Detecção imunoistoquímica de Ki67,
receptores de estrogênio e de progesterona
em espécime cirúrgico e biópsia percutânea
de carcinoma de mama
Nome do autor: Fabiane Silva
Barbosa
Nome do orientador: Prof. Dr.
Cláudio O. P. Alexandre
Nome do co-orientador: Prof.ª
Dra. Márcia Graudenz
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Patologia da Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre como requisito para a obtenção do grau
de Mestre
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DE PORTO ALEGREL DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DE PORTO ALEGREL DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DE PORTO ALEGREL DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DE PORTO ALEGRE I
Detecção imunoistoquímica de Ki67,
receptores de estrogênio e de progesterona
em espécime cirúrgico e biópsia percutânea
de carcinoma de mama
Nome do autor: Fabiane Silva
Barbosa
Nome do orientador: Prof. Dr.
Cláudio O. P. Alexandre
Nome do co-orientador: Prof.ª
Dra. Márcia Graudenz
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Patologia da Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre como requisito para a obtenção do grau
de Mestre
B238d Barbosa, Fabiane Silva
Detecção imunoistoquímica de Ki67, receptores de estrogênio e de progesterona em espécime cirúrgico e biópsia percutânea de carcinoma de mama / Fabiane Silva Barbosa. – Porto Alegre, 2008.
70 f. : il.
Dissertação (mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Patologia. Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre. 2008.
Orientador: Claudio O. P. Alexandre. Co-orientador: Márcia Graudenz.
1. Carcinoma de mama. 2. Ki67. 3. Imunoistoquimia. I. Alexandre, Claudio O. P. II. Graudenz, Márcia. III. Título.
CDU 618.19-006 CDD 616.99449
A minha mãe Solange, fonte inspiradora das minhas ações. Aos meus amigos, que fazem da minha vida cada vez mais bela.
AGRADECIMENTOS
A realização deste estudo contou com a participação e o empenho de muitas pessoas. Difícil seria mencionar todas, sem fazer jus ao real esforço de cada uma delas. Para algumas delas, expresso aqui o meu mais sincero agradecimento.
Ao amigo e Prof. Dr. CLÁUDIO OSMAR PEREIRA ALEXANDRE pela constante e incansável dedicação demonstrada em todos os momentos do projeto. Pela amizade, apoio e compreensão nesses anos de convivência.
Ao amigo e Prof. Dr. ANTONIO LUIZ FRASSON pela participação e colaboração indispensáveis neste projeto. Pela amizade e apoio sempre demonstrados.
Ao Prof. Dr. VINÍCIUS DUVAL DA SILVA pela amizade e incansável dedicação e disponibilidade.
Ao Prof. FELIPE PEREIRA ZERWES pela amizade e colaboração nesta dissertação.
A Prof. Dra. MARCIA GRAUDENZ pela co-orientação desta dissertação.
A Acadêmica de medicina MARCELLE MORAES DOS SANTOS pela dedicação e empenho.
A funcionária do laboratório de Pós-Graduação em Patologia ROSSALVA MAUER pela amizade e colaboração com a elaboração das lâminas e ajuda com a imunoistoquímica.
A secretária IVONICE OLIVEIRA DOS SANTOS pelo carinho e dedicação.
A estatística LUIZA COELHO pela ajuda indispensável com a análise estatística.
Aos meus queridos amigos MARIA CAROLINA REY, ALINE FERREIRA CASTILHOS, THIRZÁ FRISON, ANNA LUCIA ZECCA, EDUARDO LICHTENFELS, MÁRCIA TATSCHI, ADRIANA MACHADO e FERNANDA ALAITE ZAMBELLI pelo apoio, compreensão e amizade de sempre.
A MATTEO LUIGI FOLLINI pelo apoio, amizade e incentivo.
A minha mãe SOLANGE SILVA BARBOSA pelo apoio incondicional em todas as decisões da minha vida.
SUMÁRIO
Lista de Abreviaturas e Símbolos ... VII Lista de Figuras ... IX Lista de Gráficos e Tabelas ... X RESUMO... XII ABSTRACT... XIV 1. INTRODUÇÃO... 1 2. REVISÃO DA LITERATURA ... 5 Câncer de Mama... 5 Epidemiologia ... 5 Patogênese ... 6 Técnica Imunoistoquímica ... 8
Antígeno Ki67 e câncer de mama ... 9
Receptores Hormonais e câncer de mama ... 11
Receptores Hormonais e carcinoma ductal in situ ... 18
3. JUSTIFICATIVA PARA O ESTUDO ... 21
4. OBJETIVOS ... 22
4.1 Objetivo Geral... 22
5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 23
6 ARTIGO EM INGLÊS ... 32
7 ARTIGO EM PORTUGUÊS ... 53
8 ANEXOS ... 73
8.1 PACIENTES, MATERIAIS E MÉTODOS ... 73
8.1.1 Delineamento do estudo ... 73 8.1.2 População estudada ... 73 8.1.3 Amostra estudada ... 73 8.2 METODOLOGIA... 74 8.2.1 Avaliação clínico-patológica ... 74 8.2.2 Avaliação imunoistoquímica ... 78 8.2.3 Análise estatística ... 79
8.2.4 Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa ... 80
8.2.5 Termo de Consentimento Informado Livre e Esclarecido para Pesquisa Cientifica ... 80
8.3 FIGURAS ... 84
Lista de abreviaturas e Símbolos
CEMA – Centro de Mama do Hospital São Lucas da PUCRS
UFCSPA – Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre CM- Carcinoma de mama
IQ- imunoistoquímica BP- Biopsia percutânea EC- Espécime Cirúrgico IC – Intervalo de Confiança
Ki67 – Marcador de proliferação tumoral
PUCRS – Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul RE – Receptor de Estrogênio
RH – Receptores Hormonais RP – Receptor de Progesterona
TNM- classificação TNM conforme padronização da União Internacional Contra o Câncer, 6ª edição. Esse sistema é baseado no TNM, no qual o T se refere ao tamanho tumoral, N ao comprometimento de linfonodos e M à presença de metástases a distância
UICC- União Internacional Contra o Câncer
NSABP B-14 – Estudo realizado pelo National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project Protocol B-14
