Universidade Federal do Rio de Janeiro

Instituto de Bioquímica Médica

Caracterização da taxa mutacional em loci STR do

cromossomo Y na população do Estado do Rio de Janeiro:

Implicações em testes de paternidade e no âmbito forense

Humberto De Vitto

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química Biológica, Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como requisito parcial necessário à obtenção do Título de Mestre em Química Biológica.

Orientador: Franklin David Rumjanek

Rio de Janeiro 2008

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DE VITTO, Humberto

Caracterização da taxa mutacional em loci STR do cromossomo Y na população do Estado do Rio de Janeiro: Implicações em testes de paternidade e no âmbito forense / Humberto De Vitto – Rio de Janeiro, 2008.

85 fls.: il., fig., tab., gráf.

Dissertação (Mestrado em Química Biológica) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Bioquímica Médica, Rio de Janeiro, 2008.

Orientador: Franklin David Rumjanek

1. Cromossomo Y 2. População do Estado do Rio de Janeiro 3. Taxa de mutação 4 Marcadores complexos.

I. Rumjanek, Franklin David (Orient.). II. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Bioquímica Médica, Programa de Pós-Graduação em Química Biológica. III. Título.

O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Identidade Humana e Paternidade por DNA, SONDA-UFRJ e no Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular do

Schistossoma mansoni, Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de

Janeiro – UFRJ, sob orientação do professor Franklin David Rumjanek e com auxílio financeiro concedido pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES – Bolsa de mestrado)

Caracterização da taxa mutacional em loci STR do cromossomo Y na população do Estado do Rio de Janeiro: Implicações em testes de paternidade e no âmbito forense.

Humberto De Vitto

Orientador: Franklin David Rumjanek

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química Biológica, Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como requisito parcial necessário à obtenção do Título de Mestre em Química Biológica. Aprovada em Outubro de 2008 por:

__________________________________________________________

Orientador: Dr. FRANKLIN DAVID RUMJANEK

Prof. Titular do Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro – IBqM/UFRJ

___________________________________________________________

Dra. DAYSE APARECIDA DA SILVA

Profa. Adjunta visitante do Dpto. de Patologia, Instituto de Biologia, Universidade do Estado do Rio de Janeiro – IBRAG /UERJ

___________________________________________________________

Dra. ANA LUCIA MORAES GIANNINI

Profa. Adjunta do Depto. de Genética, Instituto de Biologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro – IB/UFRJ

____________________________________________________________

Dr. PAULO CAVALCANTI GOMES FERREIRA

Prof. Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro – IBqM/UFRJ

____________________________________________________________

Suplente externo: Dra. CLAUDIA AUGUSTA DE MORAES RUSSO

Profa. Adjunta do Depto. de Genética, Instituto de Biologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro – IB/UFRJ

____________________________________________________________

Revisor/Suplente interno: Dr. MARCOS HENRIQUE FERREIRA SORGINE Prof. Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de

Aos meus pais, JOSÉ ALBERTO DE

VITTO

e

MARIA

APARECIDA

VICTORELLI

DE

VITTO

e

irmã

FABIANA DE VITTO,

AGRADECIMENTOS

Ao Dr. Franklin David Rumjanek pela orientação, confiança e participação na minha formação pessoal e acadêmica;

À Dra Concy Maya Caldeira pela orientação na conduta, estratégia e elaboração do trabalho; e também pela enorme contribuição na minha formação acadêmica e pessoal. Reitero os agradecimentos pela amizade verdadeira construída;

À minha amada família, pelo incentivo incondicional na busca pelos meus objetivos; Ao Laboratório SONDA-UFRJ, pela estrutura, suporte técnico-científico e fomento para o desenvolvimento do projeto de pesquisa;

À Rosana Oliveira Volkweis, pela colaboração no dia-a-dia de trabalho e triagem técnica de confirmação de paternidade biológica nas regiões autossômicas de marcadores de DNA de indivíduos da população do Estado do Rio de Janeiro;

Aos colegas de laboratório Camilla, Nicolas e Ana Claudia;

Aos docentes do Programa de Pós-Graduação em Química Biológica, Instituto de Bioquímica Médica, UFRJ, pelo ensinamento e formação científica;

Ao Dr. Marcos Henrique Ferreira Sorgine, pela disponibilidade como revisor de dissertação de tese e acompanhamento minucioso dessa tese;

Aos colegas de pesquisa do Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular do

"

O dever de um perito é dizer a verdade; no entanto, para

isso é necessário: primeiro saber encontrá-la e, depois

querer dizê-la. O primeiro é um problema científico, o

segundo é um problema moral."

RESUMO

DE VITTO, Humberto. Caracterização da taxa mutacional em loci STR do cromossomo Y na população do Estado do Rio de Janeiro: Implicações em testes de paternidade e no âmbito forense. Dissertação (Mestrado em Química Biológica) – Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2008.

No presente trabalho, amostras de DNA de 270 homens foram analisadas a fim de investigar a taxa mutacional em transferências meióticas em loci STR do cromossomo Y em uma população regional. Para tal, foi construído um banco de haplótipos do cromossomo Y composto por indivíduos do Estado do Rio de Janeiro. Inicialmente, onze marcadores foram analisados e foi possível identificar 135 haplótipos do cromossomo Y. Desses haplótipos, 119 haplótipos foram únicos na população o que gerou uma Fração Única de Haplótipos (FUH) (~88%). A análise posterior de outros seis marcadores adicionais propiciou individualizar uma grande parcela da população em estudo (~98.0%). Além disso, foi calculada a diversidade de haplótipos, sugerindo que a chance de se escolher, aleatoriamente, dois indivíduos com haplótipos diferentes na população foi de 99,76%. Um fator importante que contribuiu para o alto grau de diversidade de haplótipos foi a presença de marcadores polimórficos com elevados valores de diversidade gênica, entre eles: DYS 385, DYS 389 II, DYS 390 e DYS19 com valores 88.76%, 71.08%, 68.40% e 61,53%, respectivamente. Além disso, estudos de tipagem dos marcadores STR do cromossomo Y abrem a possibilidade às aplicações desta ferramenta como instrumento indicativo de origem geográfica, separando os haplótipos em seus haplogrupos correspondentes. Nesse ensaio, foi possível determinar a origem da população do Estado do Rio de Janeiro, o que agrupou a população masculina brasileira em três esferas distintas: uma quase totalidade composta por descendentes de origem Européia, seguida por uma pequena fração de linhagem Africana e raros marcadores de linhagem Ameríndia. A partir de 1450 transferências meióticas foram registradas quatro mutações em três marcadores (DYS389 I/II, DYS390 e DYS393), sendo possível calcular uma taxa mutacional locus-específico que ficou entre 0.0 e 7.6 x10¯³ por geração e uma taxa mutacional global de 2.76x10¯³ (95% C.I.: ±1.37x10¯³). Surpreendentemente duas das mutações descritas acima ocorreram no marcador bi-alélico DYS389 I/II de um mesmo par pai/filho. Essas diferenças observadas na região consenso só foram passíveis de detecção quando se buscou analisar a seqüência íntegra do marcador polimórfico. Tal evento produziu uma situação na qual fragmentos de DNA, embora portando mutações, exibiram a mesma massa molecular. Esse resultado chama a atenção para a necessidade de se confirmar as mutações por seqüenciamento. Considerando a importância da utilização de marcadores STR na tipagem de DNA em teste de paternidade e no âmbito forense, estudos adicionais em marcadores STR, poderão trazer um entendimento melhor sobre impacto da geração de resultados falso-negativos quando se trabalha com marcadores de estrutura complexa.

ABSTRACT

DE VITTO, Humberto. Characterization of mutation rate at Y-STRs in population of Rio de Janeiro state: Implications for paternity testing and forensic sphere. Dissertate (Master in Biological Chemistry) – Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2008.

