MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
SECRETARIA DA EDUCAÇÃO MÉDIA E TECNOLÓGICA INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA
DO RIO GRANDE DO SUL – CAMPUS BENTO GONÇALVES CURSO SUPERIOR EM VITICULTURA E ENOLOGIA
BRUNO TERRES ONSI
AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE MICROBIOLÓGICA E QUALIDADE
SENSORIAL DO VINHO TINTO SECO COMUM
EM EMBALAGEM PET
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
SECRETARIA DA EDUCAÇÃO MÉDIA E TECNOLÓGICA INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA
DO RIO GRANDE DO SUL – CAMPUS BENTO GONÇALVES CURSO SUPERIOR EM VITICULTURA E ENOLOGIA
BRUNO TERRES ONSI
AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE MICROBIOLÓGICA E QUALIDADE
SENSORIAL DO VINHO TINTO SECO COMUM
EM EMBALAGEM PET
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio Grande do Sul – Campus Bento Gonçalves como requisito para conclusão do curso.
Professora Orientadora: Cristina Simões da Costa
RESUMO
A estabilidade microbiológica de vinhos engarrafados é resultado de vários cuidados que devem ser tomados desde o processo de sua elaboração até as condições de engarrafamento. O produto engarrafado deve manter sua qualidade até o momento em que for consumido, indiferentemente do tipo de embalagem em que foi armazenado. O envase em embalagens de polietileno tereftalato (PET), por se tratar de uma embalagem de menor custo e que oferece condições restritas de conservação ao produto, tem sido empregado no engarrafamento de vinhos de menor qualidade, evidenciando-se, freqüentemente, desenvolvimento microbiano no produto já envasado. Neste trabalho, buscou-se avaliar a estabilidade microbiológica de vinhos comercializados em garrafas PET. No mercado local, foram selecionadas sete marcas diferentes de vinhos envasados em garrafas PET, as quais foram armazenadas por 30 dias em condições similares ao armazenamento durante a comercialização. Após esse período, amostras foram submetidas a análises microbiológicas para detectar a presença de bactérias e leveduras viáveis e foram caracterizadas físico-química e sensorialmente. Nos vinhos analisados, foram encontradas tanto leveduras quanto bactérias, sendo que em quatro das marcas de vinho analisadas, estes microrganismos estavam presentes em concentrações elevadas. A alta concentração microbiológica destes vinhos afetou negativamente sua qualidade físico-química e sensorial. De um modo geral, pode-se concluir que a estabilidade microbiológica do vinho embalado em garrafas PET é baixa, comprometendo sua qualidade durante a comercialização.
ABSTRACT
Microbiological stability of envased wine depends on certain measures that should be taken since wine´s elaboration until envasing. Envased product must keep its quality until its consumed, nevertheless the packing material used. Polyethylene terephthalate (PET) bottles, since is a cheaper and have less conservative material, have been used to envase lower quality wine, in which, microbiological development during commercialization is usually observed. This work aimed to evaluate microbiological quality of wine envased in PET bottles. Seven different brands of wine commercialized in local market in PET bottles were analyzed. The samples were kept during 30 days, a period that simulates kept during commercialization and, then were submitted to microbiological analysis to determine the presence of viable cells of yeasts and bacterials, and to physico-chemical and sensorial characterization. Yeasts and bacterials were present in the samples of wine analyzed, been found in high concentration in four of the brands examined. The high microbiologic concentration of these wines affect negatively their physico-chemical and sensorial quality. In a general way, it can be concluded that microbiological stability of PET envased wine is poor, compromising its quality during commercialization.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO... 1 2 OBJETIVOS DO TRABALHO ... 2 2.1 Objetivos Gerais... 2 2.2 Objetivos Específicos ... 2 3.1 Embalagem PET ... 3 3.1.1 O PET e o Vinho... 43.2 Flora microbiana contaminante nos vinhos... 5
3.2.1 Contaminações por bactérias... 6
3.2.1.1 Bactérias Acéticas ... 6
3.2.1.1.1 Picado acético... 7
3.2.1.1.2 Oxidação das Hexoses... 8
3.2.1.1.3 Fermentação Acética do Álcool Etílico... 8
3.2.1.1.4 Significado da Acidez Volátil... 9
3.2.1.2 Bactérias Láticas ... 9
3.2.1.2.1 Picado lático... 10
3.2.1.2.2 Fermentação Manítica ou Agridoce... 11
3.2.1.2.3 Volta... 12
3.2.2 Contaminações por leveduras... 13
3.2.2.1 Flor ou Véu ... 13
3.2.2.4 Refermentação Indesejada ... 15
3.3 Conservantes... 16
3.3.1 Ácido Sórbico... 16
3.3.2 Dióxido de Enxofre... 17
3.4 Cultivo de bactérias e leveduras componentes da flora do vinho... 18
3.4.1 Cultivo de Bactérias Láticas e Acéticas... 18
3.4.1.1 Teste de Catalase... 18
3.4.1.2 Coloração de Gram... 19
3.4.2 Cultivo de mofos e leveduras... 20
4 MATERIAIS E MÉTODOS... 21 4.1 Meios de Cultura... 21 4.2 Amostragem... 21 4.3 Isolamento... 21 4.4 Análises Físico-Químicas ... 22 4.5. Avaliação Sensorial... 22 4.6. Análise Estatística ... 22 CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 33 REFERÊNCIAS ... 34
LISTA DE QUADROS
QUADRO 1...3 QUADRO 2...5 QUADRO 3...22 QUADRO 4...23 QUADRO 5...25 QUADRO 6...26 QUADRO 7...27 QUADRO 8...27 QUADRO 9...28 QUADRO 10...29 QUADRO 11...29 QUADRO 12...30 QUADRO 13...311 INTRODUÇÃO
A preocupação com a estabilização microbiológica do vinho após sua elaboração é crescente nos últimos anos. O surgimento de novas opções de embalagens no mercado, que permitem certo grau de oxigenação do produto, como o polietileno tereftalato (PET) e o “bag in box” , contribuem para essa situação.
Infelizmente, sabe-se que grande parte do vinho engarrafado no PET apresenta qualidade questionável, devido a vários fatores, tais como, o baixo custo do produto, a falta de cuidado na higiene durante o envase, e a incorporação de oxigênio que o material permite.
Neste trabalho, buscou-se avaliar a estabilidade microbiológica de vinhos comercializados em garrafas PET através da realização de análises microbiológicas, físico-químicas e análise sensorial.
2 OBJETIVOS DO TRABALHO
2.1 Objetivos Gerais
De modo geral, o presente trabalho tem como objetivo verificar a estabilidade microbiológica dos vinhos em embalagem PET, através da realização de análises microbiológicas, físico-químicas e análise sensorial de sete marcas diferentes.
2.2 Objetivos Específicos
- Visa-se o detalhamento das possíveis contaminações microbiológicas encontradas nos vinhos engarrafados em embalagens PET;
- Discriminar entre bactérias e leveduras;
- Relacionar a estabilidade microbiológica com as características físico-químicas e sensoriais dos vinhos.
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Embalagem PET
Em 1941, foi elaborada a primeira amostra de politereftalato de etileno, polímero termoplástico, originalmente desenvolvido por dois químicos ingleses, Whinfield e Dickson. A produção em larga escala surgiu após a Segunda Guerra Mundial, na década de 50, em laboratórios da Europa e Estada Unidos. Inicialmente, sua principal aplicação era no setor têxtil (ABIPET, 2010).
O PET chegou ao Brasil em 1988, sendo utilizado primeiramente na área têxtil, e, somente em 1993 passou a ter forte expressão no mercado de embalagens – principalmente nos refrigerantes. Foi neste momento também, que a embalagem começou a ser utilizada para vinhos. Segundo a Associação Brasileira da Indústria do PET, o consumo de embalagens subiu de 80.000 toneladas em 1994 para 462.000 toneladas em 2008 (ABIPET, 2010).
No quadro 1, é apresentado o demonstrativo do consumo para as embalagens PET.
Ano Consumo para Embalagens
1994 80.000 1995 120.000 1996 150.000 1997 185.700 1998 223.600 1999 244.800 2000 255.100 2001 270.000 2002 300.000 2003 330.000 2004 360.000 2005 374.000 2006 378.000 2007 432.000 2008 462.000
Quadro 1. Quantidade, em toneladas, de embalagens PET consumidas no Brasil (Fonte:ABIPET).
manuseio, com alta resistência a impactos, assim, gerando pouca perda ou quebra no produto, contrariamente ao que ocorre com as embalagens de vidro. A embalagem também oferece facilidades para seu transporte, pois pode ser disposta em fardos de até oito garrafas, graças ao baixo peso da embalagem. A garrafa pode ser adquirida por um baixo custo, além de dispor de vários fornecedores no mercado e ser descartável (ENGARRAFADOR MODERNO, 2006).
