Camada de Plasma em Microcanais

Texto

(1)Bolsa de Integração Integraç na Investigaçãoo (BII) CEFT/BII/2009/01. Estudo da Camada de Plasma em e Microcanais. Cátia Marisa Lourenço Fidalgo Engenharia Biomédica Porto, Dezembro 2010.

(2) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais. Bolsa de Integração na Investigação (BII) CEFT/BII/2009/01. ______________________________________________________________________. Estudo da Camada de Plasma em e Microcanais ______________________________________________________________________. Orientado por: Rui Lima Co-Orientado por: Ricardo Dias Realizado por: Cátia Marisa Lourenço Fidalgo. Com a colaboração de:. Cátia Fidalgo. 2.

(3) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais. Agradecimentos. À Fundação para a Ciência e Tecnologia pela bolsa concedida no âmbito da Bolsa de Integração na Investigação CEFT/BII/2009/01. Ao orientador, Professor Drº Rui Lima, por todo o apoio, orientação e dedicação que me deu na realização deste projecto, fico-lhe muito agradecida. Ao Drº Ricardo Dias, pelo incentivo, simpatia e atenção ao longo do projecto.. Cátia Fidalgo. 3.

(4) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais. Resumo Tem havido um interesse crescente, por parte da comunidade científica na área da Engenharia Biomédica, na concepção de microdispositivos como ferramentas alternativas no diagnóstico de doenças cardiovasculares e cancerígenas. É, portanto, importante compreender o comportamento do escoamento sanguíneo neste tipo de microdispositivos, de forma a optimizar a concepção e utilização de biochips para análises clínicas. Assim, neste projecto pretendeu-se estudar as principais variáveis que influenciam a formação da camada de plasma em microcanais circulares de vidro e polidimetilsiloxano (PDMS). Após a obtenção de vários vídeos por intermédio de um sistema de microvisualização confocal, o presente estudo concentrou-se essencialmente na utilização de um método de análise de imagem para a medição da espessura da camada de plasma em microcanais de vidro borosilicato com diâmetros de aproximadamente 100µm. Assim, com o auxílio do Image J (NIH) e do plugin MtrackJ foi possível investigar a influência do hematócrito (Hct) no comportamento da camada de plasma neste tipo microcanais. Os resultados sugerem que a espessura da camada de plasma livre de células sanguíneas tende a aumentar com a diminuição do Hct e com o aumento do diâmetro do microcanal.. Cátia Fidalgo. 4.

(5) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais. Abstract In recent years, there has been a growing interest by the biomedical community to develop biochips as an alternative tool to diagnose both cardiovascular and cancer diseases. It is therefore important to understand the behavior of the blood flow and this type of microdevices in order to optimize the design and the use of biochips for clinical analysis. Thus, in this project it is aimed to study the main variables that influence the formation of the plasma layer in circular microchannels of borosilicate glass and polydimethylsiloxane (PDMS). After obtaining several videos through a confocal microvisualization system, this study focused primarily on the use of a method of image analysis for measuring the thickness of the plasma layer in a microchannel of borosilicate glass with diameters of about 100 µm. With the help of the Image J (NIH) and the plugin MtrackJ it was possible to investigate the influence of the hematocrit (Hct) on the behavior of the plasma layer in such kind of microchannels. The results suggest that the thickness of the blood-cell-free layer tends to increase with the decrease of the Hct and with the increase of the diameter of the microchannel.. Cátia Fidalgo. 5.

(6) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais. Índice. Resumo ............................................................................................................................. 4 Abstract ............................................................................................................................. 5 Índice de Figuras .............................................................................................................. 8 Índice de Tabelas ............................................................................................................ 10 Nomenclatura.................................................................................................................. 11 1.. Introdução ............................................................................................................ 12. 2.. O Sangue ............................................................................................................. 14 2.1.. Constituição do Sangue ................................................................................... 14. 2.1.1.. Glóbulos Vermelhos ................................................................................. 14. 2.1.2.. Glóbulos Brancos ..................................................................................... 16. 2.1.3.. Plaquetas sanguíneas ................................................................................ 17. 2.1.4.. Plasma Sanguíneo ..................................................................................... 17. 2.2.. Comportamento dos Fluidos ............................................................................ 19. 2.3.. Viscosidade Sanguínea .................................................................................... 20. 2.4.. Escoamento Sanguíneo .................................................................................... 22. 2.5.. Velocidade do Sangue ..................................................................................... 24. 3.. Microcanais e Fluidos Fisiológicos ..................................................................... 25 3.1.. Capilares de Vidro Borosilicato ....................................................................... 25. 3.2.. Dextran 40 (Dx40) ........................................................................................... 26. 3.3.. Etilenodiamino tetra-acético (EDTA) .............................................................. 26. 3.4.. Soro Fisiológico ............................................................................................... 27. 4.. Software para o Estudo da Camada de Plasma.................................................... 28 4.1.. Phantom ........................................................................................................... 28. 4.2.. Image J ............................................................................................................. 28. 4.2.1.. “Z-Project”................................................................................................ 29. 4.2.2.. “MTrackJ” ................................................................................................ 30. 4.2.3.. “Brightness/Contrast” ............................................................................... 31. 4.2.4.. “Find Edges” ............................................................................................ 32. 4.2.5.. “Binary” .................................................................................................... 33. Cátia Fidalgo. 6.

(7) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais 5.. Procedimento Experimental ................................................................................ 34 5.1.. Materiais e Métodos ......................................................................................... 34. 5.1.1.. Microcanais e Fluidos Utilizados ............................................................. 34. 5.2.. Aquisição de Imagens ...................................................................................... 35. 5.3.. Image J ............................................................................................................. 36. 5.3.1.. “Z-Project”................................................................................................ 37. 5.3.2.. “MTrackJ” ................................................................................................ 38. 5.4. 6.. Processamento em Excel ................................................................................. 41 Resultados Experimentais ................................................................................... 42. 6.1.. Análise e processamento de imagem ............................................................... 43. 6.2.. Resultados da Espessura da Camada de Plasma .............................................. 49. 7.. Análise e Discussão dos Resultados .................................................................... 56. 8.. Conclusões e Trabalho Futuro ............................................................................. 61. 9.. 8.1.. Conclusões ....................................................................................................... 61. 8.2.. Trabalho Futuro ............................................................................................... 62 Referências Bibliográficas ................................................................................... 63. Anexos ............................................................................................................................ 66. Cátia Fidalgo. 7.

