AVALIAÇÃO COMPARATIVA DO NÚMERO DE MASTÓCITOS NA
MUSCULAR CIRCULAR DO ESÔFAGO E DO CÓLON DE
CHAGÁSICOS CRÔNICOS COM E SEM MEGA
SIMONE WANDERLEY PINHEIRO
AVALIAÇÃO COMPARATIVA DO NÚMERO DE MASTÓCITOS NA
MUSCULAR CIRCULAR DO ESÔFAGO E DO CÓLON DE
CHAGÁSICOS CRÔNICOS COM E SEM MEGA
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Patologia, área de concentração: Patologia Geral, da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, como requisito parcial para obtenção do Título de Doutora.
ORIENTADORA: Profa. Sheila Jorge Adad
A doença de Chagas é causada pelo protozoário flagelado, Trypanosoma cruzi, prevalente na América do Sul, tendo como uma de suas lesões básicas a resposta inflamatória (CHAGAS, 1909, 1916; CHAPADEIRO, 1967; PRATA, 1994; EKSI et al., 1996; KIRCHHOFF, 1996; LOPES et al., 2000; PRATA, 2001; ENGMAN, LEON, 2002). A fase aguda da doença ocorre na infância (CHAGAS, 1909) ou pode ser inaparente e, na fase crônica, cardiopatia, megaesôfago e/ou megacólon podem aparecer 30a 40 anos mais tarde como manifestações da fase crônica da doença (CHAGAS, 1916).
Para AMORIM, MARIN-NETO (1995) a função patogenética da destruição dos nervos intrínsecos do coração decorrente da doença é controversa, enquanto para KÖBERLE (1968) e REZENDE, RASSI (1983) o envolvimento do sistema nervoso entérico parece ser essencial na patogênese das desordens gastrointestinais. KÖBERLE (1968a, 1968b) e KÖBERLE et al (1983) descrevem como fator imprescindível e determinante para o aparecimento das manifestações digestivas na doença de Chagas a redução quantitativa dos neurônios dos componentes parassimpático do sistema nervoso
autônomo intramural (teoria parassimpaticopriva). Os plexos intramurais por estarem localizados na parede das vísceras, são as estruturas mais atingidas, em virtude do parasitismo das camadas musculares vizinhas (KÖBERLE, 1968a, 1968b; ADAD, 1996; REZENDE, MOREIRA, 2000). Aparentemente todas as vísceras ocas podem ser afetadas pelo processo de denervação (KÖBERLE, 1957), envolvendo os plexos submucoso e mientérico (KÖBERLE, 1968a, b; ADAD 1989, 1996; ADAD et al. 1991, 1992, 1997a, 1997b, 2001).
TAFURI, MARIA e LOPES (1971) descrevem que a maioria dos autores brasileiros admite que, à exceção de raros casos de doenças congênitas, o megaesôfago e o megacólon são de etiologia chagásica e que as lesões do plexo mientérico constituem o substrato da alteração da motilidade ou, mais precisamente, dos reflexos peristálticos intrínsecos e extrínsecos, especialmente do esôfago e do cólon. As anormalidades encontradas no sistema nervoso entérico são degenerações e redução no número de neurônios intrínsecos (KÖBERLE, NADOR,1955; ADAD, 1989, 1996; ADAD et al., 1991, 2001) .
Segundo KÖBERLE (1958, 1961); BETARELLO, PINOTTI, HABR-GAMA (1983) o principal fator patogenético, senão exclusivo da esofagopatia chagásica, é a denervação; todavia, há dados na literatura que parecem questionar esse ponto de vista, pois esôfagos de calibre normal podem não apresentar um único neurônio (ANDRADE, ANDRADE, 1979; ADAD et al., 1992). Entretanto, existem freqüentes alterações na camada muscular, tais como miosite e fibrose, tanto no esôfago (TAFURI, RASO, 1983; ADAD, 1989; ADAD et al., 1991) quanto no cólon (TAFURI, RASO, 1983; ADAD, 1996; PINHEIRO, 2000; PINHEIRO et al., 2003), que poderiam contribuir para a patogênese dos megas chagásicos.
motilidade, absorção e nos casos mais grave pelos megas (TAFURI, 1987; REZENDE, 1979; REZENDE, LUQUETTI 1994; LOPES et al., 2000). Estes, relativamente freqüentes no Brasil e em alguns da América Latina, constituem a única manifestação digestiva dessa doença passível de diagnóstico anatomopatológico (LOPES et al., 2000).
Observa-se no tubo digestório, desde o esôfago até o reto, quatro camadas distintas: mucosa, submucosa, muscular própria e serosa ou adventícia. As principais diferenças entre os segmentos estão na mucosa, que apresenta epitélios de revestimento adequados às funções (BAILEY, 1973; STERNBERG, 1997). A submucosa exibe variações ao longo do trato gastrintestinal, especialmente quanto à presença de glândulas. A muscular externa ou própria é composta por duas camadas: uma circular (interna) e outra longitudinal (externa) (BAILEY, 1973; FURNESS, COSTA, 1980; GABELLA, 1990; STERNBERG, 1997).
ADAD (1989, 1996) e ETCHEBEHERE (2001) analisaram os gânglios do esôfago e do cólon e concluiram que os gânglios do esôfago são vascularizados e, os do cólon, avasculares, o que pode ter importância na patogênese das esofagopatias e colopatias que cursam com ganglionite e denervação, como a doença de Chagas e a acalásia idiopática. Ganglionite é freqüente no esôfago mesmo em não chagásicos, sem qualquer doença manifesta no tubo digestório.
À macroscopia, o esôfago dos pacientes com a doença de Chagas, pode apresentar diâmetro aumentado proporcionalmente ao grau evolutivo da afecção (REZENDE, MOREIRA, 2000). O órgão mostra graus variados de dilatação, espessamento em virtude da acentuada hipertrofia da túnica muscular (ADAD, 1989,1996) especialmente da camada circular, que se torna mais espessa que a camada longitudinal (KOBERLE, 1960), a ponto de alguns considerarem que há mesmo um componente de hiperplasia (PEREIRA, GONÇALVES, 1958). Há espessamento também, por vezes considerável, da muscular da
mucosa; o epitélio esofágico fica também espessado e mostra paraceratose, ou mesmo ortoceratinização (ADAD, 1989; ANDRADE, 2000). Para WYCHULIS, WOOLAM, ANDERSEN (1971) essas alterações hiperplásicas, ou mesmo displásicas, do epitélio esofágico assumem importância porque tem sido demonstrada uma freqüência aumentada de até 7 vezes, de carcinoma do esôfago em portadores de megaesôfago idiopático. REZENDE, ROSA, VAZ (1985) descrevem que o carcinoma do esôfago também tem sido registrado com maior freqüência em portadores de megaesôfago chagásico. ADAD et al. (1999) em revisão da literatura destacam que tratam-se em geral de carcinomas epidermóides, porém, relatam ter tido um caso de paciente com megaesôfago chagásico com leiomiosarcoma de esôfago.
Ao exame microscópico, encontram-se focos inflamatórios com predomínio de linfócitos, menor número de macrófagos e raros plasmócitos que se associam com a destruição das miocélulas (ADAD, 1989; ADAD et al., 1991). Em alguns casos são vistos granulomas; porém, parasitas raramente são encontrados (KÖBERLE, 1968a, 1968b, ADAD, 1989; ADAD et al., 1991).
Os estudos ultra-estruturais nos megas chagásicos (TAFURI et al., 1971; TAFURI, 1974) confirmaram as observações da microscopia de luz comum e acrescentaram outras. Com relação às alterações nas células musculares e nos componentes do interstício no megaesôfago chagásico, TAFURI et al. (1971) e TAFURI (1974), descreveram que, na maioria das vezes, essas células estavam muito afastadas umas das outras por alargamento do espaço intercelular, ocupado por substância amorfa eletrodensa e finamente granulosa, contendo, eventualmente, fibrilas colágenas orientadas em diversos sentidos.
Segundo TAFURI, RASO (1983), no megaesôfago chagásico observa-se fibrose, ora focal que poderia representar uma seqüela de miosite e estaria associada com infiltrado de mastócitos, ora fibrose intersticial difusa que não mostraria relação topográfica com a
hipóteses: 1) que resultaria da estruturação da substância fundamental por enzimas circulantes, provenientes de fibroblastos distantes da área de fibrose ou 2) estaria relacionada com a mastocitose presente na doença de Chagas experimental e humana.
