Estudo termodinâmico de blendas de fibroína de seda e alginato de sódio

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA

LAISE MAIA LOPES

ESTUDO TERMODINÂMICO DE BLENDAS DE FIBROÍNA DE SEDA

E ALGINATO DE SÓDIO

CAMPINAS 2016

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LAISE MAIA LOPES

ESTUDO TERMODINÂMICO DE BLENDAS DE FIBROÍNA DE SEDA

E ALGINATO DE SÓDIO

Orientadora: PROF.ª DR.ª MARISA MASUMI BEPPU

Co-orientadora: PROF.ª DR.ª MARIANA AGOSTINI DE MORAES

CAMPINAS 2016

Dissertação de mestrado

apresentada à Faculdade de Engenharia Química como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestra em Engenharia Química.

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA LAISE MAIA LOPES, E ORIENTADA PELA

PROF.ª DR.ª MARISA MASUMI

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A banca examinadora composta pelos membros abaixo aprovou esta dissertação: Prof.ª Dr.ª Marisa Masumi Beppu, Presidente

Instituição: FEQ/UNICAMP

Prof. Dr. Theo Guenter Kieckbusch Instituição: FEQ/UNICAMP

Prof. Dr. Bronislaw Polakiewicz Instituição: FCF/USP

A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.

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AGRADECIMENTOS

A Deus pelo discernimento, saúde mental e física, e pela paz espiritual ao longo de todos esses anos.

Aos meus familiares, em especial, aos meus pais pelo apoio incondicional, por acreditarem na minha capacidade e por terem me dado os dois bens mais valiosos que eu poderia ter: amor e educação.

Aos meus irmãos pelo companheirismo, pelas viagens, por serem exemplos de estudo e de retidão ao longo de toda minha vida.

À Professora Dr.ª Marisa M. Beppu e à Professora Dr.ª Mariana Agostini de Moraes por confiarem a mim um trabalho tão importante e me orientarem no mestrado. E também, por serem um exemplo de profissional em que certamente irei me espelhar.

Às Professoras Drª. Ângela Maria Moraes, Maria Alvina Krähenbühl por participarem da minha banca de qualificação e pelas críticas e sugestões ao meu trabalho.

Ao Professor Dr. Pedro de Alcântara Pessoa Filho pelas discussões iniciais, que me ajudaram a entender melhor meu trabalho e pela total disponibilidade em contribuir com o mesmo. A todos os meus amigos, que me acompanharam nesse desafio tornando-o mais leve, interessante e divertido, em especial Amanda Noronha, Bruna Melo, João Batista e Paulo Henrique. E a Gabriel Carvalho por todo apoio, companheirismo e carinho.

A todos os colegas de laboratório, pelo convívio diário, pelas discussões enriquecedoras, pela amizade e ajuda no desenvolvimento desse trabalho.

Ao Instituto de Física e ao Seu Levi (FEQ/UNICAMP) pelo auxílio na montagem do aparato do laser.

Ao Professor Dr. Pedro Corbi e à técnica Sonia Fanelli do Instituto de Química (UNICAMP) que permitiram a realização das análises de FTIR-ATR.

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Aos técnicos do Laboratório de Caracterização de Biomassa, Recursos Analíticos e de Calibração: Adilson Brandão, Luis Barban, Celso Camargo, Lucelia Luisa e Hugo Teixeira pelas análises realizadas e pela disponibilidade em discutir resultados.

Ao Dr. Daniel Ruiz Abánades (IB/UNICAMP) pelas análises de SDS-PAGE e Bradford e pelas discussões enriquecedoras.

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“Digo: o real não está na saída nem na chegada: ele se dispõe para a gente é no meio da travessia.” João Guimarães Rosa

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RESUMO

A utilização de polímeros naturais nas diversas áreas vem crescendo ao longo dos anos. Algumas características relacionadas a esses materiais, como biodegradabilidade, não toxicidade e biocompatibilidade, contribuem para isso. A mistura de dois ou mais polímeros, formando blendas, tem o intuito criar novos produtos com características intermediárias às dos polímeros utilizados. O estudo dessas blendas sob a ótica termodinâmica se faz necessário para elucidar fenômenos químicos que ocorrem nos sistemas formados pelos polímeros. O presente trabalho estuda a separação de fases que ocorre no sistema ternário composto pela fibroína de seda, alginato de sódio e água. Também foram estudadas as membranas formadas pelas blendas dos polímeros naturais a fim de tentar prever suas morfologias e as diferenças entre elas. As membranas foram analisadas utilizando-se as técnicas de DRX, FTIR-ATR e DSC, dessa forma foi possível comprovar a interação entre os polímeros naturais. Já no sistema com solvente, a cinética de separação de fases foi estudada através do espalhamento de luz utilizando laser de He-Ne. A partir do perfil de espalhamento de luz, foi possível se identificar o provável mecanismo de separação de fases que ocorreu no sistema com solvente e nas membranas das blendas. A quantificação dos componentes foi feita utilizando-se o método de Bradford, para fibroína de seda, evaporação de solvente, para água e o alginato de sódio foi quantificado por balanço de massa. Com os dados de equilíbrio foi possível construir diagramas ternários e identificar regiões monofásicas e bifásicas, bem como regiões de metaestabilidade nas quais ocorreu formação de hidrogéis de fibroína de seda e alginato de sódio.

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ABSTRACT

The use of natural polymers in many fields is growing over the years. Some characteristics related to these materials, such as biodegradability, non-toxicity and biocompatibility, contribute to this. The mixture of two or more polymers to form blends has the purpose to create new products with characteristics intermediate of the polymers used. The thermodynamic study of these systems is needed to elucidate the chemical phenomenon that occurs in the system formed by polymers. This work studies the solid-liquid phase separation that occurs in the ternary system formed by silk fibroin, sodium alginate and water. The membranes of these blends were also studied using the technics: XDR, FTIR-ATR e DSC, with which was possible to prove the interaction between the polymers. In the system with solvent, the kinetic of phase separation was studied with light scattering using He-Ne laser. It was also possible, using the light scattering profiles, identify the probable mechanism of phase separation that occurred in the system with solvent and in the membranes of the blends. The quantification of the components was performed using the Bradford method for silk fibroin, solvent evaporation to water and sodium alginate was quantitated by mass balance. With the equilibrium data it was possible to construct ternary diagrams and identify regions of one and two phases as well as meta-stability regions where there was formation of hydrogels silk fibroin and sodium alginate.

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LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1- Estrutura primária da fibroína da seda (Ala-Alanina;Gly-Glicina;Ser-Serina). 6 Figura 2 – Conformação secundária das cadeias polipeptídicas – folha β. ... 6 Figura 3 - Conformação secundária das cadeias polipeptídicas – α-hélice ... 7 Figura 4 - Estrutura química do alginato de sódio. ... 9 Figura 5 – Esquema representativo das estruturas de “caixa de ovos” formadas pela reação de

cross-linking entre o alginato de sódio e os íons cálcio. ... 10

Figura 6 - Ligação de hidrogênio entre alginato de sódio e fibroína de seda. ... 11 Figura 7 - Representações de diagrama de fases ternário (a) e digrama de fases retangular (b). ... 18 Figura 8 – Diagrama ternário do sistema água, fibroína de seda e brometo de lítio. ... 21 Figura 9 – Simulação numérica da evolução através do tempo, em segundos, das morfologias de separação de fases: (a) decomposição spinodal, (b) nucleação e crescimento. ... 23 Figura 10 - Evolução do padrão de espalhamento de luz com o tempo para (a) decomposição spinodal e (b) nucleação e crescimento. ... 23 Figura 11 - Diagrama ternário das blendas de fibroína de seda e alginato de sódio com as frações mássicas iniciais teóricas. ... 27 Figura 12 - Aparato para medição do espalhamento de luz. 1) laser de He-Ne; 2) polarizador; 3) porta-amostra; 4) anteparo de PMMA; 5) fonte de alimentação do laser. ... 30 Figura 13 - Esquema da metodologia utilizada para quantificação de cada componente na fase líquida. ... 31 Figura 14 - Esquema da metodologia utilizada para quantificação de cada componente na fase sólida. ... 31 Figura 15 – Distribuição do diâmetro de partícula versus número de partículas das dispersões de fibroína de seda e alginato de sódio feita em triplicata... 34 Figura 16 - Distribuição do diâmetro de partícula versus intensidade das dispersões de fibroína de seda e alginato de sódio feita em triplicata. ... 35 Figura 17 – Distribuição do potencial zeta da solução de fibroína de seda e da solução de alginato de sódio feita em triplicata. ... 36 Figura 18 - Massa molecular da fibroína de seda utilizando SDS-PAGE. ... 37

