ANÁLISE MORFOLÓGICA E QUANTITATIVA DOS NEURÔNIOS MIOENTÉRICOS IMUNOREATIVOS A PROTEÍNA HU (HUC/HUD) DO CECO DE RATOS (RATTUS NORVEGICUS) DIABÉTICOS SUBMETIDOS A SUPLEMENTAÇÃO COM VITAMINAS C E E DURANTE 120 DIAS DE TRATAMENTO EXPERIMENTAL
Lucas Souza Quijo (PIBIC/CNPq-UEM), Marli Aparecida dos Santos Pereira, Jacqueline Nelisis Zanoni Pinheiro (Orientadora), e-mail: jnzanoni@uem.br. Universidade Estadual de Maringá/Departamento de Ciências Morfofisilógicas, PR.
Área de conhecimento: Ciências Biológicas, Morfologia, Histologia. Palavras-chave: neurônios mioentéricos, ceco, vitaminas C e E.
Resumo
O aumento na produção de radicais livres no diabetes mellitus (DM) é um dos responsáveis pela neuropatia autonômica gastrintestinal presente na doença. As vitaminas C e E melhoram o estresse oxidativo e podem ter um papel relevante no tratamento das complicações neurológicas do diabetes. O propósito deste trabalho foi realizar um estudo morfológico e quantitativo dos neurônios mioentéricos imunoreativos a proteína HU (HuC/ HuD) do ceco de ratos diabéticos suplementados com essas vitaminas durante 120 dias de tratamento experimental. Vinte animais foram igualmente divididos em quatro grupos: controle (C), controle tratado com as vitaminas (CAE), diabético (D) e diabético tratado com as vitaminas (DAE). Após o tratamento os ratos foram mortos e os cecos coletados, fixados e microdissecados para a obtenção de um preparado da túnica muscular, face ventral. Os preparados foram processadas para detecção da proteína HU (HuC/HuD), presente nos neurônios mioentéricos. Os quais foram quantificados através de microscópio de imunofluorescência em uma área total de 4.1 mm2 por preparado. Também foi mensurada a área de 500 corpos celulares por grupo. Com relação a densidade neuronal não houve diferença significativa entre o grupo (DAE) e (D) (p>0.05) e houve redução significativa destes comparado aos demais grupos; com relação a área do corpo neuronal, não houve diferença quando comparados os grupos (D) e (DAE). Concluímos que o DM provocou uma redução da densidade neuronal e o tratamento experimental não apresentou um efeito protetor sobre a densidade neuronal no plexo mioentérico dos ratos diabéticos.
Introdução
O sistema nervoso entérico (SNE) está contido na parede do trato gastrintestinal desde o esôfago até o esfíncter anal interno, desempenha diversas funções e possui dois plexos ganglionares principais: plexo
mioentérico (plexo de Auerbach), que se localiza entre as camadas de músculo liso longitudinal e circular e o submucoso (plexo de Meissner) que está contido na tela submucosa.
O diabetes mellitus (DM) resulta em desequilíbrio metabólico severo, principalmente: distúrbios na via do poliol (BRONWLEE, 2001); formação de produtos de glicolisação avançada (BRONWLEE, 2001); peroxidação lipídica (BAYNES & THORPES, 2001) e o estresse oxidativo (VALKO et al, 2007), podendo estes eventos gerar, induzir ou sofrer a ação dos radicais livres ou espécies reativas de oxigênio (ROS – reactive oxigen species).
Estudos recentes mostraram alterações severas nos componentes do SNE de ratos, em modelos de diabetes experimental, como redução do número de neurônios entéricos em diversos segmentos entre eles no ceco (ZANONI et al, 1997).
A vitamina C é composta por ácido ascórbico, além de suas formas oxidadas. A literatura revela que esta vitamina tem um papel neuroprotetor, pois reduz a fragilidade capilar, o estresse oxidativo e a concentração do sorbitol, através da inibição da aldose redutase, relacionada a via dos poliois (Darkos 2002), e ainda diminui a citotoxicidade extracelular.