NSABP B-24 Estudo realizado pelo National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project Protocol B-24
EBCTCG – Estudo realizado pelo The Early Breast Cancer Trialists Collaborative Group
ATAC Trial – Estudo Clinico denominado: “Arimidex, Tamoxifen, Alone or in Combination” FDA - Food and Drug Administration
CDI – Carcinoma Ductal Invasor CDIS – Carcinoma Ductal in situ
Lista de Figuras
Figura 1. Imunoistoquímica para RE em material de biópsia percutanea de carcinoma de mama: ausência de coloração, baixa coloração (1-9% das células coradas), elevada coloração (superior a 10% da células coradas). (400 aumentos,objetiva de 40x) ... 84
Figura 2. Imunoistoquímica para RE em material de espécime cirúrgico de carcinoma de mama: ausência de coloração, baixa coloração (1-9% das células coradas), elevada coloração (superior a 10% da células coradas). (400 aumentos,objetiva de 40x) ... 84
Figura 3. Imunoistoquímica para RP em material de biópsia percutanea de carcinoma de mama: ausência de coloração, baixa coloração (1-9% das células coradas), elevada coloração (superior a 10% da células coradas).(400 aumentos,objetiva de 40x)... 85
Figura 4. Imunoistoquímica para RP em material de espécime cirúrgico de carcinoma de mama: ausência de coloração, baixa coloração (1-9% das células coradas), elevada coloração (superior a 10% da células coradas).(400 aumentos,objetiva de 40x)... 85
Figura 5. Imunoistoquímica para Ki67em material de biópsia percutanea de carcinoma de mama baixa coloração (1-9% das células coradas), elevada coloração (superior a 10% das células coradas). (400 aumentos,objetiva de 40x)... 86
Figura 6. Imunoistoquímica para Ki67 em material de espécime cirúrgico de carcinoma de mama baixa coloração (1-9% das células coradas), elevada coloração (superior a 10% das células
Lista de Gráficos e Tabelas
Gráfico 1. Box-plot dos valores extremos observados em quartis da imunoisqoquímica do Ki67 na biópsia percutânea e no espécime cirúrgico ... 87
Gráfico 2. Diferenças na avaliação imunoistoquímica de RE entre material de biópsia percutânea e espécime cirúrgico ... 88
Gráfico 3. Diferenças na avaliação imonoistoquímica de RP entre material de biópsia percutânea e espécime cirúrgico ... 89
Tabela 1. Dados clínicos e anátomo-patológicos ... 90
Tabela 2. Graduação Bloom e Richardson (modificada por Elston e Ellis) ... 92
Tabela 3: Distribuição das freqüências simples e relativas para RE e RP e medidas de tendência central e de variabilidade para KI67, segundo o tipo de cirurgia ... 93
Tabela 4: Distribuição das freqüências simples e relativas para RE e RP e medidas de tendência central e de variabilidade para KI67, segundo o tipo de tumor ... 94
Tabela 5: Distribuição das freqüências simples e relativas para RE e RP e medidas de tendência central e de variabilidade para KI67, segundo o grau tumoral ... 95
Tabela 6: Distribuição das freqüências simples e relativas para RE e RP e medidas de tendência central e de variabilidade para KI67, segundo o número de linfonodos metastaticos ... 96 Tabela 7: Distribuição das freqüências simples e relativas para RE e RP e medidas de tendência central e de variabilidade para KI67, segundo o tempo de decurso entre biopsia percutanea e cirurgia ... 97
RESUMO
Introdução: O antígeno Ki67 é um importante marcador de proliferação celular usado, no carcinoma de mama (CM), como fator prognóstico. Da mesma forma, o estado dos receptores hormonais é fundamental no manejo de pacientes com CM, predizendo resposta à terapia e prognóstico. A terapia endócrina é considerada ineficaz em pacientes que não expressam receptores de estrogênio (RE) e/ou progesterona (RP). A avaliação do Ki67 e dos receptores hormonais é obtida, rotineiramente, por meio da técnica imunoistoquímica (IQ) utilizando o espécime cirúrgico (EC). Entretanto, em muitos casos, tais como no carcinoma de mama avançado, a amostra tumoral a partir da biópsia percutânea (BP) pode ser a única amostra de tecido disponível para a avaliação.
Objetivo: Avaliar a expressão de Ki67 e receptores hormonais em espécime cirúrgico e biópsia percutânea, por meio da técnica imunoistoquímica, de pacientes com carcinoma de mama.
Material e métodos: Foi realizado um estudo transversal em 90 mulheres com carcinoma de mama sem tratamento neoadjuvante e submetidos à biópsia percutânea prévia. Foi utilizado o método computadorizado de análise quantitativa para determinar a expressão do Ki67 e dos receptores hormonais detectados pela técnica imunoistoquímica. Todas as lâminas (EC e BP) foram confeccionadas e testadas no mesmo laboratório e no mesmo período de tempo.
Resultados: Os percentuais observados para o Ki67 na biópsia percutânea, cuja média foi de 18,32, se mostraram significativamente superiores quando comparados aos percentuais de Ki67 no espécime cirúrgico, cuja média foi de 5,86 (p<0,001) A expressão dos RP no EC foi detectada em 58,9% (53/90) dos casos e na BP em 68,9% (62/90), esta diferença não foi estatisticamente
significativa (p=0,2144), entretanto quando evidenciados os resultados positivos e negativos concordantes, houve uma tendência a maior positividade em material de BP (p=0,108). Por outro lado, a freqüência dos RE detectada em EC e BP, não mostrou diferença estatisticamente significativa (p=0,248). Quando o critério de receptor hormonal positivo considerado foi ER ou RP positivos, não foi observada diferença entre EC e BP. Não foram observadas diferenças com relação ao tipo de cirurgia, tipos histológicos ou estadiamento do tumor.