ANDRADE, ANDRADE (1979), analisando a fibrose miocárdica, admitem, também que a fibrose focal poderia decorrer de cicatrização dos focos inflamatórios relacionados com a presença de mastócitos, todavia ressaltam que a patogenia da fibrose intersticial difusa não está esclarecida. Esses autores levantam a possibilidade de que a organização do edema intersticial crônico, a ação de um anticorpo que atue nas membranas musculares, interstício e vasos, ou a liberação de linfocinas fibrosantes poderiam estar envolvidas.
Do ponto de vista macroscópico, TAFURI, RASO (1983) e LOPES et al. (2000), caracterizam o megacólon como uma dilatação permanente do cólon, acompanhada ou não de espessamento da parede e alongamento da alça, não provocada por obstrução mecânica. KOBERLE (1968a) e OKUMURA (1983) acrescentam a hipertrofia da parede, mas não referem ser a dilatação permanente. ADAD (1996) propõe que os termos espessamento ou hipertrofia da parede sejam substituídos por aumento da massa muscular.
Microscopicamente, as alterações mais características e constantes do megacólon chagásico são as dos plexos nervosos intramurais e das musculares (KÖBERLE, 1968a; KÖBERLE et al., 1983; TAFURI, RASO, 1983; NOGUEIRA, 1996; ADAD, 1996; LOPES et al., 2000; ADAD et al., 2001). São representadas por ganglionite, periganglionite, neurite, perineurite, denervação e fenômenos degenerativos dos neurônios, ocorrendo, por vezes, destruição completa de alguns gânglios, mais freqüentemente no plexo mientérico. Segundo KÖBERLE (1968a, 1968b) o grau de denervação necessário para o aparecimento de megacólon seria em torno de 50-55%,
enquanto que para o megaesôfago seria necessário 90-95%. Esses dados foram confirmados por ADAD (1989, 1996), embora no caso do megacólon seja necessário realizar correção da contagem devido à hipertrofia neuronal (ADAD, 1996; ADAD et al., 2001). Observa-se, na túnica muscular do megacólon chagásico, miosite de intensidade variável, com degeneração e necrose de miocélulas e ainda fibrose, focal ou difusa, direta ou indiretamente relacionada com os focos de miosite (TAFURI, RASO, 1983).
KISS (1972) analisou as células musculares no megacólon "adquirido" e descreveu aumento do número de pontos de íntimo contato entre as miocélulas, vacuolização citoplasmática, dilatação do retículo endoplasmático e desorganização de miofilamentos.
O infiltrado inflamatório é constituído predominantemente por linfócitos (ROCHA et al., 1981; TAFURI, RASO, 1983; LOPES et al., 2000; ADAD, 1996), em especial por linfócitos T (NOGUEIRA, 1996; ADAD, 1996). Em geral, há número menor de linfócitos B, plasmócitos, eosinófilos, macrófagos, mastócitos e neutrófilos (ROCHA et al., 1981; LOPES et al., 2000; ADAD, 1996). A população de linfócitos T é representada tanto por células CD4+ quanto CD8+, que segundo ADAD (1996), não seria possível estimar, sem estudo quantitativo, o tipo predominante. LEMOS (1998) realizou análise quantitativa de subpopulações de linfócitos T no sangue periférico de portadores de megacólon chagásico e mostrou um maior número de CD4+ em relação às células CD8+, numa razão que variou de 1,1 a 1,2.
Focos de miosite foram identificados por ADAD (1996) no cólon em 100% dos chagásicos com mega, quando analisados cortes subseriados de três regiões (transição reto-sigmóide, porção média do sigmóide e transição descendente-sigmóide), assim como fibrose, freqüentemente moderada ou intensa, na túnica muscular. No grupo sem
Em nenhum controle (não chagásico), encontrou miosite e/ou fibrose (ADAD, 1996). Segundo TAFURI, RASO (1983), excepcionalmente a miosite é do tipo granulomatoso. Entretanto, no material de ADAD (1996), miosite granulomatosa foi vista em até 52,9% dos casos de megacólon, talvez por avaliar 30 cortes subseriados de anéis intestinais completos de 3 regiões. No grupo de chagásicos sem megacólon, esta autora não identificou miosite granulomatosa.
ADAD (1996) refere que as alterações vistas no megacólon chagásico, tais como focos de miosite, fibrose e aumento da área da muscular, foram freqüentes tanto na porção média quanto na distal do sigmóide; todavia, a denervação foi mais intensa na região distal (transição reto-sigmóide), em relação à porção média do sigmóide e, nesta, em relação à parte proximal da alça (transição descendente-sigmóide). Essa autora classificou a fibrose no megacólon como de substituição (em geral focal), quando a neoformação conjuntiva parecia substituir miocélulas e denominou-a de endomisial quando havia aumento do conjuntivo entre as miocélulas (freqüentemente difusa), a qual fora chamada de intersticial por TAFURI, RASO (1983).
Os mastócitos são células residentes no tecido conjuntivo, particularmente associadas aos vasos sanguíneos, nervos e ductos glandulares, nas proximidades de superfícies com interface para o meio externo (METCALFE et al., 1997; BERTON et al., 2000), que apresentam grânulos citoplasmáticos metacromáticos. São células capazes de secretar numerosos mediadores inflamatórios em resposta à agressão do tecido e podem estar envolvidos em processos fibróticos (BERTON et al., 2000) e imunológicos (GALLI et al., 1984). Essas células possuem receptores de membrana de alta afinidade para imunoglobulina E (DVORAK et al., 1983), através dos quais podem estabelecer, em
presença de ligantes multivalentes, pontes que levam à sua ativação e à conseqüente liberação do conteúdo dos grânulos.
Os mastócitos são derivados da “stem cell” da medula óssea (KITAMURA, MIYOSHI, 1978; KITAMURA et al., 1981; SCHARADER et al., 1981; NAKAHATA et al., 1982; KANAKURA et al., 1988) e para sobreviverem dependem de fatores sobre as células tronco (METCALFE et al., 1997).
Os mastócitos contêm e liberam várias substâncias como histamina, proteases neutras (LEVI-SCHAFFER, RUBINCHICK, 1995), fatores quimiotáticos (SIRAGANIAN, 1988), heparina (uma glicosaminoglicana sulfatada responsável pela metacromasia) (JORPES, 1937; HOLMGREN, WILANDER, 1937), serotonina, citocinas como as interleucinas 4, 5, 6, fator de necrose tumoral-alfa (OKAYAMA et al., 1995), interleucina 13 (KATZ et al., 1995) e mediadores inflamatórios: prostaglandina D2, leucotrienos C, D, E e fator de ativação das plaquetas.
Os mastócitos quando ativados liberam um espectro de mediadores que iniciam e modulam a reação de hipersensibilidade tipo-imediata. A expressão de proteases neutras dos mastócitos, marcador específico dessas células, é regulada por vários fatores de crescimento. Os mastócitos humanos, assim como em roedores, são conhecidos por produzirem citocinas que modulam a produção de imunoglobulina E e inflamação (SCHWARTZ, 1993).
Os mastócitos expressam uma variedade de aspectos fenotípicos nos tecidos, determinados pelo ambiente local. Retirada dos fatores de crescimento necessários resulta na apoptose de mastócitos. Os mastócitos parecem ser altamente relacionados com múltiplas funções biológicas críticas. São ativados por diversos estímulos, tanto receptor de classe dependente de imunoglobulina E, quanto independente de imunoglobulina E. Ativação através de diversos receptores leva a distintas vias de sinalização. Ativação dos
que ocorre horas depois, pode contribuir para inflamação crônica. Funções biológicas dos mastócitos parecem incluir um papel na imunidade natural, envolvimento em mecanismos de defesa do hospedeiro contra manifestações por parasitos, imunomodulação do sistema imune, tecido de reparação e angiogênese (METCALFE et al.,1997).
