1- Fazer o Gráfico de [Produto] x Tempo para a Reação A B. Definir velocidade da reação v = -DA/ Dt v = DB/ Dt

(1)

1- Fazer o Gráfico de [Produto] x Tempo para a Reação

A B. Definir velocidade da reação

v = -DA/ Dt

v = DB/ Dt

(2)

2-Escrever a equação de velocidade da reação A B em função da

concentração de A. Como proceder para medir esta velocidade? Que

tempos (iniciais ou finais) devem ser escolhidos para que as medidas de

velocidade sejam de fato relacionadas à concentração inicial de A?

3- Definir velocidade inicial de reação

k

(3)

• 3- Definir velocidade inicial de reação

4- Estudar o software Cinética Enzimática e responder as

questões 5, 6 e 7.

(4)

• 5. Classificar as afirmações abaixo como verdadeiras ou falsas.

• 5a. Sempre que o número de moléculas de substrato é maior que o número de moléculas de enzimas, todas as moléculas de enzimas estão ligadas a moléculas de substrato.

• 5b. A velocidade da reação é proporcional ao tempo da reação.

• 5c. A velocidade da reação é proporcional à concentração de substrato. • 5d. A velocidade da reação é proporcional concentração de enzima,

desde que a concentração de substrato não seja limitante.

• 5e. A velocidade da reação é proporcional à concentração do complexo enzima-substrato.

• 5f. A quantidade de produto formado depende do tempo da reação.

• 5g. Ao final de cada experimento (do software) todo substrato foi convertido em produto.

(5)

• 6. Em um experimento com concentração constante de enzima e substrato obteve-se 0,001 mmols de produto em 20 minutos de reação. A massa de produto formada em 10 minutos de incubação será

(6)

• 7. Em um experimento com concentração constante de enzima e substrato obteve-se 0,001 mmols de produto, formados a cada minuto durante 20 minutos de reação. Se o tempo de incubação fosse 10 minutos, a velocidade da reação seria

•7a. 0,0005 mmols/minuto 7b. 0,0010 mmols/minuto 7c. 0,0020 mmols/minuto

(7)

8. Definir sítio ativo. Podem pertencer ao sítio ativo de uma enzima cadeias laterais de aminoácidos distantes uns dos outros na estrutura primária?

9. A ligação de uma enzima ao seu substrato é uma reação irreversível?

(8)

10. Escrever a equação de velocidade da formação do complexo ES.

Escrever a equação da velocidade da formação de P a partir de ES. k₄ é desprezada porque

Em v₀ a [P] é muito baixa V₀= k₁[E][S]

V_Max= k₃ [E_t] k₃ = k_cat

Et= Enzima total

(9)

11. Verificar as concentrações relativas de enzima e substrato em uma reação enzimática e estabelecer a relação entre as ordens de grandeza das constantes de velocidade k₁, k₂ e k₃.

Qual é a etapa limitante da velocidade de transformação de S em P?

V

_o

= k

₃

[ES]

k₁> k₂ k₃ << k₁, k₂ Michaelis Menten: [S] >>>[E] [P] <<< [S] k₄é desprezado

(10)

(11)

Substrato [S] V eloc idad e 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

12. Fazer o gráfico da velocidade da reação S → P, catalisada enzimaticamente, em função da concentração de S. Descrever os procedimentos experimentais que

levariam à obtenção dos dados para a construção do gráfico.

✓ Concentração variada de substrato ✓ Concentração fixa de enzima

✓ Experimento realizado num tempo determinado

(12)

Substrato [S] V eloc idad e 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

13. Analisando o gráfico do item 12, verificar, em cada trecho da curva, as concentrações de enzima livre, substrato e complexo ES.

E livre

100% Complexo ES: E_livre = 0, substrato livre 100%

25% Complexo ES: enzima livre 75%, substrato livre 100%

50% Complexo ES: enzima livre 50%, substrato livre 100%

(13)

14. A constante de Michaelis-Menten (KM) deve ser expressa em unidades de

tempo, de velocidade ou de concentração? Como é feita sua determinação experimental? Substrato [S] V eloc idad e 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 K_M

K_M – Indica a afinidade entre o substrato e a enzima.

K_m= concentração do substrato quando a reação atinge a metade da velocidade máxima. Expressa em concentração.

V₀ = Vmax [S] K_M + [S]

K

_m

= k

₂

k

₁

K

_m

= (k

₂

+ k

₃

)

k

₁

k

₃

<< k

₂

e k

₃

(14)

15. Pode-se afirmar que, se o valor de KM para o substrato A é maior do que para o

substrato B, a enzima tem maior afinidade por A?

Substrato [S] V eloc idad e 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 K_M Substrato [S] V eloc idad e 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 K_M Substrato A Substrato B

(15)

(16)

16. Fazer o gráfico da velocidade de uma reação enzimática em função: a) da concentração de enzima;

b) da temperatura; c) do pH.

Descrever os procedimentos experimentais que levariam à obtenção dos dados para a construção destes gráficos. Justificar a forma dos gráficos.

Substrato [S] V eloc idad e 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 E 2E

(17)

16. Fazer o gráfico da velocidade de uma reação enzimática em função: a) da concentração de enzima;

b) da temperatura;

c) do pH. Descrever os procedimentos experimentais que levariam à obtenção dos dados para a construção destes gráficos. Justificar a forma dos gráficos.