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Figura 19 – Espectros de infravermelho obtidos para as membranas puras de fibroína de seda e alginato de sódio e para a membrana da blenda SF0,5/SA0,5/WA99... 38

Figura 20 - Difratograma das membranas de fibroína de seda, alginato de sódio e blenda SF0,5/SA0,5/WA99. ... 41

Figura 21 – (A) Fotografia das membranas de fibroína de seda e alginato de sódio, (B) micrografia eletrônica de varredura da superfície das membranas e (C) micrografia da fratura das membranas. ... 43 Figura 22 – (A) Fotografia das membranas das blendas SF0,5/SA0,5/WA99 e SF1,5/SA0,5/WA98,

(B) micrografia eletrônica de varredura da superfície das membranas das blendas e (C) micrografia da fratura das membranas das blendas. ... 44 Figura 23 – (A) Fotografia das membranas das blendas SF2,5/SA0,5/WA97 e SF1,0/SA1,0/WA98,

(B) micrografia eletrônica de varredura da superfície das membranas das blendas e (C) micrografia da fratura das membranas das blendas. ... 49 Figura 28 - Curva DSC das membranas de fibroína de seda, alginato de sódio e da blenda SF0,5/SA0,5/WA99. ... 50

Figura 29 – Hidrogel formado após um dia de preparo da blenda (A) e fases líquida e sólida após separação de fases (B). ... 54 Figura 30 – Fotografias do espalhamento de luz (A) e intensidade de luz espalhada em função da distância (B) para as blendas SF0,5/SA0,5/WA99, SF1,0/SA1,0/WA98, SF0,5/SA1,5/WA98 e

SF0,5/SA2,5/WA97. Branco significa a luz do laser e preto ausência de luz. (C) estado final do

sistema fibroína de seda-alginato de sódio-água. ... 56 Figura 31 – Fotografias do espalhamento de luz (A) e instensidade de luz espalhada em função da distância (B) para as blendas SF1,5/SA0,5/WA98, SF2,0/SA1,0/WA97,

SF1,5/SA1,5/WA97 e SF1,0/SA2,0/WA97. Branco significa a luz do laser e preto ausência de luz.

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Figura 32 – Fotografias do espalhamento de luz (A) e intensidade de luz espalhada em função da distância (B) para as blendas SF2,5/SA0,5/WA97, SF3,0/SA1,0/WA96, SF2,0/SA2,0/WA96 e

SF1,0/SA3,0/WA96.. Branco significa a luz do laser e preto ausência de luz. (C) estado final do

sistema fibroína de seda-alginato de sódio-água. ... 58 Figura 33 – Fotografias do espalhamento de luz (A) e intensidade de luz espalhada em função da distância (B) para as blendas nos estágios iniciais da separação de fases das blendas SF2,5/SA0,5/WA97 e SF2,0/SA1,0/WA97. Branco significa a luz do laser e preto ausência de luz.

... 60 Figura 34 – Representação no diagrama de fases dos mecanismos de separação de fases que ocorreram no sistema ternário estudado. ... 61 Figura 35 - Esquema para determinação do ângulo de espalhamento máximo... 62 Figura 36 – Fotografias do espalhamento de luz (A) e intensidade de luz espalhada em função da distância (B) para as membranas das blendas SF0,5/SA0,5/WA99, SF0,5/SA1,5/WA98,

... 63 Figura 37 – Fotografias do espalhamento de luz (A) e intensidade de luz espalhada em função da distância (B) para as membranas das blendas SF2,5/SA0,5/WA97, SF3,0/SA1,0/WA96,

... 64 Figura 38 – Fotografias do espalhamento de luz (A) e intensidade de luz espalhada em função da distância (B) para as membranas das blendas SF1,5/SA0,5/WA98, SF2,0/SA1,0/WA97,

... 65 Figura 39 – Microscopia eletrônica de varredura ambiental da fase rica em alginato de sódio do sistema caseína-alginato de sódio-água em estudo obtido por Antonov e Moldenaers (2011). ... 69 Figura 40 – Diagrama de fases do sistema fibroína de seda-alginato de sódio-água. Fase líquida ( ), fase sólida ( ) e pontos iniciais ( ) e linhas de amaração ( ). ... 71 Figura 41 - Diagrama de fases do sistema fibroína de seda-alginato de sódio-água com a possível região do precipitado verdadeiro, onde se incluem os pontos indicados pelos círculos pretos. ... 73 Figura A1.1 - Espectro de infravermelho obtido para as membranas das blendas de fibroína de seda e alginato de sódio. ... 86 Figura A1.2 - Difratograma obtido para as membranas das blendas de fibroína de seda e alginato de sódio. ... 87 Figura A1.3 – Termogramas de DSC obtida para as membranas das blendas de fibroína de seda e alginato de sódio. ... 88

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Figura A1.4 – Diagrama de fases indicando a região de variabilidade do sistema fibroína de seda, alginato de sódio e água. ... 92

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Principais bandas de absorção observadas para as diferentes blendas de fibroína de seda e alginato de sódio. ... 39 Tabela 2: Temperaturas de transição vítrea obtidas paras membranas de fibroína de seda, alginato de sódio e suas blendas. ... 51 Tabela 3: Valores de fração mássica de cada componente nas fases das membranas de fibroína de seda e alginato de sódio e valor de 𝜒 para as blendas SF0,5/SA0,5/WA99, SF1,5/SA0,5/WA98,

SF2,5/SA0,5/WA97, SF3,0/SA1,0/WA96 e SF1,0/SA3,0/WA96. ... 53

Tabela 4: Distância entre os domínios das fases das blendas em que há a morfologia de IPN’s e onde, provavelmente, ocorre a separação por decomposição spinodal. ... 62 Tabela 5: Distância entre os domínios das fases das membranas das blendas em que ocorreu provável separação por decomposição spinodal. ... 67 Tabela 6: Diferentes tipos de mecanismo de separação de fases obtidos para o sistema ternário composto por fibroína de seda-alginato de sódio-água e para as membranas das blendas.68 Tabela 7: Fração mássica dos componentes do sistema ternário na fase líquida. ... 70 Tabela 8: Fração mássica dos componentes do sistema ternário na fase sólida. ... 70 Tabela A1.1 Massa de fibroína de seda, alginato de sódio e água nas fases líquida e sólida – 1º experimento. ... 89 Tabela A1.2 Massa de fibroína de seda, alginato de sódio e água nas fases líquida e sólida – 2º experimento. ... 90 Tabela A1.3 Massa de fibroína de seda, alginato de sódio e água nas fases líquida e sólida – média e desvio padrão. ... 91

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SUMÁRIO

RESUMO ... viii

ABSTRACT ... ix

LISTA DE ILUSTRAÇÕES ... x

LISTA DE TABELAS ... xiv

1 INTRODUÇÃO ... 1 2 OBJETIVOS ... 3 2.1 Objetivo Geral ... 3 2.2 Objetivos Específicos ... 3 3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ... 4 3.1 Blendas poliméricas ... 4 3.2 Fibroína de seda ... 5 3.3 Alginato de sódio ... 8

3.4 Blendas de fibroína de seda e alginato de sódio ... 10

3.5 Critérios termodinâmicos de miscibilidade de blendas ... 13

3.6 Modelos Termodinâmicos ... 14

3.7. Avaliação da miscibilidade de uma blenda polimérica a partir da temperatura de transição vítrea (Tg). ... 15

3.8 Diagrama de fases ... 18

3.8.1 Estudos termodinâmicos com fibroína de seda e alginato de sódio ... 19

3.9 Mecanismos de separação de fases ... 22

4 MATERIAIS E MÉTODOS ... 25

4.1 Preparo das soluções de fibroína de seda e alginato de sódio... 25

4.2 Espalhamento de luz dinâmico ... 25

4.3 Determinação da massa molecular de fibroína de seda. ... 26

4.4 Preparo das blendas de fibroína de seda e alginato de sódio para estudo do sistema ternário. ... 26

4.5 Preparo das membranas das blendas de fibroína de seda e alginato de sódio ... 27

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4.6.1 Espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR-ATR)... 27