O aumento do número de mastócitos é visto em uma variedade de doenças fibrosantes (STEAD et al., 1990), ou proliferativas como na fibrose pulmonar (HUNT et al., 1992; PESCI et al., 1993; BJERMER et al., 1988), fibrose hepática (ARMBRUST et al., 1997; MURATA et al., 1973), neurofibromatose e psoríase (SCHULMAN, 1993; GRUBER, KAPLAN , 1993; ROTHER et al., 1990), esclerodermia (HAWSKINS et al., 1985; NISHIOKA et al., 1987; CHANEZ et al., 1993), quelóide (CRAIG et al., 1986) e em doenças associadas com neovascularização como artrite reumatóide (CRISP et al., 1984; MALONE et al., 1987), diabete melito (NORRBY et al., 1990), hemangioma (GLOWACKI et al., 1982) e outros tipos de tumores ( MENINGER, ZETTER, 1992).
Muitas substâncias produzidas pelos mastócitos tem o potencial de afetar o tecido conjuntivo. A histamina tem demonstrado estímulo para crescimento de fibroblastos e aumento da síntese de colágeno tanto in vivo (SANDBERG, 1962) quanto in vitro (NORRBY, 1973). Heparina e histamina agem juntas podendo influenciar a formação de cicatriz (CLAMAN, 1993). Heparina tem demonstrado também influência no crescimento de fibroblastos e aumento da síntese de colágeno (FERRAO, MASON, 1993; YAMASHITA et al., 1992). A triptase dos mastócitos humanos induz proliferação de fibroblastos in vitro (RUOSS et al., 1991) e também é um fator fibrogênico capaz de estimular a síntese de RNA mensageiro e a quimiotaxia (GRUBER et al.,1997; CAIRNS, WALLS, 1997). Diversas citocinas produzidas pelos mastócitos são conhecidas também pela sua atividade fibrogenética como interleucina 4 (MONROE et al., 1988), Fator de
Necrose Tumoral Alfa e Fator de Crescimento Tumoral Beta 1 (KOVACS, 1991). Finalmente, os mastócitos podem contribuir diretamente para a fibrose através de sua habilidade para produzir glicoproteínas da matriz extracelular (THOMPSON et al., 1991).
Muitos desses mediadores não são produzidos exclusivamente pela ativação dos mastócitos, particularmente no contexto da inflamação crônica. Entretanto, evidências sugerem uma causa direta no relacionamento entre ativação dos mastócitos e inibição da fibrose e/ou ativação e proliferação dos fibroblastos (METCALFE et al.,1997).
Experimentalmente, tem sido demonstrado que os mastócitos do peritônio de ratos aumentam a proliferação de fibroblastos 3T3 e a produção de colágeno em culturas de monocamadas (LEVI-SCHAFFER, RUBINCHICK, 1994).
Estudos in vivo e in vitro sugerem que os mastócitos podem interagir com os fibroblastos, induzindo fibrose. In vitro, os fibroblastos regulam a sobrevivência e diferenciação dos mastócitos, enquanto estas células causam mudanças bioquímicas nos fibroblastos, podendo induzir fibrose (LEVI-SCHAFFER, RUBINCHICK, 1994).
Nas inflamações crônicas em geral têm-se atribuído aos mastócitos participação na colagenogênese do fenômeno produtivo-reparativo (BENSLEY, 1949; MORRIONE, 1952; FERNEX, 1960, 1961, 1963, 1968; ORFANOS, STTÜTGEN, 1963).
A indução de novos vasos sanguíneos, ou angiogênese, tem sido em parte relacionada com os mastócitos (MENINGER, ZETTER, 1992). Primeiro, porque os mastócitos do tecido conjuntivo estão topograficamente associados com pequenos vasos (RAKUSAN et al., 1990; RHODIN, FUJITA, 1989). Segundo, porque os mastócitos acumulam um número de situações angiogênese-dependente, incluindo ovulação (KRISHNA et al., 1989), formação de hemangioma (DETHLEFSEN et al., 1986), neoplasia (DE CIDRE, DE LUSTIG, 1990; DONHUIJSEN et al.,1992; HAFEZ,
al., 1989; RAKUSAN, CAMPBELL, 1991).
Grânulos de mastócitos têm sido descritos dentro das células endoteliais (ATKINS et al., 1985; DESCHRYVER-KECSKEMETI et al., 1992) e estimulam sua proliferação (DUNCAN et al., 1992; MARKS et al., 1986; ROCHE, 1985).
Do ponto de vista funcional, é concebível que uma interação entre mastócitos e sistema nervoso periférico exista e levaria a vários processos inflamatórios e fisiológicos. Neuropeptídeos, como neurotensina e substância P, induzem degranulação dos mastócitos. Além disso, tem sido mostrado que a substância P estimula as células endoteliais vasculares e induz infiltração granulocítica através da degranulação dos mastócitos (GRONBECH, LACY, 1994; LIWAMOTO et al., 1992; MATSUDA et al., 1989; YANO et al., 1989). De fato, mastócitos foram descritos em íntima associação com nervos periféricos no trato gastrintestinal e em uma variedade de sítios anatômicos em humanos e em outras espécies de mamíferos (BIENENSTOCK et al., 1993).
Com relação à fixação dos mastócitos, TAINSH e PEARSE (1992) usaram o formol como fixador e distinguiram dois subtipos de mastócitos, os sensíveis e insensíveis ao formol. Estudaram histoquimicamente 4 tipos de mastócitos: peritoniais, do mesentério, da pele e do pulmão de rato. Essas células apresentaram diferentes respostas à coloração pelo azul de alcian-safranina O após fixação pelo formol. Utilizando a coloração seqüencial verificaram que mastócitos do mesentério e da pele foram resistentes ao formol e exibiram características intermediárias de coloração.
BIANCHI e MUGNAI (1991) testaram as técnicas de coloração por Azul de Toluidina e Astra Blue em língua de rato para análise histoquímica por imagem dos mastócitos. A comparação entre essas duas colorações mostra que a preparação corada pela técnica de Astra Blue captura mais pixels do que aquela corada pelo Azul de
Toluidina. A escolha de Astra Blue como uma alternativa para Azul de Toluidina em análises densidométricas de mastócitos é baseada na propriedade de restringir a coloração aos grânulos dos mastócitos.
XAUBET et al. (1991) compararam diferentes fixadores e métodos de coloração para identificar mastócitos obtidos no lavado broncoalveolar de pacientes com doenças pulmonares intersticiais. As células foram fixadas com formaldeído e metanol e identificadas pelas colorações metacromáticas com May Grunwald Giemsa, Azul de Toluidina e Giemsa Galamina Azul. Depois da fixação pelo formaldeído poucas células foram identificadas independente da coloração utilizada, enquanto que um maior número de mastócitos foi observado depois da fixação com metanol. Usando esse fixador, identificaram-se mais células pela técnica de Azul de Toluidina do que pelo May Grunwald Giemsa; entretanto, não houve diferença entre Toluidina e Giemsa Galamina Azul. A fácil identificação de mastócitos depois da coloração pelo Azul de Toluidina, combinada com a fácil aplicação, sugerem que essa coloração depois da fixação pelo metanol é o método mais útil para determinar mastócitos em fluidos.
RONAI et al. (1993) analisaram as colorações May Grunwald Giemsa e Azul de Toluidina para detectarem mastócitos no fluido broncoalveolar e consideraram as duas colorações adequadas.
Na doença de Chagas tem-se relatado aumento do número de mastócitos, associado ou não ao processo inflamatório, tanto em humanos como experimentalmente.
ALMEIDA et al. (1975) estudando cardiopatas chagásicos verificaram, através de estudo quantitativo, mastocitose relacionada topograficamente com a miocardite. Admitiram que um dos possíveis fatores responsáveis pelo caráter fibrosante da miocardite chagásica crônica seria o aumento do número de mastócitos no miocárdio. Para a contagem dos mastócitos os fragmentos foram cortados em micrótomo de
0,5%, pH 4,5.
ROCHA (1986) descreveu aumento do número de mastócitos no nó sinusal de chagásicos crônicos, porém, esse autor não estabeleceu relação com a fibrose.
TAFURI et al. (1971) e TAFURI (1974), em estudos ultra-estruturais, ressaltaram mastocitose no megaesôfago e megacólon chagásico referindo que os mastócitos localizavam-se na cápsula, no interior dos gânglios do plexo mientérico, próximos ao interstício intermuscular e entre os feixes de células musculares.
TAFURI, RASO (1983) descreveram dois tipos de mastocitose nos megas chagásicos: um focal, sempre relacionado com focos de inflamação e outro, difuso, independente desses focos.
