por 12 horas, mantidos em álcool 70º até seu processamento, quando foram desidratados em série crescente de álcool etílico e posteriormente incluídos em parafina. Cortes de 5-7 micrômetros, obtidos em micrótomo tipo Minot, foram corados com hematoxilina-eosina (HE) e ácido periódico de Shiff (PAS). Estes foram examinados em microscópio de luz para avaliação da distância entre extremos das lâminas secundárias, espessura do filamento primário e da lâmina secundaria, altura do epitélio do filamento primário e distância entre lâminas secundárias, utilizando-se o sistema analisador de imagens (KARL ZEISS VISION, KS100 Imaging System Release 3.0, 1997). Cinco filamentos primários foram escolhidos ao acaso e se realizaram cinco repetições de cada medida em cada filamento, até a amostragem do 14º dia pós-inoculação.
O delineamento utilizado foi inteiramente casualizado, em esquema fatorial 5 x 8 (5 tratamentos e 8 tempos), com 4 repetições. As medias obtidas foram comparadas pelo teste de DUNCAN a 5%.
Figura 1- Brânquias: as retas mostram os locais onde se realizaram as diferentes medidas (HE, 400 x). Reta laranja: distancia laminas= distancia entre os extremos das lâminas direita e esquerda do mesmo
filamento branquial
Reta vermelha: separação lâminas= distancia entre lâminas secundarias de um lado do filamento primário Reta amarela: espessura lamina= medida da lâmina secundaria tomada no estremo apical
Reta azul: espessura filamento= espessura total do filamento primário
Reta verde: epitélio do filamento= altura do epitélio do filamento primário, desde a base da lâmina secundaria ate o eixo cartilaginoso.
Resultados e Discussão
A análise da variância mostrou que não houve interação entre tratamentos e tempos de amostragem, para nenhuma das variáveis (P> 0,20), permitindo que os fatores fossem analisados independentemente.
As primeiras experiências de suplementação com cromo, como levedura e quelato de cromo, demonstraram que este mineral produz diminuição da concentração de cortisol sérico e aumento da quantidade de imunoglobulinas séricas (CLARK et al., 1994; CHANG et al., 1996 e BORGS e MALLARD, 1998). Contrariamente a esses resultados, observou-se que no início deste trabalho, a média dos valores de cortisol para os tratamentos não suplementados com cromo foi menor que para os tratamentos que receberam cromo na alimentação (2,71 vs 3,91 µg/dL de cortisol plasmático).
Os valores de cortisol encontrados neste experimento (Tabela 2), em peixes suplementados ou não com cromo, foram inferiores aos citados por outros autores (BARTON e IWAMA, 1991), porém as situações de estresse foram diferentes
(transporte e densidade). Segundo WHITE et al. (1984), a inoculação de LPS produz incremento dos níveis de cortisol sérico em peixes, mas este fenômeno está associado à fonte de LPS, método de isolamento e via de aplicação, dificultando sua comparação.
Tabela 2. Médias e desvio padrão dos parâmetros sanguíneos e hepáticos de pacu submetidos a estresse inflamatório.
Tratamentos Glicogênio (g/100g) Cortisol (µg/dL) Glicemia (g/100mL) IHS % Hematocrito % Controle 14,25 ± 2,61 a 2,46 ± 1,2 b 63,23 ± 10,7 a 1,50 ± 0,3 a 34,06 ± 2,4 b LPS 13,37 ± 2,4 ab 3,51 ± 2,0 ab 66,06 ± 11,9 a 1,71 ± 0,3 a 36,78 ± 3,9 a Cra 13,72 ± 2,7 a 3,87 ± 2,4 a 61,01 ± 11,2 a 1,51 ± 0,3 a 37,09 ± 3,7 a CRb 13,43 ±2,3 ab 4,03 ± 2,0 a 61,08 ± 11,8 a 1,54 ± 0,3 a 36,18 ± 3,5 a CRc 12,72 ± 2,7 b 3,07 ±1,7 ab 65,09 ± 11,5 a 1,55 ± 0,3 a 36,62 ± 3,1 a
Letras diferentes na coluna diferem pelo teste de Duncan a 5% (P<0,05) IHS= índice hepatossomático
BALM (1995) inocularam LPS em Oreochromis mossambicus e estudaram os níveis de cortisol, in vitro, com o objetivo de eliminar o estresse produzido pela captura e manejo, fatores que podem confundir a interpretação dos resultados.