4.6.2 Difração de Raio X (DRX)... 28

4.6.3 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) ... 28

4.6.4 Análise térmica – Calorimetria exploratória diferencial (DSC)... 28

4.7 Estudo Cinético ... 29

4.8 Identificação do mecanismo de separação de fases ... 29

4.9 Quantificação dos componentes nas fases sólida e líquida. ... 30

5 RESULTADOS ... 34

5.1 Caracterização das soluções de fibroína de seda e alginato de sódio. ... 34

5.1.1 Determinação do tamanho de partícula e potencial zeta ... 34

5.1.2 Massa molecular da fibroína de seda e do alginato de sódio ... 37

5.2 Caracterização das membranas das blendas de fibroína de seda e alginato de sódio. ... 38

5.2.1 Espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR-ATR). .. 38

5.2.2 Difração de Raio X ... 40

5.2.3 Microscopia Eletrônica de Varredura ... 41

5.3 Avaliação da miscibilidade das blendas de fibroína de seda e alginato de sódio a partir da Tg. ... 50

5.5 Identificação do mecanismo de separação de fases das blendas de fibroína de seda e alginato de sódio. ... 55

5.6 Quantificação dos componentes em cada fase. ... 69

10 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 80

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1 INTRODUÇÃO

A termodinâmica química é uma área do conhecimento primordial para a elucidação de fenômenos químicos. É, também, uma ciência que vem sendo estudada há muitos séculos e tem suas leis básicas consolidadas do ponto de vista formal da lógica matemática (FRANCO, 2012). Dessa maneira, a termodinâmica contribui significativamente no estudo de novas tecnologias. Atualmente, os polímeros naturais e os biopolímeros vêm sendo bastante estudados para diversas finalidades, desde a indústria de embalagens até a indústria médica e farmacêutica. No entanto, a modelagem termodinâmica do comportamento da maioria desses polímeros naturais ainda é pouco conhecida. Dentre os polímeros naturais mais estudados no momento se destacam a fibroína de seda e o alginato de sódio.

A fibroína de seda é uma proteína que tem grande potencial de aplicação como biomaterial. Ela tem sido utilizada em estudos in vitro e in vivo e apresenta promissoras aplicações como biomaterial na engenharia tecidual (UCHIDA et al., 2014) devido à afinidade com células do tecido ósseo, cartilaginoso, e de tendões e ligamentos. Já o alginato de sódio é um polissacarídeo amplamente utilizado no tratamento de doenças da mucosa gástrica e como curativos (LEUNG et al., 2014; RICHARDSON et al., 2004), além de ter propriedade hemostática e hidrofílica. Portanto, ambos polímeros naturais representam uma alternativa aos polímeros sintéticos para uso como biomaterial, além de serem mais econômicos, biocompatíveis e não-tóxicos.

Devido às características destes dois polímeros naturais, alguns pesquisadores (DE MORAES et al., 2014; MANDAL; KUNDU, 2009; MING; ZUO, 2014a) vêm buscando formar blendas e compósitos entre eles a fim de conjugar suas propriedades e intensificar a utilização desses materiais.

Os sistemas que envolvem proteínas e polissacarídeos são complexos, sendo observado separação de fases em blendas formadas pelos polímeros naturais. Esse processo depende da miscibilidade entre os dois polímeros. Uma abordagem mais generalista ao que ocorre com uma mistura de polímeros pode ser enquadrada sob uma visão de separação de fases, ou seja, através de critérios termodinâmicos. Além disso, a solução formada pelos polímeros deve ser estável. A estabilidade de uma solução é verificada a partir da análise da segunda derivada da variação da energia livre de Gibbs em relação à composição com temperatura e pressão fixas (MAGGIONI, 1999).

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O modo como a separação de fases ocorre é um ponto-chave nesses sistemas. A separação de fases pode ocorrer de duas formas: separação por nucleação e crescimento ou separação spinodal. Cada um desses mecanismos fornecerá materiais finais cuja disposição das fases geram características estruturais diferentes e consequentemente propriedades distintas.

O conhecimento sobre as características termodinâmicas de substâncias químicas é essencial para sua utilização industrial. A partir de dados termodinâmicos é possível prever o comportamento dessas substâncias, ao longo de processos de transformação, bem como determinar parâmetros de operação que são fundamentais nas mais diversas aplicações.

O Laboratório de Engenharia e Química de Produto (LEQUIP), coordenado pela Professora Doutora Marisa Masumi Beppu, desenvolveu (DE MORAES, 2010) blendas de fibroína de seda e alginato de sódio com potencial de aplicação como curativos de alto desempenho. Dentro deste contexto, o presente trabalho busca compreender como a fibroína de seda e o alginato de sódio interagem, bem como estabelecer o mecanismo de separação de fases que ocorre nas blendas formadas por estes polímeros naturais.

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2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Estudar o comportamento de mistura da blenda de fibroína de seda e alginato de sódio sob a ótica termodinâmica.

2.2 Objetivos Específicos

1. Estabelecer o tempo necessário para que o sistema atinja o equilíbrio termodinâmico; 2. Estudar a influência da fração mássica dos componentes no sistema;

3. Propor um diagrama de fases que represente o sistema estudado;

4. Identificar o mecanismo de separação de fases das blendas de fibroína de seda e alginato de sódio;

5. Determinar as temperaturas de transição vítrea das blendas, a fim de verificar a miscibilidade das mesmas;

6. Estudar as morfologias das blendas formadas pelos polímeros naturais correlacionando-as com propriedades macroscópicas do material final;

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3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

3.1 Blendas poliméricas

Uma blenda polimérica é a mistura física de pelo menos dois polímeros ou copolímeros (UTRACKI, 1989). A mistura desses polímeros visa criar um produto que combine características individuais dos mesmos, sendo uma técnica economicamente mais viável do que criar um polímero novo que se adeque às necessidades requeridas.

Alguns métodos de preparação de blendas são: mistura mecânica, o mais utilizado devido ao menor custo; evaporação de solvente (casting), e co-precipitação, também chamado de inversão de fases, onde os polímeros são dissolvidos em um solvente comum e depois transferidos para um não-solvente havendo precipitação da blenda.

A técnica de evaporação de solvente, casting, consiste na dissolução dos componentes da blenda em um solvente comum, sendo o solvente retirado através da evaporação. Alguns parâmetros como taxa de evaporação, interação solvente-polímero e proporção entre os polímeros influenciam na morfologia final da blenda (INOUE, 2002).

A técnica de inversão de fases consiste na transformação da blenda em estado líquido para o estado sólido através da sua imersão em um banho contendo um não-solvente, diminuição da temperatura ou colocando a blenda em contato com o vapor de um não-solvente (VANDEZANDE; GEVERS; VANKELECOM, 2008). Nessa técnica, a interação dos polímeros com o não-solvente é importante pois influencia o aspecto cinético, tendo consequência direta na morfologia da blenda.

O método pelo qual a blenda polimérica é preparada interferirá diretamente em algumas características como morfologia, propriedades mecânicas e térmicas, pois as propriedades físicas das blendas dependem da forma como ocorre a separação de fases, do grau de mistura e da interação química entre os dois componentes (RADHAKRISHNAN; VENKATACHALAPATHY, 1996).

Geralmente, busca-se obter blendas cujos componentes sejam miscíveis e/ou compatíveis. A miscibilidade das blendas pode ser determinada por parâmetros termodinâmicos. As blendas miscíveis são aquelas que apresentam uma única fase. As blendas imiscíveis são aquelas que apresentam duas fases distintas, e as blendas parcialmente miscíveis são aquelas que apresentam duas fases, cada uma rica em um componente.

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Uma blenda compatível é aquela que apresenta uma mistura de polímeros atrativa comercialmente, normalmente homogênea a olho nu, frequentemente com melhora das propriedades mecânicas em relação aos polímeros constituintes (UTRACKI, 1989). Dessa forma, a miscibilidade de uma blenda não é condição indispensável para sua compatibilidade. Existem formas de aumentar a compatibilidade de uma blenda, utilizando compatibilizantes que irão atuar principalmente na interface das fases, ou seja, nas ligações intermoleculares.