PEREIRA (1972) procedeu estudo quantitativo dos mastócitos da camada muscular circular do esôfago de chagásicos crônicos sem mega e encontrou aumento do número de mastócitos, em relação a não chagásicos. Descreveu que o aumento de mastócitos era difuso, não havendo relação topográfica com os focos inflamatórios. A contagem de mastócitos foi feita em cortes corados pelo azul de toluidina a 0,5% de pH 4.
ADAD (1989) descreveu que parecia haver maior número de mastócitos na muscular circular do esôfago de chagásicos crônicos, distribuídos de modo difuso sem relação topográfica com os focos inflamatórios. Entretanto, ao realizar análise quantitativa de mastócitos na muscular do esôfago (ADAD et al., 1992) e do cólon (ADAD et al, 1997c) de chagásicos crônicos, com e sem mega, não detectaram diferença estatisticamente significante. Esses estudos foram feitos em cortes corados pela técnica de Giemsa.
LOPES (1999), quantificou o colágeno no miocárdio de cardiopatas de diferentes etiologias, inclusive chagásica, através de métodos bioquímicos, biofísicos e morfométricos. Embora não tenha detalhado a análise segundo a etiologia da cardiopatia, verificou que o método morfométrico utilizado (percentagem de pontos da ocular integradora, coincidentes com área de fibrose) guardava relação com a concentração de hidroxiprolina que permitia estimar o teor de colágeno.
PINHEIRO (2000) realizou estudo morfométrico na muscular circular do cólon contando o número de mastócitos e medindo o tecido conjuntivo fibroso nessa camada, em cortes histológicos corados pela técnica de Giemsa de anéis intestinais retirados da transição reto-sigmóide de 26 chagásicos crônicos, 13 com megacólon e 13 sem megacólon comparados a 13 não chagásicos. Demonstrou que havia maior número de mastócitos e aumento evidente do conjuntivo fibroso nos chagásicos com mega em relação aos chagásicos sem mega e aos não chagásicos. Entretanto, não foi possível demonstrar se existia relação entre fibrose e o número de mastócitos, talvez devido ao tamanho da amostra. Expandindo o estudo anterior, foram avaliados 30 casos de chagásicos crônicos sendo 15 anéis da transição reto-sigmóide de chagásicos com megacólon e 15 sem megacólon comparados a 15 não chagásicos, PINHEIRO et al. (2003) concluíram que o número de mastócitos e a fibrose foram maiores no grupo com megacólon em relação ao chagásico sem mega e ao não chagásico e, não houve diferença significante entre os dois últimos grupos. Concluíram ser provável a relação entre mastocitose e fibrose no megacólon chagásico, como já foi demonstrado em outras doenças.
PEREIRA (2002) realizou estudo morfológico, histoquímico, imuno-histoquímico, morfométrico e ultra-estrutural na língua de indivíduos chagásicos crônicos autopsiados e concluiu que a densidade de tecido conjuntivo fibroso e de
não-chagásicos.
Com relação à doença de Chagas experimental, MENEZES, ALCÂNTARA (1965) observaram aumento do número de mastócitos em áreas de reinoculação de T. cruzi na pele de camundongos. Segundo esses autores, a inflamação, determinada por novo inóculo, seria a causa do aumento dessas células.
TAFURI, BRENER (1967) descreveram aumento do número de mastócitos na submucosa e especialmente na muscular do intestino delgado e do intestino grosso de camundongos cronicamente infectados com a cepa “ABC” do Trypanosoma cruzi.
CHAPADEIRO et al. (1988) em ratos albinos Wistar, infectados experimentalmente por Trypanosoma cruzi, referiram que, na fase aguda, os mastócitos estavam ausentes ou eram escassos nos animais infectados. Os autores não fizeram referência ao comportamento dessas células na fase crônica da doença.
PINHEIRO et al. (1992) em ratos cronicamente infectados por Trypanosoma cruzi, demonstraram aumento do número de mastócitos no miocárdio, porém, não puderam demonstrar relação com a fibrose. Quantificaram também o número de eosinófilos, que não diferiu estatisticamente dos ratos não chagásicos. A contagem das células foi realizada em cortes corados pela técnica de Giemsa.
PIRES et al. (1992) infectaram experimentalmente camundongos e demonstraram aumento dos níveis de histamina no músculo esquelético e no trato gastrointestinal. Esses autores sugeriram que haveria paralelismo entre o aumento dos níveis de histamina e o aumento de mastócitos nos tecidos na doença de Chagas.
POSTAN et al. (1994) demonstraram proliferação in situ e migração de mastócitos, obtidos através de cultura in vitro de corações de camundongos infectados experimentalmente por Trypanosoma cruzi. As células foram identificadas como
mastócitos pelo microscópio eletrônico e pela positividade dos grânulos quando corados pelas técnicas de Giemsa, Azul de Toluidina e Sulfato de Berberina.
CALIARI et al. (2002) através de análise morfométrica computadorizada quantificaram as áreas ocupadas por músculo cardíaco, tecido conjuntivo fibroso e tecido adiposo no átrio direito de cães experimentalmente infectados pelo Trypanosoma cruzi. Todos os cães infectados apresentaram miocardite crônica fibrosante com graus variáveis de redução de músculo cardíaco, aumento do tecido conjuntivo e substituição por tecido adiposo.
ADAD estudou isoladamente esôfago (1989) e cólon (1996). Refere ter tido a impressão de que na muscular do esôfago em geral existem muito mais mastócitos que no cólon dos controles. Considerando que o mastócito pode ter relação com processo inflamatório e fibrose, seria interessante avaliar quantitativamente essa célula nesses dois órgãos. Além disso, não encontramos na literatura estudos comparativos entre número de mastócitos na muscular do esôfago em relação ao cólon, seja em indivíduos normais ou chagásicos. Por essas razões nos propusemos realizar análise quantitativa do número de mastócitos na muscular circular do esôfago e do cólon de chagásicos crônicos, com e sem mega, visando conhecer melhor a morfologia do megaesôfago e megacólon chagásicos.
Geral
Avaliar comparativamente o número de mastócitos na muscular do esôfago e do cólon normais e, verificar se existe aumento do número de mastócitos no esôfago e cólon de chagásicos crônicos com e sem mega, visando contribuir para a patogênese das lesões dos megas chagásicos.
Específicos
1. Comparar o número de mastócitos na muscular do esôfago entre os diferentes grupos.
2. Comparar o número de mastócitos na muscular do cólon entre os diferentes grupos. 3. Comparar o número de mastócitos na muscular do esôfago em relação ao cólon dos
mesmos indivíduos, tanto não chagásicos quanto chagásicos.
4. Avaliar semi-quantitativamente a miosite e a fibrose na túnica muscular do esôfago e do cólon de chagásicos crônicos com e sem mega.
1. Material
Foram estudados 28 casos de necrópsias realizadas no Serviço de Patologia do Hospital Escola da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, Uberaba, Minas Gerais.
Os 28 casos correspondem a 16 chagásicos crônicos e 12 não chagásicos sem qualquer patologia gastrointestinal, que serviram de controle. O grupo dos 16 chagásicos foi dividido em dois subgrupos:
Chagásico sem mega - constituído por 10 chagásicos sem megacólon e sem megaesôfago;
Chagásico com mega - composto por 6 chagásicos com megaesôfago e megacólon. O diagnóstico de infecção chagásica foi baseado na positividade de pelo menos duas das três seguintes reações no sangue e/ou líquido pericárdico: ELISA (Enzime-linked-immunosorbent-assay), hemaglutinação passsiva e imunofluorescência indireta para
Trypanosoma cruzi. Os indivíduos do grupo controle apresentaram as três reações negativas.
O diagnóstico de megaesôfago foi feito através de dados clínicos (disfagia) e radiológicos (radiografia contrastada de esôfago). O diagnóstico de megacólon também foi feito a partir de dados clínicos (obstipação intestinal acompanhada freqüentemente de complicações como fecaloma e volvo) e radiológicos (enema opaco mostrando dilatação e perda das haustrações acompanhadas ou não de alongamento do cólon e/ou radiografia simples de abdome, evidenciando fecaloma e dilatação intestinal). A análise dos dados clínicos, exame físico, eletrocardiograma, radiografia de tórax e exame contrastado de esôfago, constantes nas fichas hospitalares e/ou de dados das necrópsias, permitiu classificar os chagásicos em portadores ou não de megaesôfago, bem como cardiopatas (com ou sem insuficiência cardíaca) ou não cardiopatas. Os anexos 1, 2 e 3, relacionam os dados de identificação dos pacientes e os principais achados anatomoclínicos nos grupos não chagásico, chagásico sem mega e chagásico com megaesôfago e megacólon, respectivamente.