A captura, anestesia e manejo, são situações que produzem estresse, motivo pelo qual esperava-se que os animais do tratamento Controle também apresentassem aumento dos níveis de cortisol, porém em níveis inferiores ao observado nos outros tratamentos em que ocorreu também o estímulo provocado pelo LPS.
Os valores de cortisol sérico do grupo Controle foram inferiores (P<0,05) ao CRa e CRb. Apesar disso outros parâmetros avaliados (glicemia, IHS, hematócrito) sugerem que em todos os tratamentos aconteceu ativação do eixo hipotálamo-hipófise-interrenal. Possivelmente o primeiro tempo de amostragem após a inoculação (24 horas), não foi adequado para esta variável, pois impediu detectar elevações rápidas de cortisol provocadas pela captura, e diferenciar esta elevação da produzida pela ação do inóculo. Os valores de cortisol através do tempo, apresentados na Tabela 3, sugerem que após 24 horas este já se encontrava em fase descendente, o que corrobora a hipótese que a elevação rápida própria do estresse agudo não foi detectada.
Segundo BATEMAN et al. (1989) uma marcada elevação do cortisol durante período prolongado de tempo sería prejudicial ao organismo razão da existência de mecanismos moduladores de sua produção. Os macrófagos são responsáveis pela estimulação do eixo HPI, também secretam fatores que inibem a produção adrenal de
esteróides, como o fator de crescimento de tecidos β (TGF-β). Também os neutrófilos,
in vitro, são produtores de peptídeos inibidores da secreção adrenal.
Apesar da falta de trabalhos específicos sobre a cronobiologia do cortisol no pacu, esta é uma espécie de hábitos omívoros, não predatória, sendo seu ciclo de alimentação diurno, o que influência a ritmicidade circadiana do cortisol. Esta ritmicidade deve ser contemplada, pois a aplicação de estímulos em períodos onde a concentração sérica normalmente está alta (período de acrofase) impede a potencialização de estímulos (captura e inóculo), o que pode ter acontecido neste ensaio.
Tabela 3. Médias e desvio padrão dos parâmetros sanguíneos e hepáticos, de pacu submetidos a estresse inflamatório, nos diferentes tempos de amostragem. Tempo Glicogênio (g/100g) Cortisol (µg/dL) Glicemia (g/100mL) IHS % Hematócrito % 0 horas 12,29 ± 4,8 b 3,44 ± 1,9 bc 54,98 ± 6,4 b 1,77 ± 0,3 a 32,10 ± 3,9 b 1 dia 12,83 ± 2,1 b 4,93 ± 2,3a 69,14 ± 7,5 a 1,49 ± 0,3 bc 37,5 ± 2,8 a 2 dias 13,56 ± 1,3 ab 4,35 ± 1,7 ab 69,69 ± 8,6 a 1,41 ± 0,3 c 37,95 ± 2,7 a 4 dias 14,18 ± 1,9 ab 3,36 ± 1,8 bc 66,79 ± 10,4 a 1,50 ± 0,3 bc 36,05 ± 3,3 a 9 dias 15,13 ± 2,4 a 2,66 ± 1,4 cd 68,88 ± 11,9 a 1,64 ± 0,3 ab 36,60 ± 3,3 a 14 dias 13,87 ± 1,9 ab 3,32 ± 1,8bc 59,35 ± 8,8 b 1,61 ±1 0,3ab 36,80 ± 3,8 a 19 dias 13,53 ± 2,1 ab 2,99 ± 2,2 cd 58,44 ± 13,5 b 1,63 ± 0,3 ab 36,15 ± 3,1 a 24 dias 12,56 ± 1,4 b 2,11 ± 1,5 d 59,19 ± 13,0 b 1,46 ± 0,3 bc 36,10 ± 3,6 a
Letras diferentes na coluna, diferem pelo teste de Duncan a 5% (P<0,05) IHS= índice hepatossomático Tempo 0= amostragem prévia à inoculação
O cortisol afeta o metabolismo de proteínas, carboidratos e lipídeos, agindo como regulador fisiológico dos tecidos e induzindo o catabolismo ou anabolismo, dependendo das necessidades do organismo. As reservas hepáticas de carboidratos, estocadas na forma de glicogênio, são modificadas durante o estresse, porém, a participação do cortisol neste processo tem gerado resultados contraditórios, pois em algumas circunstâncias sua elevação foi relacionada com aumento do glicogênio e em outras com sua diminuição (VIJAYAN e MOOM, 1992 e VIJAYAN et al.; 1994).