A vitamina E apresenta como composto biologicamente mais ativo o α-tocoferol, o seu principal papel é combater os radicais peroxila que desencadeia na peroxidação lipídica. Em pacientes diabéticos, REUNANEN et al. (1998) verificaram que a vitamina E promoveu redução dos indicadores de estresse oxidativo e diminuição da glicosilação protéica. Em ratos diabéticos que foram submetidos ao tratamento com vitamina E, observou-se redução da peroxidação lipídica e o aumento da atividade da enzima superóxido dismutase, aumento da velocidade de condução nervosa e proteção contra disfunção nervosa (VAN DAM et al., 1999). A vitamina C e E atuam de maneira sinérgica, uma vez que aquele é capaz de reduzir o radical tocoferil, produto da oxidação da vitamina E, novamente a α-tocoferol.
Materiais e métodos
Foram empregados 20 ratos machos Wistar (Rattus norvegicus), com 90 dias de idade, divididos em quatro grupos: controle (C), controle suplementado com vitamina C e E (CAE), diabéticos (D), diabéticos suplementados com vitamina C e E (DAE).
A indução do diabetes foi realizada nos ratos dos grupos D e DAE pela administração endovenosa de estreptozootocina na proporção de 35mg kg-1 de peso corporal. Após a indução a glicemia dos ratos foi determinada através de teste para a glicose oxidase.
A vitamina C foi adicionada a água (1g L-1 diariamente preparado) e a vitamina E foi incorporada na ração Nuvital (1% preparado a cada semana). A água e a ração suplementadas foram administradas aos ratos dos grupos CAE e DAE durante 120 dias.
Após esse período os ratos foram mortos e tiveram o ceco coletado e processado. Cada ceco foi lavado com tampão fosfato salinado (PBS) 0,1M
pH 7,4, amarrado em uma das extremidades do experimento e injetado com Zamboni e fechado na outra extremidade, os segmentos foram armazenados no Zamboni por 18horas. Foram cortadas as extremidades dos segmentos, desidratados, diafanizados em xilol e reidratados e armazenados em PBS. Em seguida foi retirada a região apical e a parte distal da região basal foi aberta tendo a face dorsal desprezada. A face ventral foi microdissecada sob estereomicroscópio para obtenção de preparados totais.
Os preparados totais foram submetidos a técnica imunohistoquimica utilizando o anticorpo primário anti-HuC/HuD (1:500), diluído em PBS, BSA 2% Triton X- 100 0,1% em temperatura ambiente sob agitação por 48 horas. Depois da incubação os preparados totais foram lavados três vezes em PBS por cinco minutos. Em seguida os segmentos foram incubados em solução contendo o anticorpo secundário, anti-camundongo conjugado com fluresceína por duas horas em temperatura ambiente. Depois, foram lavados três vezes seguidas com PBS, foram montados em laminas com glicerol tamponado (9:1) e armazenados na geladeira. O controle negativo foi realizado com a omissão do anticorpo primário.
A quantificação e a mensuração foram realizadas a partir de imagens capturadas por uma câmera de alta resolução acoplada a um microscópio de fluorescência. Para cada animal foram contados todos os neurônios presentes em 30 imagens, capturadas em objetiva de 20X, totalizando uma área de 4.132 mm2 por animal. A área (µm2) de 100 neurônios por ceco, perfazendo um total de 500 corpos celulares por grupo foi mensurada.
Os resultados obtidos foram submetidos a análise de variância One-way ANOVA, seguida de Tukey, sendo expresso como média ± desvio padrão. O nível de significância utilizado foi de 5%.
Resultados e Discussão
A estreptozootocina promoveu nos animais diabéticos (UD e DAE) um conjunto de sintomas típicos desta doença, incluindo poliúria, polidpsia, polifagia, hiperglicemia, perda de gordura visceral e reduzido ganho de peso ou até mesmo perda de peso corporal. Estes sintomas resultam das alterações metabólicas provocadas pela ausência/insuficiência de insulina e das mudanças do funcionamento celular, devido a hiperglicemia.