3.1.1 O PET e o Vinho
Apesar das vantagens já citadas do PET, esta embalagem confere ao produto uma imagem depreciativa, de baixa qualidade quando utilizada no engarrafamento de vinho. Para o uso de PET em refrigerantes, a embalagem requer uma maior carbonatação, devido às perdas de gás carbônico pelas paredes do recipiente. Tal dado é convergente com a alteração veloz que o vinho sofre dentro da embalagem PET, devido à permeabilidade do plástico, o produto sofre oxigenações e oxidações durante seu tempo de estocagem, assim apresentando características de alterações para o consumidor (ENGARRAFADOR MODERNO, 2006).
A oxigenação do produto acontece através das paredes da embalagem, e também pode ocorre através da tampa, se a mesma não for de boa qualidade, pois se faz necessário manter o produto hermeticamente fechado. Com a oxigenação que a embalagem permite em um curto período de tempo, o principal conservante do produto, dióxido de enxofre, sofre rápida oxidação e consequentemente, perde sua ação antimicrobiana e antioxidativa (ENGARRAFADOR MODERNO, 2006).
As alterações de sabor nos produtos acondicionados em PET também podem ser atribuídas ao material plástico da tampa e à presença do composto acetaldeído, que é gerado durante o processo de fabricação das embalagens (ENGARRAFADOR MODERNO, 2006). O acetaldeído, assim como o oxigênio, pode combinar com o dióxido de enxofre, inativando-o. Possivelmente, mais uma explicação para a rápida degradação do conservante na embalagem PET.
O vinho sofre grandes riscos com a oxigenação, podendo ocorrer manifestações microbiológicas graves, principalmente em vinhos suaves, onde a presença de oxigênio juntamente com o baixo teor de SO2 livre e alta concentração de açúcar, propicia um ambiente favorável para uma refermentação (PARONETTO, 1977).
Os vinhos secos também estão aptos aos ataques microbianos, onde a manifestação de leveduras e bactérias pode causar o avinagramento do produto, dentre outras alterações (BOULTON, 1996).
3.2 Flora microbiana contaminante nos vinhos
Para Oreglia (1978), o vinho é um sistema polifásico de substâncias, algumas das quais pré-existentes no mosto, e outras que decorrem das transformações que o mosto sofre durante a fermentação alcoólica e outras fermentações paralelas. No transcorrer da fermentação, alguns componentes do mosto desaparecem totalmente, parcialmente, ou permanecem inalterados, e outros aumentam sua concentração em decorrência da maceração das partes sólidas da uva com o mosto.
A flora microbiana do vinho sofre influência da sua composição, os constituintes do vinho são divididos em voláteis e não voláteis (fixos), dentre aqueles, encontram-se a água (constituinte mais abundante do vinho), alcoóis (etílico, metílico e superiores), ácido acético, ésteres voláteis e aldeídos. As substâncias fixas são todos os ácidos (exceto ácido acético) e seus sais, glicerina, butanodiol, substâncias nitrogenadas, polifenóis, substâncias pécticas, minerais e sacarídeos (OREGLIA, 1978).
No quadro 2 são apresentados os principais compostos do mosto e do vinho, assim como suas concentrações.
Componente Mostos Vinhos
Água 700 – 850 750 – 900 Sacarídeos 140 – 250 0,1 – 2 Polissacarídeos 3 – 5 2 – 4 Alcoois - 69 – 121 Ácidos Orgânicos 9 – 27 3 – 20 Polifenóis 0,5 2 – 6 Compostos Nitrogenados 4 – 7 3 – 6 Minerais 0,8 – 2,8 0,6 – 2,5 Vitaminas 0,25 – 0,8 0,2 – 0,7
Quadro 2. Composição do Mosto e do Vinho (em gramas por litro). Fonte: FLANZY (2003).
para que certo microorganismo desenvolva-se no vinho, dentre estes fatores encontram-se o pH, a temperatura, concentração de dióxido de enxofre, higienização da cantina, cuidado com as trasfegas e demais operações.
Dentre os microrganismos que podem ser encontrados nos vinhos que apresentam importância tecnológica, destacam-se as bactérias e os fungos.
3.2.1 Contaminações por bactérias
Para Paronetto (1977) as bactérias que se manifestam no vinho são genericamente classificadas em dois grupos: láticas e acéticas. Ambas podem ser industrialmente úteis, assim como podem ser danosas.
Bactérias acéticas são consideradas absolutamente prejudiciais na elaboração de qualquer vinho, mas muito útil na indústria de vinagre. Já as bactérias láticas, ao contrário, podem ser úteis ou prejudiciais para o vinho, podendo ajudar nos casos de vinhos muito ácidos, através da fermentação malolática, assim como podem causar várias doenças, como uma fermentação malolática indesejada, volta, amargor e agridoce (PARONETTO, 1977).
3.2.1.1 Bactérias Acéticas
As bactérias que causam a transformação de álcool etílico em ácido acético são essencialmente as do gênero Gluconobacter e Acetobacter, ambas pertencem à família Acetobacteraceae, segundo a classificação do Manual de Bergey (ZOECKLEIN, 2001).
Segundo Delfini (1995), o gênero Acetobacter apresenta-se em forma elipsóide ou bastonete, reto ou ligeiramente curvado, em cadeias, emparelhados ou sozinhos, móveis, podendo ser peritríquias (flagelos ao redor de toda a célula), ou imóveis. Apresentam comportamento gram-negativo, e possuem enzima catalase (peróxido de hidrogênio redutase). Estas bactérias são capazes de contaminar mostos, uvas e os vinhos, oxidando o etanol em ácido acético.
O gênero Gluconobacter apresenta forma elipsóide ou bastonete, em células sozinhas, emparelhadas ou em cadeias. Geralmente aparecem com três a oito flagelos polares, raramente, com apenas um flagelo ou não-móveis. São aeróbias obrigatórias, gram-negativas, não formadoras de esporos e também possuem enzima catalase (FLANZY, 2003; SILVA et
al, 2007).
Do ponto de vista morfológico, não é um trabalho fácil diferenciar bactérias acéticas de bactérias láticas na mesma amostra. Uma importante ferramenta de reconhecimento é a mobilidade da célula, quando existente, e o tipo de distribuição dos cílios ao redor da célula. Bactérias acéticas podem facilmente ser diferenciadas através do processo de coloração de gram, de modo que as bactérias acéticas são gram-negativas, e as láticas, positivas (PARONETTO, 1977).
As bactérias acéticas, sendo aeróbias obrigatórias, precisam de grandes quantidades de oxigênio para seu desenvolvimento. A reação se dá quando o etanol é oxidado em ácido acético e água, segundo a reação abaixo:
C2H5OH + O2 → CH3 - COOH + H2O
Os teores de oxigênio para que tal reação aconteça são notáveis, para cada 0,5 g.L-1 de ácido acético formado, são necessários 6 L de ar, o que obriga a bactéria acética a desenvolver-se apenas na superfície do vinho. Portanto, recipientes, embalagens, garrafas e tanques de vedação não hermética estão sujeitos à esta manifestação. Felizmente, as bactérias acéticas são sensíveis ao dióxido de enxofre, que com eficácia, bloqueia o crescimento bacteriano (DELFINI, 1995).
Embora o resultado final do metabolismo destas bactérias resulte em ácido acético, suas formas de manifestação e suas vias metabólicas são notavelmente distintas.
3.2.1.1.1 Picado acético
Na fase inicial de avinagramento, ou seja, quando houver a produção pelas bactérias acéticas de cerca de 1 g.L-1 de ácido acético, trata-se de um picado acético, sendo que a acidez volátil de um vinho seco, são e recém fermentado pode ficar entre 0,2 - 0,4 g.L-1 de ácido acético. Também importantes, quantidades superiores a 200 mg.L-1 de acetato de etila conferem ao vinho um caráter de avinagramento (PARONETTO, 1977). Esta reação acontece preferencialmente em presença de pequenas quantidades de oxigênio (ZOECKLEIN, 2001).
As condições que favorecem o picado acético podem aparecer em várias situações, podendo ser proveniente de uvas com podridão, neste caso, devem-se usar doses que variam de 75-100 mg.L-1 de dióxido de enxofre no mosto (EDER, 2006). O crescimento excessivo de bactérias acéticas na uva pode causar uma modificação na composição do mosto, alterando o crescimento das leveduras na fermentação alcoólica e prejudicando a progressão da
fermentação malolática (FLANZY, 2003).