A idade variou de 25 a 85 (53 ± 17,26) anos no grupo não chagásico, 47 a 84 (59,5 ± 14,67) anos no grupo chagásico sem mega e 43 a 67 (55,3 ± 12,04) anos no grupo chagásico com mega.
Em relação ao sexo, 10 (83,3%) do grupo não chagásico, 6 (60%) do grupo chagásico sem mega e 5 (83,3%) do grupo chagásico com mega, eram do sexo masculino.
Quanto à cor, foram separados em brancos e não brancos, sendo que 8 (66,7%) do grupo não chagásico, 4 (40%) do grupo chagásico sem mega e 3 (50%) do grupo chagásico com mega, eram brancos.
2.1. Colheita e processamento do material
Retirou-se de cada caso, um anel com cerca de 0,5cm de “altura” na transição reto-sigmóide, ou seja, no sigmóide distal e no terço inferior do esôfago, a 5 cm da cárdia . Os anéis do sigmóide distal e do esôfago foram fixados em formol a 4%, sendo os anéis menores preenchidos com papel de filtro antes de serem colocados no formol para mantê-los com o formato anular. Para evitar que os anéis maiores fossem subdivididos, eram abertos a fresco, enrolados sobre si mesmos com um papel de filtro justaposto à mucosa, facilitando a fixação e moldando-os para posterior inclusão. Após a fixação, os anéis foram submetidos à desidratação, diafanização e inclusão em parafina, confeccionando-se blocos para microtomia, com até 5x5cm, obtendo-se cortes histológicos com 7µm de espessura. Os cortes foram corados segundo as técnicas de hematoxilina-eosina, Tricrômico de Masson e Giemsa. A seguir, procedeu-se à análise quantitativa dos mastócitos, nos cortes corados pela técnica de Giemsa, e à análise semi-quantitativa da fibrose, nos cortes corados pelo Tricrômico de Masson. Os cortes corados pala técnica de hematoxilina-eosina foram utilizados para análise geral dos anéis e avaliação semi-quantitativa da miosite.
2.2. Análise quantitativa dos mastócitos
A contagem dos mastócitos foi feita na muscular circular do cólon e do esôfago, nos cortes corados pela técnica de Giemsa, utilizando um microscópio de luz comum, da marca LEICA, modelo DIASTAR.
Os cortes histológicos dos anéis eram marcados em 8 locais, criando subdivisões aproximadamente eqüidistantes entre si, sendo os mastócitos contados em 8 campos
microscópicos consecutivos em cada subdivisão, totalizando 64 campos microscópicos, com ocular de 10x milimetrada e objetiva de 40x, correspondendo a uma área total de 12,6mm². O número de mastócitos era anotado em cada campo e, ao final, obtinha-se a soma do número de mastócitos em 64 campos para cada caso.
2.3. Análise semi-quantitativa da miosite e da fibrose.
Para a avaliação da miosite foram utilizados cortes histológicos corados pelas técnicas de Hematoxilina-eosina e Giemsa observando-se a presença ou não dessas alterações. O processo inflamatório na túnica muscular do esôfago e do cólon foi classificado em discreto, moderado ou intenso com base no tamanho e freqüência dos focos de exsudato.
Para a análise semi-quantitativa da fibrose foram utilizados os cortes histológicos corados segundo a técnica de Tricrômico de Masson, obtendo-se a fibrose em azul e o músculo em vermelho. A análise da fibrose foi feita na muscular circular do cólon e do esôfago tanto nos chagásicos sem mega quanto com mega comparados ao grupo não chagásico. Analisou-se a fibrose de substituição (neoformação conjuntiva que parecia interromper e substituir miocélulas) e a fibrose intersticial (endomisial/perimisial; aumento do conjuntivo entre as miocélulas). A fibrose foi classificada quanto à intensidade, em discreta, moderada ou intensa.
para a contagem dos mastócitos foi obtido após cálculo das médias acumuladas para quantidades adequadas, nos casos controles (WILLIAMS,1981).
As variáveis analisadas não apresentaram distribuição normal, sendo comparadas por meio da estatística de Kruskal-Wallis com relação aos três grupos de estudo e Mann-Whitney quando agrupados todos os chagásicos num mesmo grupo, através do programa GraphPad InStat.
Para a comparação da miosite e da fibrose foi utilizado o Teste Exato de Fisher. O nível de significância considerado para os testes foi de 5% (p < 0,05).
A análise estatística demonstrou homogeneidade entre os grupos não chagásico, chagásico sem mega e chagásico com mega, com relação à idade, sexo e cor.
1. Análise quantitativa dos mastócitos
A avaliação preliminar global dos cortes corados pela técnica de Giemsa permitiu observar que os mastócitos, em todos os grupos, encontravam-se dispersos em toda a túnica muscular do cólon e do esôfago, em geral sem formar acúmulos (Figuras 1, 2, 3, 4, 5 e 6). Nos chagásicos havia mastócitos tanto nos focos de miosite, quanto dispersos no restante da muscular (Figuras 7 e 8).
microscópicos de grande aumento (área total: 12,6mm²), na muscular circular do esôfago e do cólon de cada caso.
Quadro 1 – Numero de mastócitos em 64 campos microscópicos (área total: 12,6mm²) na muscular do esôfago e do cólon em cada caso, segundo os grupos de estudo.
Caso Grupo Mastócitos Esôfago Mastócitos Cólon 1 NC 346 8 2 NC 160 0 3 NC 70 2 4 NC 18 0 5 NC 122 1 6 NC 62 1 7 NC 373 1 8 NC 59 0 9 NC 133 0 10 NC 241 20 11 NC 84 24 12 NC 108 1 13 CSM 182 3 14 CSM 474 5 15 CSM 185 0 16 CSM 74 1 17 CSM 196 0 18 CSM 114 42 19 CSM 27 1 20 CSM 43 0 21 CSM 44 111 22 CSM 1070 49 23 CCM 578 30 24 CCM 340 29 25 CCM 60 25 26 CCM 118 7 27 CCM 241 31 28 CCM 179 1
NC: não chagásico; CSM: chagásico sem mega; CCM: chagásico com mega
Nota-se, no quadro 1, grande variação no número de mastócitos nos diferentes grupos sendo, em geral, maior no esôfago em comparação ao cólon, em todos os grupos.
A Tabela 1 mostra o resultado da contagem de mastócitos na muscular do esôfago do grupo não chagásico e indivíduos chagásicos com e sem mega em conjunto.
Tabela 1 - Resultado da contagem de mastócitos na muscular circular do esôfago no grupo não chagásico em relação aos indivíduos chagásicos com e sem mega em conjunto.
MASTÓCITOS NÃO CHAGÁSICO CHAGÁSICO Média 148 245 Desvio padrão 114 270 Mediana 115 180 Valor máximo 373 1070 Valor mínimo 18 27 n° de casos 12 16 Teste de Mann-Whitney p = 0,4499
Como observa-se na Tabela 1, embora os valores médios sejam maiores nos chagásicos, talvez devido a grande variabilidade do número de mastócitos no esôfago, a diferença não foi estatisticamente significante entre o grupo não chagásico e os indivíduos chagásicos com e sem mega em conjunto (p = 0,4499).
A Tabela 2 mostra o resultado da contagem de mastócitos na muscular circular do esôfago nos grupos não chagásico, chagásico sem mega e chagásico com mega.
Tabela 2 - Resultado da contagem de mastócitos na muscular circular do esôfago nos grupos não chagásico, chagásico sem mega e chagásico com mega.
NÃO CHAGÁSICO
MASTÓCITOS CHAGÁSICO sem megaesôfago com megaesôfago
Média 148 241 253 Desvio padrão 114 319 187 Mediana 115 148 210 Valor máximo 373 1070 578 Valor mínimo 18 27 60 n° de casos 12 10 6 Teste de Kruskal-Wallis p = 0,4980
Como observa-se na Tabela 2, os valores médios no grupo com mega tendem a ser maiores que no chagásico sem mega e também maiores neste em relação ao não chagásico; porém, não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos (p =
a grande variabilidade individual, além do pequeno número de casos no grupo com mega. A Tabela 3 mostra o resultado da contagem de mastócitos na muscular circular do cólon do grupo não chagásico e dos indivíduos chagásicos com e sem mega em conjunto.