(8) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais. Índice de Figuras Figura 2.1 Capilar sanguíneo ……………………………………………...………….14 Figura 2.2 Estrutura dos glóbulos vermelhos ……………………………...…………15 Figura 2.3 Técnica de obtenção do hematócrito ……………………………...……....16 Figura 2.4 Representação dos tipos de leucócitos ……………………………...…….17 Figura 2.5 Ilustração do plasma numa amostra sanguínea ………………………...…18 Figura 2.6 Variação da tensão de corte em relação ao gradiente de velocidade ………………………………………………………………………………..………...20 Figura 2.7 Variação da viscosidade com o hematócrito ……………………………...20 Figura 2.8 Efeito da viscosidade do sangue in vitro através de capilares de vidro ......21 Figura 2.9 Escoamento laminar e turbulento num tubo de vidro ……………………..23 Figura 3.1 Modelo do microcanal de vidro …………………………………….……..25 Figura 4.1 Esquematização do procedimento para o comando “Z-Project” ………….29 Figura 4.2 Imagem de um microcanal com 15% Hct ……………………………...…30 Figura4.3 (a) Imagem aplicando a intensidade máxima (15% Hct); (b) Imagem aplicando a intensidade mínima (15% Hct) ……...…………………………………....30 Figura 4.4 Esquematização do “MTrackJ” ……………………….…………...…..….31 Figura 4.5 Esquematização do “Brightness/Contrast” ……………….…….……...….31 Figura 4.6 (a) Imagem original com 24% Hct; (b) Imagem aplicando o “Brightness/Contrast” ………………………………………………………………....32 Figura 4.7 (a) Imagem depois de aplicada a intensidade máxima com 9% Hct; (b) Imagem aplicando o “Find Edges” ……..……………………………………………..32 Figura 4.8 Esquematização do “Binary” ……………………………………………...33 Figura 5.1 Representação da preparação das amostras de sangue …………...……….35 Figura 5.2 Esquematização de todos os elementos usados na aquisição de imagem ...36 Figura 5.3 Procedimento para a análise de imagem: (a) Imagem original; (b) Imagem resultante da intensidade máxima do “Z-Project”; (c) Imagem resultante da aplicação do “Find Edges” e (d) Imagem com a análise do MTrack J. ………………………….38 Figura 5.4 Representação de uma análise por trajectória de um GV (neste caso na PB), com 35% Hct …………...…………………………………………………………...…39 Figura 5.5 Imagem de 15% Hct com os pontos da análise ……...………………...….40. Cátia Fidalgo. 8.

(9) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais Figura 6.1 Imagem melhorada com 35% de hematócrito …………………………….42 Figura 6.2 Imagem resultante do método da trajectória dos GVs (“Tracking”) ...……43 Figura 6.3 Imagem resultante do método do “Z-Project” …………………………….43 Figura 6.4 Imagem resultante do método das trajectórias dos GVs (“Tracking”) …....44 Figura 6.5 Imagem resultante do método do “Z-Project” …………………………….44 Figura 6.6 Imagem resultante do método da trajectória dos GVs (“Tracking”) ..…….45 Figura 6.7 Imagem resultante do método do “Z-Project” …………………………….45 Figura 6.8 Imagem resultante do método da trajectória dos GVs (“Tracking”) ...……46 Figura 6.9 Imagem resultante do método do “Z-Project” …………………………….46 Figura 6.10 Imagem resultante do método do “Z-Project” …………………………...47 Figura 6.11 Imagem resultante do método da trajectória dos GVs (“Tracking”) .……47 Figura 6.12 Imagem resultante do método do “Z-Project” …………………………...48 Figura 6.13 Imagem resultante do método do “Z-Project” …………………………...48 Figura 6.14 Representação gráfica da variação da ECP para 35% hematócrito ……...50 Figura 6.15 Representação gráfica da variação da ECP para 24% hematócrito …...…51 Figura 6.16 Representação gráfica da variação da ECP para 15% hematócrito ...……52 Figura 6.17 Representação gráfica da variação da ECP para 9% hematócrito …...…..53 Figura 6.18 Representação gráfica da variação da ECP para 2% hematócrito .……....54 Figura 7.1 Representação gráfica da variação da ECP para todos os hematócritos para microcanais de vidro ………………………………………………………………......57 Figura 7.2 Representação gráfica da variação da ECP para todos os hematócritos para microcanais de diâmetro 100µm (35%, 24%, 15% e 2%), 92µm (9%) e 75µm para o caso dos microcanais em PDMS……………………………………………………….59 Figura 7.3 Representação gráfica da espessura da camada de plasma em função do diâmetro do microvaso in vivo, adaptado de [31] ………………………………………60. Cátia Fidalgo. 9.

(10) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais. Índice de Tabelas Tabela 6.1 Resultados da média da ECP para 35% Hct ……………………………...50 Tabela 6.2 Resultados da média da ECP para 24% Hct ……………………………...51 Tabela 6.3 Resultados da média da ECP para 15% Hct ……………………………...52 Tabela 6.4 Resultados da média da ECP para 9% Hct ……………………………….53 Tabela 6.5 Resultados da média da ECP para 2% Hct ……………………………….54 Tabela 7.1 Resultados da ECP em microcanais de PDMS …………………………...56. Cátia Fidalgo. 10.

(11) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais. Nomenclatura GV- Glóbulo vermelho; Hct – Hematócrito; ECP – Espessura da Camada de Plasma; PC – Parede de Cima; PB – Parede de Baixo; PDMS – Polidimetilsiloxano; Dx40 – Dextran 40; EDTA - Etilenodiamino tetra-acético;. Cátia Fidalgo. 11.

(12) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais. 1. Introdução Diversos estudos têm demonstrado a importância de estudar o escoamento sanguíneo na microcirculação. Isto porque existem inúmeras doenças que afectam tanto os vasos sanguíneos de pequeno calibre como o próprio sangue. Assim, torna-se muito importante melhorar os nossos conhecimentos por forma a encontrar soluções para estes problemas. Para tal, já se efectuaram estudos sobre os efeitos de várias doenças nas propriedades do sangue na microcirculação, que podem afectar a viscosidade do plasma, a concentração de glóbulos vermelhos (GVs), propriedades mecânicas dos eritrócitos, viscosidade da membrana, entre outras. Recentemente, tem havido também interesse por parte da comunidade científica na área da Engenharia Biomédica, na concepção de microdispositivos como ferramentas alternativas de análises clínicas. Assim, torna-se imperativo estudar o comportamento do escoamento sanguíneo em microcanais in vitro, tais como microcanais de vidro em borosilicato e PDMS, de forma a optimizar a concepção e utilização deste tipo de microdispositivos em aplicações biomédicas. O principal objectivo deste projecto consiste na determinação da espessura da camada de plasma (ECP) em microcanais de vidro borosilicato para diferentes hematócritos (Hcts). Os microcanais têm diâmetro de 100µm ±2 excepto o caso de 9% hematócrito em que o microcanal tem apenas 92µm. O escoamento sanguíneo tem vindo a ser estudado em microcanais de vidro ao longo dos anos, devido às semelhanças com o escoamento in vivo, apresentando fenómenos hemodinâmicos como por exemplo o efeito de Fahraeus-Lindqvist. Este efeito está muito relacionado com o diâmetro do microcanal em análise, tendo grande importância quando é realizado um estudo como a determinação da ECP em microcanais de vidro. Através de um sistema de microvisualização, Micro-PTV Confocal, foi possível, numa primeira fase, obter as imagens do escoamento sanguíneo com diferentes hematócritos. Estas imagens foram posteriormente analisadas usando o programa de. Cátia Fidalgo. 12.

(13) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais análise de imagem Image J, com o qual foi possível determinar a ECP, sendo este o principal objectivo deste trabalho.. Cátia Fidalgo. 13.