Diagnosticado em tempo, pode-se tentar intervir sobre este problema, realizando-se cortes com outros vinhos com pouca acidez volátil, e também, uma refermentação, que demonstra ser eficaz, embora seja de difícil aplicação em uma cantina, se o problema de contaminação não for devidamente tratado (PARONETTO, 1997).
Segundo Flanzy (2003), devido ao fato das bactérias acéticas serem aeróbias estritas, seu crescimento somente acontece se o meio sofrer oxigenação, sendo assim, é suficiente um breve momento de aeração para que as bactérias atinjam a população de 102 a 10 3 bactérias vivas por ml.
A frequente análise sensorial e determinação da acidez volátil ajudam a conservar o vinho, podendo assim prevenir tais consequências. De qualquer modo, a acidez volátil pode ser um indicativo de outras alterações graves ou simplesmente de um fenômeno normal, como uma fermentação malolática (DELFINI, 1995).
3.2.1.1.2 Oxidação das Hexoses
Gluconobacter (aeróbio estrito) utiliza em parte hexoses do vinho e do mosto, oxidando-as em seus correspondentes ácidos cetônicos em presença de oxigênio, por exemplo, a partir da glicose, é formado o ácido glucônico. A determinação de ácido glucônico pode ser importante para o diagnóstico de alterações microbianas (DELFINI, 1995).
O ácido glucônico está presente em mostos de uvas botritizadas, ou mostos atacados por Gluconobacter ou Schizosaccharomyces. A manifestação de Gluconobacter é facilitada em uvas atacadas por Botrytis Cinerea e com podridão ácida (DELFINI, 1995).
3.2.1.1.3 Fermentação Acética do Álcool Etílico
Na presença de oxigênio, Acetobacter oxida o álcool etílico em ácido acético através da reação:
2CH3- CH2OH + O2álcooldesidrogenase → 2CH3- CHO + H2O etanol acetaldeído 2CH3- CHO + O2 aldeidodesidrogenase → 2CH3- COOH acetaldeído ácido acético
Algumas espécies de Acetobacter podem continuar a oxidação do ácido acético em anidrido carbônico e água, assim como acontece com o ácido lático. Esta diferença metabólica ajuda a diferenciar Acetobacter de Schizosaccharomyces, que não pode realizar esta última oxidação (DELFINI, 1995).
3.2.1.1.4 Significado da Acidez Volátil
A acidez volátil que se forma durante uma fermentação normal é composta quase que exclusivamente de ácido acético, único ácido volátil destilado por arraste de vapor (a não ser uma pequena fração de ácido lático). No entanto, os resultados de uma ação bacteriana resultam em mais ácidos voláteis, como o fórmico, propiônico e butírico (DELFINI, 1995).
No início da fermentação malolática, também existe produção de ácido acético, principalmente se no meio houver ácido cítrico, açúcar residual e bactérias láticas heterofermentativas.
Segundo Delfini (1995), a acidez volátil identificada sensorialmente, é muitas vezes devida à presença de acetato de etila, um éster com odor semelhante ao do ácido acético. O aroma deste éster mascara o do ácido acético, que é menos volátil e possui um limiar olfativo mais alto que o acetato de etila (cerca de 50 mg.L-1).Os fatores que influenciam a formação de ésteres de acetato são a estirpe de levedura, a temperatura de fermentação e a concentração de dióxido de enxofre.
As bactérias acéticas formam este éster principalmente no momento inicial do avinagramento, mas no decorrer do processo, o mesmo é metabolizado. Por isso o vinagre não apresenta forte cheiro de acetato de etila (PARONETTO, 1977).
3.2.1.2 Bactérias Láticas
As bactérias láticas presentes no vinho pertencem aos gêneros Lactobacillus, Leuconostoc, Oenococcus e Pediococcus. Todas são gram-positivas, imóveis, não formadoras de esporos e catalase negativa, em sua maioria. A principal característica das bactérias láticas consiste na fermentação de carboidratos com produção de ácido lático (SILVA et al., 2007).
Primeiramente, devem-se distinguir bactérias láticas homofermentativas de heterofermentativas. Nas homofermentativas as hexoses seguem a via da glicólise até ácido
pirúvico, que é reduzido em ácido lático, através da laticodesidrogenase. Nas heterofermentativas, a degradação das hexoses, segundo Delfini (1995), é como a via das pentoses, formando ácido lático, acético, succínico, álcool etílico, glicerina, 2,3-butanodiol e anidrido carbônico.
Dentre os cocos, as bactérias do gênero Pediococcus são homofermentativas e as do gênero Leuconostoc e Oenococcus são heterofermentativas. Os lactobacilos podem apresentar os dois comportamentos podendo ser divididos em três grupos, homofermentativas estritas (nunca identificadas no vinho), heterofermentativas facultativas, heterofermentativas estritas (FLANZY, 2003).
Os lactobacilos homofermentativos estritos não fermentam pentoses, e formam duas moléculas de ácido lático a partir de uma de glicose, as heterofermentativas facultativas partem de uma molécula de glicose, que resulta em duas moléculas de ácido lático, mas as pentoses são fermentadas em ácido lático e acético, já as heterofermentativas estritas fermentam a glicose em CO2, ácido lático, acético álcool etílico, e as pentoses, em ácido lático e acético (RIBÉREAU-GAYON, 2003).
O pH limitante da atividade metabólica de bactérias láticas pode variar entre espécies, além de sofrer interferência de outros fatores, como a temperatura e dióxido de enxofre (DELFINI, 1995).
Assim como bactérias acéticas, as láticas também podem provocar uma série de doenças e defeitos no vinho.
3.2.1.2.1 Picado lático
O ataque de grandes quantidades de hexoses no mosto e no vinho, com alta produção de ácido lático (cerca de 4 g.L-1) e ácido acético, causa a alteração chamada picado lático, o que significa um odor intenso de fermentação lática, ainda mais se acompanhada de formação de diacetil e avinagramento (DELFINI, 1995).
O gênero Leuconostoc apresenta metabolismo heterofermentativo, enquanto Pediococcus é homofermentativo. Particularmente, são mais temidas as bactérias do gênero Pediococcus, pois além de liberar odores desagradáveis, produz histamina, uma amina biogênica, substância prejudicial (RIBÉREAU-GAYON, 2003).
De modo geral, é possível dizer que mesmo o ácido málico e o cítrico são atacados a um pH em torno de 3,2 e também em pH mais elevado, em torno do 4,0 – 4, 5, já o ácido
tartárico é atacado em pH acima de 3,5. Segundo Zoecklein (2001), após o pH, o segundo fator importante para o desenvolvimento de baterias láticas é a temperatura, sob uma temperatura de 10oC, ocorre um desenvolvimento lento, mas em torno de 20oC atinge sua temperatura ótima para propagação.
O picado lático, em estado avançado, não apenas causa um aumento da acidez volátil, como aumento da acidez fixa, assim baixando o pH do vinho. Porém, no início, é constatado um aumento no pH, devido à rápida degradação do ácido málico e, eventualmente, do cítrico (DELFINI, 1995).
A degradação de grandes quantidades de açúcares, acarreta um considerável aumento na acidez fixa e volátil do vinho, esta alteração é detectada pela presença de D(-)lactato. Porém outras substâncias são produzidas, como etanol, ácido acético e CO2. A fermentação malolática em presença de açúcares é peculiar, pois ocorre normalmente após ou no término da fermentação alcoólica. Depois de realizada a fermentação do ácido málico, é indispensável a sulfitação do vinho (FLANZY, 2003).
3.2.1.2.2 Fermentação Manítica ou Agridoce
Uma alteração decorrente da fermentação do açúcar, principalmente frutose. Se o teor de açúcar residual do vinho for superior a 10g.L-1, pode haver formação de manitol, por isso o nome de agridoce (PARONETTO, 1977).
Segundo Delfini (1995), quando uma pequena quantidade de açúcar é atacada por bactérias homofermentativas não existem graves mudanças organolépticas no vinho, mas se o vinho for atacado por bactérias heterofermentativas, pode acarretar um notável aumento da acidez volátil. Isto é devido ao fato das bactérias homofermentativas atacarem a glicose e a frutose via glicólise, produzindo exclusivamente ácido lático, enquanto que as heterofermentativas seguem a via das pentoses, com a formação de ácido lático, acético, 2,3-butanodiol, glicerina e álcool etílico.