Blendas imiscíveis, geralmente, apresentam uma morfologia complexa, a qual é interessante em alguns casos. Muitas estruturas biológicas como ossos, pele e cartilagem possuem fases distintas. Essas estruturas apresentam propriedades e microestruturas diferenciadas e específicas que se mostram extremamente importantes na manutenção do bom funcionamento do corpo humano.

Blendas utilizando fibroína de seda e alginato de sódio já foram estudadas anteriormente (DE MORAES; BEPPU, 2013; LIANG; HIRABAYASHI, 1992; MING; ZUO, 2014) e seu potencial de aplicação como biomaterial já foi bem ressaltado pelos pesquisadores. No entanto, não há, na literatura, alusão às características termodinâmicas dessa blenda. Conhecer como esses polímeros se relacionam do ponto de vista termodinâmico é importante para prever seu comportamento em diferentes sistemas e é fundamental para prever as características morfológicas dessas blendas.

3.2 Fibroína de seda

A proteína da seda está presente em grande quantidade nas glândulas dos artrópodes produtores de seda (bicho-da-seda, aranha, escorpião, ácaros e abelhas) (KUNDU et al., 2013). O animal que mais produz seda, na natureza, é o bicho-da-seda da espécie Bombyx

mori (YUCEL; LOVETT; KAPLAN, 2014) e, devido à facilidade de domesticação e

manipulação, também é a espécie comumente utilizada em trabalhos acadêmicos.

O casulo do bicho-da-seda é composto principalmente por sericina e fibroína (DE MORAES, 2010), duas proteínas que têm aplicação como biomaterial. A sericina tem a função de unir as fibras de fibroína, uma espécie de cola que mantém a estrutura do casulo, protegendo o bicho-da-seda (ALTMAN et al., 2002). O processo de retirada da sericina dos casulos de seda é chamado de degomagem. Esse processo pode ser feito utilizando soluções alcalinas ou em água fervente e, após feita a degomagem, cerca de 25% da massa dos casulos é removida e são observadas mudanças nas características do material (DE MORAES, 2014).

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Os principais aminoácidos presentes na fibroína de seda são: glicina, alanina e serina (DU et al., 2009). Há também, em menor quantidade, a tirosina. A estrutura química primária da fibroína de seda pode ser observada na Figura 1.

Figura 1- Estrutura primária da fibroína da seda (Ala-Alanina;Gly-Glicina;Ser-Serina).

Fonte: NOGUEIRA (2005).

As proteínas apresentam, em geral, três possíveis conformações secundárias: folha β, α-hélice e enovelamento aleatório (CANEVAROLO JR., 2006). A conformação mais estável é a do tipo folha-β também chamada de seda II, mostrada na Figura 2.

Figura 2 – Conformação secundária das cadeias polipeptídicas – folha β.

Fonte: NELSON; COX (2002).

Na conformação folha-β as cadeias polipeptídicas estão estendidas em forma de zigue-zague podendo se arranjar lado a lado formando uma estrutura que remete a um conjunto de

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pregas (NELSON; COX, 2002). As cadeias polipeptídicas estão ligadas por ligações de hidrogênio entre segmentos vizinhos da cadeia.

A conformação tipo α-hélice é a conformação mais simples que a cadeia polipeptídica pode assumir (NELSON; COX, 2002). Possui esse nome devido à sua estrutura helicoidal formada pelos polipeptídeos que se torcem em torno de um eixo imaginário, mostrada na Figura 3. A estrutura é estabilizada por interações de Van der Waals e ligações de hidrogênio entre os grupos C=O residuais da cadeia principal e os grupos N-H na sequência de aminoácidos (DE MORAES, 2010). Essa conformação também é chamada de seda I e representa a forma metaestável da fibroína de seda.

Já a conformação enovelamento aleatório não apresenta uma estrutura bem definida e os polipeptídeos podem se ligar de todas as formas possíveis, produzindo regiões poliméricas amorfas (CANEVAROLO JR., 2006).

Figura 3 - Conformação secundária das cadeias polipeptídicas – α-hélice

Fonte: FRANCISCO JR. e FRANCISCO (2006).

A fibroína de seda é composta por uma cadeia leve e uma pesada que se unem através de ligações de dissulfeto, e por uma glicoproteína P25, ligada às cadeias leve e pesada através de ligações de dissulfeto e ligações não-covalentes (INOUE et al., 2000). A cadeia pesada tem aproximadamente 350 kDa e a leve de 25 kDa (TANAKA; MORI; MIZUNO, 1993).

A cadeia pesada é a componente principal da fibroína de seda, ela é formada por 12 regiões repetitivas e 11 regiões não-repetitivas organizadas de forma alternada (CRAIG; RIEKEL, 2002). Ela é composta por blocos hidrofóbicos, formados pela sequência de

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aminoácidos Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser. A cadeia pesada tem a tendência de formar a estrutura folha-β através de ligações de hidrogênio e interações hidrofóbicas (DU et al., 2009).

Na cadeia leve não se observa uma sequência organizada de aminoácidos, ela apresenta algumas estruturas em conformação α-hélice e outras em folha-β. Isso indica que esta pode formar regiões amorfas na fibroína de seda (HA et al., 2005; ZHOU et al., 2001).

Nos fios de seda, a fibroína encontra-se na conformação folha-β, estável e insolúvel em água, pois há grande quantidade de aminoácidos hidrofóbicos no interior e na superfície da sua estrutura. No preparo de soluções de fibroína de seda, são utilizadas soluções concentradas de ácidos e soluções aquosas e orgânicas de sais a fim de solubilizar a fibra. As soluções mais comumente utilizadas para dissolução dos fios de seda são: solução de LiBr e solução ternária de CaCl2, etanol e água.

Segundo Kundu et al. (2013), a fibroína de seda possui vantagem como biomaterial em comparação com outras proteínas que são derivadas de tecidos de origem alogênica ou xenogênica. Os biomaterias derivados da fibroína apresentam menor risco de infecção e baixo custo de processamento. Além disso, comparado com outros polímeros naturais, a fibroína de seda possui propriedades mecânicas interessantes, como alta resistência à tração, e boa resistência térmica, possuindo temperatura de degradação próxima aos 300ºC.

A fibroína de seda há muitos anos é utilizada na medicina para fazer suturas e ligamentos artificiais (SAH; PRAMANIK, 2010). Os estudos sobre essa proteína vem crescendo e é possível encontrar na literatura vários trabalhos que utilizam a fibroína de seda como biomaterial. Ela tem aplicação na engenharia tecidual (ALTMAN et al., 2002; FARÈ et

al., 2013; KUNDU et al., 2013; UCHIDA et al., 2014), liberação de medicamentos (MARIN;

MALLEPALLY; MCHUGH, 2014; SHI; GOH, 2011; WENK; MERKLE; MEINEL, 2011; YUCEL; LOVETT; KAPLAN, 2014), scaffold (KIM et al., 2005; MING; ZUO, 2014b; MONTANHA, 2012; POOYAN; TANNENBAUM; GARMESTANI, 2012; WANG et al., 2014) e curativos (CALAMAK et al., 2014; DE MORAES, 2010; ROH et al., 2006).

3.3 Alginato de sódio

O alginato de sódio é um polissacarídeo natural produzido por algas marrons e algumas bactérias (AGULHON et al., 2014). A sua estrutura é formada por blocos de dois

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ácidos, o β-D manurônico (M) e o α-L gulurônico (G), mostrados na Figura 4, os quais diferem estereoquimicamente no carbono-5.

Figura 4 - Estrutura química do alginato de sódio.

Fonte: Adaptado de BEKIN et al. (2014).

Os ácidos podem se ligar com seus iguais (blocos G e M) ou um com o outro (bloco GM). A relação entre o ácido β-D manurônico e o ácido α-L gulurônico é, geralmente, de 2:1 (MASUELLI; ILLANES, 2014). Essa proporção pode variar devido à origem do alginato de sódio, idade da alga e do tipo de tecido do qual foi extraído o alginato (LACROIX; TIEN, 2005; MASUELLI; ILLANES, 2014) . Essa variação irá determinar as propriedades físico-químicas do alginato de sódio (XIAO; GU; TAN, 2014).

O alginato de sódio é biocompatível, não-tóxico e hidrofílico, essas propriedades despertam o interesse em utilizá-lo como biomaterial (DE MORAES, 2010). O alginato de sódio tem sido utilizado como espessante em alimentos (RANI; MISHRA; SEN, 2013), emulsificante, estabilizante, em materiais têxteis e farmacêuticos (AOKI et al., 2012).