The present work describes the genotyping of Y-STR loci in 270 healthy males in an effort to detect mutation rates in a regional population. We constructed a chromosome STR haplotype database for individuals residing in Rio de Janeiro. 11 Y-STR loci were characterized generating 135 Y-chromosome haplotypes. Among these, 119 haplotypes were unique, producing a Fraction Unique Haplotype (FUH) of 88.0%. Further analysis of the other six Y-STR markers allowed individualization of a relatively high proportion of the population studied (98.0%). Haplotype diversity that is the chance that two random individuals might display different haplotypes was estimated yielding a value of 99,76%,. An important factor that contributed for a high haplotype diversity was the presence of Y-STR markers with high values for gene diversity among them: DYS 385, DYS 389 II, DYS 390 and DYS19 with values 88,76%, 71,08%, 68,40% and 61,53%, respectively. The typing studies allowed investigation on haplogroups that revealed the geographical origin of the individuals composing the population. Three distinct groups were found. The majority of individuals displayed lineages compatible with European haplogroups. The remaining males had African origin and very few were

Amerindian. Finally, among 1450 meiotic allele transfers, four mutation were observed

for three different markers (DYS389 I/II, DYS390 and DYS393). Locus-specific mutation rates were calculated that yielded values between 0.0 and 7.6 x10¯³ per generation and an average mutation rate estimated at 2.76x10¯³ (95% C.I.: ±1.37x10¯³). Remarkably, two mutations occurred in the biallelic marker DYS389 I/II in a father/son pair. The mutations could be detected only by nucleotide sequencing, since a concomitant event of deletion-insertion of a repeat occurred in the same locus, thus producing alleles bearing the same molecular mass. This observation highlights the need for careful analysis when analyzing mutation rates, evidencing that false negative results cold mask the mutations in complex STR markers.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - História da tipagem de DNA: DNA FINGERPRINTING...2

Figura 2. Genoma humano: 23 pares de cromossomo + DNAmitocondrial...3

Figura 3 – Estrutura do cromossomo sexual Y humano e os principais marcadores STR do cromossomo Y...6

Figura 4 – Exemplos de mutações pontuais por substituição de bases SNPs (Single Nnucleotide Polymorphism)...9

Figura 5 – Exemplos de regiões de polimorfismo de seqüência de minissátelite no cromossomo autossômico 1...10

Figura 6 - Polimorfismo em regiões STR (Short Tandem Repeats)...11

Figura 7 - Distribuição geográfica dos haplótipos em seus respectivos haplogrupos...13

Figura 8 - Estrutura do marcador STR complexo DYS389I/II...15

Figura 9 - Mecanismos de mutações em regiões STR: slippage “derrapagem” da enzima DNA polimerase...16

Figura 10 - Imagem da ferramenta de busca de haplótipos de acordo com a população ou região geográfica do banco mundial de haplótipos do cromossomo Y...27

Fgura 11 – Os haplogrupos característicos da população do Estado do Rio de Janeiro...34

Figura 12 - Eventos mutacionais no marcador DYS389I/II...38

Figura 13 - Evento mutacional no marcador DYS390...39

Figura 14 - Evento mutacional no marcador DYS393...40

Figura 15 - Registro de um alelo microvariante raro no marcador DYS385...42

LISTA DE TABELAS, QUADROS E GRÁFICO

Quadro 1 - Seqüência de primers de 17 regiões STR do cromossomo Y...21 Quadro 2 - Seqüência de oligonucleotídeos do plasmídeo p-GEM®-T

Easy Vector...24

Tabela 1 - Distribuição dos haplótipos dos indivíduos do Estado do

Rio de Janeiro...30 Gráfico 1 - Valor adicional de marcadores STR do cromossomo Y na capacidade de discriminação de indivíduos na População do Estado do Rio de Janeiro...33 Tabela 2 - Distribuição global de eventos mutacionais, alelos microvariantes, alelos nulos e alelos duplos na população do Rio de Janeiro, brasileira e mundial...36 Tabela 3 - Seqüências das mutações observadas para os 11 marcadores STR do cromossomo Y...43

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

A Adenina

ABO Sistema ABO de tipos sanguíneos humanos

Yq Braço grande do cromossomo Y

Yp Braço pequeno do cromossomo Y

C Citosina

°C Grau Celsius

MgCl2 Cloreto de Magnésio

NaCl Cloreto de Sódio

DG Diversidade Gênica

DH Diversidade de Haplótipos

DHPLC Denaturing High Performance Liquid Chromatography

(Cromatografia Líquida de Desnaturação de Alta Performace)

DNA Ácido desoxirribonucléico

dNTPs Desoxirribonucleotídeos fosfatados

EDTA Ethylene Diamine Tetracetic Acid (Ácido

Etileno-Diamino-Teracético)

FUH Fraction of Unique Haplotypes (Fração Única de Haplótipos)

g grama

G Guanina

g/L Gramas por Litro

HCl Ácido Clorídrico

CI Confidence Interval (Intervalo de Confiança)

INDELs Short Insertion-Deletion Polymorphisms (Polimorfismos curtos do

tipo inserção/deleção

ISFG International Society of Forensic Genetics (Sociedade

Internacional de Genética Forense)

L Litro

mA Miliampere

Mb Megabase – equivalente a um milhão de nucleotídeos

µL Microlitro

mm Milímetro

mM Milimolar

min Minuto

mL Mililitro

MtDNA DNA Mitocondrial

MVR-PCR Minisatellite Variant Repeat Mapping by PCR (Repetição variante

em minissatélite mapeado por PCR)

ng Nanogramas

NRY Non Recombining Y (Região não recombinante do cromossomo Y)

PAR-1 Pseudo-autosomal Region 1 (Região Pseudo-autossômica 1)

PAR-2 Pseudo-autosomal Region 2 (Região Pseudo-autossômica 2)

Pb Pares de bases

PCR Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase)

PDI Poder de Discriminação Individual

pH Potencial hidrogeniônico

% Porcentagem

RFLP Restriction Fragment Length Polimorphism (Polimorfismo de

Fragmento de Restrição)

Rh Tipo de proteína sanguínea - Rhesus (macaco)

RNA Ácido ribonucléico

RPM Rotação por minuto

SDS Dodecil Sulfato de Sódio

SIREs Short Interpersed Elements (Elementos Curtos Intercalados)

SMM Stepwise Mutation Model (Modelo de mutação gradual)

SNPs Single Nucleotide Polymorphism (Polimorfismo de Nucleotídeo

Único)

∑ Somatória

SSC Standard Saline Citatre (Citrato Salino de Sódio)

T Timina

TBE Tampão tris-ácido bórico-EDTA

TE Tampão Tris-EDTA

Tris Tris (hidroximetil) aminometano

U Unidade

UEPs Unique Event Polimorphisms (Polimorfismo de Evento Único)

V Volts

W Watts

Y - Alu Endonuclease de restrição bacteriana

Y base Banco de Dados Mundial do cromossomo Y

YCC Y Chromosome Consortium (Consórcio do Cromossomo Y)

YHRD-Y Y-Chromosome Haplotype Reference Database (Banco de

SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS...vi

RESUMO...viii

ABSTRACT...ix

LISTA DE FIGURAS...x

LISTA DE TABELAS, QUADROS E GRÁFICO...xi

LISTA DE ABREVIATURA E SIGLAS...xii

SUMÁRIO...xv

1.

_{INTRODUÇÃO...1}

1.1 Identidade humana...1

1.2 Transmissão da informação gênica...3

1.3 O cromossomo Y...4

1.4 Polimorfismos genéticos...7

1.4.1 Polimorfismo binário...8

1.4.2 Polimorfismo de minissatélites...9

1.4.3 Polimorfismo de microssatélites...10

1.5 História do cromossomo Y no Brasil...11

1.6 Marcadores STR complexos do cromossomo Y: DYS389I/II...13

1.7 Mutações de microssatélites do cromossomo Y...15

2.

_{OBJETIVOS...18}

2.1. Objetivo geral...18

2.2. Objetivos específicos...18

3.

_{MATERIAL E MÉTODOS...19}

3.1. Coleta das amostras...19

3.3. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)...20

3.4. Fracionamento de DNA por eletroforese...22

3.5. Caracterização dos alelos...22

3.6. Purificação do DNA...23

3.7. Clonagem de fragmento de DNA...23

3.8. Reação de seqüenciamento...25

3.9. Análise Estatística...25

3.10 Determinação dos haplogrupos...28

4.