Segundo Delfini (1995), dificilmente pode-se afirmar o desenvolvimento de certa bactéria, pois as mesmas que podem realizar uma fermentação malolática, podem fermentar açúcares e outros ácidos, dependendo das condições do meio, como citado anteriormente. A formação de manitol pode ocorrer concomitantemente à fermentação malolática, ou logo depois, quando o pH atinge valores perto de 3,5.
3.2.1.2.3 Volta
Algumas espécies de bactérias láticas são capazes de metabolizar o ácido tartárico através de duas vias enzimáticas, na primeira ocorre a deterioração do ácido tartárico em ácido oxalacético, e o mesmo em ácido pirúvico, e após a sua descarboxilação, resulta em ácido acético e lático. A segunda via consiste na formação de ácido succínico e acético através do ciclo de Krebs (DELFINI, 1995).
Primeira via:
Ác. Tartárico → Ác. Oxalacético → Ác. Pirúvico → Ác. Lático e Acético
Segunda Via:
a) Ác. Tartárico → Ác. Oxalacético → Ác. Málico → Ác. Fumárico → Ác. Succínico b) Ác. Pirúvico → Ác. Acético
Teoricamente a volta ocorre quando apenas o ácido tartárico é degradado, mas, na realidade, são decompostos vários compostos do vinho, como o ácido pirúvico, cítrico e a glicerina, porém, o primeiro composto a ser atacado no vinho, é o açúcar, favorecendo a multiplicação celular das bactérias (DELFINI, 1995).
Esta alteração dificilmente ocorre em vinhos ricos em ácido málico, havendo geralmente um pH mais baixo. Quando o ácido tartárico é atacado, ocorreria uma notável alteração de pH, se não ocorresse concomitantemente à formação de ácido lático e acético (BOULTON, 1996).
Segundo Delfini (1995), um vinho que apresenta volta tem o pH superior à 4,0; para Ribéreau-Gayon et al. (2003) ocorre em vinhos de pH alto (3,65 – 3,9) e pouco sulfitados, sendo mais favorável a lactobacilos do que cocos.
Para outros autores, o ácido tartárico não é metabolizado por bactérias do vinho, mas sua degradação pode ocorrer depois que demais ácidos (málico, pirúvico e cítrico) tenham sido atacados. Tal degradação somente é realizada por um pequeno número de bactérias pertencentes ao gênero Lactobacillus (ZOECKLEIN, 2001).
3.2.1.2.4 Amargor
O gosto amargo, característico do amargor, é decorrente da combinação da acroleína (aldeído amargo subproduto do ataque à glicerina) com antocianos, por isso, este defeito é mais pronunciado em vinhos tintos do que em brancos (FLANZY, 2003; ZOECKLEIN, 2001). Somente 1% de Oenococcus oeni, 12% de Pediococcus parvulus e 31% de Lactobaccilus são capazes de fermentar o glicerol (FLANZY, 2003).
O pH é um dos fatores limitantes para esta enfermidade, o ácido tartárico somente é atacado quando o pH atingir valores maiores de que 3,5 e o vinho estiver sob temperaturas superiores à 25oC, embora as bactérias apresentem alta sensibilidade ao álcool etílico e dióxido de enxofre (SUÁREZ, 1990).
3.2.2 Contaminações por leveduras
Grande maioria das leveduras tem forma oval ou elipsóide, apresentam, geralmente, reprodução assexuada, podendo certas espécies reproduzirem-se sexuadamente. As leveduras que não apresentam ascosporos são denominadas imperfeitas, por exemplo, Brettanomyces, mas também podem apresentar células idênticas, porém com formação de ascosporos, então, passam a ser denominadas de Dekkera (DELFINI, 1995).
Segundo Delfini (1995), as alterações provocadas no vinho pela contaminação de leveduras são divididas em flor, refermentação indesejada e produção de ácido sulfídrico.
3.2.2.1 Flor ou Véu
Segundo Oreglia (1978), esta é uma enfermidade que pode ocorrer durante qualquer época do ano, após momentos em que o vinho esteve em contato com o ar e esteve sob temperaturas que variam de 2oC – 34oC.
A flor (ou véu) num primeiro momento caracteriza-se como uma fina camada delgada, ligeiramente cinza, lisa ou pregueada que, com o passar do tempo, tende a ficar espessa enrugada, podendo flocular e precipitar (SUÁREZ, 1990).
A alteração pode ser causada por várias espécies de leveduras, também chamadas de leveduras formadoras de véu. Tais leveduras incluem cepas de Saccharomyces, e outras
espécies nativas da uva, como Pichia, Candida, Hansenula e Metshnikowia que podem sobreviver à fase fermentativa. Também existem espécies de Brettanomyces e sua forma esporulante Dekkera; juntamente com Kloeckera e Hanseniaspora que apesar de serem formadoras de véu, também apresentam caráter altamente fermentativo. Espécies de Kloeckera podem efetivar a fermentação alcoólica até teores altos de etanol. A multiplicação ocorre na superfície, onde existe contato com o ar, formando um véu que, no decorrer do seu espessamento, precipita-se para o fundo do recipiente (DELFINI, 1995; ZOECKLEIN, 2001).
Em condições oxidativas, o etanol, assim como o glicerol e outros ácidos orgânicos (principalmente o malato) servem como substrato para a formação de acetaldeído, ácido acético e acetato de etila (DELFINI, 1995), o açúcar residual também é um dos compostos atacados. As alterações em si não são graves, e no decorrer do tempo, não causam grandes problemas na qualidade do vinho, mas se não controlada, predispõe o vinho a um pico de produção de ácido acético (PARONETTO, 1977).
Uma vez começada a formação do véu, o uso de dióxido de enxofre parece não ser mais efetivo no controle de seu crescimento. Zoecklein (2001) observa que leveduras nativas da espécie Pichia são resistentes ao uso de SO2 molecular livre em mais de 3 mg.L-1, dependendo do pH, isto corresponde à adições totais de 75 m g.L-1 de SO2 (pH 3,2) e 273 m g.L-1 (pH 3,8).
Costumava-se considerar que Brettanomyces/Dekkera era o principal problema para vinhos tintos, mas também foi constatada sua presença em vinhos brancos e também nos famosos vinhos espumantes alemães cuveés (ZOECKLEIN, 2001). Esta levedura é de difícil controle, pois sua presença passa despercebida, até que o vinho esteja totalmente afetado. A formação do fenol volátil, 4-etil-fenol, é um indicador inquestionável de presença de Brettanomyces. Nenhuma espécie de bactéria acética, ou outros gêneros e espécies de leveduras são capazes de formarem tal composto (DELFINI, 1995). Os fenóis voláteis são produzidos a partir dos ácidos cumárico e ferúlico, presentes na uva.
Leveduras do tipo Kloeckera e Hanseniaspora desenvolvem-se em abundância durante as primeiras etapas da fermentação alcoólica, e tendem a serem dominantes em mostos não sulfitados. Observou-se que K. apiculata desenvolve-se em doses de até 150 mg.L-1 de SO
2. Tanto Kloeckera como Hanseniaspora podem produzir quantidades relevantes de ácido acético e acetato de etila (ZOECKLEIN, 2001).
A alteração é favorecida por vinhos com baixa graduação alcoólica, riqueza em compostos nitrogenados, podendo desenvolver-se até em vinhos com 15% de etanol em presença de açúcar residual. Os vinhos com alta graduação alcoólica (superior à 15oGL), pH
de baixo valor, juntamente de doses efetivas de SO2 dificultam o processo, embora os agentes de alteração não apresentem sensibilidade ao dióxido de enxofre, e possam se desenvolver em meios com pH acima de 3 (OREGLIA, 1978).
Geralmente os vinhos atacados sofrem uma diminuição da acidez fixa, assim como do teor alcoólico. Para evitar tais problemas, necessita-se de uma conservação hermeticamente fechada da pipa ou tanque, ao abrigo do ar, preferencialmente utilizando gases inertes, como gás carbônico (CO2) ou nitrogênio (N2) para preencher o volume desocupado do tanque e a presença de 30 mg.L-1de SO2 livre incorporado ao vinho. Deve-se evitar totalmente o engarrafamento a quente (FLANZY, 2003). Uma pasteurização ou uma filtração esterilizante do vinho são as maneiras mais completas de eliminar o desenvolvimento e a presença dos microorganismos (SUÁREZ, 1990).
De acordo com Suárez (1990) todas as espécies de leveduras formadoras de véu são capazes de desenvolverem-se em um vinho com no máximo 13 % de álcool, algumas crescem sob baixas temperaturas (10 – 12oC) e em sua grande maioria, não possuem poder fermentativo.