Conclusões Nossos dados indicam que a biópsia percutânea pode ser utilizada para a detecção do Ki67 e dos RH em pacientes com carcinoma de mama. Sugerimos que se deve considerar uma nova avaliação de RP, quando o espécime cirúrgico for negativo para RH, usando-se a biópsia percutânea.
ABSTRACT
Rationale The Ki67 antigen is an important breast cancer (BC) marker of cell proliferation, used as a prognostic marker. The status of hormonal receptors (HR) is critical in the management of BC patients, predicting responsiveness and prognosis. Endocrine therapy is considered ineffective in patients whose tumours show no expression of oestrogen receptors (ER) and progesterone receptors (PR). The assessment of Ki67 and hormonal receptors is usually done by immunohistochemistry on tissue sections from surgical specimen (SS). The core biopsy (CB) has become the method of choice for diagnosing lesions. Previous studies have shown that the CB can also be used to assess receptor status.
Objectives To assess Ki67 and hormonal receptors immunohistochemistry expression differences between surgical specimens and core biopsy of breast cancer patients.
Study design A transversal study was performed with 90 breast cancer women, without neoadjuvant therapy and submitted to breast surgery and, previously, core biopsy. A computer assisted quantitative scoring method was used to determinate Ki67 and hormonal receptor immunohistochemistry expression. All slides (core and surgical specimens) were stained and tested in the same laboratory at the same time.
Results The percentage observed for Ki67 on the BP, where the average is 18,32, was statistically significantly higher than when compared to the Ki67 percentage in SS, where the average is 5,86 (p<0,001). PR expression in surgical specimens was 58,9% (53/90); while 68,9% (62/90) of cores were positive, this difference was not statically significance, even though when positive or negative results where evidenced, there was a positive tendency in BP material (p=0,108). The ER status of surgical specimens showed no statistical differences (p=0,248) between SS and CB. If a tumour was
defined as overall positive hormone receptor (ER+ or PR+), no differences in the assessment of receptor expression were found between SS and CB. No differences were observed when the type of surgery, histological type and staging were analysed.
Final comments Our data suggests that core biopsy could be used to asses Ki67 and HR in breast cancer patients. We suggest that a new assessment should be done in CB when PR in surgical specimens is negative.
INTRODUÇÃO
A expressão do antígeno Ki67 varia em intensidade durante o ciclo celular, sendo mais baixa durante a fase G1 e fase S e aumentando progressivamente até atingir a intensidade máxima durante a mitose1. A ausência de expressão de Ki67 em células quiescentes e sua expressão universal em tecidos que estão em divisão geraram um grande interesse na sua utilização como marcador de proliferação celular1. Atualmente, este antígeno é considerado o de maior acurácia na identificação da atividade proliferativa celular e existem evidências que é capaz de predizer prognóstico em pacientes com câncer de mama e linfonodos negativos, quando utilizado como única variável2;3. A técnica imunoistoquímica é utilizada rotineiramente para a sua avaliação3.
As terapias endócrinas e a quimioterapia são opções de tratamento para pacientes com carcinoma de mama e o conhecimento do estado dos receptores hormonais é fundamental para predizer resposta e prognóstico4. Nas pacientes que não expressam receptores hormonais no tumor, as terapias endócrinas são consideradas ineficazes e o estado dos receptores hormonais é útil na escolha do tipo de quimioterapia e na avaliação do grau de responsividade 4. A análise da expressão dos receptores hormonais por meio da técnica imunoistoquímica é considerada como um padrão para a avaliação da resposta à terapia oncológica no câncer de mama.
As terapias endócrinas são recomendadas para a maioria dos pacientes com receptores hormonais positivos, de estrogênio e/ou progesterona, pela eficácia e menor
quantidade de efeitos colaterais 5-7 Tamoxifeno, inibidores da aromatase e ablação ovariana fazem parte da terapêutica hormonal 5;7.
O uso de tamoxifeno na adjuvância é um dos maiores progressos da oncologia mundial, sendo utilizado desde 1970, e, para mulheres com tumores que apresentam receptor hormonal positivo, seu uso por 5 anos está associado com 50% na redução do risco de recidiva e 28% de redução no risco de morte pela doença em 10 anos8 Recentemente, o uso de inibidores da aromatase de terceira geração (anastrozol; letrozol) vem sendo comparado ao tamoxifeno na adjuvância em mulheres na pós-menopausa, sendo que dados preliminares mostram que podem ser uma alternativa tão eficiente, e com menores índices de efeitos colaterais cardiovasculares 9. A terapia adjuvante seqüencial, com o uso de letrozol após 5 anos de tamoxifeno, mostrou um importante benefício na sobrevida livre de doença após 4 anos, com um índice aceitável de efeitos colaterais , e diversos estudos ainda estão em aberto, tentando encontrar o tempo ideal de tratamento10-12. A hormonioterapia com tamoxifeno (com ou sem ablação ovariana) mostrou-se tão benéfica quanto a quimioterapia com CMF oral ou regime baseado em antraciclina em mulheres com receptor hormonal positivo, linfonodo positivo na pré-menopausa, sendo uma alternativa bem mais cômoda e barata, quando se computam os gastos com a infusão das drogas e com as intercorrências do tratamento citotóxico13.
A determinação da expressão dos receptores hormonais, de estrogênio e de progesterona, pode ser realizada por meio do método quantitativo ou semiquantitativo 4 a partir da avaliação imunoistoquímica (IQ); geralmente utilizando o espécime cirúrgico14. A biópsia percutânea é utilizada, pré-operatoriamente, para o diagnóstico
das lesões mamárias e proporciona uma amostra de tecido tumoral capaz de fornecer informações sobre o estado dos receptores hormonais14. Em muitos casos, tais como no carcinoma de mama avançado, a amostra tumoral a partir da biópsia percutânea pode ser a única amostra de tecido disponível para a avaliação destes receptores15.