Os grupos carboxilato tornam o alginato de sódio solúvel em água (NIETO, 2009), sendo seus filmes impermeáveis a óleos e gorduras (LACROIX; TIEN, 2005). No entanto, o alginato de sódio na presença de cátions divalentes e polivalentes, tais como Ca2+, Cu2+, Al3+ e Fe3+, forma um gel através da reação de cross-linking (intercruzamento), tornando-se insolúvel em água (JOST et al., 2014). O cátion mais utilizado na reação de cross-linking é o Ca2+, pois ele se liga, preferencialmente, aos grupos de ácido gulurônico formando estruturas chamadas de “caixa de ovos”, mostradas na Figura 5.

Os géis de alginato de sódio são bastante versáteis podendo ser combinados com outras moléculas para diversas aplicações, como por exemplo, na liberação de fármacos (BHUTANI et al., 2015; JABEEN et al., 2015; MCLENNAN et al., 2000), na engenharia

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tecidual (FINOSH et al., 2015; KUO; MA, 2001; SARKER et al., 2015; SILVA et al., 2014) e em curativos (BALAKRISHNAN et al., 2005; KAMOUN et al., 2013).

Figura 5 – Esquema representativo das estruturas de “caixa de ovos” formadas pela reação de

cross-linking entre o alginato de sódio e os íons cálcio.

Fonte: CHRISTENSEN; INDERGAARD; SMIDSRØD (1990)

Os filmes de alginato de sódio têm como características: resistência mecânica, flexibilidade e baixa permeabilidade ao oxigênio (LACROIX; TIEN, 2005; NIETO, 2009). Embora existam vários estudos sobre os filmes de alginato de sódio, o processo de formação destes é bastante complexo, por isso, ainda não está bem esclarecido (XIAO; GU; TAN, 2014). A formação de filmes de alginato de sódio envolve movimento da cadeia do polímero, assim como interações solvente-polímero e polímero-polímero durante a evaporação do solvente (CROSSINGHAM; KERR; KENNEDY, 2014).

3.4 Blendas de fibroína de seda e alginato de sódio

Alguns trabalhos importantes envolvendo blendas de fibroína de seda e alginato de sódio comprovaram que ocorre interação entre os dois polímeros naturais por meio de ligações de hidrogênio (LIANG; HIRABAYASHI, 1992), de acordo com o esquema mostrado na Figura 6. As blendas obtidas apresentam propriedades melhoradas, como maior tensão de ruptura e alongamento, quando comparadas aos polímeros separados.

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Figura 6 - Ligação de hidrogênio entre alginato de sódio e fibroína de seda.

Fonte: LIANG; HIRABAYASHI (1992)

O primeiro trabalho publicado utilizando blendas de fibroína de seda e alginato de sódio foi feito por Liang e Hirabayashi (1992). Os autores estudaram as propriedades mecânicas, térmicas e a capacidade de absorção de água das blendas e concluíram que, em relação às membranas de fibroína de seda, as blendas apresentavam valores de tensão de ruptura cerca de 68% maiores do que a membrana de fibroína de seda. Além disso, as blendas apresentaram maior alongamento e maior capacidade de retenção de água em relação à membrana de fibroína de seda.

Lee et al. (2004) estudaram as propriedades térmicas, morfológicas e mecânicas das blendas de fibroína de seda e alginato de sódio. Os autores prepararam as blendas misturando soluções aquosas dos polímeros, seguido por liofilização, obtendo blendas esponjosas. Em relação às propriedades mecânicas, os autores concluíram que o alginato de sódio é um bom aditivo para melhorar as propriedades mecânicas de materiais à base de fibroína de seda. A análise morfológica mostrou que as blendas esponjosas apresentavam separação de fase macroscópica. Através de análise por calorimetria diferencial exploratória foi possível verificar que a cristalização térmica da fibroína de seda foi interrompida pela incorporação de alginato de sódio, ou seja, embora ocorra separação de fases, há interação entre os dois polímeros naturais.

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Para utilização como biomaterial, pode-se citar alguns artigos que demonstraram o potencial de aplicação dessas blendas na área médica.

Roh et al. (2006) compararam o efeito cicatrizante das blendas esponjosas de fibroína de seda e alginato de sódio com o curativo commercial Nu Gauze™. Os testes foram realizados na pele de ratos e os autores observaram que as blendas reduziam, significativamente, o tamanho das lesões após sete dias. Mais ainda, comparado ao curativo comercial, as blendas de fibroína de seda e alginato de sódio eram mais eficientes no processo de cura. Isso ocorre porque as blendas promovem a re-epitelização pela rápida proliferação das células epiteliais e deposição de colágeno via proliferação dos fibroblastos. Esse efeito é devido à sinergia entre a fibroína de seda e o alginato de sódio.

De Moraes (2010) avaliou a miscibilidade e as características físicas das blendas de fibroína de seda e alginato de sódio. As blendas obtidas apresentaram separação microscópica de fases, sendo parcialmente miscíveis, e com uma morfologia bastante interessante, contendo glóbulos regulares e auto organizados. As blendas também apresentaram propriedades melhores do que as membranas de fibroína de seda, como por exemplo, maior grau de intumescimento, permeabilidade ao vapor d’água e hidrofilicidade. A autora também comparou as propriedades mecânicas das blendas com a membrana de fibroína de seda pura, sendo os valores de tensão de ruptura e alongamento maiores nas blendas. Além disso, as blendas apresentaram aumento na viabilidade celular, indicando o potencial de aplicação como curativos de ferimentos e queimaduras.

Srisuwan e Baimark (2013) estudaram filmes biodegradáveis de fibroína de seda e alginato de sódio para liberação controlada de medicamentos antimicrobianos. Os filmes obtidos apresentaram morfologia homogênea. Os filmes de alginato de sódio se mostraram mais solúveis em água do que os de fibroína de seda, e as blendas apresentaram valores intermediários. Já na liberação do medicamento, os autores observaram que quanto maior a proporção de fibroína de seda na blenda, menor a liberação do fármaco, já que a liberação é feita em meio aquoso e a fibroína de seda possui caráter predominantemente hidrofóbico.

Nota-se que nos trabalhos mencionados é apresentado um estudo de miscibilidade da blenda, seja para explicar sua morfologia, ou propriedades adquiridas. Portanto, a miscibilidade ou compatibilidade de uma blenda é um fator importantíssimo a ser avaliado, pois poderá influenciar em propriedades desejadas para sua aplicação.

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3.5 Critérios termodinâmicos de miscibilidade de blendas

As blendas poliméricas podem ser divididas em três categorias: miscíveis, formando uma única fase, parcialmente miscíveis e imiscíveis, formando um sistema multifásico (BOUDENNE et al., 2011). O parâmetro termodinâmico que determina a miscibilidade de uma mistura é a variação da energia livre de Gibbs de mistura, que pode ser calculada através da equação fundamental da termodinâmica como mostra a Equação 1, onde ΔGm é a variação

da energia livre de Gibbs de mistura; ΔHm é a variação da entalpia de mistura; ΔSm é a

variação da entropia de mistura e T é a temperatura.

ΔGm = ΔHm – TΔSm (Equação 1)

Para que a blenda seja miscível é necessário que o valor de ΔGm seja menor que zero. Além disso, é necessário que a segunda derivada da variação da energia livre de Gibbs da mistura em relação à fração volumétrica do polímero i ( i), com temperatura e pressão constantes, seja maior que zero, como mostra a Equação 2, devido à critérios de estabilidade.

(

𝜕²∆𝐺𝑚

𝜕∅𝑖²

)

_𝑇,𝑃

> 0

(Equação 2)

Embora todo processo de mistura aumente a entropia do sistema, em misturas poliméricas a probabilidade de rearranjo molecular é muito pequena, fazendo com que a entropia de mistura seja bastante pequena (TAGER, 1977). Então, para que um sistema seja miscível, a variação da entalpia de mistura deve ser menor que a contribuição entrópica.