3.2.2.4 Refermentação Indesejada
Para Paronetto (1977), a refermentação é combatida em todos os tipos de vinho, principalmente os prontos para o consumo e engarrafados, pois devido à multiplicação celular das leveduras da refermentação, pode ocorrer uma turvação, que pode causar uma grave depreciação comercial do produto.
A refermentação depende de vários fatores, como a presença de leveduras com alta capacidade fermentativa e alta tolerância ao álcool, como apresenta Saccharomyces bayanus e a Zygosaccharomyces bailii (PARONETTO, 1977).
Muitas espécies de Zygosaccharomyces podem fermentar completamente o mosto, e cepas de Zygosaccharomyces fermentati, possuem grande velocidade de fermentação. Felizmente, as cepas de Zygosaccharomyces bailii, espécie contaminante mais importante, ocorre com menos freqüência, pois assimila mais facilmente a frutose do que a glicose, como a maioria das outras leveduras que fermentam o mosto de uva (OREGLIA, 1978).
Um alto teor alcoólico exerce uma ação antifermentativa bastante enérgica, principalmente se aliado a uma conservação à baixa temperatura e a alto teor de açúcar residual. Considerando os teores de álcool e de açúcar residual, pode-se fazer um cálculo
aproximado para a não-fermentabilidade do produto, através do Cálculo da unidade “Dellé” (U.D.), que avalia o efeito antibiótico sinérgico da concentração do açúcar e do álcool, embora não seja um coeficiente absoluto. Segundo “Dellé”, o vinho é considerado instável biologicamente se não atingir ao menos 80 U.D. O índice é calculado pela fórmula: Açúcar % + Álcool % x 4,5 (DELFINI, 1995).
Além do teor alcoólico elevado e altas quantidades de açúcar residual, existem outras substâncias como o ácido ascórbico, ácido sórbico e dióxido de enxofre que ajudam a controlar a atividade destas leveduras.
Já a levedura Zygosaccharomyces bailii apresenta alta resistência a doses de 3 mg.L-1 de SO2 molecular, 800 mg.L-1 de ácido sórbico e 1000 mg.L-1 de ácido benzóico. Tal levedura também sobrevive a níveis baixos de pH, em torno de 2,0 e concentrações elevadas de álcool etílico, cerca de 15% (DELFINI, 1995).
3.3 Conservantes
Para se obter a estabilidade microbiológica são empregados aditivos, como ácido ascórbico, ácido sórbico, benzoato de sódio e dióxido de enxofre.
3.3.1 Ácido Sórbico
Seu efeito consiste na ação fungistática, porém não antibacteriana, por isso deve ser usado juntamente com SO2. Demonstra ser um conservante inofensivo à saúde humana, pois no interior das células humanas é metabolizado em ácido capróico, ácido graxo normalmente encontrado no corpo humano, porém, segundo alguns pesquisadores, o seu uso pode causar efeitos mutagênicos em determinadas concentrações (DELFINI, 1995).
Sua dose de emprego no vinho varia de 100-200 mg.L-1 juntamente com um teor de 30-40 mg.L-1 de SO2. Sobretudo, é mais utilizado em vinhos doces, para evitar uma refermentação, mas de acordo com Delfini (1995) a levedura Zygosaccharomyces bailii possui uma menor sensibilidade ao ácido sórbico, doses superiores a 400 mg.L-1 não são suficientemente eficazes para seu controle. Embora o ácido sórbico exerça ação sobre Saccharomyces, apresenta pouca efetividade sobre Brettanomyces/Dekkera e Zygosaccharomyces sp. (ZOECKLEIN, 2001).
O ácido sórbico não demonstra ação inibitória sobre bactérias acéticas e láticas, e ainda pode ser utilizado como substrato para produzir o famoso composto volátil denominado gerânio. Por isso, o ácido sórbico deve ser usado em combinação com adições de SO2 quando o vinho for engarrafado, para prevenir posteriores ataques bacterianos (ZOECKLEIN, 2001).
Para Delfini (1995) a sensibilidade das leveduras ao ácido sórbico depende da concentração de SO2 no meio, a força iônica do meio, teor alcoólico e pH. Teores mais altos de etanol aumentam o poder fungistático. A forma ativa de ácido sórbico é a sua molécula dissociada, que em pH 3 atinge o valor de 98 %, e em pH 5 é perto de 37%.
Segundo a Resolução CNS/MS de número 04, que data do dia 24 de novembro de 1988, o limite máximo para o uso de ácido sórbico é de 200 mg.L-1 (MAPA, 2010).
3.3.2 Dióxido de Enxofre
O SO2 é um dos anti-sépticos mais utilizados na enologia, exercendo forte influência na estabilidade microbiológica do produto. A ação anti-séptica do dióxido de enxofre consiste na fração molecular, e não na livre. Somente a fração completamente dissociada SO3- (íon sulfito) possui ação antibacteriana. A ação inibidora não é considerada proporcional ao teor de SO2 livre, mas sim à fração molecular (DELFINI, 1995).
Para Delfini (1995), obter a estabilidade microbiológica de um vinho depende da interação dentre seis parâmetros: teor de SO2 livre do vinho; pH do vinho; temperatura do vinho; quantidade de SO2 molecular no meio; graduação alcoólica; teor de SO2 molecular suficiente para exercer efeito inibitório sobre um microorganismo.
Para Zoecklein (2001), em geral, uma concentração de SO2 molecular superior à 0,8 mg.L-1 é suficiente para prevenir o crescimento de bactérias no vinho, assim como 50 mg.L-1 de SO2 total podem inibir bactérias láticas.
No Brasil, o uso de dióxido de enxofre tem o valor limite em 350 mg.L-1, segundo a Resolução CNS/MS de número 04, que data do dia 24 de novembro de 1988 (MAPA, 2010).
3.4 Cultivo de bactérias e leveduras componentes da flora do vinho
3.4.1 Cultivo de Bactérias Láticas e Acéticas
Os meios de isolamento são seletivos e diferenciais, suprindo as exigências da cultura a ser desenvolvida e distinguindo o alvo das demais manifestações.
As exigências nutricionais das bactérias láticas são complexas, grande parte dependendo da presença de vitaminas, carboidratos e outros fatores que auxiliam seu crescimento. Podem-se adicionar componentes estimuladores para o crescimento, como acetato e tween 80 (agente tensoativo) (DELFINI, 1995).
Os meios de cultura utilizados são especialmente formulados para garantir o crescimento das espécies mais exigentes. A incubação normalmente é feita em condições microaerófilas, para favorecer as espécies mais sensíveis ao oxigênio.
Dois métodos podem ser utilizados para a análise, o plaqueamento ou a técnica do Número Mais Provável (NMP), com uma grande variação dentre os meios de cultura.
Quando a técnica de plaqueamento é utilizada, o meio de cultura mais empregado é o ágar MRS. Esse meio de cultura foi desenvolvido por Man, Rogosa e Sharpe (1960) com a finalidade de facilitar o desenvolvimento de bactérias láticas, também ocorrendo a manifestação de outros microorganismos, como bactérias acéticas. O meio permite um bom crescimento de Leuconostoc e Pediococcus (DELFINI, 1995). As bactérias acéticas por também serem acidófilas e tolerantes a valores baixos de pH, também desenvolvem-se neste meio de cultura (RIBÉREAU-GAYON,2003).
Como tanto bactérias lácticas quanto acéticas podem apresentar crescimento no agar MRS, realizam-se dois testes para discriminá-las.
3.4.1.1 Teste de Catalase
O teste de catalase objetiva verificar se a bactéria é capaz de produzir a enzima catalase, responsável pela decomposição do peróxido de hidrogênio (H2O2). O peróxido é um metabólico formado durante a utilização aeróbia de carboidratos, é tóxico e pode provocar a morte das células se não for decomposto rapidamente (SILVA et al, 2007).
A decomposição ocorre através da ação de enzimas classificadas como hidroperoxidases, que incluem a peroxidase e a catalase (peróxido de hidrogênio redutase). Grande parte das bactérias aeróbias e anaeróbias facultativas que contêm citocromo (proteína que pode ser encontrada na membrana interior das mitocôndrias e no retículo endoplasmático de eucariontes, nos cloroplastos de plantas, em microorganismos fotossintéticos e em bactérias) também apresenta catalase (SILVA et al, 2007).
A maioria das bactérias anaeróbias, como Clostridium sp, por exemplo, possuem peroxidase em lugar de catalase. As bactérias que não apresentam catalase ou peroxidase não são capazes de decompor o peróxido de hidrogênio, tendo o crescimento inibido pelo acúmulo deste produto de seu próprio metabolismo.