_{RESULTADOS...29}

4.1 Construção de banco regional de haplótipos: Análise estatística dos marcadores STR do cromossomo Y...29

4.2 Valor adicional de loci STR do cromossomo Y...32

4.3 A origem molecular do cromossomo Y na população do Estado do Rio de Janeiro...33

4.4 Fatores de interferência em transferências meióticas...35

5.

DISCUSSÃO...45

5.1 Marcadores polimórficos STR complexos: Alerta técnico...50

6.

_{CONCLUSÕES...52}

BIBLIOGRAFIA...54

ANEXO I - DADOS REFERENTES A DELEÇÕES NO MARCADOR

Deleção no marcador sexual da Amelogenina no cromossomo Y...63

A filogeografia da deleção AMELY...64

Perspectivas...64

1. INTRODUÇÃO

A identificação humana pode ser realizada através da utilização de marcadores polimórficos, que são considerados ótimas ferramentas para discriminação individual. Os principais marcadores conhecidos são: os grupos sanguíneos (ABO e Rh), proteínas séricas e eritrocitárias, imunoglobulinas, o complexo de histocompatibilidade e polimorfismo do DNA. (CAVALLI-SFORZA, 1996).

As regiões de polimorfismo presentes na molécula de DNA produzem alto grau de discriminação entre indivíduos (BONACORSO, 2000). Um dos fatores que proporciona tal variabilidade é o processo de recombinação gênica, que aumenta as chances de variabilidade entre os organismos vivos. A recombinação gênica é o resultado da troca recíproca de DNA entre cromátides homólogas, que ocorre através de ″crossing-over″, ou seja, permuta gênica. Além da recombinação gênica, existem forças evolutivas, os eventos mutacionais, que aumentam ainda mais a chance de que cada indivíduo da espécie humana apresente perfil genético único, com exceção de gêmeos monozigóticos que compartilham o mesmo genótipo (BONACCORSO, 2000).

Segundo dados publicados pelo INTERNATIONAL HUMAN GENOME

SEQUENCING CONSORTIUM, (2001) como parte do projeto genoma humano, a

espécie humana comporta aproximadamente 30 mil genes que codificam proteínas e RNAs. Estes genes representam somente uma pequena fração do genoma (3%). O restante do material genético é composto principalmente por LINEs, SINEs, elementos semelhantes a retrovírus, transposons (elementos genéticos móveis) e repetições de seqüências simples (ALBERTS, 2004). Essas repetições de seqüências conhecidadas como regiões hipervariáveis ou polimórficas do DNA apresentam alta incidência de polimorfismo na população.

No início da década de 80, o pesquisador inglês Alec Jeffreys enquanto estudava genes da mioglobina humana (proteína do músculo que liga oxigênio), notou que certos trechos do DNA apareciam no genoma de diferentes pessoas em mais de uma forma (JEFFREYS, 1979). Anos depois, Jeffreys e colaboradores analisando regiões polimórficas do DNA de indivíduos não relacionados pelo método de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP), detectaram variações possivelmente geradas por mutações, resultando na alteração do perfil de repetições do DNA de cada um deles

(JEFFREYS, 1985a). Nesse trabalho pioneiro, foi demonstrado que cada indivíduo na população apresentava um conjunto característico de padrões de seqüências de DNA, como uma impressão digital, denominada por eles “DNA fingerprinting” (JEFFREYS, 1985b) (Figura 1). Esses resultados promoveram uma verdadeira revolução no âmbito da ciência biomédica com a aplicação da técnica de tipagem de DNA para identificação humana (RUMJANEK, 1997).

Desde então, a tipagem molecular de material genético foi utilizada como método comprobatório de identidade humana, sendo aplicada oficialmente pela primeira vez, em 1985, por Jeffreys, na Inglaterra para a resolução de um problema de imigração (JEFFREYS, 1985c). Um ano após, o mesmo autor empregou essa técnica para identificar o verdadeiro estuprador e assassino de duas vítimas. Esse caso ficou conhecido como Enderby (Queen v. Pitchfork) (BONACCORSO, 2000).

Figura 1 História da tipagem de DNA: DNA FINGERPRINTING.

Os principais eventos que elevaram a utilização do DNA como ferramenta indispensável a aplicações forense foram: a descoberta de marcadores STR (Short Tandem Repeats) e o desenvolvimento da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), na década de 90. Adaptado de: Butler (2005).

História da tipagem do DNA

Banco de dados de freqüência de alelos e banco de haplótipos

Desenvolvimento da PCR

DNA Mitocondrial 1° STR

1.2 Transmissão da informação gênica

O genoma humano é constituído por 23 pares de cromossomos, dos quais 22 pares são chamados de autossômicos e o par restante, ligado ao sexo, é composto pelos cromossomos X e Y (Figura 2 A), além da porção de DNA circular presente nas mitocôndrias (DNA mitocondrial) (Figura 2 B).

Figura 2. Genoma humano: 23 pares de cromossomo + DNA mitocondrial.

(A) O genoma humano é diplóide e contém aproximadamente 3,2 bilhões de pares de bases organizados em 23 pares de cromossomos (22 pares de cromossomos autossômicos e 1 par de cromossomos sexuais X e Y) localizados no compartimento nuclear. (B) O DNA mitocondrial esta presente em aproximadamente 100 cópias por célula. Este é um DNA circular, fita dupla e pequeno, composto por 16,569 pares de bases que esta localizado na matriz mitocondrial dentro do compartimento do citoplasma celular. Adaptado de: Butler, 2005.

Os cromossomos aparecem nas células somáticas no estado diplóide (2n) quando as células se encontram na fase G 1 da intérfase. Nos gametas (espermatozóides e ovócitos), os cromossomos se encontram em estado haplóide (n) e a partir do processo de fecundação formam um zigoto diplóide (2n) que por sucessivas mitoses produzirá

B. A.

um organismo multicelular. Em par, um alelo do cromossomo é derivado do espermatozóide e outro do ovócito (GRIFFITHS, 2000).

Assim existe apenas um caso peculiar em que determinado cromossomo tem um padrão de transmissão da informação gênica diferencial, tornando-se peça importantíssima para estudos de ancestralidade através da variabilidade das regiões hipervariáveis. O cromossomo sexual Y, além de ser restrito aos indivíduos do sexo masculino (BUTLER, 2005), sofre o processo de recombinação gênica apenas na região pseudo-autossômica o que corresponde a menos de 5% do cromossomo Y (HAMMER e ZEGURA, 1996). Nesse caso, a inexistência de troca de genes com outros segmentos genômicos (como ocorre com o cromossomo X), permite que o cromossomo Y seja transmitido para gerações futuras em blocos de genes, chamado de haplótipo (GRAVES, 1995).

1.3 O Cromossomo Y

A história do cromossomo Y pode ser dividida em três momentos, a começar pela caracterização de modos de herança genética, os quais foram baseados em estudos de Gregor Mendel com árvores genealógicas humanas, conceituando a idéia de existência de três tipos de herança: autossômico recessivo, autossômico dominante e herança recessiva ligada ao cromossomo X.

Posteriormente, seguidores de Mendel propuseram que o cromossomo Y portava genes determinantes do sexo masculino e possuía transmissão de herança entre pai e filho do sexo masculino (JACOB, 1959 E FORD, 1959). A idéia de exclusividade de linhagem masculina foi reforçada por Ohno e colaboradores em 1967, sugerindo que os cromossomos sexuais X e Y foram originados de um par de cromossomos autossômicos. Além disso, especulou-se que o cromossomo X reteve genes ancestrais do cromossomo autossômico e o cromossomo Y perdeu todos os demais genes, restringindo-se a presença dos genes da determinação de características sexuais (OHNO, 1967).

Recentemente o projeto genoma humano concluiu o seqüenciamento molecular do cromossomo Y. Foi observado que se trata de um cromossomo com alta incidência

natural de repetições, que se comportam como um mosaico de repetições (SKALETSKY, 2003).

