Delineamento do estudo

Trata-se de um estudo transversal de prevalência.

8.1.2 População estudada

Foram consideradas elegíveis todas as pacientes do sexo feminino submetidas a tratamento cirúrgico no Centro de Mama do HSL da PUCRS, que apresentavam biópsia percutânea prévia ao tratamento, no período de 2000 a janeiro de 2007. Nenhum tipo de tratamento neoadjuvante foi administrado nessas pacientes. Todas as pacientes concordaram em participar do estudo através de termo de consentimento livre e esclarecido, previamente aprovado pela Comissão de Ética da FFFCMPA (reunião 5/10/2006, parecer 248-06) e do HSLda PUCRS (reunião 17/01/2007, registro 06/03343).

Foram excluídas as amostras com quantidade tumoral insatisfatória para a análise imunoistoquímica, quer seja do material da biópsia percutânea ou do espécime cirúrgico.

Pacientes que apresentaram mais de um tumor na mama somente foram incluídas quando pudemos identificar em qual tumor foi realizada a biópsia percutânea.

Das 100 pacientes com câncer de mama que inicialmente compunham o estudo, foram excluídas 10 pacientes por apresentarem quantidade insuficiente de tumor na biópsia percutânea ou no espécime cirúrgico.

8.2. Metodologia

8.2.1 Avaliação clínico-anátomo patológica

Todas as pacientes foram submetidas à biópsia percutânea prévia ao tratamento cirúrgico. Nenhum tipo de tratamento neoadjuvante foi administrado. Os exames para diagnóstico e estadiamento da doença, a indicação cirúrgica e o tipo de tratamento administrado ocorreram conforme a rotina do Ambulatório do Centro de Mama do HSL da PUCRS. A realização desse estudo não interferiu em nenhum momento no diagnóstico ou tratamento dessas pacientes.

A avaliação histológica do material de biópsia percutânea e espécime cirúrgico dos tumores foi classificada em carcinomas ductais infiltrantes do tipo não-especial, carcinomas ductais in situ, carcinomas infiltrantes do tipo lobulares e do tipo especial (medular, papilífero, tubular e mucinoso). Os demais subtipos histológicos, a exemplo do carcinoma papilar e inflamatório, não foram encontrados nas pacientes estudadas99.

A classificação histológica e a graduação dos carcinomas foram realizadas de acordo com a graduação de Scarff-Bloom-Richardson, oficialmente adotadas pela Organização Mundial de Saúde em 1968 e modificada por Elston e Ellis, referida como Nothinghan. (Tabela 2). De acordo com estes autores, conforme a porcentagem de formação tubular, pleomorfismo nuclear e o índice mitótico as lesões são classificadas em grau I, II e III, como carcinomas bem, moderadamente e pouco diferenciados, respectivamente19;100

Foi utilizada a classificação TNM conforme padronização da União Internacional Contra o Câncer (UICC), 6ª edição. Esse sistema é baseado no TNM, no qual o T se refere ao tamanho tumoral, N ao comprometimento de linfonodos e M à presença de metástases a distância 101, como indicado abaixo:

Classificação patológica pTNM- 6ª edição

Tumor primário (pT)

pTx Tumor primário não pode ser avaliado pT0 Sem evidências de tumor primário

pTis Carcinoma in situ: carcinoma intraductal ou carcinoma lobular in situ ou doença de Paget da papila sem tumor associado.

pT1 Tumor com 2 cm ou menos em sua maior dimensão: pT1mic- carcinoma microinvasor (≤ 0,1 cm)

pT1a - tumor com 0,5 cm ou menos em sua maior dimensão

pT1b - tumor com mais de 0,5 cm e até 1 cm em sua maior dimensão pT1c - tumor com mais de 1 cm e até 2 cm em sua maior dimensão pT2 Tumor com mais de 2 cm e até 5 cm em sua maior dimensão pT3 Tumor com mais de 5 cm em sua maior dimensão

pT4 Tumor de qualquer tamanho, com extensão direta à parede torácica ou à pele pT4a – extensão à parede torácica

pT4b– edema (incluindo peau d’orange) ou ulceração da pele da mama ou nódulos cutâneos satélites, confinados à mesma mama.

pT4c – T4 a e T4 b associados T4d – carcinoma inflamatório

Linfonodos regionais (pN)

pN0 Ausência de metástase nos linfonodos regionais pN0 – (i/+)*

pN0 – (MOL -/+)* pN1

pN1mi – micrometástase ( >0,2 mm e ≤ 2mm) em axila ou cadeia mamária interna.

pN1a – 1 a 3 linfonodos axilares homolaterais comprometidos com pelo menos uma metástase > que 2mm.

pN1b - linfonodos da mamária interna com metástase microscópica identificada em linfonodo sentinela mas não clinicamente aparente

pN1c- 1 a 3 linfonodos axiliares comprometidos incluindo pelo menos uma metástase maior que 2mm e linfonodos da mamária interna com metástase microscopicas em linfonodo sentinela mas não clinicamente aparente. Metástases em linfonodo(s) axilar(es) homolateral(is) móvel(is)

pN2-

pN2a- 4 a 9 linfonodos axiliares comprometidos incluindo pelo menos uma metástase maior que 2mm

pN2b- linfonodos da mamária interna clinicamente aparentes na ausência de comprometimento axilar

pN3-

pN3a- 10 ou mais linfonodos axilares comprometidos incluindo pelo menos uma metástase maior que 2mm