Entretanto, estudos recentes mostram resultados controversos com relação a detecção dos RH a partir de material de espécimes cirúrgicos e de biópsia percutânea 16. Divergências têm surgido na literatura, sobre qual o melhor material a ser utilizado para se realizar a avaliação imunoistoquímica. Até o momento, o fator de decisão tem sido a comodidade clínica. Não há recomendações de consenso ou alguma norma que determine se a decisão terapêutica adjuvante será baseada nos resultados da IQ de biópsia percutânea ou de espécime cirúrgico. No estudo desenvolvido por Mann e colaboradores, onde 100 pacientes foram avaliados pela técnica imunoistoquímica utilizando material de biópsia percutânea e de excisão tumoral, 9% das pacientes (IC 95%, 4,2-16,4%) apresentaram biópsia percutânea positiva para receptores hormonais e resultado negativo quando a avaliação foi realizada no espécime cirúrgico16. É importante salientar que, se a decisão terapêutica fosse baseada somente na avaliação do espécime cirúrgico, estas pacientes seriam consideradas receptores hormonais negativos e não receberiam terapia hormonal complementar. Essa discordância de resultados, apontada na literatura internacional, justifica a avaliação em nosso meio dos resultados obtidos com a IQ de biópsia percutânea e de excisão tumoral, uma vez que não apresentamos uma rotina estabelecida.
O presente estudo tem como objetivo principal avaliar a expressão do antígeno Ki67 e dos receptores hormonais em espécime cirúrgico e biópsia percutânea de
pacientes com carcinoma de mama, utilizando a técnica imunoistoquímica, buscando contribuir para a definição da melhor opção para a detecção destes marcadores.
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Câncer de mama
2.1.1 Epidemiologia
O carcinoma mamário é uma das neoplasias mais freqüente no mundo e a mais comum entre as mulheres 17 A cada ano, cerca de 22% dos novos casos de câncer, em mulheres, são de mama. Quando diagnosticado e tratado precocemente, o carcinoma mamário é considerado de relativo bom prognóstico. No entanto, as taxas de mortalidade por câncer de mama continuam elevadas no Brasil, muito provavelmente porque a doença ainda é diagnosticada em estádios avançados. Na população mundial, a sobrevida média após cinco anos é de 61%.
No Brasil, o número de casos novos de câncer de mama esperados no ano de 2008, é de 49.400, com um risco estimado de 51 casos a cada 100 mil mulheres 17. Porém, a distribuição dos casos novos deste carcinoma varia significativamente entre os estados e capitais do país. Na região Sudeste, o câncer de mama é o mais incidente entre as mulheres, com um risco estimado de 68 casos novos por 100 mil. Sem considerar os tumores de pele não melanoma, esse tipo de câncer também é o mais freqüente nas mulheres das regiões Sul (67/100.000), Centro-Oeste (38/100.000) e Nordeste (28/100.000). Na região Norte, é o segundo tumor mais incidente (16/100.000) 17.
O Rio Grande do Sul, em particular, apresenta uma incidência bastante elevada, 88,5 casos por 100.000 mulheres no estado e de 119,5 casos por 100.000 mulheres na
capital 17. As estimativa para o ano de 2008 são, no estado, 4.880 novos casos e na capital, Porto Alegre, 950 17.
2.1.2 Patogênese
O carcinoma de mama tem uma patogênese bastante complexa. A maioria dos carcinomas de mama se origina das células que revestem o segmento dúctulo terminal da árvore mamária, na transição entre a porção ductular e acinar18. Do ponto de vista morfológico, a maioria dos tumores malignos da mama é classificada como carcinoma ductal infiltrante. Com relação a graduação histológica, aplicada por Bloom e Richardson e modificada por Elston e Ellis19(Tabela 2), existe uma forte associação entre graus histológicos e prognóstico, onde o grau I tem sobrevida melhor que grau II e III20.
Os fatores de risco para o desenvolvimento do carcinoma de mama dividem-se em maiores e menores. Os fatores de risco maiores compreendem sexo feminino, idade avançada, historia familiar (CM no período pré-menopáusico em mãe, irmã, filha ou CM bilateral)21, história pessoal de CM contra-lateral, prévio carcinoma mamário não infiltrante e alterações proliferativas mamárias benignas com atipias22;23. Os fatores de risco menores são menarca precoce (antes dos 11 anos), menopausa tardia (após os 54 anos), obesidade após a menopausa, nuliparidade, idade da primeira gestação a termo acima dos 30 anos e exposição a radiação no tórax ou na mama24;25. Muitos desses fatores estão relacionados à exposição de estrogênios endógenos26, especialmente a terapia de reposição hormonal prolongada com estrogênios e progesterona (período superior a 5 anos)27.
A fonte de estrogênios nas mulheres pré-menopáusicas são os ovários28. A produção ovariana de estrogênios e progesterona diminui após a menopausa, os ovários e a camada cortical da glândula supra-renal passam a secretar basicamente androgênios. Os androgênios são convertidos em estrogênios nos tecidos periféricos (como tecido adiposo, pele, fígado, músculos e cérebro). Os níveis circulantes de estrogênio diminuem após a menopausa, entretanto a síntese periférica é aumentada e a concentração de estrogênio no tecido mamário das mulheres pós-menopáusicas pode ser tão elevada quanto aquela observada em mulheres pré-menopáusicas 28;29. Nos tumores de mama, a maior concentração de estrogênio localiza-se na gordura mamária. Este fato é parcialmente explicado pela síntese local e gradientes favoráveis que captação sérica de androgênios e estrogênio pelo tecido mamário30 . O sultafo de estrona, pode ainda ser convertido em estrogênio em tumores31. Ressalta-se ainda que a sensibilidade do câncer de mama ao estrogênio aumenta com a idade da paciente11.