Citologicamente o cromossomo Y pode ser considerado o terceiro menor cromossomo humano (60Mb) (ALI e HASNAIN, 2002 E CRAIG, 2004). Possui uma região de heterocromatina e outra de eucromatina. A primeira está situada na região distal do braço grande (Yq) e varia fenotipicamente em tamanho em homens normais. Por outro lado, a região de eucromatina (30Mb) tem um tamanho constante em homens geneticamente normais e localiza-se no braço pequeno (Yp), no centrômero e na zona proximal do braço grande (figura 3 A).

O cromossomo Y é um cromossomo haplóide que realiza recombinação gênica com o cromossomo X somente nas regiões pseudo-autossômicas do cromossomo Y, o que significa menos de 5 % do cromossomo. Essas regiões são chamadas de PAR1 e PAR2 (Pseudo-autosomal Regions), com 2,6 e 0,34 milhões de pares de bases (Mb) no braços pequeno e grande, respectivamente (VOGT, 1997).

O restante do cromossomo Y, cerca de 55 (Mb), compreende seqüências de DNA não recombinante (NRY - Non Recombinig Y) (HARRIS, 1986), estando localizados nessa região os marcadores de interesse em estudos de patrilinhagem (figura 3 B). De acordo com Jobling e Tyler-Smith (1995), o pequeno número de genes reduz a probabilidade do cromossomo Y sofrer intensa seleção natural, o que o torna uma excelente ferramenta para estudos de dispersão humana (JOBLING e TYLER SMITH, 1995).

Figura 3. Estrutura do cromossomo sexual Y humano e os principais marcadores

STR do cromossomo Y.

(A) O cromossomo Y é pequeno, com aproximadamente 60 (Mb), sendo composto por um braço pequeno (p) e um braço grande (q), os quais nas suas extremidades, em laranja, portam as regiões pseudo-autossômicas 1 e 2 que possuem homologia de recombinação com o cromossomo X. O restante do cromossomo Y compreende seqüências de DNA não recombinante. Em branco, existe uma região de eucromatina e no braço grande, em cinza, existe uma região de DNA super enovelado em estado de heterocromatina que não possui função biológica bem estabelecida. (B) Alguns dos marcadores STR do cromossomo Y que são ferramentas utilizadas em testes de paternidade e no âmbito forense. Em azul, estão representados os marcadores mínimos utilizados para se gerar um poder de discriminação aceitável pela ISFG (International

Society of Forensic Genetic). Adaptado de:

<http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/ystrpos1.htm>. Acessado em julho de 2008.

A.

B.

Segundo Butler, deve-se considerar marcadores do cromossomo Y e DNA mitocondrial (mtDNA) como “marcadores de linhagem”, devido à peculiaridade de serem transmitidos para gerações seguintes sem alterações, exceto em eventos mutacionais (BUTLER, 2005).

Um exemplo de marcador polimórfico são os marcadores microssatélites ou em Short Tandem Repeats (STR). Esses estão presentes em grandes quantidades nos cromossomos humanos (HOHOFF, 1999) e são altamente polimórficos (ROEWER, 1996). A aplicação científica desses marcadores pode ser vista em estudos nas áreas de genética de populações, evolução, estudos genealógicos, testes de paternidade e investigações forenses (KAYSER, 2004 E GUSMÃO, 2006).

Estima-se que os marcadores em STR do cromossomo Y já somam aproximadamente 400 loci e estão depositados nos bancos de dados públicos, tais como o GDB Human Genome Database (www.gdb.org) (HANSON e BALLANTYNE, 2007) e o Ybase. O Ybase é um banco de dados que abrange uma escala populacional mundial, com completos 13.018 registros de haplótipos catalogados para um total de 49 marcadores STR do cromossomo Y, com acesso é possível através do endereço eletrônico www.ybase.org.

1.4 Polimorfismos genéticos

Estudos recentes têm mostrado que o genoma humano apresenta alto grau de duplicação, estruturas polimórficas e números de cópias variáveis (BAILEY, 2002 E FREEMAN, 2006). O cromossomo Y contém proporção particularmente grande de segmentos de duplicação (SKALETSKY, 2003), alto grau de estruturas polimórficas, inversões (VERMA, 1982 E BERNSTEIN, 1986) e translocações neutras com os cromossomos autossômicos (SCHMID, 1984). A soma desses eventos em regiões estruturais, incluindo-se seqüências de DNA-satélite, megassatélites, minissatélites e microssatélites, acarretam variabilidade genética entre indivíduos. A literatura descreve que a ocorrência de regiões repetitivas de DNA na seqüência do genoma chega a totalizar 15% do genoma humano (BENNETT, 2000).

Essas regiões incluem, fundamentalmente, uma família de arranjos de seqüência de DNA repetidas em tandem classificada de acordo com o comprimento de um

determinado número de unidades repetitivas e de seqüência, local onde a diferença está no arranjo formado por essas unidades (STRACHAN e READ, 2002).

Dentre os tipos de regiões hipervariáveis presente no cromossomo Y, destacam-se polimorfismo binário (destacam-seqüência), polimorfismo de minissatélite e polimorfismo de microssatélite (comprimento).

1.4.1 Polimorfismo binário

O polimorfismo binário compreende classes de polimorfismo de substituição, inserção ou deleção na seqüência do fragmento de DNA. Um exemplo clásico são as regiões de (RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphisms). Essas regiões podem ser identificadas através de digestão com enzimas de restrição como no trabalho pioneiro de Fingerprinting de DNA publicado por Jeffreys, Wilson e Thein (1985). Além disso, a variação de uma única base, através de mutações pontuais conhecidas como SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) também pode ser considerado um evento de polimorfismo binário (Figura 4). Nesse contexto, a alteração na seqüência de um único nucleotídeo pode ser detectada por reação de seqüenciamento do DNA, DHPLC (Denaturing High Performance Liquid Chromatography), ou ainda por meio de enzimas de restrição (UNDERHILL, 1996).

Existem outros eventos deletérios que afetam longos trechos da molécula de DNA. Recentemente, tem sido dada ênfase à investigação desses eventos deletérios em uma grande porção do braço pequeno do cromossomo Y humano (Yp). Os dados disponíveis até o momento sugerem que essas deleções podem atingir de 2.5 a 4.0 milhões de pares de bases (Mb). Nesse contexto, o gene da amelogenina, o marcador de identificação sexual de gênero, pode ser perdido (JOBLING, 2007). Esse fato pode afetar o diagnóstico pré-natal dependente de sexagem (ZHU, 2005), tipagem forense, teste de paternidade (SULLIVAN, 1993) e estudos arqueológicos (STONE, 1996 E FAERMAN, 1997).

Figura 4. Exemplos de mutações pontuais por substituição de bases SNPs (Single Nucleotide Polymorphism).

A figura representa dois eventos de polimorfismo de base simples (SNP). Há uma troca C
T no quarto par de bases (da esquerda para a direita) e uma segunda troca A
G no oitavo par de bases. Esse marcador polimórfico tem ampla aplicação em estudos filogeográficos e forenses. Adaptado de: Butler (2005).

1.4.2 Polimorfismo de minissatélite

O Polimorfismo de regiões variáveis de repetições em seqüência (VNTRs -

Variable Number Tandem Repeats) é composto por arranjos de repetições que variam

geralmente de 0,1 a 20 Kb de extensão com unidades de repetição variando de 13 a 300 unidades de repetições como sugerido pelo projeto genoma humano (Figura 5) (INTERNATIONAL HUMAN GENOME SEQUENCING CONSORTIUM, 2001).

O primeiro marcador polimórfico em minissatélite descrito na literatura para o cromossomo Y foi denominado de p122f2 (CASANOVA, 1985). Entretanto a proximidade de localização dessas regiões hipervariáveis com regiões subteloméricas, que são consideradas regiões de instabilidades, dificulta estudos de genômica (STRACHAN e READ, 2002). A vantagem de se utilizar as regiões hipervariáveis de minissatélites como marcadores de identidade humana está relacionada à alta taxa de mutação de mais de 1% por geração (JOBLING, 1997).