Tabela 3 - Resultado da contagem de mastócitos na muscular circular do cólon no grupo não chagásico em relação aos indivíduos chagásicos com e sem mega em conjunto.
MASTÓCITOS NÃO CHAGÁSICO CHAGÁSICO
Média 5 21 Desvio padrão 8 29 Mediana 1 6 Valor máximo 24 111 Valor mínimo 0 0 n° de casos 12 16 Teste de Mann-Whitney p = 0,0735
Como observa-se na Tabela 3, embora os valores médios sejam maiores nos chagásicos, talvez devido a grande variabilidade no número de mastócitos no cólon, a diferença não foi estatisticamente significante entre os grupos não chagásico e indivíduos chagásicos com e sem mega em conjunto (p = 0,0735).
A Tabela 4 mostra o resultado da contagem de mastócitos na muscular circular do cólon entre os grupos não chagásico, chagásico sem mega e chagásico com mega.
Tabela 4 - Resultado da contagem de mastócitos na muscular circular do cólon, nos grupos não chagásico, chagásico sem mega e chagásico com mega.
NÃO CHAGÁSICO
MASTÓCITOS CHAGÁSICO sem megacólon com megacólon
Média 5 21 20 Desvio padrão 8 37 13 Mediana 1 2 27 Valor máximo 24 111 31 Valor mínimo 0 0 1 n° de casos 12 10 6 Teste de Kruskal-Wallis p = 0,0728
Como observa-se na Tabela 4, apesar dos valores médios nos chagásicos com e sem megacólon terem sido maiores que os do grupo não chagásico, talvez devido a grande variabilidade no número de mastócitos no cólon, a diferença não foi estatisticamente significante (p = 0,0728).
Comparamos também a contagem de mastócitos no esôfago em relação ao cólon do mesmo indivíduo em cada grupo, pois nos impressionou a tendência geral de ter mais mastócitos no esôfago.
A Tabela 5 mostra o resultado da contagem de mastócitos na muscular do esôfago e do cólon, dos mesmos indivíduos, do grupo não chagásico.
Tabela 5 - Resultado da contagem de mastócitos na muscular circular do esôfago e do cólon, dos mesmos indivíduos, no grupo não chagásico.
MASTÓCITOS ESÔFAGO CÓLON
Média 148 5 Desvio padrão 114 8 Mediana 115 1 Valor máximo 373 24 Valor mínimo 18 0 n° de casos 12 12 Teste de Mann-Whitney p < 0,0001
Como nota-se na Tabela 5, quando se compara o número de mastócitos no esôfago e no cólon dos mesmos indivíduos do grupo não chagásico, observa-se diferença estatisticamente significante (p < 0,0001), sendo maior no esôfago.
A Tabela 6 mostra o resultado da contagem de mastócitos na muscular do esôfago e do cólon dos mesmos indivíduos do grupo chagásico com e sem mega em conjunto.
dos mesmos indivíduos, do grupo chagásico com e sem mega em conjunto.
MASTÓCITOS ESÔFAGO CÓLON
Média 245 21 Desvio padrão 270 29 Mediana 180 6 Valor máximo 1070 111 Valor mínimo 27 0 n° de casos 16 16 Teste de Mann-Whitney p < 0,0001
Como observa-se na Tabela 6, quando se compara o número de mastócitos no esôfago e no cólon dos mesmos indivíduos, do grupo chagásico com e sem mega em conjunto, nota-se diferença estatisticamente significante ( p < 0,0001), sendo maior no esôfago.
A Tabela 7 mostra o resultado da contagem de mastócitos na muscular do esôfago e do cólon, dos mesmos indivíduos do grupo chagásico sem mega.
Tabela 7 – Resultado da contagem de mastócitos na muscular circular do esôfago e do cólon, dos mesmos indivíduos do grupo chagásico sem mega.
MASTÓCITOS ESÔFAGO CÓLON
Média 245 21 Desvio padrão 319 37 Mediana 148 2 Valor máximo 1070 111 Valor mínimo 27 0 n° de casos 10 10 Teste de Mann-Whitney p = 0,0021
Como nota-se na Tabela 7, quando se compara o número de mastócitos no esôfago e no cólon dos mesmos indivíduos do grupo sem mega, observa-se diferença estatisticamente significante (p < 0,0021), sendo maior no esôfago.
A Tabela 8 mostra o resultado da contagem de mastócitos na muscular do esôfago e do cólon, dos mesmos indivíduos do grupo chagásico com megaesôfago e megacólon.
Tabela 8 – Resultado da contagem de mastócitos na muscular circular do esôfago e do cólon, dos mesmos indivíduos do grupo chagásico com megaesôfago e megacólon.
MASTÓCITOS MEGAESÔFAGO MEGACÓLON
Média 253 20 Desvio padrão 187 13 Mediana 210 27 Valor máximo 578 31 Valor mínimo 60 1 n° de casos 6 6 Teste de Mann-Whitney p = 0,0022
Como observa-se na Tabela 8, quando se compara o número de mastócitos no esôfago e no cólon dos mesmos indivíduos do grupo chagásico com megaesôfago e megacólon, nota-se diferença estatisticamente significante (p < 0,0022), sendo maior no esôfago.
A análise global desses resultados permite concluir que o número de mastócitos no esôfago é muito maior que no cólon em todos os grupos, o que indica uma diferença na estrutura desses dois órgãos, o que pode ser importante na amplificação da resposta inflamatória. Entretanto, com relação a possível mastocitose nos chagásicos, não foi possível, com o número de casos estudados, estabelecer diferença.
2. Análise semi-quantitativa da miosite e da fibrose
Miosite, caracterizada por infiltrado celular associado a degeneração e/ou necrose das miocélulas não foi observada nos esôfagos do grupo não chagásico (Figura 9). No grupo chagásico sem mega detectou-se miosite em 6 (60%) dos 10 casos, enquanto nos chagásicos com megaesôfago miosite esteve presente em todos os 6 (100%) casos. Em todos os chagásicos os focos eram constituídos predominantemente por mononucleares, ocasionalmente com eosinófilos de permeio (Figuras 10 e 11).
miosite em discreta, moderada ou intensa. De modo geral, quanto mais numerosos eram os focos de miosite, mais intenso era o exsudato e o aspecto destrutivo da lesão.
intersticial e o número de mastócitos na muscular circular do esôfago nos grupos não chagásico, chagásico sem mega e chagásico com mega.
Quadro 2 - Miosite, fibrose de substituição e intersticial e número de mastócitos na muscular circular do esôfago, em cada caso, nos grupos não chagásico, chagásico sem mega e chagásico com mega.
Caso Grupo Miosite Fibrose substituição Fibrose intersticial Número de mastócitos 1 NC - - - 346 2 NC - - - 160 3 NC - - - 70 4 NC - - - 18 5 NC - - - 122 6 NC - - - 62 7 NC - - - 373 8 NC - - - 59 9 NC - - - 133 10 NC - - - 241 11 NC - - - 84 12 NC - - - 108 13 CSM ++ - + 182 14 CSM - - - 474 15 CSM - - - 185 16 CSM + - - 74 17 CSM ++ - + 196 18 CSM ++ + - 114 19 CSM - - - 27 20 CSM + - + 43 21 CSM - - - 44 22 CSM ++ - - 1070 23 CCM + + ++ 578 24 CCM ++ ++ ++ 340 25 CCM + +++ +++ 60 26 CCM ++ + + 118 27 CCM + +++ ++ 241 28 CCM + ++ +++ 179
NC: não chagásico; CSM: chagásico sem mega; CCM: chagásico com mega; - : ausente; + : discreta; ++ : moderada; +++: intensa.
Quando realizamos o Teste exato de Fisher para compararmos a presença ou ausência de miosite entre os grupos chagásico sem mega e chagásico com mega não encontramos diferença estatisticamente significante (p = 0,2335).