As bactérias láticas que atacam o vinho não apresentam ação catalase positiva, já as bactérias acéticas são dotadas da enzima catalase, assim decompondo o peróxido de hidrogênio. As leveduras também apresentam comportamento positivo (SILVA et al, 2007).
3.4.1.2 Coloração de Gram
A coloração de gram tem por objetivo diferenciar as bactérias lácticas (Gram positivas) das bactérias acéticas (gram negativas). Entretanto não é uma análise conclusiva, pois podem existir outros tipos de bactérias, que não sejam láticas e acéticas.
A diferença apresentada pelas bactérias gram positivas e negativas deve-se às variações entre a estrutura e a composição da parede celular. A parede celular das bactérias Gram negativas é mais complexa e estreita, pois apresentam uma membrana externa que recobre a fina camada de peptídeoglicano.
A membrana externa é composta de fosfolipídeos, lipoproteínas e lipopolissacarídeos, este último, exclusivamente localizado na membrana externa. Devido à fina camada de peptídeoglicanos, a célula permite a penetração de álcool que dissolve o complexo violeta de genciana-iodo que se forma, deixando a célula incolor, que será então recolorida em vermelho pela safranina.
Bactérias Gram positivas possuem uma quantidade grande de peptidoglicano e uma concentração fraca de lipídios. A parede celular é composta de proteínas, peptídeoglicanos e ácidos teicóicos. A espessa parede de peptídeoglicano e a desidratação produzida pelo álcool não permite a penetração do álcool na célula que preserva a coloração violeta ou azul escuro do complexo violeta de genciana-iodo (DELFINI, 1995).
A coloração deve ser efetuada em colônias jovens, dentro do seu período exponencial de desenvolvimento (DELFINI, 1995).
3.4.2 Cultivo de mofos e leveduras
Os bolores e leveduras fazem parte de um grande grupo de microorganismos, a maioria é originária do solo e do ar. Os bolores são extremamente versáteis, grande parte das espécies são capazes de utilizar qualquer fonte de carbono derivada de alimentos. A maior parte também é indiferente com relação às fontes de nitrogênio, podendo utilizar fontes alternativas, como o nitrato, íons de amônia e nitrogênio orgânico. Porém várias espécies irão apresentar um crescimento limitado se utilizarem como fonte de nitrogênio e/ou carbono, as proteínas e aminoácidos
De maneira geral, as leveduras são mais exigentes que os bolores, porém ambos apresentam forte resistência a condições adversas, como pH ácido e atividade de água baixa. Os fungos são pouco afetados dentre uma variação de pH 3,0 até pH 8,0. O pH ótimo para o crescimento de fungos mantém-se na faixa de pH 5,0 (DELFINI, 1995).
A temperatura ótima para o crescimento da maioria dos fungos varia dentre 25oC – 28oC, não apresentando bom desenvolvimento em temperaturas mesófilas (35 oC – 37 oC) e raramente apresentam crescimento em temperaturas de bactérias termotolerantes (45 oC). O crescimento sob condições de refrigeração não é um fenômeno raro, mas sob temperaturas de 10oC negativos os alimentos mantém-se microbiologicamente estáveis (SILVA et al, 2007).
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Meios de Cultura
Para o cultivo de bactérias foi escolhido o Ágar MRS, específico para bactérias láticas, composto basicamente por ácidos aminados de caseína, tecido animal digerido enzimaticamente, extrato de levedura, extrato de carne, dextrose, acetato de sódio, agente tween 80, fosfato de potássio, sulfato de magnésio, sulfato de manganês, citrato de amônio e ágar. O Ágar WL® foi utilizado no cultivo de mofos e leveduras encontrados em processos industriais, apresenta valor de pH 5,5 à 20 °C, composto por extrato de levedura, ácidos aminados de caseína, dextrose, fosfato de monopotássio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, sulfato de magnésio, cloreto férrico, sulfato de manganês, verde de bromocresol e ágar.
4.2 Amostragem
Foram analisadas sete marcas diferentes de vinho tinto seco comum, embalados em garrafas PET, cada uma proveniente de uma vinícola distinta da Serra Gaúcha. Adquiriram-se três garrafas de cada marca, em pontos de venda da região de Caxias do Sul.
No estabelecimento comercial as amostras estavam armazenadas de tal forma que não estavam protegidas da luz e suscetíveis às variações de temperatura, não foi possível constatar a quanto tempo as garrafas estavam nas prateleiras dos pontos de venda.
Após a coleta, as amostras foram armazenadas de modo que fossem simuladas as condições em que estavam no mercado, desprotegidas da luz e suscetíveis às variações de temperatura, pelo período de um mês até que fossem efetuadas as análises.
4.3 Isolamento
As amostras foram plaqueadas em profundidade como método padrão, em Ágar MRS e WL e incubadas a 30°C em aerobiose por 120 horas. As colônias desenvolvidas foram enumeradas com o auxílio de um contador de colônias de acordo com a metodologia do
MAPA (2010) e as colônias que diferiram entre si, tiveram sua identidade detectada através do teste de catalase e coloração diferencial de Gram.
4.4 Análises Físico-Químicas
Todas as amostras tiveram duas das três garrafas analisadas em duplicata, seguindo as metodologias abaixo, no total foram elaboradas onze análises físico-químicas, conforme o quadro 3.
Análise Metodologia
Densidade Relativa Densimetria
Extrato Seco Tabela de Tabarié
Álcool Etílico Refração/Densimetria
Acidez Total Alcalinimetria
Acidez Volátil Alcalinimetria
Dióxido de Enxofre Livre Arraste de Vapor
Dióxido de Enxofre Total Arraste de Vapor
Dióxido de Enxofre Molecular Tabela
Ph Potenciometria
Açúcares Redutores Rebelein
Ácido Sórbico Espectrofotometria UV
Quadro 3. Análises e suas metodologias.
4.5. Avaliação Sensorial
A análise sensorial foi realizada empiricamente por um conjunto de seis enólogos para ter-se um parecer descritivo dos vinhos, sem utilizar nenhuma metodologia sensorial científica. Foram avaliados descritivamente os atributos de aroma, cor e gosto das sete marcas de vinho.
4.6. Análise Estatística
O software Statistica 6.0 (StatSoft, USA) foi usado para calcular a análise de variância (ANOVA) dos dados referentes à caracterização físico-química. O teste de comparação de
médias de Tukey foi usado para determinar as diferenças significativas dos atributos avaliados em um intervalo de confiança de 95%.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Características Físico-químicas
As características físico-químicas das sete marcas são apresentadas no quadro 4.
Atributos Amostras I II III IV V VI VII Densidade Relativa 20/20 oC 0,9959 ± 0,0 0,9966 ± 0,0 0,9952 ± 0,0 0,9959 ± 0,0 0,9950 ± 0,0 0,9955 ± 0,0 0,9959 ± 0,0 Álcool Etílico (%) 10,71 ± 0,00f 11,01 ± 0,01c 11,06 ± 0,01c 11,89 ± 0,01a 10,90 ± 0,02d 11,44 ± 0,01b 10,75 ± 0,01f Extrato Seco (g.L-1) 26,3 29,2 25,8 30,0 24,5 27,4 26,6
Acidez Total (meq.L-1) 92,55 ±
0,45c 93,15 ± 0,15c 83,00 ± 0,10e 87,05 ± 0,05d 86,85 ± 0,15d 103,40 ± 0,20a 100,90 ± 0,10b Acidez Volátil (meq.L-1) 15,85 ±
0,15b 12,15 ± 0,15d 10,50 ± 0,20e 10,50 ± 0,00e 8,45 ± 0,15f 18,15 ± 0,15a 13,50 ± 0,20c SO2 Livre (mg.L-1) 28,00 ± 2,00a 23,00 ± 1,00abc 16,00 ± 1,00ac 13,50 ± 1,50c 21,50 ± 2,50bc 25,00 ± 1,00ab 13,50 ± 2,50ac SO2 Total (mg.L-1) 65,00 ± 1,00 d 129,00 ± 1,00a 102,00 ± 1,00b 77,50 ± 0,50c 103,00 ± 1,00b 108,00 ± 2,00b 38,50 ± 1,50d SO2 Molecular (mg.L-1) 0,44 0,51 0,46 0,34 0,80 0,66 0,37 pH 3,58 ± 0,00a 3,46 ± 0,01b 3,29 ± 0,01d 3,36 ± 0,00c 3,17 ± 0,01f 3,38 ± 0,01c 3,25 ±0,01e Açúcares Redutores (g.L-1, em glicose) 1,91 ± 0,01e 3,00 ± 0,00b 2,19 ± 0,02d 5,96 ± 0,01a 2,47 ± 0,03c 2,12 ± 0,02d 1,89 ± 0,01e Ácido Sórbico (g.L-1) 0,00 0,00 0,00 0,23 0,00 0,15 0,22
Quadro 4. Caracterização físico-química das amostras
Letras minúsculas diferentes na mesma linha significam diferenças significativas entre as amostras. (média ± erro padrão).
