A análise da variância mostrou que não houve interação entre tratamentos e tempos de amostragem, para nenhuma das variáveis (P> 0,20), permitindo que os fatores fossem analisados independentemente.
As primeiras experiências de suplementação com cromo, como levedura e quelato de cromo, demonstraram que este mineral produz diminuição da concentração de cortisol sérico e aumento da quantidade de imunoglobulinas séricas (CLARK et al., 1994; CHANG et al., 1996 e BORGS e MALLARD, 1998). Contrariamente a esses resultados, observou-se que no início deste trabalho, a média dos valores de cortisol para os tratamentos não suplementados com cromo foi menor que para os tratamentos que receberam cromo na alimentação (2,71 vs 3,91 µg/dL de cortisol plasmático).
Os valores de cortisol encontrados neste experimento (Tabela 2), em peixes suplementados ou não com cromo, foram inferiores aos citados por outros autores (BARTON e IWAMA, 1991), porém as situações de estresse foram diferentes
(transporte e densidade). Segundo WHITE et al. (1984), a inoculação de LPS produz incremento dos níveis de cortisol sérico em peixes, mas este fenômeno está associado à fonte de LPS, método de isolamento e via de aplicação, dificultando sua comparação.
Tabela 2. Médias e desvio padrão dos parâmetros sanguíneos e hepáticos de pacu submetidos a estresse inflamatório.
Tratamentos Glicogênio (g/100g) Cortisol (µg/dL) Glicemia (g/100mL) IHS % Hematocrito % Controle 14,25 ± 2,61 a 2,46 ± 1,2 b 63,23 ± 10,7 a 1,50 ± 0,3 a 34,06 ± 2,4 b LPS 13,37 ± 2,4 ab 3,51 ± 2,0 ab 66,06 ± 11,9 a 1,71 ± 0,3 a 36,78 ± 3,9 a Cra 13,72 ± 2,7 a 3,87 ± 2,4 a 61,01 ± 11,2 a 1,51 ± 0,3 a 37,09 ± 3,7 a CRb 13,43 ±2,3 ab 4,03 ± 2,0 a 61,08 ± 11,8 a 1,54 ± 0,3 a 36,18 ± 3,5 a CRc 12,72 ± 2,7 b 3,07 ±1,7 ab 65,09 ± 11,5 a 1,55 ± 0,3 a 36,62 ± 3,1 a
Letras diferentes na coluna diferem pelo teste de Duncan a 5% (P<0,05) IHS= índice hepatossomático
BALM (1995) inocularam LPS em Oreochromis mossambicus e estudaram os níveis de cortisol, in vitro, com o objetivo de eliminar o estresse produzido pela captura e manejo, fatores que podem confundir a interpretação dos resultados.
A captura, anestesia e manejo, são situações que produzem estresse, motivo pelo qual esperava-se que os animais do tratamento Controle também apresentassem aumento dos níveis de cortisol, porém em níveis inferiores ao observado nos outros tratamentos em que ocorreu também o estímulo provocado pelo LPS.
Os valores de cortisol sérico do grupo Controle foram inferiores (P<0,05) ao CRa e CRb. Apesar disso outros parâmetros avaliados (glicemia, IHS, hematócrito) sugerem que em todos os tratamentos aconteceu ativação do eixo hipotálamo-hipófise- interrenal. Possivelmente o primeiro tempo de amostragem após a inoculação (24 horas), não foi adequado para esta variável, pois impediu detectar elevações rápidas de cortisol provocadas pela captura, e diferenciar esta elevação da produzida pela ação do inóculo. Os valores de cortisol através do tempo, apresentados na Tabela 3, sugerem que após 24 horas este já se encontrava em fase descendente, o que corrobora a hipótese que a elevação rápida própria do estresse agudo não foi detectada.
Segundo BATEMAN et al. (1989) uma marcada elevação do cortisol durante período prolongado de tempo sería prejudicial ao organismo razão da existência de mecanismos moduladores de sua produção. Os macrófagos são responsáveis pela estimulação do eixo HPI, também secretam fatores que inibem a produção adrenal de
esteróides, como o fator de crescimento de tecidos β (TGF-β). Também os neutrófilos,
in vitro, são produtores de peptídeos inibidores da secreção adrenal.