(14) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais. 2. O Sangue 2.1. Constituição do Sangue. O sangue é uma substância líquida que circula nas artérias e veias do organismo. Pode ser descrito como um fluido opaco, com viscosidade superior à água e heterogéneo sendo constituído por um líquido claro – plasma – e uma série de componentes elementares. Num adulto saudável com cerca de 70Kg de peso, o volume de sangue corresponde a aproximadamente 7% do peso do corpo, a que correspondem cerca de 5 litros, dos quais quase 60% é plasma. Na Figura seguinte (2.1), é possível observar um vaso sanguíneo em corte, onde se podem visualizar vários elementos (glóbulos vermelhos e brancos e plaquetas) suspensos no plasma sanguíneo [10].. Figura 2.1 Capilar sanguíneo. [11]. 2.1.1. Glóbulos Vermelhos. Os glóbulos vermelhos são unidades morfológicas da parte vermelha do sangue, também são conhecidos por eritrócitos ou hemácias. São cerca de 700 vezes mais numerosos que os leucócitos (glóbulos brancos) e 17 vezes mais que as plaquetas. Em condições normais existem no sangue aproximadamente 4.5 a 6.5x106/mm3, variando. Cátia Fidalgo. 14.

(15) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais do sexo masculino (5.2 milhões de eritrócitos/mm3) para o sexo feminino (4.5 milhões de eritrócitos/mm3). São constituídos basicamente por globulina e hemoglobina, esta última composta por 4 moléculas proteicas de estrutura terciária e 4 grupos heme que contêm ferro. A sua principal função é transportar o oxigénio (maior quantidade) e o dióxido de carbono (menor quantidade) para os tecidos; têm um período de vida de aproximadamente 120 dias [1], [12].. Figura 2.2 Estrutura dos glóbulos vermelhos. [13]. Os eritrócitos não se movem activamente, são movidos através da circulação pelas forças responsáveis pela circulação sanguínea. Apresentam a forma de disco bicôncavo, com cerca de 7.5 µm (micrómetros) de diâmetro com as extremidades mais espessas que o centro da célula (Figura 2.2). De modo a tornar mais fácil o seu movimento pelos pequenos vasos sanguíneos, os eritrócitos dobram-se pelo centro.. 2.1.1.1.. Hematócrito (Htc). O hematócrito é a percentagem ocupada pelos glóbulos vermelhos no volume total de sangue. Antigamente era usado o método do microhematócrito onde a percentagem de eritrócitos era obtida pela centrifugação a 10000 r.p.m. durante 5 minutos do sangue dentro de um tubo capilar. Actualmente é obtido recorrendo a aparelhos automatizados. Esta metodologia automatizada não mede directamente o hematócrito, mede o volume dos eritrócitos ou o tamanho médio dos eritrócitos (VCM) e quantifica o número de eritrócitos no sangue (Figura 2.3), sendo calculado da seguinte forma:. Cátia Fidalgo. 15.

(16) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais. . ú

(17) á 10. Os valores médios diferem segundo o sexo e a idade, podendo variar 36%-52%, sendo nos homens 42%-52% e nas mulheres 36%-48%. Esta é uma medida cada vez mais importante para efeitos clínicos. Caso o valor seja inferior à média significa que existe pouca quantidade de eritrócitos, o que pode levar a hemorragias, anemias e leucemias. Caso o valor seja superior à média existem muitos eritrócitos em relação ao volume de sangue, podendo ocorrer doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC) [14].. Figura 2.3 Técnica de obtenção do hematócrito. [15]. 2.1.2. Glóbulos Brancos. Os glóbulos brancos ou leucócitos são células produzidas na medula óssea, que estão presentes no sangue, linfa, órgãos linfóides e vários tecidos conjuntivos. Têm a função de combater os microrganismos que causam doenças fazendo a sua captura ou usando anticorpos. Existem três tipos de leucócitos: os granulados (50 a 60%), os agranulados ou linfáticos (30 a 40%) e os monócitos (até 7%) (Figura 2.4). Os leucócitos são capazes de realizar a diapdese (migrar para fora dos vasos capilares) e também a fagocitose que é a captura de organismos estranhos por projecção das suas extremidades (pseudópodes). Um adulto normal possui entre 3.800 e 9.800 mil leucócitos/mm3 de sangue e pode produzir aproximadamente 100 milhões de leucócitos por dia. Uma quantidade muito pequena de leucócitos (leucopenia) ou muito grande de leucócitos (leucocitose) Cátia Fidalgo. 16.

(18) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais indica um distúrbio. No caso da leucopenia, o indivíduo fica susceptível a infecções, no caso da leucocitose pode ser uma resposta a infecções ou a substâncias estranhas [16].. Figura 2.4 Representação dos tipos de leucócitos. [17]. 2.1.3. Plaquetas sanguíneas. A plaqueta sanguínea ou trombócito é um fragmento de célula presente no sangue que é formado na medula óssea. A sua principal função é a formação de coágulos, tendo um papel muito importante na coagulação sanguínea. As plaquetas estão em circulação no sangue durante cerca de 5 dias sendo depois destruídas no baço. Um indivíduo normal tem entre 150.000 e 400.000 plaquetas/mm3 de sangue. A sua diminuição (trombocitopenia) ou disfunção pode levar a sangramentos e o seu aumento (trombocitose) eleva o risco de trombose [18].. 2.1.4. Plasma Sanguíneo. Todos os fluidos fora do compartimento celular constituem o fluído extracelular, do qual 14 ou cerca de 3 litros (considerando um adulto com cerca de 70Kg) está no interior de vasos sanguíneos constituindo o plasma, a porção líquida ou não celular do sangue. O plasma é um líquido (92% água) amarelado e claro no qual as células sanguíneas estão suspensas; é o maior componente único do sangue, correspondendo a. Cátia Fidalgo. 17.

(19) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais 55% do volume total do sangue, como se pode observar na Figura 2.5. Contém inúmeras substâncias em solução ou suspensão, substâncias de pequeno e elevado peso molecular, correspondendo a 10% do volume de plasma. Destas substâncias, as proteínas plasmáticas correspondem a 7%, os sais inorgânicos são cerca de 0,9% e o restante são compostos orgânicos diversos: aminoácidos, glicose, vitaminas, mediadores químicos, entre outros. A concentração total de proteína plasmática é aproximadamente 7.0-7.5g/dl incluindo não só proteínas simples mas também conjugadas: lipoproteínas e glicoproteínas. É possível separar as proteínas plasmáticas em três grupos: as albuminas, as globulinas e o fibrinogénio (proteínas da coagulação) [10].. Figura 2.5 Ilustração do plasma numa amostra sanguínea. [20]. A principal função do plasma é transportar as proteínas e as substâncias dissolvidas, como nutrientes, medicamentos, produtos tóxicos (por exemplo o dióxido de carbono que as células eliminam) e também transporta para todo o corpo os medicamentos ingeridos. O plasma permite uma troca livre dos seus componentes com o líquido intersticial, através dos poros existentes na membrana capilar. As proteínas plasmáticas em condições normais, não atravessam a membrana devido às suas grandes dimensões, permanecendo assim no plasma. O mesmo não acontece com a água e outras substâncias dissolvidas, que atravessam a membrana facilmente. A saída de água do plasma através dos capilares é controlada pela pressão coleidosmótica e pelo estado da permeabilidade das membranas, ou seja, as proteínas extraem água dos tecidos para os capilares mas dificultam a sua saída dos capilares para. Cátia Fidalgo. 18.