Em um sistema com dois componentes, A e B, e π fases, sem reação química, as condições para que haja equilíbrio termodinâmico são: equilíbrio térmico, equilíbrio mecânico e equilíbrio químico, ou matematicamente:

Tfase 1_{= T}fase 2_{= T}fase 3 _{= ...= T}fase π

Pfase 1_{= P}fase 2_{= P}fase 3 _{= ... = P}fase π

μAfase 1 = μAfase 2 = μAfase 3 = ... = μAfase π

μBfase 1 = μBfase 2 = μBfase 3 = ... = μBfase π

onde P, T e μ representam, respectivamente, a pressão, a temperatura das fases e o potencial químico dos componentes.

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Com essas condições de equilíbrio e a equação fundamental da termodinâmica, é possível propor modelos para construção de diagramas de fase. Os estudos do equilíbrio de fase iniciaram pela forma mais simples, o equilíbrio entre fluidos. No entanto, macromoléculas como os polímeros não se ajustam bem a esse modelo.

Com o objetivo de descrever o equilíbrio termodinâmico de macromoléculas, muitos cientistas desenvolveram modelos, sendo o primeiro deles, o de Flory-Huggins.

3.6 Modelos Termodinâmicos

3.6.1 Modelo de Flory-Huggins

Em 1941, Flory publicou um artigo sobre a termodinâmica de soluções de polímeros. Seu modelo, Equação 3, pode ser aplicado a moléculas de tamanhos diferentes e contém duas partes: a primeira é uma contribuição entrópica, que considera efeitos de tamanho e forma de moléculas; a segunda é uma contribuição entálpica que considera as interações intermoleculares (YANO, 2007). Embora antigo, o modelo ainda é utilizado como abordagem inicial em sistemas atuais.

∆𝐺 𝑅𝑇=

[

𝑥𝐴 𝑙𝑛 ∅𝐵 𝑥𝐴 + 𝑥_𝐵 𝑙𝑛∅𝐵 𝑥_𝐵

]

+ 𝜒

(

𝑥𝐴+ 𝑚𝑥𝐵

)

∅𝐴∅𝐵 (Equação 3)

Onde xA e xB são as frações molares dos componentes A e B, respectivamente;

m é dado por: 𝑚 = 𝑉𝐵

𝑉𝐴

VA e VB são os volumes molares dos componentes A e B, respectivamente;

χ é o parâmetro de interação de Flory-Huggins;

ϕA e ϕB são as frações volumétricas dos componentes A e B, respectivamente;

Esse modelo é baseado em três hipóteses (SCHMID, 2011):

1. A conformação dos polímeros é considerada igual àquelas de cadeia ideal, independente da composição;

2. O polímero fundido é tido como incompressível e os monômeros ocupam volumes iguais;

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Na prática, nenhuma dessas hipóteses é válida, pois a conformação do polímero depende da composição, os volumes ocupados pelos monômeros não são iguais e as flutuações na composição tem influência fundamental no comportamento das fases (SCHMID, 2011).

O parâmetro de Flory-Huggins (χ) não é um parâmetro fixo, ele deriva das interações energéticas entre os polímeros e depende da composição da blenda, da temperatura e do tamanho das cadeias (SCHMID, 2011). Ele fornece informações a respeito da miscibilidade de uma blenda, para valores positivos de χ, a separação de fases é favorecida (JIMENEZ, 2007).

Há outros modelos que também são utilizados como o NRTL (Non-Random, Two

Liquids) desenvolvido por Renon e Prausnitz, que é aplicável a sistemas parcialmente

miscíveis e o modelo UNIQUAC (Universal Quasi Chemical) desenvolvido por Abrams e Prausnitz, que assim como Flory-Huggins relaciona a energia livre de Gibbs com contribuições entrópicas e entálpicas.

O modelo UNIQUAC é uma extensão da teoria quase-química de Guggenheim (1952) para moléculas não-randômicas de misturas contendo diferentes tamanhos (AGUIAR, 2009). O modelo UNIQUAC é aplicável a moléculas de diversos tamanhos, portanto, pode ser utilizado para polímeros.

O modelo se baseia na energia de Gibbs molar em excesso, a qual é determinada pela soma de uma parte combinatorial e residual, como mostrado na Equação 4. A parte combinatorial expressa as contribuições entrópicas dos componentes e a parte residual expressa as contribuições entálpicas.

𝑔𝐸 𝑅𝑇= ( 𝑔𝐸 𝑅𝑇)_{𝑐𝑜𝑚𝑏𝑖𝑛𝑎𝑡𝑜𝑟𝑖𝑎𝑙}+ ( 𝑔𝐸 𝑅𝑇)_{𝑟𝑒𝑠𝑖𝑑𝑢𝑎𝑙} (Equação 4)

3.7. Avaliação da miscibilidade de uma blenda polimérica a partir da temperatura de transição vítrea (Tg).

A temperatura de transição vítrea (Tg) é a temperatura em que o polímero amorfo ou a região cristalina do polímero semicristalino adquire energia (geralmente térmica) suficiente para que as cadeias tenham mobilidade, ou seja, adquiram possibilidade de mudança de conformação (CANEVAROLO JR., 2006).

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Um dos métodos de avaliação da miscibilidade é através do deslocamento da Tg. Quando uma blenda é miscível, ela apresenta um valor de Tg que deve ser intermediário ao valor das Tgs dos componentes puros (CASSU; FELISBERTI, 2005). Já quando a blenda é parcialmente miscível ele apresentará dois ou mais valores de Tgs também intermediários aos valores das Tgs dos componentes puros, e se for imiscível, a blenda apresentará os mesmos valores de Tg dos polímeros puros.

A temperatura de transição vítrea pode ser determinada por três técnicas: calorimetria exploratória diferencial, análise dinâmico-mecânica e dilatometria.

A calorimetria exploratoria diferencial (DSC) é uma técnica termoanalítica que utiliza um material termicamente inerte como referência para medir as variações de entalpia de uma amostra em relação a referência enquanto ambas são submetidas a aquecimento (DENARI; CAVALHEIRO, 2012). Existem dois tipos de DSC, por compensação de potência e por fluxo de calor. Na primeira, a amostra e a referência são mantidas a uma mesma temperatura através de aquecedores elétricos individuais (DENARI; CAVALHEIRO, 2012), enquanto na calorimetria por fluxo de calor a diferença em fluxo de calor entre a amostra e a referência é registrada enquanto a temperatura da amostra é aumentada ou diminuída linearmente (CANEVAROLO JR., 2006).

A análise dinâmico-mecânica (DMA) ou termodinâmico-mecânica (DMTA) consiste em medir a deformação sofrida ou a tensão resultante de um sólido ou líquido viscoso ao se aplicar uma tensão ou deformação oscilatória, geralmente senoidal, de baixa amplitude (CASSU; FELISBERTI, 2005). A transição vítrea é seguida por uma grande variação do módulo de armazenamento, cerca de 103, o que torna a técnica de DMA mais sensível para detecção de Tgs e pode ser utilizada para medir Tg em fases que apresentam baixa concentração de um componente (CASSU; FELISBERTI, 2005).

A dilatometria é uma técnica que consiste em medir a variação de volume específico em relação à variação de temperatura (AKCELRUD, 2007). A Tg é identificada através da mudança do coeficiente angular (α).

A partir da Tg também é possível estimar o valor do parâmetro de Flory-Huggins (χ). Em sistemas parcialmente miscíveis formados por dois componentes, cada fase pode ser considerada como uma fase miscível. É possível utilizar as equações de Fox (Equação 5), de Couchman (Equação 6) ou de Gordon-Taylor (Equação 7) (LU; WEISS, 1992) em cada fase

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e encontrar a relação de Tg com as frações mássicas dos componenetes em cada fase. A fração mássica pode ser convertida em fração volumétrica, e com esses dados, é possível através da Equação 8 desenvolvida por Kim e Burns (1987), encontrar o parâmetro de Flory-Huggins. Para as blendas de fibroína de seda e alginato de sódio, adotou-se a seguinte nomenclatura: sf para fibroína de seda e sa para alginato de sódio.