Não houve variabilidade entre as amostras de mesma marca nas determinações de densidade, extrato seco, SO2 molecular e ácido sórbico, o que impossibilitou a realização de análise de variância.
Com relação ao percentual de álcool etílico, houve variação entre as marcas analisadas, observando-se uma diferença de aproximadamente 1 % entre a amostra “IV”,
11,89% (maior teor) e as amostras “VII” e “I”, cujos teores foram de 10,75% e 10,71%, respectivamente. Para Oreglia (1978), vinhos com baixa graduação alcoólica, riqueza em compostos nitrogenados estão suscetíveis à manifestação da flor.
Pode-se observar uma grande variação da acidez total entre as diferentes marcas, observando-se o maior valor de acidez total, 103,4 meq.L-1 , para amostra “VI” e o menor valor, 83,0 meq.L-1 na amostra “III”. Analiticamente, supõem-se que a amostra “I” tenha sofrido uma demasiada desacidificação, com resultado não satisfatório, elevando o pH do vinho para 3,58.
A acidez volátil apresentou uma grande variação dentre as marcas, mas de modo geral os vinhos apresentaram valores altos de acidez volátil, encontrando-se um teor de 18,15 meq.L-1 na amostra “VI” e de apenas 8,45 meq.L-1 na amostra “III”. Um vinho com valores de acidez volátil acima de 15 meq.L-1 torna perceptível os odores de ácido acético e acetaldeído.
O conteúdo total de SO2 variou muito dentre as amostras, apresentando valores relativamente baixos. As marcas “I” e “VII” apresentaram os menores conteúdos de SO2, sendo de respectivamente 65,00 e 38,5 mg.L-1, enquanto o maior valor encontrado foi na amostra “II”, de 129 mg.L-1, valor que atinge quase o dobro do teor encontrado na amostra “I”. De acordo com Zoecklein (2001), 50 mg.L-1 de SO2 total são suficientes para provocar a inibição de bactérias lácticas, de onde pode-se concluir que teores inferiores, como o encontrado na amostra “VII”, podem permitir o desenvolvimento de bactérias láticas no produto, diminuindo sua estabilidade microbiológica.
No que diz respeito à concentração molecular de SO2, apenas a amostra “V” apresenta concentração de 0,8 mg.L-1, sendo indicado por Zoecklein (2001), como concentração mínima para prevenir o crescimento de bactérias no vinho. Todas as outras amostras apresentaram valores abaixo do ideal, facilitando a manifestação de bactérias no vinho.
A marca “I” apresentou o pH mais elevado, 3,58, enquanto o menor pH foi encontrado na marca “V”, 3,17. Para Ribéreau-Gayon (2005) grande parte das bactérias desenvolvem-se preferencialmente em pH perto da neutralidade, mas as bactérias láticas desenvolvem-se de valores inferiores á pH 3, até pH 3,8, onde sua ação é mais veloz. Já as acéticas podem multiplicar-se facilmente em pH 3,5. Valores mais baixos de pH potencializam a ação do dióxido de enxofre (ZOECKLEIN, 2001).
A concentração de açúcares redutores apresentou uma variação grande entre as marcas analisadas. Este é um fator importante a ser levado em conta, pois vinhos com uma quantidade elevada de açúcar residual oferecem um desafio maior para obter a estabilidade microbiológica (PARONETTO, 1977), principalmente em conjunto com a leve oxigenação
que a embalagem oferece (REVISTA ENGARRAFADOR MODERNO, 2006).
Enquanto as marcas “I” e “VII” mostraram valores de, respectivamente, 1,91 e 1,89 g.L-1 de glicose, a amostra “IV”, apresentou o valore de 5,96 g.L-1, três vezes mais elevado, o que faz com que essa marca seja mais susceptível ao desenvolvimento microbiano, o que poderia explicar o elevado conteúdo em ácido sórbico, 0,23 g.L-1 encontrado nessa marca.
Apesar das variações observadas nos parâmetros analisados nas diferentes marcas, apenas duas apresentaram irregularidades, quanto ao limite máximo de ácido sórbico e limite de açúcar residual para vinhos secos.
As quantidades definidas por lei de ácido sórbico para vinhos não devem ultrapassar as 200 mg.L-1, no entanto, nas marcas de vinho “IV” e “VII”, foram encontradas concentrações de 230 mg.L-1 e 220 mg.L-1, respectivamente.
Outra irregularidade encontrada na marca “IV” trata-se do limite máximo de açúcares totais para vinhos secos, determinado por lei em 5 g.L-1 na Portaria No 229, de 25 de outubro de 1988 (MAPA, 2010), entretanto a amostra apresenta 5,96 g.L-1.
5.2 Avaliação Sensorial
O perfil de cada amostra, levantado pelo painel é apresentado no quadro 5.
Marca Descrição
I O vinho apresentou aromas preservados e frescos, comparativamente aos outros produtos, dentre os aromas, destacam-se os de frutas e pimenta. Bom aspecto, límpido e cor de tom violáceo. No paladar demonstrou grande desequilíbrio gustativo causado pela demasiada acidez.
II Aromas de oxidação, que lembram café e frutas cozidas passadas, com tom de cor atijolado, típico de oxidação e aspecto límpido. Gustativamente é desequilibrado, com alta acidez.
III Vinho oxidado, com aromas que lembram álcool vínico e características de ataque de microorganismos, como pipa velha. Coloração oxidada, com tons marrons, na boca apresenta grande desequilíbrio de acidez.
IV Demonstrou aromas típicos de oxidação, pano sujo e peculiar aroma de sorbato de potássio. Tom de cor atijolado, e no paladar apresentou equilíbrio e uma maciez levemente adocicada.
V Aromas passados com notas de pano sujo e etanal, tom de cor marrom, oxidado. Na boca demonstrou ser neutro com um toque desequilibrado de acidez.
VI Vinho com fortes aromas desagradáveis, típicos de ataque bacteriano, como pano sujo, também contém aroma de oxidação, couro e ácido acético. Aspecto levemente turvo, de coloração oxidada, na boca apresentou gostos desagradáveis, desequilibrado com acidez muito acentuada.
Marca Descrição
VII Olfativamente demonstrou aromas oxidados, e desagradáveis como de pano sujo e pipa velha, com gosto também desagradável e demasiada acidez.
Quadro 5. Avaliação sensorial das 7 marcas de vinho embalados em garrafas PET analisadas.
De modo geral, com exceção da marca “I”, todos os vinhos apresentaram aromas oxidados, em diferentes intensidades. Em alguns deles, foi verificado cheiro de pano sujo e pipa velha.
Foi de consenso geral dentre os degustadores que os vinhos possuem demasiada acidez, faltando maciez no paladar. A amostra “I” foi o vinho com melhor aroma e paladar, enquanto as amostra “VI” e “VII” apresentaram os piores aromas e gostos dentre os sete produtos.
Analiticamente a marca “I” demonstrou alto teor de acidez volátil, e elevado pH, não afetando sua qualidade sensorial. A amostra “VI” apresentou a quantidade de acidez volátil bem próximo do limite legal, 20 meq.L-1, contribuindo para seu aroma desagradável de pano sujo. O vinho da marca “VII” possui teores baixos de dióxido de enxofre livre, propiciando o ataque de bactérias que possivelmente conferiram ao vinho os aromas de pano sujo e pipa velha.
5.3 Análise Microbiológica
Os vinhos examinados apresentaram grandes diferenças quanto à concentração de microrganismos presentes, embora todas as amostras tenham apresentado contaminação microbiana.
5.3.1 Marca I:
Os resultados da enumeração em placas do vinho da marca “I” em Ágar MRS e WL e dos testes de confirmação de identidades das colônias podem ser visualizados nos quadros 6 e 7, respectivamente.
Avaliação Resultado
Avaliação Resultado
Apresentação da Célula Cocos
Coloração de Gram Positiva
Teste de Catalase Negativa
Número de colônias de Mofos e Leveduras Zero
Quadro 6. Resultados do plaqueamento da amostra “I” em Ágar MRS
*estimado
Avaliação Resultado
Número de colônias de bactérias 14 UFC.mL-1 est*
Apresentação da Célula Cocos
Coloração de Gram Positiva
Teste de Catalase Negativa
Número de colônias de Mofos e Leveduras 3 UFC.mL-1 est*
Quadro 7. Resultados do plaqueamento da amostra “I” em Ágar WL.