Temperatura o_C V elo ci dade 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

(18)

17. Fazer o gráfico vo x [S] para concentrações E e 2E de enzima. Substrato [S] V eloc idad e 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 E 2E

(19)

18. Fazer o gráfico vo x [S] na ausência de inibidor, na presença de duas concentrações

de inibidor competitivo e na presença de duas concentrações de inibidor não competitivo. 1/Substrato [S] 1/ V elo ci dade (V 0 ) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2x inibidor 1 x [inibidor] Sem[inibidor]

Vmax = sem mudanças Km = aumenta Substrato [S] V eloc idad e 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2x inibidor 1 x [inibidor] Sem[inibidor]

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Inibidor Competitivo

Substrato [S] V eloc idad e 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2x inibidor 1 x [inibidor] Sem[inibidor]

(21)

1/Substrato [S] 1/ V eloc idad e (V 0 ) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2x inibidor 1 x [inibidor] Sem[inibidor] Vmax = muda Km = sem mudanças

de inibidor competitivo e na presença de duas concentrações de inibidor não

competitivo. Substrato [S] V eloc idad e 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2x inibidor 1 x [inibidor] Sem[inibidor]

(22)

Substrato [S] V eloc idad e 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2x inibidor 1 x [inibidor] Sem[inibidor]

de inibidor competitivo e na presença de duas concentrações de inibidor não

(23)

Uma vez que inibidores não-competitivos tenham sido identificados, o valor de Ki é melhor determinado através de um segundo gráfico obtido plotando-se os diferentes valores de inclinação ou de 1/Vmax aparente (intercepto no eixo 1/Vo) versus concentração de inibidor ([I]). Em ambos os gráficos o

intercepto no eixo de [I] dá o valor de –Ki .

Para calcular Ki de um inibidor não competitivo fazer o gráfico de Km aparente vs [Inibidor] No caso de Inibidor competitivo fazer o gráfico de 1/Vmax aparente vs [Inibidor]

(24)

19. Definir constante de inibição (Ki). O que esta constante mede?

K_I – É a constante de afinidade da Enzima e o Inibidor

[I] K M ap p -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 1x [Substrate] 2x [Substrate] 4x [Substrate] 1/ V eloc idad e -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 [I] 1x [Substrate] 2x [Substrate] 4x [Substrate] -K_i -K_i

(25)

[pNPP] (µM) 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 R ate µ M /s 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 No vanadate Vanadate 180 µM Vanadate 300 µM 1/[pNPP] (µM) 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 1/ V 0 ( µ M /sec) 0 100 200 300 400 500 Control (no vanadate) Vanadate 180 µM Vanadate 300 µM

Inibição competitiva

(26)

20. Quais seriam os valores de K e V se fosse adicionado inibidor competitivo na concentração de 1 Ki à reação? E se fosse adicionado inibidor não competitivo,

também na concentração equivalente a 1 Ki? Considere duas reações separadas

para cada inibidor.

Substrato [S] V eloc idad e 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 x [inibidor] Sem[inibidor] Km – aumenta Vmax – se mantém Substrato [S] V eloc idad e 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 x [inibidor] Sem[inibidor] Km – se mantém Vmax – reduz

(27)

para cada inibidor.

Substrato [S] V eloc idad e 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 [inibidor] = 1 K_Ic Sem[inibidor] Km – aumenta Vmax – se mantém

Portanto o K

_M

dobraria

V

_Max

ficaria igual

V₀= Vmáx [S] K_Ic + [S] K_M ( 1 + [I_c] ) V₀= Vmáx [S] K_Ic + [S] K_M ( 1 + [K_Ic] ) V₀= Vmáx [S] + [S] 2 K_M

(28)

Substrato [S] V eloc idad e 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 x [inibidor] Sem[inibidor] Km – se mantém Vmax – reduz

para cada inibidor.

V

_Max

na presença de [I

_NC

]= 1 K

_INC

A velocidade seria a metade da V

_Max

sem

inibidor

V₀= V_máx K_INc [S] 1 + [I_Nc] K_M _{+ [S]} V0 = V_máx K_INc [S] 1 + [K_INc] K_M _{+ [S]} V₀= V_máx [S] 2 K_M _{+ [S]}

(29)

21. Mostrar as vantagens da transformação de Lineweaver-Burk para a

determinação do KM de uma enzima. Fazer o gráfico de Lineweaver-Burk na

ausência de inibidor, na presença de duas concentrações de inibidor competitivo e na presença de duas concentrações de inibidor não competitivo.

V

₀

=

Km

Vmax [S]

1 Vmax

1 +

y = ax + b

y = slope.x + intercepto

(30)

22. Por que a cinética de algumas enzimas alostéricas tem aspecto sigmoidal enquanto as enzimas michaelianas têm cinéticas hiperbólicas?

Ler Regulação alostérica, pag. 258 a 261).

✓ Cooperatividade ✓ Ativação alostérica

(31)

23. Fazer o gráfico vo x [S] para uma reação catalisada por uma enzima alostérica, na

ausência de efetuadores e na presença de efetuadores positivo e negativo, que afetam seu K_M. Substrato [S] V eloc idad e 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Sem efetuador Efetuador positivo Efetuador negativo