VIJAYAN et al. (1994) postularam mecanismos de controle que evitam a quebra do glicogênio em algumas situações e a estimulam em outras, devido ao aumento da sensibilidade do hepatócito ou modificação nos sinais de tradução.
Nesta pesquisa, não foi observado aumento na deposição de glicogênio hepático com a suplementação de cromo (Tabela 2), como foi encontrada em tilápias por SHIAU
e LIN (1993). Os animais do tratamento Controle apresentaram valores maiores que os outros tratamentos, porém só foi significativamente diferente do tratamento CRc.
A presença de maior quantidade de glicogênio no tratamento Controle, pode-se explicar considerando alguns fatores, como o valor inicial encontrado neste tratamento, que foi superior e se manteve assim através do tempo. Outro fator que pode explicar a maior quantidade de glicogênio hepático no Controle, esta relacionado com a menor exigência requerida por estes animais (em razão de receber um estresse de menor intensidade) e a velocidade de recuperação do glicogênio durante este tipo de estresse, já que foi comprovado que esta recuperação ocorre seis horas após o estresse (ROCHA, 2001). O processo de gliconeogênese se inicia entre quatro e oito horas após o começo da utilização do glicogênio hepático e atinge seu ápice quando o glicogênio está próximo de seu valor mínimo (MOMMSEN et al., 1999). A glicose produzida durante o processo de gliconeogênese tem como função aumentar o aporte energético e promover a síntese e depósito de glicogênio no fígado.
A utilização do glicogênio hepático no tratamento Controle deve ter ocorrido durante as primeiras horas e como o estresse produzido foi de baixa intensidade, as necessidades do organismo voltaram ao normal rapidamente permitindo sua recuperação antes da próxima amostragem (Tabela 3). Por outro lado, o tratamento CRc teve o menor valor de glicogênio hepático, o qual estaria relacionado com os baixos níveis de cortisol que se registraram neste tratamento. Como descrito por BARTON et al. (1987), em algumas situações de estresse o aumento do cortisol estimula a deposição de glicogênio no fígado de peixes.
Segundo PEREIRA et al. (1995), após o estímulo estressante ocorre aumento da capacidade do fígado para responder à insulina, com formação rápida de glicogênio, sendo esta ação mais pronunciada em casos de resposta aguda ao estresse. Além disto, o LPS é responsável pelo aumento indireto de quantidade de insulina circulante (CAMPOS e BAUMANN, 1992); e as interações entre os níveis de insulina e do cortisol, poderiam explicar os valores intermediários encontrados nos tratamentos CRa, CRb e LPS.
O IHS pode diminuir durante o estresse devido à mobilização das reservas de glicogênio e lipídeos. O estresse provoca a resposta primária, representada pela elevação plasmática de catecolaminas primeiro e de glicocorticoides depois.
Segundo FIGUEREDO-GARUTTI (1998) pacus alimentados durante 60 dias com dietas suplementadas com cromo sofrem aumento significativo do IHS, o que já