A idade continua sendo um dos mais importantes fatores de risco. As taxas de incidência aumentam rapidamente até os 50 anos, e posteriormente o mesmo se dá de forma mais lenta. Essa mudança no comportamento da taxa é conhecida na literatura como “Clemmesen’s hook”, e tem sido atribuída à menopausa 17.
Recentes avanços no campo da biologia molecular permitiram um melhor entendimento da gênese desta neoplasia. Seu desenvolvimento decorre da alteração na expressão de um conjunto de genes que controlam a proliferação celular. A maioria das mutações, nestes genes, ocorre de forma esporádica. No entanto, alguns genes, como BRCA1 e BRCA2 são classicamente envolvidos no desenvolvimento de tumores de mama com incidência familiar32;33. Estes genes são responsáveis por 3 a 8% de todos os
carcinomas de mama esporádicos, mas estão presentes em até 80% dos CM familiares34 Mulheres portadoras de mutações no BRCA1 apresentam um risco cumulativo de desenvolver câncer de mama e ovário de 87% (IC 95%, 72-95%) e 44% (IC 95%, 28-52%), respectivamente, a 70 anos de idade 35. Entre as portadoras de mutações no BRCA2, o risco é de 84% (IC 95%, 43-95%) e 27% (IC 95%, 0-47%), respectivamente36.
2.2 Técnica Imunoistoquímica
A técnica de imunoistoquímica, desenvolvida por Coons e cols. 37 em 1941, foi baseada na marcação de anticorpos com produtos fluorescentes, tais como o isocianato de fluoresceína, para a detecção de antígenos teciduais. Em 1966, Nakane e cols., substituem o isocianato de fluoresceína pela enzima peroxidase 38. Na década seguinte, com o desenvolvimento da técnica de peroxidase anti-peroxidase e o emprego de anticorpos monoclonais, observou-se um rápido e espetacular incremento no uso da imunoistoquímica nas rotinas de laboratório 39;40. Taylor e colaboradores 41 contribuíram decisivamente para a maior aplicabilidade desta técnica, demonstrando a possibilidade de detecção de alguns antígenos a partir de tecidos rotineiramente processados e emblocados em parafina. A imunoistoquímica é uma técnica fundamentalmente qualitativa, entretanto aplicações quantitativas podem ser realizadas. Seu objetivo principal é o de localizar topograficamente o antígeno na célula ou no tecido45.
Esta técnica , principalmente após o desenvolvimento de anticorpos capazes de reconhecer epítopos que não se degradam durante o processamento histológico, vem, gradativamente, substituído o método bioquímico, antes tido como o padrão-ouro, para
a avaliação dos receptores hormonais. O custo e a complexidade do método bioquímico são fatores que contribuíram para esta decisão42-44.
Entretanto, convém ressaltar que os resultados obtidos a partir da técnica imunoistoquímica estão fortemente associados a variáveis como o tipo de fixador utilizado, o tempo de fixação do material, a temperatura de processamento e o método de recuperação antigênica utilizado42;43. Estas variáveis, caso não sejam criteriosamente estabelecidas, podem ser as responsáveis pela principal desvantagem da técnica que reside na discordância de resultados obtidos tanto observador quanto inter-laboratorial45. Por outro lado, a atividade de enzimas endógenas, a ligação inespecífica de anticorpos a componentes teciduais se constituem também em fatores que podem afetar a especificidade da técnica.
2.3 Antigeno Ki67 e câncer de mama
O antígeno Ki67 foi identificado por Gerdes e colaboradores em 1991 na cidade de Kiel (portanto “Ki”), como uma proteína nuclear não histona, após a imunização de ratos com linfoma de Hodking da linhagem celular L428 (67 se refere ao número do clone) 468. Esta proteína pode ser expressa como duas isoformas de peso molecular de 320kD e 359kD, respectivamente.
Este marcador de proliferação celular está presente em células de todas as fases ativas do ciclo celular , tendo relação direta com a fração de crescimento da população celular. O percentual de núcleos corados é o índice de proliferação celular. Um baixo
índice de proliferação celular está associado a um menor crescimento tumoral e melhor prognóstico.47
A expressão do Ki67 pode ser detectada a partir de tecido fresco ou fixado e incluído em bloco de parafina. Utiliza-se como referência a porcentagem de núcleos de células tumorais positivamente coradas pelo anticorpo48. Acredita-se que o ponto de corte para avaliar valor prognóstico do Ki67 no carcinoma de mama inicial varie entre 15 a 22%49. A expressão do Ki67 é significativamente maior no carcinoma de mama ductal invasor que no carcinoma ductal invasor com componente intraductal 50.
Martínez-Arribas e colaboradores avaliaram a proliferação tumoral no carcinoma de mama por meio da citometria de fluxo e da técnica imunoistoquímica (Ki67) para determinar o método que melhor avalia tumores com alta e baixa proliferação celular em relação a parâmetros clínicos e biológicos51. Os autores concluiram que apesar da citometria de fluxo fornecer dados que podem ser correlacionados com a invasão linfonodal, a determinação da expressão do Ki67 pela técnica imunoistoquímica é um método mais simples, rápido, de pouco custo e fidedigno no estudo da proliferação celular no carcinoma de mama 51.
Diferentes estudos mostra evidências sobre o potencial da expressão do Ki67 em discriminar grupos de bom e mau prognóstico, entre as pacientes com carcinoma de mama e linfonodos negativos, quando considerado como única variável2;52-56. A associação da expressão do Ki67 e a resposta ao tratamento médico no carcinoma de mama parece ser clara48. Alguns estudos relatam a capacidade de altos valores do Ki67 em predizer melhor resposta (clínica e patológica) à quimioterapia57;58.
Jones e colaboradores59 compararam a expressão do Ki67 no carcinoma de mama e o significado prognóstico, antes e após a quimioterapia neodjuvante. Neste estudo, o Ki67 mostrou-se um fator prognóstico de desfecho (recidiva e sobrevida livre de doença) nos casos em que não houve resposta tumoral completa.