Este polimorfismo pode ser analisado por MVR-PCR (Minisatellite Variant Repeat Mapping by PCR) ou por sondas unilocais e multilocais, configurando ferramentas importantes de pesquisa para o desenvolvimento de formas alternativas de análises em testes de paternidade e no âmbito forense.

Figura 5. Exemplos de regiões de polimorfismo de seqüência de minissátelite no cromossomo autossômico 1.

Polimorfismo VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) representando quatro motivos de repetição de 16 pares de bases. Esse marcador polimórfico apresenta uma alta taxa de mutação na população. No entanto, apresenta a desvantagem da sua análise técnica ser muito laboriosa e cara. Adaptado de: Butler (2005).

1.4.3 Polimorfismo de microssatélite

O polimorfismo de regiões microssatélites conhecido da sigla em inglês STR (Short Tandem Repeat) resulta da variação no número de unidades de repetição curta em seqüência consecutiva que possuem de dois a treze pares de base (Figura 6) (INTERNATIONAL HUMAN GENOME SEQUENCING CONSORTIUM, 2001).

Os marcadores microssatélites possuem diversas aplicações no campo de biologia molecular, genética funcional e genética de populações. Por duas razões: primeiro, por exibir ampla distribuição no genoma e hipervariabilidade, e segundo, pela facilidade de se amplificar essas regiões através do emprego da técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR – Polymerase Chain Reaction). A união desses dois fatores, a partir da década de 1990, revolucionou a identificação humana no campo forense. (GOLDSTEIN e SCHOLÖTTER, 1999).

O primeiro locus STR do cromossomo Y descrito foi o 27H39LR, hoje conhecido como DYS19. Este foi utilizado para excluir um suspeito em um caso de estupro (ROEWER e EPPLEN 1992). A partir daí, o número de marcadores STR descritos para o cromossomo Y cresceu consideravelmente (BERGER, 2003). Enquanto no ano de 2000 estimava-se aproximadamente 30 marcadores STR (BUTLER, 2003), dados publicados por Hanson e Ballantyne no ano passado, sugeriram que o banco de

dados mundial, Human Genome Database, já comportava ~400 loci STR do cromossomo Y (HANSON e BALLANTYNE, 2007).

Figura 6. Polimorfismo em regiões STR (Short Tandem Repeats).

Polimorfismo de reptições curtas consectivas de tetranucleotídeos, com 3 e 2 motivos de repetição completos AATG. Adaptado de: Butler (2005).

1.5 Hitória do cromossomo Y no Brasil

Com a utilização de marcadores genéticos é possível estimar tempos de ancestralidade baseados nas taxas mutacionais (WALSH, 2001). Mais especificamente, podemos citar estudos populacionais que se utilizaram de marcadores polimórficos de DNA. O maior estudo de variabilidade humana englobou a tipagem de 377 microssatélites autossômicos em 1064 indivíduos de 51 populações definidas pela origem geográfica, indicando que a origem recente do homem moderno foi na África. (ROSEMBERG, 2002).

A análise dos marcadores STR do cromossomo Y e de regiões hipervariáveis do DNA mitocondrial (mtDNA) torna possível estudos de patrilinhagem e matrilinhagem, respectivamente. Nesse caso é possível rastrear molecularmente várias gerações, e reconstruir parte da história genética de uma população (JOBLING e TYLER-SMITH, 2003).

O encontro dos povos oriundos da Ásia (Ameríndios), da Europa (Portugueses) e da África (escravos da África Oriental e Central), no século XVI no Brasil, iniciou um processo de mistura gênica inusitado, gerando o brasileiro atual (PENA, 2000). Nesse contexto, trabalhos com marcadores polimórficos do cromossomo Y determinaram o

retrato molecular atual da população brasileira para as cinco regiões geopolíticas do Brasil, sugerindo que a formação da população brasileira masculina foi resultado da miscigenação intensa ocorrida, principalmente entre as linhagens Européias, Africanas e Ameríndias (RIBEIRO, 1995 E PENA, 2000).

Numa escala maior, estudos de âmbito global, como o realizado pelo YCC em 2002 (The Y Chromosome Consortium, 2002), através de análises de mutações pontuais (UEPs) caracterizaram uma árvore genealógica global dos haplogrupos do cromossomo Y (Figura 7). Mais recentemente, criaram-se ferramentas computacionais que possibilitam caracterizar a identidade geográfica pela simples comparação de haplótipos STR do cromossomo Y com haplótipos modelo, caracterizados através de polimorfismos de nucleotídeo único (haplotipo SNPs do cromossomo Y que representam fielmente determinado haplogrupo) (ATHEY, 2005).

Figura 7 Distribuição geográfica dos haplótipos em seus respectivos haplogrupos.

Adaptado de: YCC (2002).

1.6 Marcadores STR complexos do cromossomo Y: DYS389I/II

O cromossomo Y apresenta uma grande quantidade de marcadores STR que são utilizados em investigações de identificação humana (HANSON e BALLANTYNE, 2007) alguns desses portam estruturas complexas, o que significa que apresentam mais de um tipo de motivo de repetição variável na população. Dentre os marcadores complexos analisados no presente estudo, podemos destacar: o locus DYS389II com estrutura de repetição (TCTG)n(TCTA)m N48 (TCTG)3(TCTA)p (KAYSER, 1997), o

marcador DYS390 com motivo de repetição alternando entre (TCTG)n(TCTA)m(TCTG)p(TCTA)q (KAYSER, 1997 E DE KNIJFF, 1997), o

marcador DYS437 com unidade repetitiva (TCTA)n(TCTG)1–3(TCTA)4 (AYUB, 2000),

o locus DYS438 com motivo de repetição (TTTTC)1(TTTTA)0-1(TTTTC)n (GUSMÃO,

2002), o locus DYS448 com unidade repetitiva [AGAGAT]n N42 [AGAGAT]m (REDD,

2002), o marcador DYS449 com unidade de repetição (TTTC)n N50 (TTTC)n (REDD,

2002) e o marcador DYS635 ou GATA C4 com unidade de repetição (TCTA)4(TGTA)2(TCTA)2(TGTA)2(TCTA)2(TGTA)0-2(TCTA)n (WHITE, 1999).

Levando-se em conta que a existência de motivos complexos que variam na população abre precedente para se criar seqüências diferentes de mesmo tamanho molecular, reservou-se atenção especial para o marcador DYS389 I/II, como será mostrado mais adiante.

Como exposto anteriormente, o locus DYS 389 I/II é uma região complexa e variável (nesso caso com três motivos de repetição variáveis na população) que apresenta polimorfismo em repetições de tetranucleotídeos (ROLF, 1998). Além disso, a existência de dois sítios de ligação para o iniciador 5’
3’ [Genome Database ID: G00-366-108] gera dois produtos de amplificação com diferentes números de unidades de repetições (COOPER, 1996). A estrutura do produto maior inclui dois motivos de repetição (TCTG)n (TCTA)m, seguidas de 48 pares de bases (bp) e mais o motivo do fragmento menor (TCTG)3 (TCTA)p que é uma subsessão do produto de maior peso molecular (ROLF, 1998) (Figura 8).

Figura 8. Estrutura do marcador STR complexo DYS389I/II.

O marcador DYS389 I/II é um marcador STR do cromossomo Y com estrutura complexa (TCTG)n(TCTA)m N48 (TCTG)3(TCTA)p com três motivos de repetições que

podem variar na população. Além disso, o primer senso tem dois sítios de anelamento que, consequentemente, geram dois produtos de amplificação, um de maior e outro de menor peso molecular, sendo que o produto menor é considerado uma subsessão do

fragmento mais pesado. Adaptado de:

<http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/y_strs.htm> Acessado em julho de 2008.

