UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DIRETORIA DE PESQUISA
PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA – PIBIC : CNPq, CNPq/AF, UFPA, UFPA/AF, PIBIC/INTERIOR, PARD, PIAD, PIBIT, PADRC E FAPESPA
RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO Período : Março/2015 a Agosto/2015
( ) PARCIAL (X) FINAL
IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO
Título do Projeto de Pesquisa: Aspectos epidemiológicos da infecção por Leishmania infantum chagasi em cães e gatos oriundos de município de transmissão intensa para leishmaniose visceral no estado do Pará
Nome do Orientador: Gustavo Góes Cavalcante Titulação do Orientador: Doutor
Faculdade: Medicina veterinária
Instituto/Núcleo: Universidade Federal do Pará Laboratório: Parasitologia animal
Título do Plano de Trabalho: Aspectos epidemiológicos da infecção por Leishmania infantum chagasi em cães e gatos oriundos de município de transmissão intensa para leishmaniose visceral no estado do Pará
Nome do Bolsista: Pedro Henrique Marques Barrozo Tipo de Bolsa : ( ) PIBIC/ CNPq ( ) PIBIC/CNPq – AF
( ) PIBIC /CNPq- Cota do pesquisador ( ) PIBIC/UFPA ( ) PIBIC/UFPA – AF (x) PIBIC/ INTERIOR ( ) PIBIC/PARD ( ) PIBIC/PADRC ( ) PIBIC/FAPESPA ( ) PIBIC/ PIAD ( ) PIBIC/PIBIT
INTRODUÇÃO
As leishmanioses são parasitoses causadas por protozoários do gênero Leishmania (Kinetoplastida: Trypanosomatidae) e que acometem tanto o homem quanto outros animais. O agente etiológico da LV no Brasil é o protozoário Leishmania chagasi (sin. Leishmania infantum chagasi), que apresenta caráter zoonótico, tendo como principal vetor biológico o flebotomíneo Lutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidae). Atualmente, os cães são considerados os principais reservatórios domésticos de L. infantum chagasi; contudo, em função dos hábitos alimentares dos flebotomíneos vetores, outros animais domésticos também podem exercer um papel no ciclo biológico do agente da LV. O crescente número de relatos de casos de leishmaniose visceral felina indicam que os gatos domésticos podem ter grande importância no ciclo urbano e peri-urbano de L. infantum chagasi.
Diferentes estudos realizados na Europa demonstraram uma taxa de 1,9% a 68% de gatos soropositivos, e a infecção de L. longipalpis a partir da alimentação em gatos infectados também já foi comprovada. Estas enfermidades podem apresentar diferentes formas clínicas que variam de acordo com a espécie do parasito envolvido e da relação parasito-hospedeiro. Diversos trabalhos apontam a reação em cadeia da polimerase (PCR) e a reação em cadeia da polimerase em tempo real como sendo ferramentas de grande valia para o diagnóstico da infecção em diferentes tecidos animais. O presente projeto tem por objetivo diagnosticar e comparar as taxas da infecção natural por Leishmania infantum chagasi em cães e gatos residentes em comunidades rurais do município de São Domingos do Capim, estado do Pará. O projeto será desenvolvido em São Domingos do Capim (S01º40’27’’ e W47º46’16’’), que fica localizado na mesorregião nordeste do estado do Pará. São Domingos do Capim é classificado como área de transmissão intensa dos agentes da LV em humanos.
JUSTIFICATIVA
No período de 1990 a 2007 foram confirmados 561.673 casos humanos de leishmanioses no Brasil, sendo 508.193 (90,5%) provocados pelas espécies L. (V.) braziliensis, L. (V.) guyanensis, L. (V.) lainsoni, L. (V.) naiffi, L. (V.) shawi e L. (L.) amazonensis e 53.480 (9,5%) por L. (L.) infantum chagasi (ALVES et al., 2009).
Segundo o Ministério da Saúde (2012), a LV está presente em 21 estados brasileiros, atingindo as cinco regiões brasileiras. Entre os anos de 2006 e 2010 foram registrados 18.168 casos de LV humana no país Em 2010, a região Nordeste representou cerca de 47% dos
casos, seguida pelas regiões Norte com 18,0%, Sudeste com 17,8% e o restante dos casos nas regiões Centro-Oeste e Sul do Brasil. Entre os anos de 1990 e 2010, o estado do Pará foi o recordista de registros de casos de LV em humanos na região norte, com 3.770 notificações e taxa de letalidade de 2,9%.