Apesar da falta de trabalhos específicos sobre a cronobiologia do cortisol no pacu, esta é uma espécie de hábitos omívoros, não predatória, sendo seu ciclo de alimentação diurno, o que influência a ritmicidade circadiana do cortisol. Esta ritmicidade deve ser contemplada, pois a aplicação de estímulos em períodos onde a concentração sérica normalmente está alta (período de acrofase) impede a potencialização de estímulos (captura e inóculo), o que pode ter acontecido neste ensaio.
Tabela 3. Médias e desvio padrão dos parâmetros sanguíneos e hepáticos, de pacu submetidos a estresse inflamatório, nos diferentes tempos de amostragem. Tempo Glicogênio (g/100g) Cortisol (µg/dL) Glicemia (g/100mL) IHS % Hematócrito % 0 horas 12,29 ± 4,8 b 3,44 ± 1,9 bc 54,98 ± 6,4 b 1,77 ± 0,3 a 32,10 ± 3,9 b 1 dia 12,83 ± 2,1 b 4,93 ± 2,3a 69,14 ± 7,5 a 1,49 ± 0,3 bc 37,5 ± 2,8 a 2 dias 13,56 ± 1,3 ab 4,35 ± 1,7 ab 69,69 ± 8,6 a 1,41 ± 0,3 c 37,95 ± 2,7 a 4 dias 14,18 ± 1,9 ab 3,36 ± 1,8 bc 66,79 ± 10,4 a 1,50 ± 0,3 bc 36,05 ± 3,3 a 9 dias 15,13 ± 2,4 a 2,66 ± 1,4 cd 68,88 ± 11,9 a 1,64 ± 0,3 ab 36,60 ± 3,3 a 14 dias 13,87 ± 1,9 ab 3,32 ± 1,8bc 59,35 ± 8,8 b 1,61 ±1 0,3ab 36,80 ± 3,8 a 19 dias 13,53 ± 2,1 ab 2,99 ± 2,2 cd 58,44 ± 13,5 b 1,63 ± 0,3 ab 36,15 ± 3,1 a 24 dias 12,56 ± 1,4 b 2,11 ± 1,5 d 59,19 ± 13,0 b 1,46 ± 0,3 bc 36,10 ± 3,6 a
Letras diferentes na coluna, diferem pelo teste de Duncan a 5% (P<0,05) IHS= índice hepatossomático Tempo 0= amostragem prévia à inoculação
O cortisol afeta o metabolismo de proteínas, carboidratos e lipídeos, agindo como regulador fisiológico dos tecidos e induzindo o catabolismo ou anabolismo, dependendo das necessidades do organismo. As reservas hepáticas de carboidratos, estocadas na forma de glicogênio, são modificadas durante o estresse, porém, a participação do cortisol neste processo tem gerado resultados contraditórios, pois em algumas circunstâncias sua elevação foi relacionada com aumento do glicogênio e em outras com sua diminuição (VIJAYAN e MOOM, 1992 e VIJAYAN et al.; 1994).
VIJAYAN et al. (1994) postularam mecanismos de controle que evitam a quebra do glicogênio em algumas situações e a estimulam em outras, devido ao aumento da sensibilidade do hepatócito ou modificação nos sinais de tradução.
Nesta pesquisa, não foi observado aumento na deposição de glicogênio hepático com a suplementação de cromo (Tabela 2), como foi encontrada em tilápias por SHIAU
e LIN (1993). Os animais do tratamento Controle apresentaram valores maiores que os outros tratamentos, porém só foi significativamente diferente do tratamento CRc.
A presença de maior quantidade de glicogênio no tratamento Controle, pode-se explicar considerando alguns fatores, como o valor inicial encontrado neste tratamento, que foi superior e se manteve assim através do tempo. Outro fator que pode explicar a maior quantidade de glicogênio hepático no Controle, esta relacionado com a menor exigência requerida por estes animais (em razão de receber um estresse de menor intensidade) e a velocidade de recuperação do glicogênio durante este tipo de estresse, já que foi comprovado que esta recuperação ocorre seis horas após o estresse (ROCHA, 2001). O processo de gliconeogênese se inicia entre quatro e oito horas após o começo da utilização do glicogênio hepático e atinge seu ápice quando o glicogênio está próximo de seu valor mínimo (MOMMSEN et al., 1999). A glicose produzida durante o processo de gliconeogênese tem como função aumentar o aporte energético e promover a síntese e depósito de glicogênio no fígado.