1 Tg= 𝑤𝑠𝑓 𝑇𝑔𝑠𝑓+ 𝑤𝑠𝑎 𝑇𝑔𝑠𝑎 (Equação 5) 𝑙𝑛 𝑇𝑔 =𝑤𝑠𝑓 𝑙𝑛𝑇𝑔𝑠𝑓+𝑘𝑤𝑠𝑎𝑙𝑛 𝑇𝑔𝑠𝑎 𝑤𝑠𝑓+𝑘𝑤𝑠𝑎 (Equação 6) 𝑇𝑔 =𝑤𝑠𝑓 𝑇𝑔𝑠𝑓+𝑘𝑤𝑠𝑎𝑇𝑔𝑠𝑎 𝑤_𝑠𝑓+𝑘𝑤_𝑠𝑎 (Equação 7) 𝜒 = (𝜑_{𝑠𝑓𝑓1}2 − 𝜑_{𝑠𝑓𝑓2}2)[𝑚₁ 𝑙𝑛𝜑𝑠𝑓𝑓2 𝜑𝑠𝑓𝑓1+(𝑚𝑠𝑓 −𝑚𝑠𝑎)(𝜑𝑠𝑎𝑓1 −𝜑𝑠𝑎𝑓2)]+(𝜑𝑠𝑎𝑓1 2_−𝜑 𝑠𝑎𝑓22) [𝑚𝑠𝑓 𝑙𝑛𝜑𝑠𝑎𝑓2_{𝜑𝑠𝑎𝑓1}+(𝑚𝑠𝑎−𝑚𝑠𝑓)(𝜑𝑠𝑓𝑓1−𝜑𝑠𝑓𝑓2)] 2𝑚𝑠𝑓𝑚𝑠𝑎 (𝜑𝑠𝑓𝑓12−𝜑𝑠𝑓𝑓22)(𝜑𝑠𝑎𝑓12−𝜑𝑠𝑎𝑓22) (Equação 8) Onde:

Tg, Tgsf e Tgsa são as temperaturas de transição vítrea da blenda, da fibroína de seda e do

alginato de sódio, respectivamente;

wsf e wsa são as frações mássica de fibroína de seda e alginato de sódio, respectivamente;;

𝑘 = ∆𝐶𝑝𝑠𝑎

∆𝐶𝑝𝑠𝑓 ;

ΔCpsf e ΔCpsa são os calores específicos da fibroína de seda e do alginato de sódio,

respectivamente;

msf e msa são os graus de polimerização da fibroína de seda e do alginato de sódio,

respectivamente;

ϕsff1 e ϕsff2 são as frações volumétricas da fibroína de seda nas fases 1 e 2, respectivamente;

ϕsaf1 e ϕsaf2 são as frações volumétricas do alginato de sódio nas fases 1 e 2, respectivamente.

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3.8 Diagrama de fases

O diagrama de fases é uma representação gráfica da regra das fases de Josiah Willard Gibbs (GONÇALVES, 1994), mostrada na Equação 9. Para um sistema monocomponente com uma fase, o sistema possui dois graus de liberdade, ou seja, dada duas variáveis, temperatura e pressão, por exemplo, todas as outras estão determinadas. Para uma substância com duas fases, o sistema possui, apenas, um grau de liberdade.

F = C - P + 2 (Equação 9)

Onde F é o número de graus de liberdade; C é o número de componentes;

P é o número de fases;

Para sistemas com mais de um componente, os diagramas de fases são importantes, pois quando há separação de fases é necessário conhecer quais as características de cada fase e em quais condições isso ocorre. As principais formas de apresentar essas informações são os diagramas de fases ternários e os diagramas retangulares (ALBERTSSON, 1986).

O diagrama de fases ternário é representado por um triângulo equilátero, Figura 7 (a), onde as composições de cada componente são representadas nas arestas e os vértices representam a substância pura. O diagrama de fases retangular, Figura 7 (b), apresenta as composições de dois componentes, sendo o terceiro obtido através da diferença já que a soma da fração de todos os componentes é igual a 1.

Figura 7 - Representações de diagrama de fases ternário (a) e digrama de fases retangular (b).

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Em ambos os diagramas é possível observar a existência de uma curva que separa as regiões de uma e duas fases, essa curva é denominada de curva binodal. Na região de duas fases, observa-se a presença de uma outra curva (curva vermelha) chamada de curva spinodal. A curva spinodal delimita a região de metaestabilidade da substância e também é importante na determinação do mecanismo de separação de fases. Na região de metaestabilidade, não é possível determinar com certeza qual o estado físico real da substância.

Através das linhas de amarração, ou tie-lines, presentes nos diagramas, é possível determinar as composições dos componentes de cada fase. Todas as misturas representadas dentro da região bifásica situadas em cima da mesma linha de amarração formam fases conjugadas com a mesma composição (DA SILVA, 2014). O ponto Pc representa o ponto crítico, no qual as linhas de amarração se extinguem e são formadas duas fases de composição idêntica.

Alguns fatores como temperatura, pressão e pH, afetam o comportamento das curvas binodal e spinodal bem como das linhas de amarração. A elevação de temperatura, por exemplo, pode aumentar a solubilidade entre os componentes, deixando a região monofásica maior. No caso de polímeros, uma variável importante é a massa molecular, quanto maior ela for, menor é a concentração necessária para formação de fases (KILIKIAN; PESSOA JR., 2001).

A crescente utilização de polímeros naturais trouxe a necessidade de se conhecer mais sobre o comportamento termodinâmico dessas substâncias químicas puras e, também, quando misturadas a outros polímeros. No caso da fibroína de seda e do alginato de sódio, poucos trabalhos esclarecem essa questão, utilizando os polímeros naturais sozinhos ou interagindo com outros polímeros.

3.8.1 Estudos termodinâmicos com fibroína de seda e alginato de sódio

Nas bases de pesquisa Science Direct, Scopus e Periódicos Capes não há nenhum trabalho até o momento que mostre o diagrama de fases de blendas poliméricas formadas por fibroína de seda e alginato de sódio. No entanto, há alguns trabalhos na literatura que estudaram a separação de fases da fibroína de seda ou do alginato de sódio quando misturados a outros polímeros.

O alginato de sódio é um polissacarídeo comumente utilizado na indústria alimentícia e farmacêutica, portanto, é comum que esse polímero seja colocado em contato com

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proteínas. Algumas proteínas foram misturadas a soluções de alginato de sódio a fim de conhecer como esse sistema se comporta. Apesar do grande e diverso potencial de aplicação, o entendimento desses sistemas polissacarídeo-proteína é recente.

Pacek et al. (2000) estudaram a separação de fases e o tamanho das partículas de misturas de alginato de sódio e caseína. O tamanho das partículas foi analisado por duas técnicas: espalhamento de luz e por imagem (Video Technique). Com ambas as técnicas os autores observaram que, ao contrário dos dados da literatura, com concentrações baixas de ambos biopolímeros era possível observar a separação de fases. O tamanho das partículas observado tanto na fase rica em caseína como na fase rica em alginato de sódio foi da ordem de micrometros.

Antonov e Moldenaers (2011) estudaram a separação de fase de emulsões de alginato de sódio e caseína na presença de polieletrólito forte (dextran sulfate sodium salt) e também as estruturas formadas por esses sistemas. Inicialmente, os autores construíram um diagrama de fases utilizando a água como terceira substância, e depois avaliaram como as fases da mistura caseína-alginato de sódio eram afetadas pela presença de um polieletrólito forte. Os autores concluíram que o equilíbrio de fases era afetado, pois a caseína interage com o sal formando um complexo poli-eletrolítico. Esse fenômeno, diminui a compatibilidade do alginato de sódio devido ao efeito das interações entre a proteína e o polieletrólito.

Mession et al. (2012) estudaram a agregação de proteínas induzidas pela separação de fases em sistemas ternários de água, alginato de sódio e proteína da ervilha à 20ºC. O estudo mostrou que ocorria separação de fases macro e microscopicamente, principalmente, devido à incompatibilidade termodinâmica. Os autores observaram a morfologia e notaram que em baixas concentrações dos biopolímeros, ocorria a agregação da proteína da ervilha. Ao aumentar as concentrações iniciais dos biopolímeros, o agregado proteico era incorporado a micro domínios densos e largos constituindo a fase rica em proteína. As blendas da proteína da ervilha e alginato de sódio tiveram uma morfologia parecida com as blendas de fibroína de seda e alginato de sódio obtidas por De Moraes (2010), uma fase contínua rica em alginato de sódio e glóbulos ricos em proteína.