Desde o ano de 2003, os municípios brasileiros com transmissão de LV foram estratificados segundo a intensidade da transmissão em esporádica, moderada e intensa. As estratégias de vigilância e controle também passaram a ser diferenciadas conforme o risco epidemiológico (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2005).
O estado do Pará tem 25 cidades agrupadas na lista dos municípios prioritários para ações de vigilância e controle da LV, dentre os quais está o de São Domingos do Capim, considerado município de transmissão intensa da doença (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2012).
O Município de São Domingos do Capim (S01º40’27’’ e W47º46’16’’) fica situado a cerca de 130 km de Belém e 60 km de Castanhal. Desde o ano de 2009, o grupo de estudo em parasitologia animal da Universidade Federal do Pará montou uma força-tarefa com a Secretaria Municipal de Saúde da Prefeitura de São Domingos do Capim e a Secretaria de Saúde Pública do Estado do Pará (SESPA) para entender melhor a epidemiologia da LT e LV nas comunidades mais afetadas do município. De acordo com os dados do Terceiro Centro de Saúde da SESPA, desde 2009 até o mês de maio de 2011 foram confirmados nesse município 15 casos autóctones de LT e oito casos autóctones de LV em seres humanos, inclusive casos de óbito em decorrência dessa enfermidade.
Observações preliminares indicam que em São Domingos do Capim ocorre uma grande variedade e abundância de flebotomíneos, tendo-se capturado 14 espécies do gênero Lutzomyia, entre elas L. flaviscutelatta e L. antunesi, vetores de L. amazonensis e L. lindenbergi, respectivamente. A espécie mais abundante foi, no entanto, Lutzomyia longipalpis, que é o principal vetor de L. infantum chagasi e que foi capturado durante o ano todo na área de realização do presente estudo, sendo a espécie predominante no ambiente intradomicílio e peridomicílio (AYRES et al., 2011).
A diversidade de flebotomíneos, sobretudo no ambiente intra e peridomicílio, pode estar relacionada com a questão da grande proximidade entre as residências e as áreas de mata. Outro fator importante pode ser a presença abundante e diversificada de criações de animais como cães (GOMES et al., 2007a), gatos (MAROLI et al., 2007) e galinhas (SANT’ANA et al., 2008). Há ainda roedores (SHAW & LAINSON, 1968), marsupiais, xenarthros e canídeos silvestres (GOMES et al., 2007b), que são fonte alimentar para diferentes espécies de
flebotomíneos e que circulam com frequência próximo às casas e na mata adjacente da região estudada.
O índice médio de cães domiciliados sororreagentes para L. infantum chagasi foi de 44,57% (119/267), variando de 3,3% até 75,8% em diferentes comunidades do município, demonstrando a elevada taxa de circulação do parasito entre os animais nessa região (DAMASCENO et al., 2012).
Embora os cães sejam considerados os principais reservatórios no ciclo urbano da LV, a infecção felina tem sido relatada em áreas endêmicas de diferentes países e alguns autores já tratam a infecção felina como uma questão de saúde pública (VIDES et al., 2011) em virtude das evidências indicarem que o gato não seria apenas um hospedeiro acidental (MARTÍN-SANCHES et al., 2007, MAIA et al., 2010).
O primeiro relato de um caso autóctone de leishmaniose visceral felina (LVF) nas Américas se deu por Savani et al. (2004) no estado de São Paulo. Além deste diagnóstico da infecção felina por L. infantum chagasi, também já foi diagnosticada no Brasil a infecção felina por L. brasiliensis (SCHUBACH et al., 2004) e L. amazonensis (SOUZA et al., 2005). Também já foram detectadas outras espécies de leishmânias infectando felídeos domésticos (GRAMICCIA & GRANDONI, 2005; MANCIANTI, 2004).
Informações relativas à prevalência da infecção por L. infantum chagasi em gatos no Brasil ainda são escassas, principalmente empregando-se ferramentas moleculares. Rossi et al. (2007) relataram uma taxa de 6,5% de gatos infectados por L. infantum chagasi, Coelho et al. (2011) encontraram uma taxa de infecção felina de 5,7%, e Sobrinho et al. (2012) relataram uma taxa de infecção em gatos de cerca de 21% em áreas endêmicas no Brasil.