1.7 Mutações em microssatélites do cromossomo Y

O mecanismo de produção de mutação mais aceito para as regiões STR é o mecanismo de “derrapagem” da enzima DNA polimerase durante a replicação. Assim, esse evento pode gerar um ou mais ganhos de seqüência, como também pode acarretar uma perda de um ou mais motivos de repetições da região polimórfica (Figura 9 A, B e

C). Além disso, podem ocorrer mutações que dão origem a alelos microvariantes, com

perda ou ganho de bases gerando um motivo de repetição incompleto.

Apesar de já se conhecer o mecanismo que causa grande parte das mutações em marcadores STR, é importante estimar a taxa mutacional de cada locus para aproximação exata do histórico populacional e conhecimento de prevalência de mutação para determinados marcadores em específico. Nesse contexto, surge como propósito adequar a interpretação e aplicação de um número cada vez maior de marcadores microssatélites do cromossomo Y em testes de paternidade e casos forenses (JOBLING, 1997, KAYSER, 1997 E KAYSER, 2000).

Figura 9. Mecanismos de mutações em regiões STR: slippage “derrapagem” da enzima DNA polimerase.

(A) replicação normal de regiões STR com repetições em tetranucleotídeos. (B) ganho de seqüência de um motivo GATA de repetição inserido entre o primeiro e o segundo motivo de repetição. (C) perda de seqüência de um motivo GATA de repetição deletado entre o terceiro e o quinto motivo de repetição. Adaptado de: Butler (2005).

A.

B.

Além da necessidade de se trabalhar com eventos mutacionais, uma segunda diretriz importante é a possibilidade de acesso a bancos de haplótipos relativamente grandes e de preferência regionais, para não haver subestimação da freqüência haplotípica. (GILL, 2001 E ROEWER, 2001).

Nesse contexto, a contrapartida de se trabalhar com regiões que apresentam elevadas freqüências de polimorfismo na população é a ocorrência de desvios na genética mendeliana que podem induzir à interpretação errônea de resultados falso-negativos. Para tal julga-se necessário conhecer a freqüência de ocorrência desses eventos mutacionais e seus possíveis mecanismos operantes na população em estudo.

Portanto, engajados nessa linha de pesquisa de marcadores STR do cromossomo Y utilizados diretamente em testes de paternidade e análises forenses, buscou-se determinar o impacto que a ocorrência de resultados falso-negativos pode trazer para estudos periciais. Dessa forma, nós nos propusemos a determinar a taxa e o mecanismo mutacional em transferências meióticas em 11 diferentes loci STR do cromossomo Y na população do Estado do Rio de Janeiro. Para tal foi construído um banco regional de haplótipos do cromossomo Y do Estado do Rio de Janeiro. Tais dados permitiram também determinar qual a origem da população em estudo.

2. OBJETIVOS

O objetivo desse trabalho é a determinação da taxa mutacional do cromossomo Y na população do Estado do Rio de Janeiro e seu mecanismo através de análise das transferências meióticas em marcadores polimórficos (loci STR).

2.2. Objetivos específicos

 Construir um banco regional de haplótipos do cromossomo Y do Estado do Rio de Janeiro.

 Caracterizar as implicações diretas que os eventos mutacionais podem promover em parâmetros estatísticos de análises forenses e testes de paternidade.

 Determinar o valor de se adicionar novos loci STR do cromossomo Y, medido pelo aumento da capacidade de discriminação individual.



3. MATERIAL E MÉTODOS

Foi analisado um total de 270 amostras de homens saudáveis oriundos de diversas cidades do Estado do Rio de Janeiro que deram entrada no Laboratório de Identidade Humana e Paternidade por DNA (SONDA-UFRJ) para realização de testes de comprovação de paternidade, incluindo-se 132 indivíduos não relacionados entre si que tinham de um a três filhos.

Foram coletados de cada indivíduo 3 ml de sangue periférico, por punção venosa, em tubos contendo EDTA. Como uma alternativa de coleta de menor injúria, foi realizado o raspado de células da mucosa bucal (swabs). Cada amostra foi identificada e acondicionada sob refrigeração (4°C), para posterior processamento.

3.2 Extração de DNA

O DNA genômico foi extraído de sangue periférico e de células da mucosa bucal (swabs) utilizando o método de extração orgânica descrito por Blin e Stafford, (1976).

Cada amostra foi separada em tubo próprio. No caso da extração de sangue periférico foi separado um volume contendo aproximadamente 800 µL, e para a extração por (swabs), foi cortada a cabeça do cotonete em um tubo Eppendorf.

Cada amostra foi centrifugada por duas vezes com uma solução de SSC 1X (2 minutos, a 14000rpm), descartando 500µL da amostra. Na etapa seguinte, foi adicionado acetato de sódio 0.2M, SDS 10% e Proteinase K 20mg⁄mL, e o material foi então incubado a 56°C, por pelo menos 1 hora.

Em seqüência à incubação, foi adicionado 600 µL de fenol neutralizado e equilibrado com solução tampão de Tris-HCl 100 mM pH 7.0. O tubo foi agitado em vortex por 30 segundos e posteriormente centrifugado por 5 minutos, a 14000 rpm. A fase aquosa superior transferida para um novo tubo Eppendorf.

Na terceira etapa, foi adicionado 600 µL de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico na proporção 25:24:1. O material foi então homogeneizado por inversão e centrifugado por mais 5 minutos, a 14000 rpm, e novamente foi transferida a fase aquosa para um

novo tubo Eppendorf. Por fim, foi adicionado 600 µL de clorofórmio: álcool isoamílico na proporção 24:1, invertendo o tubo suavemente e centrifugando por 2 minutos, a 14000 rpm. Mais uma vez a fase aquosa superior foi transferida para um novo tubo Eppendorf ao qual foi adicionado etanol absoluto gelado 100%, e deixado por 20 minutos a -70°C, ou por 16 horas a -20°C.

A amostra foi então centrifugada por 15 minutos, a 14000 rpm para separação do DNA extraído. Em seguida, foi adicionado ao precipitado 1 mL de etanol 70% gelado, sendo o material novamente centrifugado por 5 minutos a 14000rpm.

O precipitado foi seco por evaporação à temperatura ambiente, ressuspenso em TE (Tris-HCl 100mM pH 7,6 e EDTA 1mM pH 8,0) e incubado a 56°C por 2 a 16 horas, até a solubilização completa do DNA.

3.3 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

Com o objetivo de se trabalhar com regiões específicas do DNA foi realizada a etapa de amplificação de DNA.

Inicialmente, foram analisados 11 marcadores STR do cromossomo Y, entre eles: DYS19, DYS385 a/b, DYS389 I e II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393, DYS437 e DYS461. No decorrer do estudo foram testadas mais seis regiões polimóficas do cromossomo Y: DYS438, DYS439, DYS448, DYS449, DYS458 e DYS635 (GATA C4), totalizando 17 marcadores do cromossomo Y.

As reações de amplificação foram divididas em dois conjuntos multiplex de PCR: Y-Multiplex I incluindo os loci DYS19, DYS385 a/b, DYS389 I e II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393. E o Y-Multiplex II incluindo os loci DYS437, DYS438, DYS439, DYS448, DYS449, DYS458, DYS461 e DYS635 (Quadro 1).

A reação de PCR foi executada em um volume final de 25µL, contendo de 5 a 10ng de DNA molde, tampão 10x CETTUS (200µM de desoxirribonucleotídeos fosfatados, Tris-HCl 10mM pH 8.3, KCl 50mM, MgCl2 2mM e 0.01% de gelatina),

1.0U de Amplitaq DNA polimerase e concentrações apropriadas dos referidos primers

(Quadro 1).

O termociclador utilizado foi o PTC 100 (M J Research) sob as seguintes condições: 95°C por 11 minutos, 30 ciclos de 94°C por 1 minuto, 55°C (Y-Multiplex I)

por 1 minuto ou 59°C (Y-Multiplex II) por 1 minuto, 72°C por 1 minuto, uma extensão a 60°C por 45 minutos e um hold step a 4°C.

Quadro1 - Seqüência de primers de 17 regiões STR do cromossomo Y. Dois

conjuntos de reação em cadeira da polimerase multiplex (I e II). Foram utilizadas as concentrações dos primers senso e anti-senso e a leitura de um controle positivo para cada locus trabalhado.