(20) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais os tecidos. O principal responsável pela manutenção da pressão coleidosmótica no plasma é a albumina. Um método simples de separar as células do sangue do plasma é através de centrifugação, sendo mais específico a plasmaferese que separa o plasma das hemácias. Se ao plasma sanguíneo forem retirados os factores de coagulação naturalmente (como a fibrina), este fica com o nome de soro sanguíneo. Este soro é obtido através da coagulação do sangue total pois os factores de coagulação foram consumidos pela coagulação das hemácias. O plasma não é um meio de armazenamento e transporte para os factores de coagulação, as proteínas envolventes são necessárias para manter a pressão oncótica do sangue [19].. 2.2. Comportamento dos Fluidos Os fluidos podem ter dois comportamentos distintos: pode ser newtoniano ou nãonewtoniano, como pode ser observado na Figura 2.6. Um fluido newtoniano é um fluido em que a tensão de corte aumenta proporcionalmente com a taxa de deformação. Apresentam a mesma viscosidade em qualquer velocidade do escoamento. Como exemplos temos a água, gases, plasma e líquidos com uma forma química simples, em condições normais. Um fluido não-newtoniano é aquele em que a viscosidade varia de acordo com o grau de deformação aplicado, e sendo assim, não tem viscosidade bem definida. Alguns exemplos são suspensões coloidais, emulsões e géis, o sangue é também um exemplo de um fluido não-newtoniano, pois não apresenta um comportamento linear [28],[29].. Cátia Fidalgo. 19.

(21) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais. Figura 2.6 Variação da tensão de corte em relação ao gradiente de velocidade. [29]. 2.3. Viscosidade Sanguínea. A viscosidade do sangue depende directamente da quantidade de sangue composta por hematócrito. Quanto maior maior o hematócrito, maior é o atrito entre as camadas de sangue, então a viscosidade aumenta significativamente com o aumento do hematócrito. É possível observar esta relação no gráfico seguinte (Figura 2.7).. Figura 2.7 Variação da viscosidade com o hematócrito. [22]. Cátia Fidalgo. 20.

(22) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais Como a resistência no sistema circulatório é maior nos vasos de pequeno calibre (capilares), é importante estudar o comportamento da viscosidade nestes vasos. Além do hematócrito e das proteínas plasmáticas, existem outros factores que afectam a viscosidade sanguínea. Um dos factores é o comportamento da viscosidade nos pequenos vasos em relação aos grandes vasos; nos pequenos vasos, a viscosidade tem muito menos efeitos. Este efeito denomina-se efeito de Fahraeus-Lindqvist, que começa a notar-se quando o diâmetro do vaso é menor que 1.5mm, aproximadamente. Nos capilares, este efeito é muito acentuado, pois, teoricamente, a viscosidade nos pequenos vasos deveria ser metade da observada nos grandes vasos, o que não se verifica, como se pode observar na Figura 2.8.. Figura 2.8 Efeito da viscosidade do sangue in vitro através de capilares de vidro. [23]. O efeito Fahraeus-Lindqvist pode ser causado pelo alinhamento das hemácias quando atravessam os vasos. As hemácias alinham-se no centro do vaso e o plasma junto às paredes dos vasos, eliminando-se assim a resistência viscosa característica do sangue. Por outro lado, este efeito é compensado pela velocidade do fluxo e pelo acoplamento de células. A viscosidade sanguínea aumenta significativamente quando há uma queda na velocidade do fluxo. Assim, como a velocidade do fluxo nos pequenos vasos é muito baixa, por vezes menor que 1mm/s., a viscosidade pode aumentar até 10. Cátia Fidalgo. 21.

(23) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais vezes mais por este motivo. Este efeito pode ser causado pela aderência das hemácias entre si e às paredes dos vasos [22],[23].. 2.4. Escoamento Sanguíneo. O escoamento sanguíneo varia bastante nos diferentes tecidos. Alguns tecidos necessitam de um escoamento bastante maior do que outros. Os tecidos esqueléticos apresentam grandes variações no escoamento sanguíneo em diferentes situações. Durante o repouso, o escoamento é relativamente pequeno, mas aumenta significativamente durante o trabalho, quando existe um acréscimo não só do consumo de oxigénio e nutrientes como também da produção de dióxido de carbono. Através de uma vasoconstrição ou de uma vasodilatação, a cada momento, o escoamento sanguíneo pode aumentar ou diminuir, devido a uma maior ou menor resistência proporcionada ao mesmo [1]. O escoamento do sangue nos vasos sanguíneos tem de obedecer aos princípios físicos do escoamento no interior de condutas, ou seja, da conservação da massa, energia e quantidade de movimento. As forças que provocam o movimento (circulação do sangue) são as forças da gravidade e as forças devidas aos gradientes de pressão. A pressão nos vasos sanguíneos varia de ponto para ponto. É essa variação da pressão com a distância que provoca o movimento do sangue. As forças que, pelo contrário, se opõem à circulação do sangue são as forças de corte (tangencial) e as devidas à turbulência do escoamento [24]. Existem dois tipos principais de escoamento: o escoamento turbulento e o escoamento laminar, como se pode verificar na Figura 2.9. Cátia Fidalgo. 22.

(24) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais. Figura 2.9 Escoamento laminar e turbulento num tubo de vidro. [25]. O escoamento laminar é aquele no qual o fluido se move em camadas, ou lâminas, uma camada deslizando sobre a adjacente e havendo apenas troca de quantidade de movimento molecular. A viscosidade tende a moderar o aparecimento de instabilidade ou turbulência. Para o escoamento laminar o número de Reynolds tem um valor inferior a 2300 em condutas rectilíneas circulares. No escoamento turbulento, as partículas apresentam um movimento irregular por isso a velocidade apresenta componentes transversais ao movimento geral do conjunto do fluido. Tem algumas características especiais, tais como elevado número de Reynolds (superior a 2300), flutuações tridimensionais e dissipação de energia. [25] Pode-se analisar se um escoamento é laminar ou turbulento através da sua posição relativa numa escala de turbulência em que se indica o número de Reynolds (Re). O número de Reynolds é a relação entre as forças de inércia e forças viscosas µ : ∑. ∑ ; também pode ser calculado para condutas circulares de diâmetro D: µ. ρ ! µ. . ! [24], [25] ". .. A resistência ao escoamento no interior de um tubo é significativamente inferior no caso de escoamentos laminares quando comparados com os turbulentos. O escoamento do sangue é em muitos locais turbulento, sendo laminar nos vasos sanguíneos pequenos, o que dificulta o estudo do seu escoamento, uma vez que escoamentos laminares são mais fáceis de entender e a sua teoria está bem desenvolvida, ou contrário dos turbulentos que são mais difíceis de estudar, sem suporte teórico suficiente. O sangue nos microcanais em estudo, comporta-se como um escoamento laminar, apresentam um valor de Re de aproximadamente 0.005.. Cátia Fidalgo. 23.

(25) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais A resistência ao escoamento pode depender de factores como o comprimento do vaso, o diâmetro do vaso e a viscosidade do sangue [1].. 2.5. Velocidade do Sangue. A velocidade do sangue nos vasos depende do diâmetro do vaso e da sua proximidade ao ventrículo esquerdo. Quanto mais próximo do ventrículo, maior será a velocidade do sangue. Por outro lado, quando o sangue flui numa velocidade contínua, através de um vaso liso e longo, a velocidade de escoamento no centro do vaso é maior do que próximo às paredes [26],{27]. Um exemplo para o cálculo da velocidade no sangue no sistema circulatório seria: a área de secção de recta da artéria aorta é de aproximadamente 2,5 cm2. Já a área de secção de recta de todos os capilares existentes no nosso corpo (somados) seria de, aproximadamente, 1000 vezes maior do que a da aorta (2,5 cm2 x 1.000 = 2500 cm2 = 25 m2). A velocidade do sangue na artéria aorta é de, aproximadamente, 30 cm/segundo. Sendo assim, a velocidade do sangue num capilar seria de, aproximadamente, 1.000 vezes menor, ou seja, 30 cm/seg / 1.000 = 0,3 mm/seg. [27].. Cátia Fidalgo. 24.