A utilização do glicogênio hepático no tratamento Controle deve ter ocorrido durante as primeiras horas e como o estresse produzido foi de baixa intensidade, as necessidades do organismo voltaram ao normal rapidamente permitindo sua recuperação antes da próxima amostragem (Tabela 3). Por outro lado, o tratamento CRc teve o menor valor de glicogênio hepático, o qual estaria relacionado com os baixos níveis de cortisol que se registraram neste tratamento. Como descrito por BARTON et al. (1987), em algumas situações de estresse o aumento do cortisol estimula a deposição de glicogênio no fígado de peixes.
Segundo PEREIRA et al. (1995), após o estímulo estressante ocorre aumento da capacidade do fígado para responder à insulina, com formação rápida de glicogênio, sendo esta ação mais pronunciada em casos de resposta aguda ao estresse. Além disto, o LPS é responsável pelo aumento indireto de quantidade de insulina circulante (CAMPOS e BAUMANN, 1992); e as interações entre os níveis de insulina e do cortisol, poderiam explicar os valores intermediários encontrados nos tratamentos CRa, CRb e LPS.
O IHS pode diminuir durante o estresse devido à mobilização das reservas de glicogênio e lipídeos. O estresse provoca a resposta primária, representada pela elevação plasmática de catecolaminas primeiro e de glicocorticoides depois.
Segundo FIGUEREDO-GARUTTI (1998) pacus alimentados durante 60 dias com dietas suplementadas com cromo sofrem aumento significativo do IHS, o que já
fora observado em tilápias por SHIAU e LIN(1993). Porém, neste ensaio, não foram observadas diferenças entre os animais suplementados ou não com cromo (Tabela 2). Já quando analisado o tempo, o IHS diminuiu após 48 horas (Tabela 3), momento em que atingiu seu valor mínimo (P<0,05), retornando aos valores iniciais aos nove dias.
A diminuição no peso do fígado não pode ser atribuída à mobilização de glicogênio, já que as observações demonstraram aumento do glicogênio no tempo e sim à utilização dos lipídeos estocados, destinados a gliconeogênese como já foi comentado, ou a que a inoculação de LPS estimulou processos catabólicos no fígado pela ação de IL-1. Analisando todos os tratamentos durante as primeiras 48 horas, onde se registra a maior queda do índice, pode se notar que o tratamento Controle praticamente não se modificou. Apesar disso, não ocorreram diferenças entre o Controle e os inoculados com LPS, possivelmente devido ao alto coeficiente de variação encontrado (18,2%).
Diferentemente destes resultados, WENDERLAAR BONGA (1997) demonstrou que em situações de estresse é possível observar variações no peso corporal dos peixes, o que acontece por perda do equilíbrio osmótico, falência na bomba Na+ K+-ATPase e diminuição da prolactina, ocasionando aumento da permeabilidade do epitélio do tegumento, o que produz entrada de água no organismo e conseqüentemente aumento do peso corporal, com a conseqüente redução do IHS.
A utilização de lipídeos pelo fígado para transforma-lo em glicose é necessária para fornecer energia aos tecidos que estão passando momentos de restrição na circulação sangüínea e no aporte de oxigênio. Segundo SUAREZ e MOMMSEN (1987), os teleósteos mobilizam suas reservas hepáticas de lipídeos durante o estresse, sabendo-se que entre os precursores gliconeogênicos está o glicerol, ainda que em peixes a gliconeogênese a partir deste glicerol apresente resultados contraditórios.