Na LVF não se observa nenhum sinal clínico patognomônico, o que pode levar a uma sub-notificação da enfermidade. Assim como na LVC, pode-se observar fraqueza, anorexia e linfadenopatias (MAROLI et al., 2007; SILVA et al., 2010). Existem ainda diversos relatos sobre a presença de alterações cutâneas nos animais doentes, entre as quais as principais descritas são alopecia, nódulos, eritema e úlceras, principalmente na região da cabeça e dos membros (POLI et al., 2002; SAVANI, et al., 2004; VIDES et al., 2011).
Também se discute a relação de enfermidades imunossupressoras como a imunodeficiência (FIV) e leucemia (FeLV) virais felinas com a infecção por Leishmania spp. Essas doenças virais poderiam, teoricamente, ter implicações na infectividade do gato para o vetor, bem como, no caso da FeLV, interferir no diagnóstico realizado por meio da sorologia conforme observado por Martín-Sánchez et al. (2007).
Silva et al. (2010) fizeram o primeiro relato da infecção de Lutzmoyia longipalpis por L. infantum chagasi a partir de um gato naturalmente infectado. Os autores relataram uma taxa de infecção de 13% dos insetos que se alimentaram em um gato no qual foi detectado o DNA do protozoário em diferentes órgãos. Esse gato apresentava títulos de anticorpos de 1:160 na reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e sinais clínicos compatíveis com LVF. Os autores destacaram ainda que esse animal não foi reagente para FIV e nem para FeLV. Na Itália, Maroli et al. (2007) observaram uma taxa de infecção de 21% de Phlebotomus perniciosos, que é um importante vetor de Leishmania infantum na Europa, a partir de um gato naturalmente infectado. Esses trabalhos demonstram que, além de serem suscetíveis à infecção por L.
infantum chagasi, os gatos podem ser infectantes para os flebotomíneos vetores.
Em virtude da importância dos cães e das dúvidas sobre o papel dos gatos no ciclo epidemiológico urbano da LV, o diagnóstico da infecção por L. infantum chagasi nesses animais é de grande valor no monitoramento dessa enfermidade em regiões endêmicas e arredores. A prevalência e incidência dessas infecções nesses animais são, portanto, importantes parâmetros epidemiológicos (MORENO & ALVAR, 2002).
O sucesso do programa de controle das leishmanioses depende do entendimento da dinâmica da circulação dos parasitos nos diferentes ciclos, da evolução da doença com o passar do tempo, bem como da compreensão das características socioeconômicas da população. Isto facilitará a escolha dos métodos profiláticos a serem empregados de modo contínuo, integrado e duradouro, com o objetivo de se prevenir a dispersão do agente etiológico e de se diminuir o número de pessoas acometidas.
OBJETIVOS
Diagnosticar e comparar as taxas da infecção natural por Leishmania infantum chagasi em cães e gatos residentes em comunidades rurais do município de São Domingos do Capim, estado do Pará.
MATERIAIS E MÉTODOS
LOCAL DE ESTUDO
O projeto foi desenvolvido em São Domingos do Capim (S01º40’27’’ e W47º46’16’’), compreendendo as comunidades rurais de Boa Viagem, Cesaréia, Deus é por nós, São Benedito do Jurujaia, São Benedito, Aliança, Baixo Palheta, Catita, Monte D’Ouro e Patrimônio que estão ilustradas na Figura 1. O município fica localizado na mesorregião nordeste do
estado do Pará, às margens da bacia do rio Guamá, distante cerca de 130 km de Belém, capital do estado, e a cerca de 60 km de Castanhal, onde fica situado o Instituto de Medicina Veterinária da Universidade Federal do Pará.
De acordo com a classificação de Koppen, o clima do município é do tipo tropical úmido, subtipo Af3, com precipitação média acima de 2.000 mm³ anuais e temperatura média de 26ºC. A população é estimada em 29.846 habitantes distribuídos em uma área de 1.677 km², e a economia é baseada no extrativismo vegetal e agropecuária (IBGE, 2007).
São Domingos do Capim é classificado como área de transmissão intensa dos agentes da LV e LT em humanos. O município foi selecionado para este estudo segundo as orientações da SESPA devido ao grande número de casos humanos notificados destas enfermidades, inclusive com registros de óbitos.
Antes das coletas, foram ministradas palestras para os moradores e para os agentes comunitários de saúde da região com o objetivo de informar e sensibilizar a população sobre a importância das leishmanioses nas comunidades e da realização do presente estudo. Na ocasião também foram distribuído material informativo no formato de folder aos moradores locais.