(26) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais. 3. Microcanais e Fluidos Fisiológicos 3.1. Capilares de Vidro Borosilicato. O vidro borosilicato é um tipo de vidro resistente ao calor e aos químicos, sendo fabricado pela adição de boro aos componentes tradicionais do vidro. O seu baixo coeficiente de dilatação permite que instrumentos de vidro possam manter a precisão das suas medidas mesmo quando sujeito ao calor. Este tipo de vidro é resistente ao calor, o que o torna útil em material de laboratório em que tenha que suportar temperaturas elevadas. Além de laboratórios, também pode ser usado em indústrias químicas, equipamento de cozinha, iluminação, telescópios e armazenamento de resíduos nucleares. Os capilares de vidro borosilicato usados neste projecto têm 100µm ±2 com a excepção de um deles que tinha apenas 92µm, usado para o estudo do hematócrito 9%, este diâmetro diferente talvez seja erro da empresa. Estes capilares foram fabricados pela Vitrocom (Mountain Lakes, NJ, EUA), que foram montados sobre uma lâmina de vidro imersa em glicerina que tem o mesmo índice de refracção, como pode ser observado na Figura 3.1 [3]. O fluxo laminar através de tais microcanais gera um fluxo meramente axial, que é semelhante ao comportamento do fluxo através dos capilares [21].. Figura 3.1 Modelo do microcanal de vidro. [21]. Cátia Fidalgo. 25.

(27) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais. 3.2. Dextran 40 (Dx40). O Dextran 40 é um polissacarídeo modificado, solúvel em água, composto por resíduos de D-glucose e apresenta ligações glicosídicas. É muito usado medicinalmente como um antitrombótico (anti-plaquetário), reduzindo a viscosidade do sangue e tem vindo a ter bastantes aplicações na área farmacêutica e biomédica. O dextran aumenta a electronegatividade das hemácias, plaquetas e do endotélio vascularizado, reduzindo assim a agregação das plaquetas e dos eritrócitos. As grandes vantagens da utilização deste composto são que é biodegradável em humanos, não é tóxico e não provoca reacções no organismo. Por outro lado, existem poucos efeitos colaterais mas que podem ser graves [1],[2].. 3.3. Etilenodiamino tetra-acético (EDTA). O ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) é um composto orgânico que actua como agente quelante, e forma complexos muito estáveis com vários iões metálicos. Os iões podem ser o magnésio, cálcio (para valores de pH superiores a 7), o manganês, ferro (II e III), zinco, cobalto e cobre (II), chumbo e níquel (para valores de pH inferiores a 7). O EDTA é um ácido que actua como um ligante hexadentado. Como apresenta afinidade com o cálcio este ácido é usado como anticoagulante, sendo também utilizado como descolorante para cabelos, fabricação de pão e outros derivados da indústria alimentar [6].. Cátia Fidalgo. 26.

(28) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais. 3.4. Soro Fisiológico. O soro fisiológico é uma solução de água destilada e cloreto de sódio (NaCl) sendo isotónica em relação aos líquidos corporais. Contém 0,9% (em massa) de NaCl em água destilada, ou seja, cada 100mL da solução aquosa contém 0,9 gramas de sal. A presença do sal faz com que a solução apresente, normalmente, um pH=7. Devido às suas características, é muito usado em variadas situações. Em medicina, pode ser usado em pessoas que apresentam sintomas diversos como gripes, respostas alérgicas, limpeza de ferimentos (cortes e queimaduras) e desidratação (meio intravenoso). Em laboratórios é utilizado como meio de soluções para observação ao microscópio. Pode ainda ser usado para a limpeza de lentes de contacto [7],[8]. Neste projecto o soro fisiológico foi utilizado para lavagem de células sanguíneas durante a centrifugação.. Cátia Fidalgo. 27.

(29) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais. 4. Software para o Estudo da Camada de Plasma 4.1. Phantom. O progama Phantom faz parte de uma classe de alta velocidade de câmaras digitais que começou no início de 1990. O projecto original (patenteado pela Vision Research), inclui num mesmo programa um sistema completo que inclui um sensor CMOS, um processador e um sistema operacional interno com memória suficiente para armazenar a enorme quantidade de informação capturada pelo sensor, um sistema de interface poderosa que permite downloads e streaming de dados, sinalização de vídeo e controlo do software da câmara, além da possibilidade de várias redes câmaras sincronizadas. [5] Com este programa foi possível obter e converter os vídeos numa sequência de imagens para posterior análise.. 4.2. Image J. O Image J é um programa de processamento de imagem desenvolvido no National Institutes of Health. Image J permite exibir, editar, analisar, processar, guardar e imprimir de imagens de 8 bits, 16 bits e 32 bits. Este programa possibilita a leitura de variados formatos de imagem, tais como: TIFF, PNG, JPEG, BMP, DICOM, FITS e também formatos RAW. Suporta imagens em série, que são partilhadas numa única janela. Permite ainda o cálculo de ângulos e distâncias, assim como a realização de histogramas de densidade. Suporta funções de processamento de imagem padrão, tais como operações aritméticas e lógicas entre imagens, manipulação de contraste, convolução, análise de Fourier, nitidez, suavização, detecção de bordas e filtragem mediana. Faz. Cátia Fidalgo. 28.

(30) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais transformações geométricas como escala, rotação e saltos. O programa suporta qualquer número de imagens simultaneamente, limitado apenas pela memória disponível. [4]. 4.2.1. “Z-Project”. O “Z-Project” é um dos subprogramas usados para efectuar a análise da camada de plasma. É obtido através dos comandos “Image” – “Stacks” – “Z-Project” (Figura 4.1).. Figura 4.1 Esquematização do procedimento para o comando “Z-Project”.. O “Z-Project” projecta a imagem ao longo de um eixo perpendicular ao plano da imagem (eixo do z). Existem 5 tipos de projecções: a intensidade média, intensidade máxima, intensidade mínima, soma e desvio-padrão. A intensidade média (Average Intensity) caracteriza-se por armazenar a média da intensidade de todos os pixels de uma imagem. A intensidade máxima (Max Intensity), permite projectar uma imagem de saída, cujos valores de máxima intensidade dos pixels são demonstrados. A intensidade mínima (Min Intensity) dá-nos o valor máximo possível do padrão de intensidade dos brilhos da fonte. A soma (Sum slices), cria uma imagem real, resultante da soma de todos os pixels de imagem original. O desvio padrão (Standard Deviation) representa a raiz quadrada da variância e informa sobre a maior ou menor homogeneidade, ou heterogeneidade, de uma imagem digital.. Cátia Fidalgo. 29.

(31) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais Deste subprograma foram usadas apenas dois tipos de projecções (intensidade mínima e máxima) como se pode visualizar nas Figuras seguintes (4.2 e 4.3):. Figura 4.2 Imagem de um microcanal com 15% Hct.. (a). (b). Figura4.3 (a) Imagem aplicando a intensidade máxima (15% Hct); (b) Imagem aplicando a intensidade mínima (15% Hct).. 4.2.2. “MTrackJ”. O “MTrackJ” permite seguir os GV e determinar a espessura da camada de plasma (ECP), efectuando a marcação manual, para posterior análise. Pode ser usado para seguir a trajectória de um GV através de um filme, resultando uma sequência de valores, ou mesmo ser utilizado numa imagem para marcar a zona da ECP. Na Figura 4.4 pode-se ver a esquematização do “MTrackJ”.. Cátia Fidalgo. 30.