(PCR) Loci Ref. Seqüência (5’
3’) C. final [µM] C+

I

DYS19 Roewer,1992 CTA CTG AGT TTC TGT TAT AGT 0,5 14 ATG GCC ATG TAG TGA GGA CA 0,55

DYS385a/b Schneider, 1998 AGC ATG GGT GAC AGA GCT A 0,3 14-18 CCA ATT ACA TAG TCC TCC TTT C 4,8

DYS389 I/II Kayser, 1997 CCA ACT CTC ATC TGT ATT ATC TAT 0,6 13-30 TCT TAT CTC CAC CCA GA 0,6

DYS390 Kayser, 1997 TAT ATT TTA CAC ATT TTT GGG CC 0,45 23 TGA CAG TAA AAT GAA CAC ATT GC 0,5

DYS391 Kayser, 1997 CTA TTC ATT CAA TCA TAC ACC CA 0,5 10 GAT TCT TTG TGG TGG GTC TG 0,5

DYS392 Kayser, 1997 TCA TTA ATC TAG CTT TTA AAA ACA A 0,5 11 AGA CCC AGT TGA TGC AAT GT 0,5

DYS393 Kayser, 1997 AAC TCA AGT CCA AAA AAT GAG G 0,45 12 TAT ATT TTA CAC ATT TTT GGG CC 0,48

II

DYS437 Ayub, 2000 GAC TAT GGG CGT GAG TGC AT 0,5 14 AGA CCC TGT CAT TCA CAG ATG A 0,5

DYS438 Ayub, 2000 TGG GGA ATA GTT GAA CGG TAA 0,5 10 GTG GCA GAC GCC TAT AAT CC 0,5

DYS439 Ayub, 2000 TCGAGTTGTTATGGTTTTAGGTCT 0,6 12 GTGCTGGCATTACAAGCATGAG 0,6

DYS448 Redd, 2002 TGT CAA AGA GCT TCA ATG GAG A 0,6 20 TCT TCC TTA ACG TGA ATT TCC TC 0,6

DYS449 Redd, 2002 CTT GCT CTT TTT CTT TTC TCT CTT 0,6 24 GCACTCTAGGTTGGACAACAA 0,6

DYS458 Redd, 2002 GCAACAGGAATGAAACTCCAAT 0,4 17.x GTTCTGGCATTACAAGCATGAG 0,4

DYS461 White, 1999 AGG CAG AGG ATA GAT GAT ATG GAT 0,4 11 TTC AGG TAA ATC TGT CCA GTA GTG A 0,5

DYS635 White, 1999 AGT CTC TCA CTT CAA GCA CCA AGC AC 0,7 20 GCA GCA AAA TTC ACA GTT GGA AAA ATG T 0,7

3.4 Fracionamento do DNA por eletroforese

Os produtos de amplificação de cada indivíduo na população para 11 regiões das 17 regiões polimórficas do cromossomo Y descritas acima foram submetidos a fracionamento por eletroforese em gel de poliacrilamida 6% (Acrilamida): bis acrilamida 19:1, TBE 1X, uréia (7M) de 0,4mm de espessura e 40 cm de largura, em cuba Hoefer TM SQ3. A eletroforese foi realizada nas seguintes condições: 2100V, 50mA e 60W. Como tampão de corrida foi utilizado TBE 0,5X ( Tris base 5,4g⁄L, acido bórico, pH em 8.3 e EDTA 2mM pH 8.0). Os resultados foram revelados por coloração por nitrato de prata. Nesse ensaio, o gel de poliacrilamida 6% foi pré-tratado com uma solução de 10% de ácido acético glacial para fixar o fragmento de DNA no gel. Em seqüência a etapa de fixação do fragmento de DNA, o gel foi lavado por 3 vezes com água destilada por 2 minutos cada, e então foi adicionada uma solução de 0.2% de nitrato de prata com a finalidade de impregnar o DNA. Após essa etapa, o gel foi lavado com água destilada para remover o excesso de prata e então, foi revelado com uma solução de 0.28M de carbonato de sódio. Para interromper o processo de revelação utilizou-se a mesma solução de ácido acético feita para fixar o DNA no gel (BASSAM, 1991).

Os loci STR do cromossomo Y adicionais: DYS438, DYS439, DYS448, DYS449, DYS458 e DYS635 (GATA C4) foram submetidos à mesma análise técnica, porém a análise ficou restrita somente para os haplótipos de indivíduos não relacionados que apresentavam identidade na população.

3.5 Caracterização dos alelos

A padronização dos loci STR e a nomenclatura dos alelos do cromossomo Y seguiram as recomendações sugeridas pela International Society of Forensic Genetics (ISFG) (GUSMÃO, 2006). Como exemplo, a região polimórfica DYS19 representa: (D) DNA, (Y) cromossomo Y, (S) alelo cópia simples e o número (19) a região exata em que o marcador esta presente no cromossomo.

Foi utilizada uma escada alélica individual para cada marcador polimórfico do cromossomo Y, construída pela mistura dos alelos mais freqüentes presentes na

população do Estado do Rio de Janeiro, além de um controle positivo de leitura padronizado para identificação dos alelos correspondentes (Quadro 1).

As amostras que continham mutações, resultando em diferenças no número de repetições entre os alelos do mesmo par pai/filho foram reanalizadas. Para fins de confirmação, foi realizada nova extração de DNA genômico, seguida de amplificação do marcador que apresentou o evento mutacional e o fracionamento das amostras em eletroforese em gel de poliacrilamida 6%. Sendo a amostra testada como contraprova.

Após a repetição da análise e confirmação do evento mutacional, as regiões de mutações foram submetidas à confirmação por seqüenciamento.

3.6 Purificação do DNA

A purificação do produto de PCR referente às regiões de mutações foi realizada como etapa intermediária para se obter DNA livre de sal e outros interferentes que pudessem prejudicar a análise da reação de seqüenciamento.

Foi amplificado um conjunto de reações de PCR (5 reações por indivíduo) nos respectivos marcadores que apresentavam desvio entre os alelos do par pai/filho. Uma alíquota de cada amostra foi fracionada em gel de agarose 1,5% com brometo de etídio para verificar a qualidade e quantidade do produto gerado.

Como etapa seguinte foi executada a purificação dos produtos de amplificação pela utilização do kit de purificação da GFX PCR DNA (GE Chalfont St. Giles, UK), segundo as instruções do fabricante. Novamente, foram analisadas a integridade e quantidade do produto purificado. Para isso, as amostras foram fracionadas em gel de agarose 1,5% com brometo de etídio. O DNA foi quantificado por espectrofotometria (NanoDrop 1000 Overview Thermo Scientific).

3.7 Clonagem de fragmento de DNA

Dada a complexibilidade estrutural das unidades de repetições do marcador DYS389 I/II e, a geração de dois produtos de amplificação para o marcador DYS385

a/b, recorremos à técnica de clonagem visando obter produto de DNA íntegro destas duas regiões polimórficas para posterior reação de seqüenciamento.

A clonagem foi executada com kit de clonagem p-GEM®-T Easy Vector Systems (Promega Madison WI) de acordo com as instruções do fabricante.

Novamente realizou-se uma mistura de reações de PCR (5 reações por indivíduo) para o marcador DYS389 I/II que apresentava desvio entre os alelos do par pai/filho e para o marcador DYS385 a/b que continha a presença de um alelo microvariante em outro par pai/filho. Uma alíquota das amostras foi fracionada em gel de agarose 1,5% com brometo de etídio para verificar a qualidade e quantidade do produto gerado.

Posteriormente, o produto de PCR foi purificado por fenol: clorofórmio: álcool isoamílico na proporção 25:24:1 e precipitado com álcool absoluto na proporção 2:1 com a finalidade de eliminar os sais que poderiam interferir no processo de ligação do inserto no vetor. A reação de ligação foi realizada de acordo com o protocolo p-GEM®-T Easy Vector Systems (Promega Madison WI).