*estimado
Esta marca apresentou a maior contaminação microbiana e o pH mais alto dentre todos os vinhos examinados, um teor mediano de SO2 livre (28 mg.L-1), e não continha ácido sórbico, assim oferecendo um ambiente propício para manifestação de microorganismos.
O vinho apresentou no total 3,4x103 UFC.mL-1 de prováveis bactérias láticas no meio MRS, um valor muito alto que pode ter contribuído para a quantidade elevada de acidez volátil. No entanto, o desenvolvimento microbiano não comprometeu a qualidade sensorial do produto, pois esta amostra apresentou a melhor qualidade sensorial dentre todos os vinhos em exame.
5.3.2 Marca II
Os resultados da enumeração por plaqueamento do vinho da marca II em Ágar MRS podem ser visualizados no quadro 8.
Avaliação Resultado
Número de colônias de bactérias 1 UFC.mL-1 est*
Apresentação da Célula Cocos
Avaliação Resultado
Teste de Catalase Negativa
Número de colônias de Mofos e Leveduras Zero
Quadro 8. Resultados do plaqueamento da amostra II em Ágar MRS. *estimado
Em Ágar WL, nenhuma colônia foi isolada, obtendo-se o resultado <1 UFC.mL-1 est.
Este vinho demonstra grande estabilidade microbiológica, manifestando apenas uma UFC de prováveis bactérias láticas, apesar de ter uma quantidade de quase três gramas por litro de açúcar residual, SO2 livre moderado (23 mg.L-1), e pH de valor elevado (3,46).
Sua estabilidade microbiológica pode ser proveniente do alto valor de dióxido de enxofre total, teor alcoólico elevado e boas práticas para o engarrafamento como uma eficiente filtração do vinho e higienização adequada das embalagens.
5.3.3. Marca III
Os resultados da contagem por plaqueamento do vinho da marca III em Ágar WL podem ser visualizados no quadro 9.
Em Ágar MRS, nenhuma colônia foi isolada, obtendo-se o resultado <1 UFC.mL-1est.
Avaliação Resultado
Número de colônias de bactérias 1 UFC.mL-1est*
Apresentação da Célula Cocos
Coloração de Gram Positiva
Teste de Catalase Negativa
Número de colônias de Mofos e Leveduras 5,4x102 UFC.mL-1 est*
Quadro 9. Resultados do plaqueamento da amostra III em Ágar WL.
*estimado
A baixa concentração de SO2 livre, 16 mg.L-1, pode ter propiciado a considerável contaminação provavelmente por leveduras encontradas nesse vinho. O baixo pH dessa marca, apesar de auxiliar no controle de desenvolvimento de bactérias lácticas, não possibilitou o controle das leveduras, as quais apresentam uma maior tolerância ao baixo pH.
5.3.4. Marca IV
Os resultados da enumeração em placas da marca IV em Ágar MRS podem ser visualizados no quadro 10.
Em Ágar WL, nenhuma colônia foi isolada, obtendo-se o resultado <1 UFC.mL-1 est.
Avaliação Resultado
Número de colônias de bactérias 3 UFC.mL-1 est*
Apresentação da Célula Cocos
Coloração de Gram Positiva
Teste de Catalase Negativa
Número de colônias de Mofos e Leveduras Zero
Quadro 10. Resultados do plaqueamento da amostra IV em Ágar MRS.
*estimado
A concentração de possíveis bactérias láticas encontrada nesta marca de vinho foi baixíssima, apesar da baixa concentração de dióxido de enxofre livre, 13,5 mg.L-1 e da alta concentração de açúcar residual encontradas nesse vinho.
5.3.5. Marca V
Os resultados da enumeração por plaqueamento da amostra V em Ágar WL podem ser visualizados no quadro 11.
Avaliação Resultado
Número de colônias de bactérias 2,9x102 UFC mL-1est*
Apresentação da Célula Cocos
Coloração de Gram Positiva
Teste de Catalase Negativa
Número de colônias de Mofos e Leveduras 6,7x104 UCF.mL-1 est*
Quadro 11. Resultados do plaqueamento da amostra V em Ágar WL.
*estimado
Em Ágar MRS, nenhuma colônia foi isolada, obtendo-se o resultado <1 UFC.mL-1est. Analiticamente, esta era a amostra com maior propensão para se obter a estabilidade
microbiológica, com um pH de 3,17, mais restritivo ao crescimento microbiano, teor de dióxido de enxofre molecular elevado, 0,8 mg/L e teor alcoólico mediano. Porém foi observado desenvolvimento de prováveis bactérias láticas e leveduras, sendo a concentração destas últimas elevada. Este fato pode ser explicado pelo fato do teor de dióxido de enxofre livre presente no vinho ser ligeiramente baixo, 21,5 mg.L-1, além da ausência de adição sórbico no produto.
Este vinho demonstrou aromas desagradáveis, provavelmente conseqüentes dos ataques microbianos.
5.3.6. Marca VI
Os resultados da contagem por plaqueamento da amostra VI em Ágar WL podem ser visualizados no quadro 12.
Avaliação Resultado
Número de colônias de bactérias 7,0x102 UFC.mL-1est*
Apresentação da Célula Cocos
Coloração de Gram Positiva
Teste de Catalase Negativa
Número de colônias de Mofos e Leveduras 7,0x102 UCF.mL-1est*
Quadro 12. Resultados do plaqueamento da amostra VI em Ágar WL.
*estimado
Em Ágar MRS, nenhuma colônia foi isolada, obtendo-se o resultado <1 UFC.mL-1est.
Esta marca demonstrou um teor de acidez volátil muito próximo do limite legal, 20 meq.L-1, provavelmente decorrente da concentração considerável de possíveis leveduras e bactérias láticas encontradas no vinho, apesar de possuir teor mediano de SO2 livre, 25 mg.L-1 e uma quantidade considerável de ácido sórbico, 0,150 g.L-1.
As contaminações presentes no vinho contribuíram negativamente na qualidade do produto, conferindo aromas desagradáveis, típicos de vinhos atacados microbiologicamente, como foi constatado na avaliação sensorial.
5.3.7. Marca VII
Os resultados da enumeração por plaqueamento dos microrganismos presentes na marca de vinho G realizada em ágar WL podem ser visualizados no quadro 13.
Avaliação Resultado
Número de colônias de bactérias 10 UFC. mL-1est*
Apresentação da Célula Bastonetes
Coloração de Gram Positiva
Teste de Catalase Negativa
Número de colônias de Mofos e Leveduras Zero
Quadro 13. Resultados obtidos do plaqueamento da amostra VII em Ágar WL.
*estimado
Em Ágar MRS, nenhuma colônia foi isolada, obtendo-se o resultado <1 UFC.mL-1 est. O produto apresentou uma boa estabilidade microbiológica, encontrando-se uma baixa concentração de possíveis bactérias lácticas e não se observa o desenvolvimento de leveduras, apesar de ser um vinho com teor muito baixo de dióxido de enxofre livre, 13,5 mg.L-1, com relação às outras amostras, porém, com um teor excessivo de ácido sórbico, 0,220 g.L-1, o qual ultrapassa o limite da legislação.
Apesar da estabilidade microbiológica, este vinho encontra-se entre as piores amostras analisadas sensorialmente, com aromas desagradáveis de pano sujo e pipa velha. A quantidade exagerada de ácido sórbico foi eficiente em suplantar o desenvolvimento de fungos e leveduras, mas o baixo teor de dióxido de enxofre livre não foi o suficiente para impedir o crescimento de bactérias no vinho.
As amostras “I” e “IV” não apresentavam enumeração de lote no rótulo nem na embalagem.
Nos vinhos analisados, foram encontradas tanto leveduras quanto bactérias, sendo que em quatro das amostras de vinho analisadas, estes microrganismos estavam presentes em concentrações elevadas, oferecendo graves riscos ao vinho.
Na avaliação sensorial, pode-se dizer que todas as amostras apresentaram qualidade duvidosa, em evidência os aromas defeituosos de oxidação, pano sujo e pipa velha, juntamente com a descarada acidez dos vinhos, proporcionando um paladar grosseiro e desagradável. Dentre sete marcas analisadas, apenas uma demonstrou bons aromas, frescos e preservados, embora no paladar o vinho apresentou a mesma característica ácida das outras amostras.
De um modo geral, pode-se concluir que a estabilidade microbiológica do vinho embalado em garrafas PET é baixa, juntamente com a qualidade sensorial do produto, comprometendo sua qualidade durante a comercialização.