(32) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais. Figura 4.4 Esquematização do “MTrackJ”.. 4.2.3. “Brightness/Contrast”. Este comando é obtido no ImageJ através dos comandos “Image” – “Adjust” “Brightness/Contrast”, como é possível observar na Figura 4.5:. Figura 4.5 Esquematização do “Brightness/Contrast”.. Cátia Fidalgo. 31.

(33) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais Este comando permite fazer uma pré-análise das imagens obtidas, ou seja, ajustar o contraste (contrast), a luminosidade (brightness), o mínimo (minimum) e o máximo (maximum). Assim, torna-se mais fácil analisar as imagens pois melhora significativamente a visualização da ECP, como se pode verificar na Figura 4.6.. (a). (b). Figura 4.6 (a) Imagem original com 24% Hct; (b) Imagem aplicando o “Brightness/Contrast”.. 4.2.4. “Find Edges”. Este comando também foi muito útil para determinar a camada de plasma. É obtido no Image J através os comandos “Process” – “Find Edges”. Permite encontrar os limites que temos na imagem a analisar, como se pode verificar na Figura 4.7, muitas vezes é efectuado um pré-processamento da mesma imagem.. (a). (b). Figura 4.7 (a) Imagem depois de aplicada a intensidade máxima com 9% Hct; (b) Imagem após a aplicação do “Find Edges”.. Cátia Fidalgo. 32.

(34) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais. 4.2.5. “Binary”. Este é outro comando do ImageJ, que permite fazer o binário de uma imagem, ficando apenas a preto e branco. Em algumas análises melhora os resultados, devido ao contraste da imagem. É obtido através dos comandos “Process” – “Binary” – “Make Binary” (Figura 4.8).. Figura 4.8 Esquematização do “Binary”.. Incluído neste subprograma está também o comando “Erode”, com o qual se pode fazer, como indica o próprio nome, uma erosão da imagem obtida. Os resultados obtidos podem ser melhores ou não, dependendo da imagem que estamos a analisar e do processamento efectuado.. Cátia Fidalgo. 33.

(35) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais. 5. Procedimento Experimental 5.1. Materiais e Métodos. 5.1.1. Microcanais e Fluidos Utilizados. O fluido utilizado - o sangue - foi obtido a partir de um adulto saudável, sendo adicionado ácido atilenodiamino tetra-acético (EDTA) para impedir a coagulação. Os eritrócitos foram separados por centrifugação e de seguida foi feita uma aspiração dos restantes componentes sanguíneos, sendo lavados duas vezes com soro fisiológico. Posteriormente, os eritrócitos foram marcados com um marcador de fluorescência celular (CM-Dill, c-7000, Molecular Probles) e diluídos com Dextran40 (Dx40) para obter a concentração volúmica necessária aos eritrócitos. Todas as amostras de sangue foram armazenadas hermeticamente a 4ºC até serem realizados as experiências a uma temperatura controlada de 37ºC. Assim foram obtidos cinco fluidos contendo Dx40: um fluido com 35% de hematócrito (35% Hct), 24% Hct, 15% Hct, 9% Hct e 2% Hct (Figura 5.1). Os microcanais usados neste projecto são microcanais de vidro borosilicato, com um diâmetro de 100µm ±2, com excepção de um que tem um diâmetro de 92µm para o caso do hematócrito 9%.. Cátia Fidalgo. 34.

(36) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais. Figura 5.1 Representação da preparação das amostras de sangue [23].. 5.2. Aquisição de Imagens. Numa primeira parte experimental, (Figura 5.2) foi usado um sistema denominado “Micro-PTV Confocal”, que é constituído por um microscópio invertido (IX71, Olympus, Japão) combinado com uma unidade confocal (CSU22, Yokogawa) e um laser DPSS (Laser Quantum Ltd) com um comprimento de onda de 532nm. Para a aquisição de imagens, foi utilizada uma câmara de alta velocidade (Phantom v7.1) que está ligada à unidade confocal CSU22. O microcanal obtido anteriormente foi colocado no microscópio invertido onde o caudal do fluido foi mantido constante com o valor de Re de aproximadamente 0.005 usando uma bomba de seringa (KD Scientific Inc, USA). Para verificar a temperatura foi usado um sistema controlador de temperatura (Tokai Hit) sendo colocado a 37ºC. Assim, já é possível fazer a obtenção de imagens. Todas as imagens adquiridas por este sistema confocal foram captadas no centro dos microcanais com uma resolução de 640x480 pixels, usando uma taxa de 100 imagens/segundo e um tempo de exposição de 9.4ms. Por fim, estas imagens são transferidas para o computador e no programa Phantom vão ser convertidas de vídeos para uma sequência de imagens. Esta sequência obtida pode ser então processada no Image J (NIH) Cátia Fidalgo. [31]. , utilizando também os outros 35.

(37) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais subprogramas, entre eles o “MTrackJ”. [32]. . É possível agora determinar a espessura da. camada do plasma no microcanal em análise.. Figura 5.2 Esquematização de todos os elementos usados na aquisição de imagem.[21]. 5.3. Image J. Para as imagens poderem ser analisadas neste programa, primeiro têm que ser importadas, usando os comandos File – Import – Image Sequence, seleccionando a primeira imagem da sequência e num aviso seleccionar a opção para “8-bit Grayscale”. Assim as imagens estão prontas a serem analisadas. Numa primeira parte é efectuado um pré-processamento das imagens usando o comando “Brightness/Contrast”, para tornar mais fácil a sua análise.. Cátia Fidalgo. 36.

(38) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais. 5.3.1. “Z-Project”. Neste subprograma, foram usados os parâmetros de intensidade máxima e mínima que projectam a imagem num eixo perpendicular ao plano de imagem (eixo “z”) com o propósito de obter uma distribuição estatística das células ao longo do microcanal. Em função do hematócrito e da qualidade das imagens, foram usados os dois parâmetros, sendo de seguida feito outro ajuste de brilho e contraste. Com o método do “Find Edges”, foram obtidos os contornos da imagem que possibilitam uma melhor análise da espessura da camada de plasma. Uma outra forma de efectuar a análise depois de aplicar a intensidade máxima ou mínima é pelo método “Erode”, que elimina grande parte do ruído existente na imagem. De seguida, em cada imagem obtida, quer do “Find Edges” quer do “Erode”, foi medida manualmente a espessura da camada de plasma (ECP) usando o plugin “MTrackJ”. As medições efectuadas foram obtidas por localização visual do limite da camada de plasma, tendo um ponto de referência na parede do microcanal para se poder obter valores de forma a determinar a ECP. Este procedimento pode ser observado na Figura 5.3.. Cátia Fidalgo. 37.

(39) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais. (a). (b). (c). (d). Figura 5.3 Procedimento para a análise de imagem: (a) Imagem original; (b) Imagem resultante da intensidade máxima do “Z-Project”; (c) Imagem resultante da aplicação do “Find Edges” e (d) Imagem com a análise do MTrack J.. 5.3.2. “MTrackJ”. Esta ferramenta foi das mais usadas neste projecto. Numa primeira parte, antes de analisar qualquer imagem, é muito importante fazer a calibração da mesma. Para tal, coloca-se uma linha desde a parede de cima (PC) até à parede de baixo (PB) do microcanal e usando o Set Scale é possível inserir o valor de referência (100 ±2µm) e a unidade de medida a usar, que neste caso é pixels/µm. Considerou-se que 1 pixel ≅ 0.56 µm.. Cátia Fidalgo. 38.