Existem tecidos altamente dependentes de glicose como o cérebro, rim e medula, sendo fundamental seu fornecimento constante e em concentrações adequadas, sendo órgãos determinantes do valor mínimo de glicemia necessário para o normal funcionamento do organismo. A glicose pode ter origem na absorção de carboidratos ou pode ser produzida no fígado e rim, pelos processos de glicogenólise e gliconeogênese mecanismos que são ativados quando as exigências de energia são maiores, como no caso de estresse (SUAREZ e MOMMSEN, 1987).
Os processos de glicogenólise e gliconeogênese podem determinar hiperglicemia e sua ativação é mediada pela ação hormonal, sendo que alguns trabalhos atribuem este efeito às catecolaminas (MAZEAUD et al., 1977) e outros ao cortisol (LEACH e
TAYLOR, 1980 e VAN DER BOON et al., 1991). WENDERLAAR BONGA (1997) e POTTINGER e CARRICK (1999), propuseram que a glicemia é mediada inicialmente pelas catecolaminas e, em prazos mais tardios, pelo cortisol. A elevação do cortisol reduz a utilização periférica da glicose e aumenta a lipólise, gerando mais glicose e aumentando a glicemia., o qual seria benéfico em situações de estresse, pois nestas existem altos requerimentos energéticos por parte dos principais órgãos.
Neste ensaio não se observaram diferenças significativas entre os tratamentos (Tabela 2), sugerindo que existiu ativação do eixo HPI em todos os grupos, o que pode dever-se a menor utilização periférica de glicose ou a gliconeogênese, através de funcionamento de mecanismos destinados a manter os níveis necessários de glicose; porém estes dados não coincidem com o estado de hipoglicemia encontrada em
Pleurenectes platessa por WHITE et al. (1984), que não explicaram quais as suas
possíveis causas.
O estado hipoglicêmico seria contraproducente frente a uma situação de estresse, por que o sangue constitui o único meio para prover energia extra aos tecidos, que estão momentaneamente passando por restrição circulatória.
Concordando com o observado por SCHERCK (1981), as variações através do tempo demonstraram que os níveis séricos de cortisol e a glicemia foram modificados com velocidades diferentes (Tabela 3). A última aumentou mais lentamente e permaneceu elevada por períodos mais prolongados que o cortisol. A glicemia aumentou significativamente 24 horas após da aplicação do estimulo e só diminuiu nove dias depois. O retorno aos valores iniciais de glicemia foi mais demorado que o observado por outros autores em que a recuperação ocurreu entre dois a quatro dias, porém com valores absolutos superiores aos achados neste trabalho (PICKERING et al., 1982 e RUANE et al., 1999),.
Os resultados aqui observados apontam para à hipótese de que a hiperglicemia encontrada originou-se em processos gliconeogênicos, com utilização das reservas lipídicas do fígado, e não pela utilização do glicogênio hepático, como foi descrito por CONGLETON e WAGNER (1991), que descreveram processos glicogenolíticos pelo efeito da inoculação de LPS em salmão.
Outra alteração induzida pelo estresse é a variação do hematócrito, que representa a porcentagem de eritrócitos em relação ao total do volume sanguíneo. Muitos estudos relacionam o incremento do hematócrito com a presença de estresse (CASILLAS e SMITH, 1977 e SOPINSKA, 1984).
Existem duas formas para que ocorra incremento precoce do hematócrito: uma é através do aumento do número de eritrócitos, pela contração da musculatura lisa e fibras elásticas da cápsula do baço, estimuladas pela liberação de catecolaminas (HOUSTON et al., 1996), fato não detectado neste ensaio devido ao intervalo de tempo entre as amostragens.
Outra forma é através do aumento do tamanho do eritrócito, com elevação da concentração de hemoglobina e conseqüente incremento no transporte de O2 necessário para os requerimentos metabólicos durante o estresse. Porém isto diminui a resistência das células vermelhas ao fluxo sangüíneo, aumentando a hemólise (HATTINGH e PLETSEN, 1974 e SOPINSKA, 1984).