Figura 1: Localização geográfica das comunidades rurais visitadas do município de São
ESTUDOS COM OS RESERVATÓRIOS DOMÉSTICOS
Cães e gatos domiciliados em áreas rurais do município de estudo foram examinados quanto ao estado geral de saúde e a presença de lesões e sinais clínicos sugestivos de leishmanioses.
Em cada visita domiciliar era preenchido um questionário epidemiológico com informações que ajudem a compreender melhor as características sócio-econômicas e hábitos comportamentais dos moradores. Também foram coletados dados sobre os cães e gatos como origem, tempo de residência, característica de comportamento (domiciliado ou semidomiciliado), sexo, raça, idade aproximada e registro prévio ou não da doença em outros animais.
Amostras de sangue total foram coletadas de todos os animais examinados através da punção da veia cefálica com auxílio de seringas de cinco mililitros, escalpe 23G e tubos estéreis contendo EDTA.
Também foram coletadas amostras de pele da região da orelha dos animais, após tranquilização do animal utilizando-se a associação de xilazina a 2% na dose de 1 mg/kg e ketamina a 10% na dose de 15 mg/kg por via intramuscular nos gatos e acepromazina 0,2mg/kg via Intramuscular, além da realização do botão anestésico com cloridrato de lidocaína sem vasoconstritor nos cães. Os animais foram monitorados durante todo o período em que estiverem tranquilizados até a plena recuperação da coordenação motora.
As amostras de sangue total foram estocadas a -20ºC para pesquisa de DNA de L. infantum chagasi através da reação da polimerase em cadeia (PCR).
As amostras de pele foram estocadas a -20ºC para pesquisa de DNA de L. infantum chagasi através da PCR. Algumas das atividades realizadas durante as visitas às comunidades rurais estão ilustradas na Figura 2.
Figura 2. Atividades realizadas durante as coletas: A) Palestra sobre leishmaniose para moradores das áreas estudadas; B) Entrega de folder informativo sobre a doença à população; C) Coleta de sangue total de um cão; D) Coleta de amostra de pele na região da orelha de um gato.
GRUPO AMOSTRAL
Foram coletadas amostras de pele e sangue total de cães e gatos de 10 comunidades do município de São Domingos do Capim (Tabela 1).
Tabela 1. Número de cães e gatos amostrados em função do sexo e das Comunidades rurais
de origem.
LOCAL CÃES (n=115) GATOS (n=28)
Machos Fêmeas Machos Fêmeas
Patrimônio 17 8 1 3 Baixo Palheta 2 6 1 1 Catita 3 3 1 3 Aliança 2 2 0 0 Boa Viagem 12 11 1 1 São Benedito 9 7 0 2 São Benedito Jurujaia 2 2 0 0 Deus É Por Nós 5 7 3 2 Cesaréia 3 2 1 2 Monte D'ouro 10 2 4 2
TOTAL 65 50 12 16
EXTRAÇÃO DE DNA
SANGUE
As amostras de sangue contendo EDTA foram conservadas sob refrigeração por no máximo oito horas. Após esse período, o sangue foi centrifugado e a camada leucocitária foi retirada para a extração de DNA empregando-se o kit comercial IllustraTM Blood Genomic Prep Mini Spin Kit (GE Healthcare), seguindo as recomendações do fabricante. As amostras de DNA foram armazenadas em mini tubos estéreis e livres de DNase’s, identificadas e mantidas estocadas em freezer a -20ºC para posterior análise molecular.
PELE
A extração de DNA das amostras de pele foi realizada utilizando-se o kit comercial IllustraTM Tissue & Cells Genomic Prep Mini Spin Kit (GE Healthcare), seguindo as recomendações do fabricante. As amostras de DNA foram armazenadas em mini tubos estéreis e livres de DNase’s, identificadas e mantidas estocadas em freezer a -20ºC para posterior análise molecular.
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE
As amostras de DNA de sangue e de pele de cães e gatos foram submetidas a uma Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) utilizando-se os iniciadores RV1 e RV2, específicos para L. infantum chagasi, que amplificam um produto de 145 pares de base (pb), segundo protocolo de Gomes et al. (2007a) modificado.
A solução para essas reações continha 2,5 unidades de Taq DNA polimerase (Ludwig Biotec); 100 mM Tris–HCl; pH 8,5; 500 mM KCl; 50 mM MgCl2; 0,2 mM de cada dNTP; 50 pmoles de cada iniciador; e 5 μL de DNA para um volume final de reação de 25 μL.