No entanto, existem controvérsias com relação ao valor preditivo do Ki67 e a resposta a quimioterapia neoadjuvante6061-64.
2.4 Receptores Hormonais e câncer de mama
No início da década de 70 os receptores de estrogênio foram identificados e foi postulada a teoria que os tumores de mama que contivessem grande quantidade de receptores de estrogênio responderiam a terapia endócrina, entretanto, na época havia pouca evidência clínica que embasasse esta hipótese65. Hoje, no entanto, a importância dos receptores hormonais (estrogênio e progesterona) é reconhecida na biologia do câncer de mama . Cerca de 60% dos tumores de mama expressam esses receptores
28;66;67
.
Estrógenos são necessários para o crescimento e sobrevida do epitélio mamário68. Efeitos estrogênicos são mediados pela ligação do hormônio a fatores transcricionais chamados de receptores de estrogênio. Estes receptores são proteínas que se dimerizam e ligam-se a seqüências no DNA denominadas elementos responsivos ao estrogênio na região promotora dos genes-alvo aumentando a transcrição destes genes, os quais incluem o receptor de progesterona65;69.
A estrutura do receptor de estrogênio é importante para a sua função, além de um domínio que se liga ao estrogênio e outro que se liga ao DNA após a dimerização, apresenta duas regiões de de transativação, uma no sítio de “binding (AF2) e outra no domínio N-terminal (AF-1). Esta transativação consiste na ligação das regiões AF a fatores gerais de transcrição aumentando a velocidade basal de transcrição e que se dá através do recrutamento de co-ativadores que são moléculas adaptadoras70. Estes ativadores não só trabalham por ligações aos fatores gerais de transcrição do “TATA box” , mas têm atividade enzimática de acetilase que modifica histonas e estrutura cromatínica, facilitando o acesso ao promotor. Portanto, podemos postular um mecanismo de dois passos para a ativação gênica por receptores esteróides: 1) receptor/co-ativador induzem remodelação da cromatina que permite um acesso maior dos fatores de transcrição gerais ao promotor, e 2) estabilização dos fatores gerais de transcrição ao promotor via interação proteína-proteína com complexo receptor/co-ativador65;69.
Outro receptor de estrógeno, o ER β, foi recentemente descrito em próstata e células granulosa do ovário e o clássico receptor de estrogênio passou a ser identificado como RE α. Ambos ligam-se a elementos responsivos ao estrogênio e aos mesmos ligantes, mas com diferentes afinidades71. Estes receptores tem uma grande similaridade no domínio de ligação ao DNA (96%) e são muito diferentes no domínio de ligação ao hormônio (58%), as regiões AF também não são homólogas. RE α e ER β são co-expressos em vários tumores de mama, mas sua distribuição tissular parece ser bastante variável71;72.
As propriedades físico-químicas de ambos os subtipos são discretamente diferentes na dependência dos ligantes73. A existência de dois subtipos indica duas possíveis vias de sinalização estrogênica: via subtipo beta, em tecidos exclusivamente expressando esse subtipo, e via formação de heterodímeros, em tecidos expressando ambos os subtipos74.
Uma vez que a expressão do receptor de progesterona é induzida pelo receptor de estrogênio, o RP tem sido estudado como um marcador substituto de atividade do RE e tem sido utilizado como um fator preditivo adicional para a terapia hormonal no carcinoma de mama. A análise de estudos clínicos randomizados em carcinoma de mama mostram que os receptores de progesterona possam aumentar o poder preditivo de resposta a endocrinoterapia dos receptores de estrogênio8. O receptor de progesterona também prediz resposta a terapia endócrina no carcinoma de mama metastático75. O RP sozinho tem sido associado com fraco fator prognóstico e preditivo quando comparado ao receptor de estrogênio8.
A avaliação dos receptores hormonais de estrogênio e progesterona em tumores de mama tem sido utilizada na pratica clínica há 25 anos para determinar prognóstico e predizer resposta a hormonioterapia76. Entretanto, somente no início da década de 1990 ocorre o uso difuso da determinação imunoistoquímica para a avaliação de RE e RP no carcinoma de mama, quando os anticorpos monoclonais se disponibilizam amplamente no comércio47. O ensaio bioquímico, até então muito utilizado, foi quase totalmente substituído pela imunoistoquímica na determinação dos receptores hormonais quando estudos evidenciaram que as duas técnicas apresentavam resultados concordantes77.
Na prática clínica, dúvidas surgem sobre como melhor avaliar a coloração dos RE e RP47. Ambos Barnes e colaboradores78 e Fisher e colaboradores79 compararam a habilidade de múltiplos sistemas de escores em predizer resposta a tratamento e encontraram que todos apresentaram correlação estatisticamente significativa com desfecho. O Grupo Internacional de Estudos de Câncer de Mama dividiu as células em três categorias de acordo com a coloração imunoistoquímica e a resposta ao tratamento hormonal adjuvante: ausência de coloração, baixa coloração (1 a 9% das células coradas) e elevada coloração ( superior a 10% das células coradas)80. A maioria dos tumores apresenta ou ausência de coloração (22%) ou elevada coloração (75%), apenas 3% dos tumores pertencem ao grupo com 1-9% das células coradas. 80
O estrógeno desempenha um papel mitogênico no desenvolvimento do câncer de mama. Desta forma, a inibição de sua síntese ou bloqueio de sua ação são estratégias importantes no tratamento da neoplasia de mama. A terapia endócrina adjuvante é recomendada a mulheres com tumores de mama expressam receptores de estrogênio ou progesterona. Nas mulheres pré-menopáusicas, as opções endócrinas incluem tamoxifeno, ablação ou supressão ovariana ou uma combinação de ambos. O tamoxifeno age ligando-se competitivamente ao receptor de estrógeno no tecido tumoral e em outros tecidos, formando um complexo nuclear que diminui a síntese de DNA, inibe os efeitos do estrógeno e acarreta a parada de crescimento celular, sendo considerado um forte antagonista do estrógeno. Foi aprovado pela FDA (Food and Drug Administration) em 1977 para o tratamento do carcinoma de mama avançado e anos mais tarde foi aprovado para o tratamento adjuvante do carcinoma de mama primário81.