(40) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais 5.3.2.1.. O método das trajectórias dos GVs (“Tracking”). O “MTrackJ” permite obter a trajectória dos glóbulos vermelhos (GVs) “labeled” (células marcadas com corante fluorescente - corados) através de uma sequência de imagens quando estes estão envolvidos na vizinhança da camada de plasma, sendo possível adquirir valores viáveis da ECP. Assim, neste caso, é usado o comando “Add tracks” para colocar um primeiro ponto de referência na PC e sendo os seguintes pontos colocados de forma a seguir a trajectória do GV ao longo do microcanal. Este processo é igualmente repetido para a PB. Com os valores resultantes, é feita uma média dos valores que permite determinar a ECP. Como nas imagens obtidas nem sempre se tem uma boa visualização dos GVs envolvidos na camada de plasma, este processo não foi realizado para todas elas, sendo apenas efectuado para aquelas que se tem uma boa iluminação dos GVs, como se pode verificar na Figura 5.4.. Figura 5.4 Representação de uma análise por trajectória de um GV (neste caso na PB), com 35% Hct.. Cátia Fidalgo. 39.

(41) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais 5.3.2.2.. O método “Z-Project”. Nas imagens pré-processadas do “Z-Project”, foi efectuada da mesma forma a calibração. De seguida, com o comando “Add tracks” é colocado o primeiro ponto (ponto de referência) na PC do microcanal. Neste caso, vão ser distribuídos 25 pontos, pois este é o valor que é estatisticamente correcto para uma avaliação deste tipo. Sendo assim, o 1º ponto é o ponto de referência da PC, e são colocados ao longo da PC 14 pontos; na PB o 16º ponto é o ponto de referência e os restantes são distribuídos na PB, como se pode visualizar na Figura 5.5.. Figura 5.5 Imagem de 15% Hct com os pontos da análise.. Os valores dos pontos são obtidos recorrendo ao Measure Tracks, que depois de guardados em formato ‘.txt’, podem transferidos para o Excel de modo a proceder à sua análise. Para guardar a imagem final com os pontos respectivos foi usado o comando Make movie, que permite guardar a imagem em formato TIFF, GIF, JPEG, entre outros; este último procedimento foi igualmente efectuado para o caso da trajectória dos GVs.. Cátia Fidalgo. 40.

(42) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais. 5.4. Processamento em Excel. Com os valores obtidos do “MTrackJ” já transferidos para o Excel, foi possível obter os valores médios da ECP para posterior comparação. Numa primeira fase é feita a diferença entre o valor de referência e todos os outros valores quer da PC, quer da PB; de seguida é realizado o cálculo da média e do desviopadrão. Este procedimento foi efectuado para todos os resultados obtidos de cada imagem analisada. De modo a poder fazer uma comparação de todos os dados de cada hematócrito, foram colocados os valores da média e desvio padrão de cada análise numa nova folha de Excel e foram feitos gráficos. Assim, é mais simples fazer um melhor estudo de resultados.. Cátia Fidalgo. 41.

(43) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais. 6. Resultados Experimentais Após a aquisição das imagens com diferentes hematócritos, verificou-se verificou que estas não tinham boa qualidade pois não era possível visualizar com clareza os limites das paredes do microcanal, os GVs e a espessura da camada de plasma. Assim, As como se pode verificar na Figura igura 6.1, após após o melhoramento da imagem, já é possível fazer uma melhor análise.. Parede de Cima. Parede de Baixo. Espessura da Camada de Plasma. Glóbulo Vermelho. Figura 6.1 Imagem melhorada com 35% de hematócrito.. Este procedimento foi efectuado em todas as imagens independentemente do método a usar (oo método “Tracking” ou o método “Z-Project”). ). Para as todas as imagens dos vários hematócritos (35%, 24%, 15%, 9% e 2%), foram realizados os dois métodos ou apenas um deles dependendo da imagem. Depois da aplicação de cada um dos métodos, pode-se pode se observar a análise realizada nas Figuras resultantes: Figura 6.2 até à Figura 6.13, depois da utilização do “Add tracks” do “MTrackJ”.. Cátia Fidalgo. 42.

(44) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais. 6.1. Análise e processamento de imagem •. 35% hematócrito:. Na Figura abaixo (6.2) encontra-se um exemplo dos resultados obtidos pela análise do seguimento manual por intermédio do “MTrackJ”.. Figura 6.2 Imagem resultante do método da trajectória dos GVs (“Tracking”).. Figura 6.3 Imagem resultante do método do “Z-Project”.. Na Figura 6.3 foi realizado um pré-processamento com a utilização da intensidade máxima seguido de um “binary” e um “erode”.. Cátia Fidalgo. 43.

(45) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais •. 24% hematócrito:. Na Figura abaixo (6.4) encontra-se um exemplo dos resultados obtidos pela análise do seguimento manual por intermédio do “MTrackJ”.. Figura 6.4 Imagem resultante do método das trajectórias dos GVs (“Tracking”).. Figura 6.5 Imagem resultante do método do “Z-Project”.. Na Figura 6.5 foi realizado um pré-processamento com a utilização da intensidade máxima seguido de um binário.. Cátia Fidalgo. 44.

(46) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais •. 15% hematócrito:. Na Figura abaixo (6.6) encontra-se um exemplo dos resultados obtidos pela análise do seguimento manual por intermédio do “MTrackJ”.. Figura 6.6 Imagem resultante do método da trajectória dos GVs (“Tracking”).. Figura 6.7 Imagem resultante do método do “Z-Project”.. Na Figura 6.7 foi realizado um pré-processamento com a utilização da intensidade máxima seguido de um “binary”.. Cátia Fidalgo. 45.

(47) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais •. 9% hematócrito:. Na Figura abaixo (6.8) encontra-se um exemplo dos resultados obtidos pela análise do seguimento manual por intermédio do “MTrackJ”.. Figura 6.8 Imagem resultante do método da trajectória dos GVs (“Tracking”).. Figura 6.9 Imagem resultante do método do “Z-Project”.. Na Figura 6.9 foi realizado um pré-processamento com a utilização da intensidade máxima seguido de um “find edges”.. Cátia Fidalgo. 46.

(48) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais. Figura 6.10 Imagem resultante do método do “Z-Project”.. Na Figura 6.10 foi realizado um pré-processamento com a utilização da intensidade mínima seguido de um “find edges”.. •. 2% hematócrito:. Na Figura abaixo (6.11) encontra-se um exemplo dos resultados obtidos pela análise do seguimento manual por intermédio do “MTrackJ”.. Figura 6.11 Imagem resultante do método da trajectória dos GVs (“Tracking”).. Cátia Fidalgo. 47.

(49) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais. Figura 6.12 Imagem resultante do método do “Z-Project”.. Na Figura 6.12 foi realizado um pré-processamento com a utilização da intensidade máxima seguido de um “find edges”.. Figura 6.13 Imagem resultante do método do “Z-Project”.. Na Figura 6.13 foi realizado um pré-processamento com a utilização da intensidade mínima seguido de um “find edges”.. Cátia Fidalgo. 48.