Na etapa de transformação, utilizou-se bactérias BL-21 elétro-competentes que foram selecionadas como colônias positivas (plasmídeo + inserto) através de reação em cadeia da polimerase utilizando dois oligonucleotídeos universais do p-GEM®-T Easy Vector (Quadro 2). Finalmente, no caso das colônias positivas, foi realizada a purificação do plasmídeo através do kit de purificação WIZARD® SV minipreps (Promega Madison WI), de acordo com as instruções do fabricante.

Quadro 2 - Seqüência de oligonucleotídeos do plasmídeo p-GEM®-T Easy

Vector.

Oligonucleotídeo Seqüências 5’
3’ C[µM]

T-7 d(TAATACGACTCACTATAGGG) 0,2µM

3.8 Reação de Seqüenciamento

A reação de seqüenciamento do DNA foi realizada com o Kit BigDye Termination Cycle Sequencing (Applied Biosystems, Foster City, CA) gentilmente cedido pelo Dr. Evanguedes Kalaphotrakis (Universidade Federal de Minas Gerais). Na reação de seqüenciamento foram utilizados os seguintes reagentes: 0,3µL do Big Dye Mix, 1,77µL de Tampão de reação, 5µM de cada primer e 20-100ng/µL de produto de amplificação para um volume final de 10 µL.

Após o preparo das amostras a reação de amplificação foi realizada com as seguintes condições: 96°C por 1min, seguido de 35 ciclos com desnaturação a 96°C durante 15 s, anelamento 50°C por 15 s e extensão a 60°C, sendo que para produto de PCR utilizou-se 2 min. e para plasmídeo 4 min. de extensão e finalmente, um hold step a 4°C infinito.

Posteriormente, as amostras foram precipitadas com Isopropanol (MERCK®) 65% e lavadas com etanol (MERCK®) 60%. Como etapa final, as amostras foram tratadas com formamida e submetidas à eletroforese em capilar, através do aparelho ABI 3130 Genetic Analyser (Applied Biosytems, Foster City, CA).

As seqüências foram analisadas através da ferramenta Contig Express, parte integrante do software Vector NTI™ Advance 10 (Invitrogen).

3.9 Análise Estatística

A análise estatística relativa à freqüência de haplótipos e freqüência alélica do locus DYS385 a/b foi realizada por contagem direta. Para o cálculo da diversidade gênica e a diversidade haplótipos foi aplicada a fórmula descrita por Nei (1987):

DG

DH = n(1-∑x

²)/(n-1)

x

O poder de discriminação individual (PDI) foi calculado através do número de haplótipos que não apresentaram identidade na população, dividido pelo número total de haplotipos caracterizados. A fração única de haplótipos (FUH) foi calculada pela divisão dos haplótipos que apareceram uma única vez na população do Estado do Rio de Janeiro, dividido pelo número total de haplótipos caracterizados no estudo. A

capacidade de discriminação de cada locus adicional foi estimada pela correlação FUH/número total de haplótipos à medida que novos marcadores foram adicionados. Para tal, utilizou-se a ferramenta computacional Excel.

As freqüências haplotípicas da população do Estado do Rio de Janeiro foram comparadas com o banco de dados mundial Y base (www.ybase.com), que possui aproximadamente 13.018 registros de haplótipos em um total de 49 marcadores em regiões STR do cromossomo Y (Figura 10).

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search Ybase.

Figura 10. Imagem da ferramenta de busca de hapolótipos de acordo com a população ou região geográfica do banco mundial de haplótipos do cromossomo Y.

Adaptado de: < www.ybase.org/shaplo.asp>. Acessado em julho de 2008.

A taxa mutacional para os 11 marcadores do cromossomo Y na população do Estado do Rio de Janeiro foi estimada pelo número total de mutações dividido pelo número total de análises de transferências meióticas. A taxa de mutação

locus-DYS19/394 DYS385a DYS385b DYS388 DYS389i* DYS389ii* DYS390 DYS391 DYS392 DYS393

14 14 18 13 30 23 10 11 12

DYS425 DYS426 DYS437 DYS438 DYS439 DYS441 DYS442 DYS444 DYS445 DYS446

14

DYS447 DYS448 DYS449 DYS452 DYS454* DYS455* DYS456 DYS458 DYS459a DYS459b

DYS460 DYS461* DYS462 DYS463 DYS464a*DYS464b* DYS464c* DYS464d* DYS570 DYS576

11

DYS607 CDYa CDYb GATA _A10 GATA C4/ DYS635*

TAGA

H4* GGAAT1B07 YCAIIa YCAIIb

específico foi aferida pelo número de mutações em cada marcador polimórfico dividido pelo número de transferências meióticas em cada região analisada. E finalmente, o intervalo de confiança binomial 95% (C.I.) da taxa mutacional foi aferido pelo método Blyth-Still-Casella procedure (CASELLA, 1987).

3.10 Determinação dos haplogrupos

A análise dos haplogrupos foi obtida pela reunião dos conjuntos de marcadores STR do cromossomo Y estudados, uma vez que haplótipos modelos já estabelecidos para diversas populações mundiais possibilitam tal comparação.

Como critério de avaliação, para se separar os referidos haplótipos em seus haplogrupos correspondentes torna-se necessário investigar os eventos mutacionais como eventos únicos ocorridos ao longo da história humana. As mutações utilizadas para mapear as origens de cada haplótipos são mutações pontuais de inserção, deleção e substituição (polimorfismo binário), conhecidas como Single Nucleotídeos Polomorphism (SNP). Dessa forma, foi possível transpor os conjuntos de dados obtidos no presente estudo e compará-los com os perfis de haplótipos modais dos marcadores STR do cromossomo Y depositados em banco de dados mundiais.

Para cada um dos 21 principais haplogrupos originalmente caracterizados por SNPs existe um haplótipo modelo baseado nas leituras mutacionais STR. Por proximidade com haplótipos modelos é possível gerar uma estimativa baseada na freqüência de alelos. Finalmente, pode-se direcionar determinado haplótipo ao seu haplogrupo correspondente. Para tal, foi utilizado um programa de software desenvolvido por Athey (2005) e disponível no site: https://home.comcast.net/~hapest5/hapest5a/hapest5.htm?order=num

4. RESULTADOS

4.1 Construção de banco regional de haplótipos: Análise estatística dos marcadores

STR do cromossomo Y

Foram caracterizados os haplótipos de 132 pares de pai/filho do sexo masculino, não relacionados, do Estado do Rio de Janeiro nos 11 marcadores polimórficos STR do cromossomo Y: DYS19, DYS385 a/b, DYS389 I e II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393, DYS437 e DYS461, como mostrado na tabela 1. Para os 11 loci STR analisados, um total de 135 haplótipos foi registrado em nossa base de dados. Desse total de haplótipos caracterizados, foram encontrados 124 haplótipos que se diferenciavam entre si, gerando um Poder de Discriminação Individual (PDI) de 91,85%. Além disso, 119 haplótipos foram únicos na população, estimando-se uma Fração Única de Haplótipos (FUH) em torno de 88,15% assim como, uma diversidade de haplótipos (DH) de 0,9976.

O haplótipo de número 02 (H-02) apresentou a maior freqüência na população. Esse se repetiu por quatro ocasiões (2,96%). Os haplótipos (15, 36 e 40) ocorreram em outras três situações cada um (2,22%), e finalmente, os haplótipos (01, 39, 45, 46, 51, 65, 90) se repetiram por duas vezes cada um (1,48%). Os demais haplótipos só apareceram na população em um único registro (tabela 1).

Dos haplótipos que revelaram duas ou mais ocorrência na população em estudo, somente os haplótipos (H-51 e H-90) apresentaram perfis genéticos exclusivos na população do Estado do Rio de Janeiro quando comparados aos haplótipos presentes na base de dados do banco mundial (Y base) para os 11 marcadores polimórficos do cromossomo Y.

Os marcadores STR: DYS385 a/b (88,76%), DYS389II (71,08%), DYS390 (68,40%) e DYS19 (61,53%) apresentaram os maiores valores de diversidade gênica.