O uso do tamoxifeno por cinco anos em pacientes com receptores hormonais positivos reduz a recorrência local e contralateral de 47% e a mortalidade de 26% quando comparado a placebo8. Entretanto, sua utilização não evidenciou benefício além dos cinco anos de uso, pelo contrário. O estudo NSABP B-14 (National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project Protocol B-14) mostrou que seu uso por um total de dez anos acarretou um decréscimo na sobrevida livre de doença. É possível que isso se deva ao desenvolvimento de ação agonista do tamoxifeno na mama após um determinado período82.
O EBCTCG (The Early Breast Cancer Trialists Collaborative Group) confirma o benefício da ablação da função ovariana em mulheres com idade inferior a 50 anos na sobrevida global e sobrevida livre de doença 83 . De fato, um dos efeitos benéficos observados após quimioterapia adjuvante em mulheres com tumores que expressam receptores hormonais é atribuído aos efeitos citotóxicos no ovário, que induzem a sua supressão. E a indução de amenorréia após quimioterapia em tais pacientes prediz aumento da sobrevida84.
Mulheres pós menopáusicas apresentam um quantidade maior de receptores estrogênio positivos que pré-menopausicas. Entretanto, a relação entre receptores de progesterona e a idade não é significativa85. A expressão de receptores hormonais confere características próprias a estes tumores, caracterizada por uma boa resposta ao tratamento hormonal, com baixas toxicidade e custo. Essas características ocorrem independente da idade, do estado menopausal e do comprometimento linfonodal8. Estima-se que cerca de 50-60% das mulheres com tumores receptor hormonal positivo
respondam à hormonioterapia, sendo que a taxa de resposta é proporcional à concentração do receptor75.
Nas mulheres pós-menopáusicas o tamoxifeno era o único tratamento disponível, até a introdução dos inibidores da aromatase Arimidex após o estudo ATAC em 2002 (Arimidex, Tamoxifen, Alone or in Combination)9. Os inibidores da aromatase (IA) são moléculas que atuam inibindo a enzima (aromatase) responsável pela conversão periférica de androstenediona e testosterona em estradiol e estrona. Ao contrário do tamoxifeno, os IA não possuem atividade agonista12. Existem várias gerações de IA disponíveis no mercado atualmente, sendo classificados em geração, de acordo com a sua ordem de desenvolvimento clínico e em tipos, de acordo com o mecanismo de ação. Os do tipo 1 são análogos esteroidais da androstenediona, ligando-se irreversivelmente à mesma. Os do tipo 2 são não-esteroidais e ligando-se ligam de forma reversível à enzimana mama e possui efeitos agonistas fracos em diferentes tecidos, como o endométrio42
Existem duas formas de incorporação dos inibidores da aromatase na adjuvância do câncer de mama: substituindo o tamoxifeno ou seqüencialmente ao tamoxifeno. O primeiro estudo desenhado para avaliar se um IA poderia substituir ou complementar o tamoxifeno com eficácia foi o estudo ATAC 9. As pacientes foram randomizadas após a cirurgia para cinco anos de adjuvância com tamoxifeno isolado, anastrozol isolado ou a combinação das duas drogas. O estudo mostrou uma diferença pequena, porém estatisticamente significativa favorável ao anastrozol. A sobrevida livre de doença em três anos foi de 89,4% no braço do anastrozol e de 87,4% no tamoxifeno, com risco relativo (RR) de 0,83 (p = 0,005). A combinação dos dois medicamentos não mostrou diferenças estatisticamente significativas.
O anastrozol também foi superior ao tamoxifeno em termos de recorrência, com RR de 0,74 (p = 0,0002) e incidência de câncer contralateral, RR de 0,47 (p = 0,001). Houve uma tendência a um maior tempo para recidiva a distância com o IA com RR 0,84 (p = 0,06). Entretanto, não houve nenhuma diferença significativa em termos de sobrevida global e específica, porém o número destes eventos em cinco anos ainda é pequeno. Em todos os subgrupos de pacientes com receptores hormonais positivos, o benefício em termos de tempo de recorrência foi mantido, tanto em linfonodos positivos e negativos e naquelas pacientes que receberam quimioterapia prévia ou não. Esta diferença foi ainda maior nas pacientes com RE+/RP-, quando comparado ao grupo RE+/RP+9.
O uso de anastrozol após dois a três anos de tamoxifeno trouxe benefício em termos de sobrevida livre de doença com RR 0,60 (p = 0,0009), em um seguimento de 28 meses. Este benefício foi observado independentemente do status nodal ou grau tumoral. A sobrevida livre de recorrências a distância foi melhor no grupo que permaneceu em tamoxifeno, com RR de 0,61 (p = 0,067). A sobrevida global não foi estatisticamente significativa9.
Vários estudos86;87 mostram que os tumores com receptor de estrógeno positivo e progesterona negativo (RE+RP-) são resistentes ao tamoxifeno. Nesse subgrupo particular, a vantagem de anastrozol sobre o tamoxifeno mostrou-se maior88. Os tumores que apresentam positividade para o HER-2 têm de forma geral um pior prognóstico e são mais resistentes ao tratamento quimioterápico e endócrino usual89. A taxa de resposta com o uso do letrozol foi mais elevada do que com o tamoxifeno (88%
e 21%, p = 0,0004) na neo-adjuvância nos tumores RE+ e HER-2 +86. Apesar dessas observações, a Sociedade Americana de Oncologia Clínica não recomenda a escolha de inibidor de aromatase para tratamento adjuvante do câncer de mama, baseada nesses critérios90.