As reações ocorreram em um termociclador (Veriti – Life Biotechnology®) com uma etapa de desnaturação inicial de 5 minutos a 95ºC, seguida por 40 ciclos de 30 segundos a 95ºC, 30 segundos a 61ºC e 1 minuto a 72ºC, finalizando a reação com uma extensão de 10 minutos a 72ºC. O controle positivo de L. infantum chagasi foi o DNA extraído de um cão
sintomático e positivo nos exames parasitológicos. Já o DNA extraído de amostras de sangue colhidas de filhotes de cães e gatos comprovadamente negativos e oriundos de área não endêmica foi utilizado como controle negativo. Para o controle de contaminação, em cada bateria de reações foi utilizada uma amostra (branco) contendo “master mix” e água bi-destilada em vez de DNA teste.
Os produtos amplificados foram analisados por eletroforese horizontal em gel de agarose a 2% contendo brometo de etídio (0,5 μg/mL). O comprimento dos produtos amplificados foi sendo estimado utilizando-se um padrão de pares de base (50 ou 100 Base-Pair-Ladder - GE Healthcare) em cada gel de corrida. A visualização dos produtos amplificados foi realizada em sistema de fotodocumentação Quantum-ST4 1000/26M.
Georreferenciamento
Os locais de coleta foram georreferenciados com auxílio do equipamento GPS 60CSX (Garmin) e foram confeccionados mapas epidemiológicos através do programa computacional TerraView 4.2.0.
RESULTADOS
Através da PCR, detectou-se o DNA de L. infantum chagasi em 11,3% (13/115) das amostras de pele e em 2,6% (3/115) das amostras de sangue dos cães, não sendo detectado nos gatos, os animais positivos em cada tecido foram divididos por localidade (Tabela 2).
Tabela 2. Distribuição em função da comunidade rural de origem dos animais positivos para
pesquisa de DNA de L. infantum chagasi.
LOCAL CÃO GATO TOTAL DE
ANIMAIS
Pele Sangue Pele Sangue
Patrimônio 4 3 0 0 4 Baixo Palheta 1 0 0 0 1 Catita 0 0 0 0 0 Aliança 0 0 0 0 0 Boa Viagem 5 0 0 0 5 São Benedito 1 0 0 0 1 São Benedito Jurujaia 0 0 0 0 0
Deus É Por Nós 1 0 0 0 1
Cesareia 0 0 0 0 0
Monte D'ouro 1 0 0 0 1
TOTAL 13 3 0 0 13
Na figura 3 pode-se observar alguns produtos da PCR utilizando os iniciadores RV1 e RV2 das amostras de DNA extraídas da pele e sangue dos cães após eletroforese em gel de agarose.
Figura 3. Eletroforese em gel de agarose a 2% dos produtos da PCR utilizando os iniciadores
RV1 e RV2: marcador de peso molecular de 50pb (PM); controle negativo (C-); controle positivo (C+); Amostra de pele positiva (1) e amostra de sangue positiva (2); Amostra de pele positiva (3) e amostra de sangue negativa (4); controle branco da reação (NO).
Foram identificados cães positivos em 60% (6/10) das comunidades visitadas. Na figura 4 pode-se observar o mapa com o georreferenciamento do local de residência dos animais positivos e negativos nas diferentes comunidades do município de São Domingos do Capim.
PM C- C+ 1 2 3 4 NO
Figura 4: Distribuição espacial das residências dos animais nos quais detectou-se o DNA de
Leishmania infantum chagasi.
CONCLUSÃO
A partir dos resultados obtidos no presente estudo pode-se concluir que Leishmania infantum chagasi é um parasito comum em cães de diferentes comunidades rurais de São Domingos do Capim. Já os gatos parecem não ter importância relevante na cadeia epidemiológica de Leishmania infantum chagasi.
ATIVIDADES A SEREM DESENVOLVIDAS NOS PRÓXIMOS MESES
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DIFICULDADES
A maior dificuldade enfrentada para a execução do presente estudo foram os acessos à algumas comunidades rurais, bem como a negação de alguns moradores, mesmo após a palestra, em permitir a realização dos exames em seus animais.
PARECER DO ORIENTADOR: DATA : ______/_________/________ _________________________________________ ASSINATURA DO ORIENTADOR ____________________________________________ ASSINATURA DO ALUNO
INFORMAÇÕES ADICIONAIS: Esse trabalho foi financiado com recursos da FAPESPA/CNPq através do edital PPSUS.