A fibroína de seda é um polímero natural de estudo recente, a maioria das referências bibliográficas referentes à fibroína de seda são voltadas para suas aplicações, principalmente na área de biomateriais. Pouco foi estudado até o momento a respeito do comportamento

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termodinâmico dessa proteína. Sabe-se que a conformação seda I (α-hélice e helicoidal aleatória) da fibroína de seda é a sua forma metaestável e a forma como sua estrutura se modifica para seda II (folha β), que representa sua forma estável, foi estudadapor Sohn, Strey e Gido (2004). Nesse estudo, os autores construíram um diagrama ternário água, fibroína de seda e brometo de lítio e investigaram o efeito da pressão osmótica na conformação da fibroína de seda. A pressão osmótica foi variada utilizando o método de estresse osmótico, as substâncias utilizadas foram o brometo de lítio e o polietilenoglicol em diversas concentrações.

Ao final de uma semana, os componentes foram quantificados em cada fase. A estrutura da fibroína de seda foi analisada por difração de raio X. Os autores concluíram que, à medida que a pressão osmóstica aumenta, as moléculas de fibroína de seda se agrupam na forma de seda I e em pressões osmóticas elevadas a sua estrutura se converte para seda II (Figura 8). Isso ocorre, segundo os autores, porque em pressões osmóticas elevadas, a fibroína de seda perde água de hidratação, característica da estrutura seda I, convertendo sua estrutura para seda II. O estudo mostrou que não é possível a estrutura da fibroína de seda se modificar de conformação aleatória para seda II sem antes adquirir a conformação seda I, sua forma metaestável.

Figura 8 – Diagrama ternário do sistema água, fibroína de seda e brometo de lítio.

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A estrutura da fibroína de seda também pode ser modificada para seda II através de interações moleculares com outras substâncias. As transições estruturais causadas pelas interações entre os polímeros são geralmente acompanhadas de mudanças nas propriedades da matriz do polímero (SHANG; ZHU; FAN, 2013). Tais alterações se refletem na mudança do comportamento mecânico, das propriedades térmicas, e da estabilidade em água.

3.9 Mecanismos de separação de fases

O fenômeno de separação de fase pode ocorrer de duas formas: nucleação e crescimento e decomposição spinodal. Na separação por nucleação e crescimento o sistema passa da região de uma fase para duas fases de forma gradual, atravessando a região de metaestabilidade. Aos poucos, a solução unifásica forma pequenos núcleos, os quais crescem ao longo do tempo e se separam formando duas fases. A nucleação pode ser homogênea ou heterogênea. A nucleação homogênea ocorre quando o núcleo se forma sem auxílio de interfaces pré-existentes e a heterogênea ocorre quando o núcleo se forma sobre uma superfície já existente como paredes, moldes e partículas (SERANTONI, 2009).

Já a decomposição spinodal ocorre quando o composto passa da região miscível para a imiscível sem atravessar a região de metaestabilidade, ocorrendo a separação imediata de fases. Nesse caso, o composto atravessa a linha binodal e spinodal ao mesmo tempo.

Os dois mecanismos de separação geram estruturas morfológicas diferentes (Figura 9). Quando ocorre nucleação e crescimento, a morfologia observada é do tipo matriz-domínios, enquanto na decomposição spinodal a morfologia observada no início é de duas fases entrelaçadas, podendo evoluir (dependência cinética) por coalescência para a morfologia do tipo matriz-domínio com alta conectividade (MAGGIONI, 1999).

Além da análise da morfologia, o mecanismo de separação de fases pode ser determinado pela técnica de espalhamento de luz. Quando a luz incide em uma solução com duas fases, dois comportamentos podem ser observados, como mostra a Figura 10. O halo de difração de luz é característica de uma separação spinodal, no entanto, se a intensidade de luz decai monotonicamente com o ângulo de espalhamento, então pode-se dizer que ocorreu separação por nucleação e crescimento (MAGGIONI, 1999).

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Figura 9 – Simulação numérica da evolução através do tempo, em segundos, das morfologias de separação de fases: (a) decomposição spinodal, (b) nucleação e crescimento.

Fonte: ARAKI; TANAKA (2000)

Figura 10 - Evolução do padrão de espalhamento de luz com o tempo para (a) decomposição spinodal e (b) nucleação e crescimento.

Fonte: Adaptado de INOUE (1995).

Na decomposição spinodal, geralmente, é utilizada a teoria de Cahn para tratar os dados obtidos das medidas de difração de luz com variação angular. A teoria de Cahn diz que

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quando um laser incide no sistema durante a decomposição spinodal, cada flutuação de concentração com número de onda q contribui para a difração em um ângulo θ (INOUE; NUNES, 1996). O valor de q pode ser dado pela Equação 10 e também depende do comprimento de onda da luz incidente λ.

𝑞 = 4𝜋

𝜆 𝑠𝑖𝑛 𝜃

2 (Equação 10)

Nos comprimentos de onda máximos, qm, observa-se um máximo na intensidade de

luz espalhada a um ângulo θm, o que resulta em um halo de espalhamento (INOUE; NUNES,

1996), como mostrado na Figura 10(a). É possível obter informações a respeito da distância entre os domínios de cada fase utilizando o ângulo de maior intensidade de luz.

No entanto, a teoria de Cahn não prevê evidências experimentais para decréscimo de qm com o tempo e nem desvios das flutuações com o comportamento exponencial, que é

notado no estágio final da decomposição spinodal (MAGGIONI, 1999).

No mecanismo de separação por nucleação e crescimento, a intensidade da luz espalhada diminui com o aumento do ângulo como é observado na Figura 10(b). Para um ângulo fixo, a intensidade de luz (I) é função da taxa de crescimento do núcleo (κ) e da diferença entre o tempo de início da nucleação (τ) e do tempo final de nucleação (t) como mostra a Equação 11 (INOUE; NUNES, 1996).

I = κ (t-τ)n _{(Equação 11)}

Se o valor de n for próximo a 3, tem-se nucleação heterogênea, se for igual a 4, tem-se nucleação homogênea (INOUE; NUNES, 1996).

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4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Preparo das soluções de fibroína de seda e alginato de sódio

Foram utilizados casulos do bicho-da-seda da espécie Bombyx mori cedidos pela empresa Bratac S.A, localizada em Bastos, São Paulo. Inicialmente os casulos foram lavados e foi feito o processo de degomagem, que consiste na remoção da sericina.

Para isso, cada 50 g de casulos foram lavados com 600 mL de solução aquosa de NaCO3 de concentração 1g/L durante 30 minutos à 85ºC. O procedimento foi repetido três

vezes e ao final os casulos foram lavados abundantemente com água destilada. Os fios foram secos à temperatura ambiente. O período de secagem pode variar de 24 a 48 horas, dependendo da temperatura e umidade do laboratório.

Após secos, os fios sem sericina foram moídos em moinho de rotor tipo ciclone (TE-651/2 Tecnal) utilizando peneira mesh nº 10 (diâmetro de partícula igual a 2 mm). Para dissolver os fios foi utilizada solução ternária de cloreto de cálcio, etanol e água na proporção 1:2:8 molar. A suspensão foi mantida em banho termostático a 85ºC até completa dissolução dos fios.

A solução de fibroína foi dialisada utilizando água deionizada na proporção fibroína:água de 1:15 a 10ºC durante 3 dias. Foram utilizadas membranas de diálise com corte de peso molar de 3,5 kDa da marca ThermoScientific. A água de diálise foi trocada a cada 24 horas. Ao final da diálise, a solução foi centrifugada por 30 minutos a uma velocidade de 4000 RPM utilizando centrífuga da marca Centribio. A concentração da solução foi determinada por análise gravimétrica através de evaporação de solvente.

O alginato de sódio de viscosidade média obtido da alga Macrocystis pyrifera da marca Sigma-Aldrich foi dissolvido em água destilada. Para completa dissolução, a solução foi deixada em repouso por 4 dias e agitada no último dia.

4.2 Espalhamento de luz dinâmico

Ambas soluções, fibroína de seda e alginato de sódio, foram analisadas quanto ao tamanho de partícula e potencial zeta utilizando a técnica de espalhamento de luz dinâmico. O equipamento utilizado foi o ZetaSizer Nanoseries marca Malvern (Worcestershire, Inglaterra). Para analisar o tamanho de partícula, foi utilizada cubeta de poliestireno e para medição do potencial zeta, foi utilizada célula capilar de policarbonato com eletrodos de berílio/cobre folheados a ouro e também célula de imersão acoplada às cubetas de poliestireno.