Com relação à fibrose, avaliada nos cortes corados pelo Tricrômico de Masson, observou-se que no grupo não chagásico havia, em geral, escasso tecido conjuntivo, na túnica muscular do esôfago (Figura 15), correspondendo a delgadas faixas entre as miocélulas (conjuntivo intersticial). Em nenhum caso deste grupo foi vista fibrose de substituição e/ou intersticial.
No grupo chagásico sem megaesôfago, observou-se discreta fibrose de substituição em apenas 1 (10%) dos 10 casos, representada por raros focos de fibrose interrompendo miocélulas. Em outros 3 (30%) casos desse grupo havia fibrose intersticial discreta (Figura 16).
Nos chagásicos com megaesôfago, havia aumento evidente do tecido conjuntivo fibroso, com fibrose de substituição e intersticial em todos os 6 (100%) casos (Figura 17).
Quando realizamos o Teste exato de Fisher para compararmos a presença ou ausência de fibrose de substituição entre os grupos chagásico sem mega e chagásico com mega, observamos diferença estatisticamente significante (p = 0,0009), sendo mais freqüente no grupo com megaesôfago. Essa fibrose poderia estar relacionada com antigos focos de miosite, pela destruição das miocélulas. Quando comparamos a fibrose intersticial nos grupo chagásico sem mega e chagásico com mega, também observamos diferença estatisticamente significante (p = 0,0114), sendo mais freqüente nos esôfagos com mega.
Com relação à análise do cólon, não havia miosite em nenhum dos controles não chagásicos (Figura 12); detectou-se miosite em 5 (50%) dos 10 casos do grupo chagásico sem mega, sendo discreta em todos eles (Figura 13). Nos chagásicos com megacólon, miosite esteve presente em 4 (66,7%) dos 6 casos, sendo discreta em 2 e moderada nos outros 2 casos (Figura 14). O aspecto da miosite, do ponto de vista qualitativo, era semelhante ao do esôfago.
O Quadro 3 mostra a avaliação da miosite, da fibrose de substituição e intersticial e do número de mastócitos na muscular circular do cólon, nos grupos não chagásico, chagásico sem mega e chagásico com mega.
Quadro 3 - Miosite, fibrose de substituição e intersticial e número de mastócitos na muscular circular do cólon, em cada caso, nos grupos não chagásico, chagásico sem mega e com mega.
Caso Grupo Miosite Fibrose substituição Fibrose intersticial Número de mastócitos 1 NC - - - 8 2 NC - - - 0 3 NC - - - 2 4 NC - - - 0 5 NC - - - 1 6 NC - - - 1 7 NC - - - 1 8 NC - - - 0 9 NC - - - 0 10 NC - - - 20 11 NC - - - 24 12 NC - - - 1 13 CSM + - - 3 14 CSM + + + 5 15 CSM - - - 0 16 CSM - - + 1 17 CSM + - - 0 18 CSM + - - 42 19 CSM - - - 1 20 CSM - - - 0 21 CSM - + - 111 22 CSM + - - 49 23 CCM + + ++ 30 24 CCM ++ ++ +++ 29 25 CCM - ++ +++ 25 26 CCM ++ ++ + 7 27 CCM - ++ ++ 31 28 CCM + ++ +++ 1
NC: não chagásico; CSM: chagásico sem mega; CCM: chagásico com mega; - : ausente; + : discreta; ++ : moderada; +++ : intensa.
Quando realizamos o Teste exato de Fisher para compararmos a presença ou ausência de miosite entre os grupos chagásico sem mega e chagásico com mega não encontramos diferença estatisticamente significante (p = 1,0000).
Como observa-se no Quadro 3 não havia fibrose de substituição e/ou intersticial na muscular circular do cólon em nenhum caso do grupo não chagásico (Figura 18).
2 (20%) dos 10 casos e intersticial em outros 2 (20%) casos.
Nos chagásicos com megacólon, havia aumento evidente do tecido conjuntivo fibroso em todos os 6 (100%) casos, com freqüentes focos de fibrose tanto de substituição quanto intersticial (Figura 20).
ausência de fibrose de substituição no cólon entre os grupos chagásico sem mega e chagásico com mega, observamos que há diferença estatisticamente significante (p = 0,0070), sendo mais freqüente no megacólon. Essa fibrose poderia ter relação com antigos focos de miosite, pela destruição das miocélulas. Quando comparamos a fibrose intersticial nos mesmos grupos, observamos também diferença estatisticamente significante (p = 0,0070), sendo mais freqüente e intensa no megacólon.
Em nosso estudo comparamos o número de mastócitos no esôfago e cólon de chagásicos crônicos com e sem megacólon em relação a não chagásicos; porém, não conseguimos demonstrar diferença entre os grupos.
Não encontramos na literatura nenhum estudo feito simultaneamente nesses dois órgãos. Existem estudos isolados do esôfago e do cólon.
Com relação ao estudo do esôfago nossos dados estão de acordo com os de ADAD et al. (1992), que também não encontraram diferença significante entre chagásicos com mega, sem mega e não chagásicos. Estão em desacordo com o estudo de PEREIRA et al. (1992), que avaliaram 20 casos de chagásicos crônicos sem megaesôfago em relação aos controles, encontrando maior número de mastócitos nos chagásicos. Talvez essa diferença entre nosso estudo e o de PEREIRA et al. (1972) decorra do menor número de casos que avaliamos, porque embora os valores médios da contagem de mastócitos tenham sido maiores nos chagásicos com e sem mega em relação aos controles, a diferença não foi estatisticamente significante. Infelizmente não conseguimos aumentar nosso número de casos devido a dificuldade em obter chagásicos com megaesôfago e megacólon
simultaneamente, que tivessem sido submetidos à necrópsia. No início deste estudo coletamos e avaliamos vários casos só com megacólon ou apenas com megaesôfago; acabamos por excluí-los no final porque os grupos ficavam mistos, dificultando entendimento e comparação do esôfago e cólon no mesmo indivíduo.
Na realidade até mesmo aumentar o número de casos de chagásicos sem megas foi difícil porque necrópsias já realizadas anteriormente às vezes não tinham o anel completo do esôfago e cólon nos locais padronizados para este estudo.
Quanto ao número de mastócitos no cólon, nossos dados concordam com os de ADAD et al. (1997), que também não encontraram diferença significante entre chagásicos com megacólon, sem megacólon e não chagásicos. Esses autores também trabalharam com pequeno número de casos. Ao aumentar o número de casos, PINHEIRO (2000) e PINHEIRO et al. (2003), conseguiram demonstrar maior número de mastócitos nos chagásicos com megacólon. No presente estudo, assim como já referido para o esôfago, notou-se uma tendência dos valores médios de mastócitos no cólon serem maiores nos chagásicos em relação aos não chagásicos (p = 0,07), porém a diferença não foi estatisticamente significante. Outro fator que deve ser lembrado como causa de dificuldade neste presente estudo é que os casos foram todos de necrópsia, o que certamente implica em maior grau de autólise que o ocorrido no material de PINHEIRO (2000) e PINHEIRO et al. (2003), que tinham em seu material vários casos de megacólon obtidos por cirurgia. A autólise pode interferir na afinidade tintorial das células. Entretanto, como queríamos comparar esôfago e cólon dos mesmos indivíduos só foi possível trabalhar com material de necrópsia.
O dado mais interessante deste estudo é sem dúvida a demonstração de que a muscular do esôfago é muito mais rica em mastócitos do que a do cólon. Esse dado é inédito. Não encontramos na literatura nenhum estudo comparativo entre o cólon e o
importante porque o mastócito é uma célula que pode contribuir para a amplificação do processo inflamatório favorecendo maior inflamação no esôfago. Esse dado talvez possa ter relação, pelo menos em parte, com o achado de ADAD et al. (2000) que encontraram maior freqüência e intensidade de miosite no esôfago, em relação ao cólon de chagásicos crônicos. Em nosso material também parece ter ocorrido essa tendência, embora o número de casos de mega do presente estudo seja pequeno.
Acreditamos que diferença estruturais, histológicas, entre órgãos são importantes para explicar aspectos patogenéticos. Foi demonstrado anteriormente, em estudo do nosso grupo (ETCHEBEHERE, 2001), que o esôfago e o cólon diferem com relação aos gânglios do sistema nervoso entérico. A vascularização dos gânglios esofágicos pode favorecer ganglionite e denervação mais rápida e intensa e, de modo semelhante, a maior quantidade de mastócitos poderia favorecer maior grau de miosite e talvez de fibrose.