(50) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais. 6.2. Resultados da Espessura da Camada de Plasma De todas as análises efectuadas, apenas foram apresentados anteriormente um exemplo de cada, ou seja, uma imagem com o método das trajectórias do GV (“Tracking”) e outra resultante do método “Z-Project”, que pode ser de intensidade máxima ou mínima. Em anexos encontram-se os valores retirados do “MTrackJ” para todos os hematócritos de ambos os métodos (um exemplo de cada método), com os quais foi possível retirar os resultados seguintes. Como foram obtidos muitos valores com cada análise, foi feito o cálculo das médias de cada método para facilitar o estudo. Assim, de seguida são apresentados em tabelas e gráficos os resultados obtidos. Para uma melhor compreensão das tabelas e gráficos, é de referir que a intensidade máxima e mínima das tabelas corresponde ao máximo e mínimo nos gráficos e que o “Tracking” mencionado refere-se ao método da trajectória dos GVs. Nas tabelas encontram-se os valores da análise efectuada quer para a parede de cima (PC) quer para a parede de baixo (PB) do microcanal e as respectivas médias, com ambos os métodos. Nos gráficos, estão representados os valores da média da espessura da camada de plasma (ECP) de cada hematócrito, retirados das tabelas.. Cátia Fidalgo. 49.

(51) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais. •. 35% hematócrito:. Assim, para o hematócrito 35%, são apresentados na tabela 6.1 os valores e na Figura 6.14 o respectivo gráfico.. Tabela 6.1 Resultados da média da ECP para 35% Hct.. 35% Hematócrito (µ µm). Intensidade Máxima. PC. “Tracking”. Média Total. 7,0714. ---------. 7,0714. PB. 6,4552. 9,5192. 7,9872. Média ECP. 6,7633. 9,5192. 8,1412. “Z-Project”. Espessura da Camada de Plasma (µ µm). 35% Hct 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Média Máximos. Média Tracking. Média Total. Figura 6.14 Representação gráfica da variação da ECP para 35% hematócrito.. Cátia Fidalgo. 50.

(52) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais. •. 24% hematócrito:. Para 24% hematócrito, os valores encontram-se na tabela 6.2 e estão representados no gráfico da Figura 6.15.. Tabela 6.2 Resultados da média da ECP para 24% Hct.. Intensidade. Intensidade. Máxima. Mínima. “Z-Project”. “Z-Project”. PC. 5,5931. PB Média ECP. 24% Hematócrito (µ µm). “Tracking”. Média Total. 12,9061. 12,2468. 10,2486. 5,2381. 11,1271. 11,3132. 9,2262. 5,4156. 12,0166. 11,7799. 9,7374. Espessura da Camada de Plasma (µ µm). 24% Hct 14 12 10 8 6 4 2 0 Média Máximo. Média Mínimo. Média Tracking. Média Total. Figura 6.15 Representação gráfica da variação da ECP para 24% hematócrito.. Cátia Fidalgo. 51.

(53) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais. •. 15% hematócrito:. No caso de 15% hematócrito, na tabela 6.3 estão os valores que estão apresentados no gráfico da Figura 6.16.. Tabela 6.3 Resultados da média da ECP para 15% Hct.. Intensidade. Intensidade. Máxima. Mínima. “Z-Project”. “Z-Project”. PC. 8,2723. PB Média ECP. 15% Hematócrito (µ µm). “Tracking”. Média Total. 19,0988. 19,2622. 15,5444. 8,9379. 14,3242. 14,2. 12,4873. 8,6051. 16,7115. 16,7311. 14,0159. Espessura da Camada de Plasma (µ µm). 15% Hct 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 Média Máximo Media Mínimo Média Tracking. Média total. Figura 6.16 Representação gráfica da variação da ECP para 15% hematócrito.. Cátia Fidalgo. 52.

(54) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais. •. 9% hematócrito:. Em 9% hematócrito, o gráfico da Figura 6.17 foi obtido com os valores da tabela 6.4.. Tabela 6.4 Resultados da média da ECP para 9% Hct.. Intensidade. Intensidade. Máxima. Mínima. “Z-Project”. “Z-Project”. PC. 10,0821. PB Média ECP. 9% Hematócrito (µ µm). “Tracking”. Média Total. 14,4449. --------. 12,2635. 10,5944. 12,5025. 20,95. 14,6823. 10,3382. 13,4737. 20,95. 14,9206. Espessura da Camada de Plasma (µ µm). 9% Hct 25 20 15 10 5 0 Média Máximo Média Mínimo Média Tracking. Média Total. Figura 6.17 Representação gráfica da variação da ECP para 9% hematócrito.. Cátia Fidalgo. 53.

(55) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais. •. 2% hematócrito:. Por fim, para 2% hematócrito, os valores da tabela 6.5 estão representados no gráfico da Figura 6.18. Tabela 6.5 Resultados da média da ECP para 2% Hct.. Intensidade. Intensidade. Máxima. Mínima. “Z-Project”. “Z-Project”. PC. 14,5526. PB Média ECP. 2% Hematócrito (µ µm). “Tracking”. Média Total. 13,0462. --------. 13,7994. 13,0382. 12,2426. 26,45. 17,2436. 13,7954. 12,6444. 26,45. 17,6299. Espessura da Camada de Plasma (µ µm). 2% Hct 30 25 20 15 10 5 0 Média Máximo Média Mínimo Média Tracking. Média Total. Figura 6.18 Representação gráfica da variação da ECP para 2% hematócrito.. Cátia Fidalgo. 54.

(56) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais Nos casos em que o método “Tracking” não apresenta valores para a PC ou PB é devido a não haver GVs excitados pelo laser com os quais é possível realizar o “tracking”; considera-se que o comportamento é semelhante na PC e PB.. Cátia Fidalgo. 55.

(57) Estudo da Camada de Plasma em Microcanais. 7. Análise e Discussão dos Resultados Após a análise das imagens, verifica-se que a concentração dos GVs vai sendo maior no centro do microcanal do que junto às paredes, o que influencia a viscosidade sanguínea. Assim, a viscosidade é maior no centro do canal e vai diminuindo com a aproximação da parede. Assim, é importante ter a viscosidade me consideração quando é feita a análise dos resultados. Num trabalho realizado anteriormente em microcanais em PDMS. [1]. , foi efectuado. um estudo semelhante ao realizado no presente trabalho. Apesar de os diâmetros serem diferentes foi decidido compará-los qualitativamente (tabela 7.1). Tabela 7.1 Resultados da ECP em microcanais de PDMS.[1]. Microcanais. 37%. 23%. 13%. 3%. de PDMS. Hematócrito. Hematócrito. Hematócrito. Hematócrito. Média (µ µm). 7,561. 9,283. 11,190. 22,80. Para se poder comparar os resultados obtidos com microcanais de vidro borosilicato com os resultados de microcanais de PDMS (tabela 7.1), foram realizados alguns ajustes, pois a análise foi efectuada para diferentes hematócritos. Assim, vão ser considerados o Hct 37% como Hct 35%, Hct 23% como Hct 24%, Hct 13% como Hct 15% e Hct 3% como Hct 2%. Estes acertos podem ser considerados válidos pois as percentagens de hematócrito são muito próximas. De seguida vai ser feita a análise do gráfico da Figura 7.1, no qual estão representados todos os resultados obtidos para cada hematócrito.. Cátia Fidalgo. 56.