Neste ensaio os resultados (Tabela 3) indicam que em primeira instância o aumento no hematócrito ocorre devido ao aumento de tamanho dos eritrócitos, tendo apresentado os menores valores no tempo 1 (P<0,05), registrando-se intensa atividade nos sítios hemocateréticos e de reciclagem de ferro (centros melanomacrófagos) nas primeiras 24 horas (dados apresentados no capítulo 3). As catecolaminas têm ação direta na elevação do pH dos eritrócitos assim como na acidificação do plasma, permitindo o aumento da afinidade de O2 pela hemoglobina, fato só observado em peixes (WEENDERLAR BONGA, 1997). Segundo HOUSTON et al. (1996), o organismo dos peixes opta por este mecanismo já que o aumento do número de eritrócitos acarreta maior viscosidade sanguínea e, portanto, incremento do custo metabólico do trabalho circulatório, o que aumentaria as exigências energéticas do organismo durante o estresse.
Os eritrócitos maduros não são capacitados para aproveitar o ferro, o que pode resultar em diminuição da eficiência de transporte de oxigênio. Isto faz com que, em resposta ao estresse, a série vermelha circulante seja substituída por células novas, metabolicamente mais competentes. Isto está em concordância com o importante número de células imaturas que foram observadas nas extensões sanguíneas, partir das 48 horas pós-estresse.
A inoculação de LPS produziu aumento do hematócrito dos peixes com respeito ao Controle (P<0,05) (Tabela 2), ainda que os valores absolutos tenham sido inferiores aos reportados por outros autores (HINES e YASHOUV, 1970; SOPINSKA, 1984 e BHASKAR e SRINIVASA RAO, 1989), que relatam hematócritos superiores a 45%.
Agressões de diferentes tipos e intensidades produzem alterações na estrutura branquial, definidas como modificações não específicas, das quais as mais simples são
edema subepitelial parcial ou geral, apresentando-se com aspecto irregular, aumentando o espaço intercelular e a distância de difusão. Alterações hemodinâmicas mais severas são observadas pela presença de congestão e telangiectásia nas lâminas secundárias. Nesta pesquisa não foram encontradas diferenças significativas entre os tratamentos nos parâmetros avaliados, porém a estrutura branquial apresentou alterações estruturais nas diferentes amostragens (Tabela 4).
Depois de 24 horas pós-inoculação observaram-se diferenças na maioria dos parâmetros observados (P<0,05). A espessura do filamento primário e a altura de seu epitélio diminuíram possivelmente devido a migração de células para às lâminas secundárias para substituir aquelas perdidas por apoptose, conseqüentemente ao aumento dos níveis de cortisol (WENDERLAAR BONGA, 1997). A espessura da lâmina secundária, a distância entre elas e ausência de edema subepitelial indicam reação de tipo lifting do epitélio, como descrito por MALLATT (1985). Segundo este autor, o lifting do epitélio da lâmina secundária só é possível em peixes de água doce, quando acontecem ligeiros distúrbios osmóticos.
Tabela 4. Médias e desvio padrão da morfometria branquial, de pacu submetidos a estresse inflamatório, nos diferentes tratamentos e tempos de amostragem.
TRAT. Distância lâminas1 (µm) Separação lâminas2 (µm) Espessura lâminas3 (µm) Espessura filamento4 (µm) Epitélio do filamento5 (µm) Controle 200,3 ± 4,6 a 22,1 ± 0,3 a 12,4 ± 0,1 a 76,5 ± 2,5 a 32,5 ± 1,0 a LPS 208,9 ± 3,6 a 21,3 ± 0,2 a 12,2 ± 0,2 a 81,8 ± 2,4 a 34,4 ± 1,0 a Cra 211,3 ± 3,5 a 22,7 ± 0,4 a 12,4 ± 0,1 a 79,5 ± 2,3 a 34,4 ± 0,9 a CRb 221,5 ± 4,2 a 20,3 ± 0,3 a 12,3 ± 0,1 a 76,2 ± 1,6a 31,7 ± 0,6 a CRc 210,3 ± 4,0 a 22,1 ± 0,2 a 12,3 ± 0,2 a 79,2 ± 2,3 a 32,6 ± 0,9a a TEMPO 0 horas 221,7 ± 4,4 a 23,9 ± 0,3 a 13,0 ± 0,2 a 85,2 ± 2,7 ab 34,2 ±1,1 a 1 dia 218,2 ± 2,9 ab 21,4 ± 0,4 b 11,5 ± 0,1 b 68,7 ± 1,6 c 28,3 ± 0,6 b 2 dias 222,6 ±4,1 a 20,9 ± 0,2 b 12,7 ± 0,1 a 73,6 ± 1,5 bc 32,2 ±0,8 ab 4 dias 200,8 ±2,9 ab 20,5 ± 0,3 b 12,0 ± 0,1 ab 74,2 ± 1,9 bc 31,7 ± 0,8 ab 9 dias 194,3 ± 5 b 21,3 ± 0,3 b 12,6 ± 0,1 a 82,9 ± 2,4 ab 36,6 ± 0,9 a 14 dias 203,3 ± 3,5 ab 22,3 ± 0,3 ab 12,0 ± 0,1 ab 90,1 ± 2,5 a 36,9 ± 0,9 a Médias com as mesmas letras na coluna são semelhantes pelo teste de Duncan a 5% (P>0,05). Tempo 0 corresponde à amostragem prévia a inoculação. 