A densidade dos neurônios mioentéricos imunoreativos a proteína HU (HuC/ HuD), marcador da população total, está demonstrada na tabela 1. No grupo D a densidade neuronal reduziu significativamente quando comparados aos grupos C e CAE (p <0,05). A suplementação não alterou os resultados obtidos para os grupos CAE e DAE em comparação aos grupos C e D respectivamente (p >0,05). Os animais do grupo UD foram os que apresentaram a menor densidade neuronal (BRONWLEE, 2001 e BAYNES & THORPES, 2001). Essa redução foi atribuída a distúrbios metabólicos como aumento da via poliol, formação de AGEs, peroxidação lipídica e estresse oxidativo. Esses eventos metabólicos podem induzir, gerar ou sofrer ação dos radicais livres (VALKO et al, 2007). Tendo como
conseqüência um desequilíbrio entre a produção de radicais livres e o sistema antioxidante, que tem a finalidade de manter as funções celulares e evitar a apoptose.
Em relação a área dos corpos celulares houve um aumento significativo nos animais do grupo D e DAE em relação aos controles (p <0,05) Tabela 1.
Tabela 1. Densidade neuronal em neurônios imunoreativos a proteína HU (HuC/ HuD) em 4.132 mm2. Área neuronal em µm2 da amostra de 500 neurônios por grupo.
Grupos
Parâmetros C CAE D DAE
Densidade 689,9 ± 30,0a 698 ± 98,75a 383,2 ± 61,30b 384,6 ± 32,09b
Área neuronal 486,8 ± 11,65a 495,5 ± 12,21a 559,7 ± 13,28b 564,5 ± 13,72b
C: controle, CAE: controle suplementado com vitamina C e E, D: diabético, DAE: diabético suplementado com vitamina C e E. Médias seguidas por letras diferentes na mesma linha são estatisticamente diferentes de acordo com o teste de Tukey (p<0,05)
Conclusões
O diabetes mellitus provocou uma redução significativa na densidade dos neurônios mioentéricos do ceco de ratos e um aumento da área neuronal.
Durante 120 dias de tratamento experimental e na dosagem utilizada neste experimento, a suplementação com as vitaminas C e E não apresentou um efeito protetor sobre a densidade dos neurônios mioentéricos imunoreativos a proteína HU (HuC/ HuD) do ceco de ratos diabéticos suplementados em relação aos diabéticos não suplementados.
Referências
BAYNES, J.W.; THORPES, S.R. Role of oxidative stressing diabetic complication: a new perspective on an old paradigm. Diabetes 1999, 48, 1-9. BROWNLEE M. Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complication. Nature, 2001, 414, 813-820.
DARKO, D. et al. Lack of the effect of oral vitamin C on blood pressure, oxidative stress and endothelial function in Type II diabetes. Clinical Science, 2002, 103, 339-344.
REUNANEN, A.; KNEKT, P.; AARAN, R.K.; AROMAA, A. Serum antioxidants and risk of non-insulin dependent diabetes mellitus. Eur J Nutr, 1998, 52, 89-93.
VALKO, M.; LEIBFRITZ. D.; MONCOL, J.; CONIN M.T.D.; MAZUR, M.; TELSER, J. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int j biochem cell biol 2007, 39, 44-84.
VAN DAM, P.S.; BRAVENBOER, B.; VAN ASBECK, S.; MARX, J.J.M.; GISPEN, W.H. High rat food vitamin E content improves nerve function in streptozotocin-diabetic rats. Eur J Pharmacol 1999, 376, 217-222.
ZANONI, J.N.; MIRANDA-NETO, M.H.; BAZZOTE, R.B.; SOUZA, R.R. Morphological and quantitative analysis of the neurons of the myenteric
plexux of the cecum of streptozotocin diabetic rats. Arq Neuropsiquiatr 1997, 55, 696-702.