- linfonodo infra-clavicular ipslateral comprometido

pN3b- linfonodos da mamária interna clinicamente comprometidos na presença de comprometimento de linfonodos axilares

- mais de 3 linfonodos axilares comprometidos e linfonodos da mamária interna com metástase microscópica identificada em linfonodo sentinela mas não clinicamente aparente

pN3c- linfonodo(s) supra-clavicular ipslateral comprometido

• _{casos em que a metástase linfonodal consiste de apenas células tumorais isoladas ou} formando grupamentos menores que 0,2mm, sendo em sua maioria detectadas por

imunohistoquimica (i) ou técnicas de biologia molecular (MOL), são classificadas como pNO, pois não mostram atividade metastática efetiva.

Metástases à distância (pM)

PMX A presença de metástases à distância não pode ser avaliada PM0 Ausência de metástases à distância

8.2.2 Avaliação imunohistoquímica

As avaliações imunoistoquímicas para RE, RP e Ki67 de todas as pacientes, foram realizadas a partir dos blocos de parafina das biópsias percutâneas e dos espécimes cirúrgicos. Todas as lâminas foram feitas no laboratório de Patologia da Pós-graduação da UFCSPA, simultaneamente (biópsia percutânea e espécime cirúrgico), pelo mesmo técnico, para minimizar possíveis variações do método.

As peças foram desparafinizadas e reidratadas, utilizando seqüencialmente xilol, álcool etílico absoluto, a 70% e a 50% e água destilada, por cinco minutos cada banho, em temperatura ambiente. A recuperação antigênica foi realizada com imersão das lâminas em tampão Tris-EDTA pH 9,0, em banho-maria até 92OC por 30 minutos seguida de descanso de 20 minutos à temperatura ambiente. Para o bloqueio da peroxidase endógena utilizou-se solução de peróxido de hidrogênio (H2O2) a 5% em metanol, por 10 minutos, à temperatura ambiente. O bloqueio de reações inespecíficas foi feito com BSA a 1% por 30 minutos.

Para avaliação do receptor de estrogênio (RE) foi aplicado o anticorpo primário, clone 6F11 (Novocastra®, Newcastle upon Tyne, UK) na diluição 1/200. O controle positivo utilizado foi tecido mamário. Para o receptor de progesterona (RP), foi utilizado o clone 16 ( Novocastra®) na diluição 1/150. Para a detecção do antígeno Ki67, utilizou-se o clone MIB-1, Dakocytomation® (Dakocytomation, CA, USA), na diluição 1/200. A incubação com o anticorpo secundário biotinilado foi realizada por 40 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente foi realizada a revelação do substrato com cromógeno (DAB) e contra-corado com hematoxilina e desidratação. As lâminas foram montadas com Entellan® (Merck, Darmstadt, GER).

As lâminas foram rotuladas com dados do bloco de parafina do paciente e analisadas por 2 examinadores, num microscópio ótico duplo, diâmetro de campo de 20mm e realizada a digitalização das imagens. Para a avaliação dos RH e do Ki67 foram identificadas áreas de “hotsptos” tumorais. Para os casos considerados negativos, RH e Ki67 foram identificados em tecido mamário não tumoral quando presente, para controle interno. Avaliação imunoistoquímica da proteína Ki67 foi utilizada, também, para avaliar a adequabilidade do material em estudo.

Na avaliação dos resultados, aceitamos os critérios definidos pelo Breast International Group (BIG) que dividiu as células em três categorias de acordo com a coloração imunoistoquímica e a resposta ao tratamento hormonal adjuvante: ausência de coloração; baixa coloração (1 a 9% das células coradas) e elevada coloração (superior a 10% das células coradas).. Como os tumores com baixa coloração apresentam pouca ou nenhuma resposta a hormonioterapia e, em geral, são tidos como negativos, aceitamos como positivas as reações nos tecidos em que havia pelo menos 10% dos núcleos marcados ( Figuras 1-6).

8.2.3 Análise estatística

Considerando um nível de significância (α) de 5% e um poder de 20%, o tamanho mínimo de amostra estimado foi de 90 casos. O erro amostral assumido, de acordo com a variabilidade evidenciada na amostra, foi de 2,6%.

Testes estatísticos univariados foram utilizados inicialmente para comparar os resultados dos receptores hormonais a partir do espécime cirúrgico e da biópsia percutânea, através de análise descritiva com tabelas de freqüência simples e relativa, e análise exploratória, visando a um maior conhecimento da distribuição das quantitativas. Foram analisadas também as características clínicas e anátomo-patológicas através de tabelas de dupla entrada, visando à investigação das concordâncias entre a avaliação, através da biópsia percutânea e do espécime cirúrgico. A

comparação das discordâncias investigadas se deu pelo teste de McNemar, que busca comparação entre dados pareados.