A fibrose na muscular circular do esôfago e do cólon é mais evidente e intensa nos casos de chagásicos com megas, apresentando-se em parte, como de substituição e em parte, intersticial. Acreditamos que a fibrose de substituição nos megas representaria uma seqüela da miosite, como já foi demonstrado em estudos de megaesôfago (TAFURI et al. 1971; TAFURI, RASO, 1983; ADAD, 1989) e também de megacólon chagásico, sendo que ADAD (1996) descreveu ter observado proliferação fibroblástica incipiente em focos de miosite destrutiva.
Para TAFURI, RASO (1983) a fibrose intersticial não estaria relacionada com a inflamação. Poderia ser decorrente da estruturação da substância fundamental por enzimas circulantes provenientes de fibroblastos distantes da área de fibrose ou poderia estar relacionada à mastocitose presente na doença de Chagas experimental e humana.
Todavia em nosso estudo, não foi possível demonstrar relação entre mastocitose e fibrose, talvez devido ao pequeno número de casos. Acreditamos na possibilidade da fibrose intersticial ser decorrente, pelo menos em parte, de um aumento inespecífico do conjuntivo de sustentação, acompanhando a hipertrofia das miocélulas como é visto por exemplo na cardiopatia hipertensiva. Essa possibilidade está sendo levantada também pelo fato de que a fibrose intersticial no megacólon foi semelhante a encontrada no megaesôfago, apesar do esôfago ser muito mais rico em mastócitos que o cólon.
Em conclusão, não encontramos na literatura estudos que comparem o número de mastócitos na muscular circular do cólon e do esôfago, mas apenas estudos isolados. A análise global desses resultados permite concluir que o número de mastócitos no esôfago é muito maior que no cólon em todos os grupos, o que indica uma diferença estrutural entre esses dois órgãos. Com relação à mastocitose em chagásicos, não foi possível, com o número de casos estudados, estabelecer diferença.
1. Na muscular do esôfago, não houve diferença estatisticamente significante entre o número de mastócitos nos chagásicos com megaesôfago em relação aos chagásicos sem mega e aos não chagásicos.
2. Na muscular circular do cólon não houve diferença, estatisticamente significante, entre o número de mastócitos nos chagásicos com megacólon em relação aos chagásicos sem mega e aos não chagásicos.
3. O número de mastócitos no esôfago foi muito maior que no cólon em todos os grupos, o que indica uma diferença estrutural entre esses dois órgãos.
4. Não houve diferença estatisticamente significante entre a freqüência de miosite no grupo chagásico com mega em relação aos chagásicos sem mega.
5. Fibrose de substituição e fibrose intersticial foram vistas mais frequentemente no grupo chagásico com mega em relação aos chagásicos sem mega.
Com o objetivo de avaliar comparativamente o número de mastócitos na muscular do esôfago e do cólon normal e, verificar se existe aumento do número de mastócitos no esôfago e cólon de chagásicos crônicos com e sem mega, contamos o número de mastócitos e avaliamos semi-quantitativamente a miosite e a fibrose visando contribuir para a patogênese das lesões dos megas chagásicos.
Foram estudados 28 casos de necrópsias sendo 12 controles não chagásicos, 10 chagásicos sem megas e 6 chagásicos com megaesôfago e megacólon. Foram retirados um anel na transição reto-sigmóide e outro no terço inferior do esôfago, a 5 cm da cárdia de todos os casos. Os anéis foram fixados em formol a 4% e processados para inclusão em parafina. Os cortes histológicos foram corados pelas técnicas de Hematoxilina-Eosina, Giemsa e Tricrômico de Masson.
Os mastócitos foram contados em 64 campos do microscópio de luz comum, marca LEICA, modelo DIASTAR (área total: 12,6mm²), em cortes corados pela técnica de Giemsa. Avaliou-se semi-quantitativamente a miosite e o tecido conjuntivo fibroso em
alterações foram classificadas em discreta, moderada ou intensa. As conclusões seguintes sintetizam nossa análise:
1. Na muscular do esôfago não houve diferença, estatisticamente significante, entre o número de mastócitos nos chagásicos com megaesôfago em relação aos chagásicos sem mega e aos não chagásicos.
2. Na muscular circular do cólon não houve diferença, estatisticamente significante, entre o número de mastócitos nos chagásicos com megacólon em relação aos chagásicos sem mega e aos não chagásicos.
3. O número de mastócitos no esôfago foi muito maior que no cólon em todos os grupos, o que indica uma diferença estrutural entre esses dois órgãos.
4. Não houve diferença estatisticamente significante entre a freqüência de miosite no grupo chagásico com mega em relação aos chagásicos sem mega.
5. Fibrose de substituição e fibrose intersticial foram vistas mais freqüentemente no grupo chagásico com mega em relação aos chagásicos sem mega.
EVALUATION OF THE MAST CELLS IN THE CIRCULAR MUSCULATURE OF THE ESOPHAGUS AND COLON OF CHRONIC CHAGA´S DISEASE WITH AND
WITHOUT MEGA
With the objective of comparatively evaluate the number of mast cells in the circular musculature of the esophagus and the normal colon, and to verify if there is an increase of the number of mast cells in the esophagus and colon of chronic chagasics with and without mega, we counted the number of mast cells and evaluated semi-qualitatively myositis and fibrosis aiming to contribute to the pathogenesis of the lesions of mega chagasic ones.
28 cases of necropsy were studied, being 12 non-chagasic controls, 10 chagasic without megas and 6 chagasic with megacolon and megaesophagus. A ring in the rectal sigmoid transition was drawn and another one in the lower third of the esophagus, 5 cm of the cardia of all the cases. The rings were fixed in formol 4% and processed for an
inclusion in paraffin. Histological cuts were stained by the hematoxylin-eosin, Giemsa and Tricrômico of Masson techniques.
Mast cells were counted in 64 microscopic fields of common light, LEICA-DIASTAR model (total area: 12. 6mm², in cuts stained by Giemsa technique. Myositis was semi-quantitatively evaluated and the fibrous connective tissue in cuts stained by hematoxylin-eosin and Tricrômico of Masson techniques. These alterations were classified in discrete, moderate or intense ones.
The following conclusions synthesize our analysis:
1. In the musculature of the esophagus there was no statistically significant difference between the number of mast cells in the chagasic subjects with megaesophagus, related to the chagasic ones without mega and to the non-chagasic ones.
2. In the musculature of the colon there was no statistically significant difference between the number of the mast cells in the chagasic subjects with megacolon, related to the chagasic ones without mega and to the non-chagasic ones.
3. The number of mast cells in the esophagus was much higher than in the colon in all of the groups, what indicates a structural difference between these two organs. 4. There was not a statistically significant difference between the frequency of
myositis in the chagasic group with mega related to the chagasic ones without mega.
5. Substitution fibrosis and interstitial fibrosis were seen more frequently in the chagasic group with mega, related to the chagasic ones without mega.
ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS E TÉCNICAS. Referências Bibliográficas: NBR-6023. Rio de Janeiro, 1989, 19p.
1. ADAD, S.J. Contribuição ao estudo da anatomia patológica e da patogênese do megaesôfago chagásico. Tese (Mestrado). Faculdade de Medicina do Triângulo Mineiro, Uberaba, 1989. 93p.
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3. ADAD, S.J.; ANDRADE, D.C.S.; LOPES, E.R.; CHAPADEIRO, E. Contribuição ao estudo da anatomia patológica do megaesôfago chagásico. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo, v. 33, p. 443-450, 1991.
4. ADAD, S.J.; CANÇADO, C.G.; LOPES, E.R.; GOMES, U.V . Análise quantitativa de neurônios no plexo mientérico no sigmóide de chagásicos crônicos com e sem megacólon . Jornal Brasileiro de Patologia, v. 33, p. 13, 1997a. Suplemento.
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6. ADAD, S.J; CANÇADO, C. G.; ETCHEBEHERE, R.M.; TEIXEIRA, V.P.A.;
GOMES, U.A.; CHAPADEIRO, E.; LOPES, E.R. Neuron count reevalution in the myenteric plexus of chagasic megacolon after morfometric neuron analysis. Virchows Archiv, v. 438, p. 254-258, 2001.
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