1Distância lâminas= distância entre os extremos das laminas direita e esquerda do filamento branquial. 2Separação lâminas= distância entre lâminas secundarias de um lado do filamento primário. 3Espessura lâmina= medida da lâmina secundaria no estremo apical. 4Espessura filamento= espessura total do filamento primário.
5
Alterações maiores de tipo compensatória, como hiperplasia e hipertrofia de células epiteliais e mucosas foram encontradas com pouca freqüência, sugerindo que a elevação de cortisol e catecolaminas foi rápida, sem ocasionar alterações mais intensas (Fig. 2).
Os resultados indicam que todos os tratamentos houve estimulação do eixo HPI que resultou na elevação do cortisol, o que aconteceu de forma rápida e possivelmente em níveis maiores do que os detectados na amostragem realizada após 24 horas da inoculação.
Figura 2- Brânquias de pacu após 48 horas da inoculação com LPS. 1- Estrutura branquial conservada e 2-Brânquias com escassas áreas de hiperplasia na base das lâminas secundarias. (HE, 200 x)
O ascenso prolongado da glicemia foi uma resposta de tipo secundaria, devida provavelmente a elevação do cortisol e de catecolaminas nas primeiras horas pós- estresse. A hiperglicemia esteve baseada em processos gliconeogênicos que utilizaram fontes lipídicas como substratos, o que afetou o índice hepatossomático, determinando sua marcada diminuição nas primeiras 48 horas.
A concentração de glicogênio hepático aumentou gradativamente no período experimental, demonstrando claramente a participação do cortisol na ativação enzimática para a síntese de glicogênio.
Parte da população de eritrócitos foi substituída por células maduras reservadas no baço e outra parte por células recém formadas, mais competentes no transporte de oxigênio e portanto, mais eficientes para o organismo na situação de estresse. Aliado a isto, a estrutura branquial facilitou o intercambio gasoso, pelo fenômeno de lifting epitelial.
Conclusões
Os resultados deste trabalho demonstram que em peixes, a estimulação do sistema endócrino pode iniciar-se através de mediadores, que até pouco tempo consideravam-se próprios do sistema imune, o que demonstra o relacionamento entre sistemas, e o importante papel que desempenha o macrófago liberador de citocinas na ativação do sistema neuroendócrino, de forma similar ao que acontece nos vertebrados superiores, demonstrando presença de mecanismos semelhantes em espécies menos evoluídas filogenéticamente.
Os resultados de pesquisas nas que foi empregado LPS, fundamentados na resistência relativa dos peixes e na resposta mais demorada dos mecanismos de defesa, tem demonstrado modificações e recuperação de valores normais em tempos muito mas prolongados que os observados neste trabalho. Via de inoculação empregada, tipo de endotoxinas, métodos de isolamento das mesmas e inclusive, séries e empresas fornecedoras, podem ser o motivo desta falta de concordância de resultados.
Os benefícios da suplementação com cromo não puderam ser confirmados neste trabalho, no entanto, os menores níveis de cortisol encontrados no tratamento com maior suplementação de cromo deixam a base para futuros trabalhos que procurem avaliar as possíveis vantagens deste micromineral.