A terapia hormonal não é utilizada nos tumores com ausência de receptores de estrogênio e progesterona 90. O Grupo Internacional de Estudos de Câncer de Mama, recentemente, no Consenso de St. Gallen (10th International Conference St. Gallen, Saint Gallen, Swiss), determinou a divisão do carcinoma de mama em três grupos de acordo com a resposta a terapia endócrina: grupo responsivo, grupo de resposta incerta e não responsivo de acordo com a quantidade de células coradas de RH, superior a 10%, 1-9% e 0 respectivamente 4;91. As recomendações de consenso são amplamente seguidas na Europa e nos Estados Unidos da América, sugerindo que a resposta à terapia endócrina deve orientar a escolha da terapia sistêmica adjuvante, um paradigma que impõem que a reprodutibilidade da coloração dos RH seja fundamental4;47;91.
2.5 Receptores hormonais e Carcinoma ductal in situ
A coloração imunoistoquímica de RE no carcinoma ductal in situ (CDIS), a diferença do que ocorre no carcinoma invasor, tem sido recentemente estimada pelo potencial beneficio à terapia hormonal com o tamoxifeno. O estudo do NSABP B-24 (National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project Protocol B-24) estudou de forma randômica 1804 mulheres tratadas com quadrantectomia e radioterapia que receberam tratamento com tamoxifeno por 5 anos ou palcebo. Os resultados mostraram que o grupo que recebeu tamoxifeno apresentaram menos desfecho carcinoma de mama que o
grupo que recebeu placebo (8.2 vs 13.4%, p=0.0009). Houve uma redução carcinoma de mama ipsilateral e novo tumor na mama contra-lateral no grupo que recebeu terapia adjuvante com tamoxifeno quando comparado com palcebo (RR 0,63; p<0,001)92;93.
Em 2003 a Universidade de Baylor e os investigadores do NSABP publicaram os resultados preliminares de um estudo retrospectivo que relaciona coloração dos RE e desfecho do estudo B-24. Dos 628 casos de CDIS (327 que pertenciam ao grupo placebo e 301 do grupo tamoxifeno) a maioria (77%) eram RE positivo, sendo claramente beneficiadas pela terapia adjuvante com o tamoxifeno, que reduziu a recorrência de câncer de mama ipsilateral e a de novo tumor na mama contra-lateral (RR 0,41; p<0,001). As pacientes ER negativo mostraram pouco benefício com a terapia hormonal (RR 0,80; p<0,51), mas o número de desfechos foi muito pequeno para conclusões sobre significado clínico94.
A expressão dos receptores de estrogênio no carcinoma de mama não mostra diferença estatística entre carcinoma ductal invasor e carcinoma ductal invasor com componente intra-ductal. Entretanto, a expressão dos receptores de progesterona no carcinoma ductal invasor apresenta, significativamente, uma menor intensidade no carcinoma ductal invasor com componente intra-ductal50.
A presença de receptores hormonais na biópsia percutânea e na peça cirúrgica é equivalente em torno de 97% das vezes95, sendo que a sensibilidade da biópsia inicial pode ser muito superior, principalmente se há retardo na cirurgia, injúria mecânica na mama e uso de quimioterapia neoadjuvante 95;96 Não existe diferença significativa entre os vários métodos de fixação, sendo a parafina o mais usado . No entanto, o preparo da lâmina deve ser feito idealmente em até 30 minutos, e nunca após 24-48 horas, e a
estocagem por períodos prolongados pode destruir os receptores hormonais, diminuindo a positividade em estudos posteriores97. Quando se analisa a intensidade dos receptores hormonais (pelo H escore), observa-se que esta é significativamente maior na biópsia percutânea, sendo que o grau de positividade diminui da periferia do tumor para o centro 98.
3. JUSTIFICATIVA PARA O ESTUDO
Até o momento não existe um consenso se a avaliação da expressão dos receptores de estrogênio, progesterona e Ki67 através da IQ deva ser realizada a partir da biópsia percutânea ou do espécime cirúrgico naquelas pacientes que realizaram a BP prévia ao tratamento cirúrgico. Dúvidas têm surgido na literatura sobre qual o melhor material para se realizar a avaliação imunoistoquímica. Até o momento a decisão tem sido baseada na comodidade clínica, uma vez que não parece haver diferenças nos resultados obtidos através da biópsia percutânea e do espécime cirúrgico. No estudo desenvolvido por Mann e cols16 onde 100 pacientes foram avaliados para estudo IHC de fragmentos de biópsia percutânea e do espécime cirúrgico, 9% das pacientes (IC 95%, 4,2-16,4%) apresentaram biópsia percutânea positiva para receptores hormonais e resultado negativo quando a avaliação foi realizada no espécime cirúrgico. Caso a decisão terapêutica fosse baseada somente na avaliação da biópsia cirúrgica, estas pacientes seriam consideradas receptores hormonais negativo e não receberiam terapia hormonal complementar. Esta discordância de resultados apontada na literatura internacional justifica a avaliação em nosso meio dos resultados obtidos com a IQ de espécime cirúrgica e de biópsia percutânea, uma vez que não apresentamos uma rotina estabelecida.
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo Geral:
Avaliar a expressão de Ki67 e de receptores hormonais em material de espécime cirúrgico e biópsia percutânea de pacientes com câncer de mama.
4.2 Objetivos Específicos:
4.2.1 Avaliar, por meio da técnica imunoistoquímica, a expressão do Ki67 em material de biópsia percutânea e de espécime cirúrgico de câncer de mama feminino.
4.2.2 Avaliar, por meio da técnica imunoistoquímica, a expressão dos receptores de estrogênio e de progesterona, em material de biópsia percutânea e de espécime cirúrgico de câncer de mama feminino.
4.2.3 Examinar a relação entre os resultados da técnica imunoistoquímica e dados demográficos e clínico-patológicos.
4.2.4. Comparar os resultados obtidos em material de espécime cirúrgico e de biópsia percutânea
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