INCIDÊNCIA DE OCRATOXINA A EM CAFÉ TORRADO E MOÍDO E EM CAFÉ SOLÚVEL CONSUMIDO NA CIDADE DE BELO HORIZONTE, MG 1

INCIDÊNCIA DE OCRATOXINA A

EM CAFÉ TORRADO E MOÍDO E

EM CAFÉ SOLÚVEL CONSUMIDO

NA CIDADE DE BELO

HORIZONTE, MG

1

Guilherme PRADO

, Marize Silva de OLIVEIRA

,

Fabiana Moreira ABRANTES

, Luciana Gonçalves

dos SANTOS

, Thaís VELOSO

, Rita Elaine de Souza

BARROSO

RESUMO

A ocorrência de ocratoxina A foi verificada em amostras de café solúvel e café torrado e moído, comercializados em Belo Horizonte/MG, no período de outubro/1998 a maio/1999. O método usado para a determinação de ocratoxina A foi a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) em

combinação com cromatografia de imunoafinidade. Os

valores de recuperação e coeficiente de variação de ocratoxina A foram superiores a 73% e inferiores 15%, respectivamente. As amostras de café solúvel e café torrado e moído,

continham níveis de ocratoxina A entre 0,31 e 1,78ng/g e 0,99 e 5,87ng/g, respectivamente. Os resultados revelaram que o café não apresenta níveis de contaminação significativos.

Palavras-chave: ocratoxina A; café; cromatografia líquida de

alta eficiência.

SUMMARY

INCIDENCE OF OCHRATOXIN A IN ROAST AND GROUND COFFEE AND SOLUBLE COFFEE

CONSUMED IN THE CITY OF BELO HORIZONTE, MG. The occurrence of ochratoxin A was measured in soluble coffee samples and roast and ground coffee, market in Belo Horizonte / MG, between october/1998 and may / 1999. The method used for determining ochratoxin A was high

performance liquid chromatography combined with

immunoaffinity chromatography. Recoveries and coefficients of variation of ochratoxin A demonstrated levels above 73% and lower than 15%, respectively. Samples of soluble coffee and roast and ground coffee contained ochratoxin A at levels between 0,31 and 1,78ng/g and 0,99 and 5,87ng/g,

respectively. The results showed that the contamination levels found in the coffee were not significant.

Keywords: ochratoxin A; coffee; high performance liquid

1 — INTRODUÇÃO

A ocratoxina A é um metabólito secundário freqüentemente encontrado como contaminante em alimentos e ração animal. Sua produção ocorre principalmente por Aspergillus

ochraceus e Penicillium verrucosum na faixa de 4-31ºC e 12-37ºC, respectivamente, e em atividade de água superior a 0,85 [11]. Um método de controle da contaminação em condições de armazenamento envolve redução do teor de umidade dos grãos ( ≤ 15%), diminuindo o crescimento de fungos e a produção de micotoxina [1].

Estudos têm demonstrado que a ocratoxina A tem ação

nefrotóxica, teratogênica, carcinogênica, imuno- supressora e está relacionada com a nefropatia endêmica dos Balcãs,

doença degenerativa dos rins que afeta exclusivamente população adulta rural. Mais recentemente, foram descritos evidências de uma possível correlação entre ocratoxina A e desenvolvimento de tumores do trato urinário de seres

humanos na Bulgária [4, 13, 16].

A ocorrência da ocratoxina A tem sido relatada em uma grande variedade de alimentos: carne de porco e aves [6],

cerveja [18], trigo, cevada, aveia, centeio [7, 21], condimentos [14], vinho e suco de uva [29], café verde, torrado e moído, solúvel e bebidas de café [5, 6, 9, 12, 13, 19, 20, 21, 22, 26]. Como esses alimentos fazem parte da dieta normal das

populações, a ocratoxina A tem sido detectada em fluidos biológicos como leite humano e plasma [8, 10, 23].

Em alguns países da Europa, níveis máximos de ocratoxina A de 5µg/Kg em cereais e 1µg/Kg para alimento destinado à população infantil tem sido sugerido como forma de

orientação [25, 27]. No Brasil não existe uma legislação específica para ocratoxina A.

A ocorrência natural de ocratoxina A em café verde tem sido relatada em concentrações na faixa de 0,2 a 360µg/Kg [3]. Devido a fatores como distribuição não homogênea da toxina no café, forma de contaminação (inoculação de cepa

toxigênica x adição de padrão), níveis de ocratoxina A,

metodologia analítica empregada e condições de torrefação, os relatos da estabilidade da ocratoxina A variam de 0 a 100%, provocando uma grande preocupação no consumo dos

produtos de café [17, 28].

Considerando a importância econômica desse cereal para o Brasil e o efeito na saúde da população pelo seu consumo, o objetivo desse trabalho foi verificar os níveis de ocratoxina A em café solúvel e café torrado e moído, consumidos em Belo Horizonte/MG, no período 1998/1999.

2 — MATERIAL E MÉTODOS

Amostras de 10 marcas comerciais de café solúvel e de 47 de café torrado e moído foram coletadas durante o período de outubro/1998 a maio/1999 em supermercados da cidade de Belo Horizonte/MG. A partir de 200g – 1000g de cada

amostra homogeneizada, sub-amostras de 5g – 100g foram separadas para análise.

2.2 – Padrão de ocratoxina A

Foi utilizado padrão da marca Sigma (St. Louis, MO), e determinada a concentração conforme descrito nos métodos de análise da AOAC [2].

Para elaboração da curva de calibração utilizada na

quantificação, transferiu-se exatos 200ng de ocratoxina A e diluiu-se para 10mL com fase móvel para cromatografia

líquida de alta eficiência: 450mL acetonitrila: 550mL solução 4mM de acetato de sódio / ácido acético (19:1), obtendo-se 0,02ng/µL de ocratoxina A. A partir dessa solução, preparou-se, por diluições sucessivas, soluções 0,01, 0,005, 0,0025 e 0,00125ng/µL de ocratoxina A em fase móvel. Todas essas soluções foram passadas em uma unidade de filtração de celulose regenerada de 15mm de diâmetro e 0,45µm de poro, sendo recebidas em frasco âmbar.

2.3 – Colunas de imunoafinidade

Foram utilizadas as colunas Ochratest da Vicam Inc. (USA), dentro do prazo de validade estabelecido (1 ano) e

conservadas a 2 – 8°C até 30 minutos antes da análise,

adaptadas a uma seringa de vidro e conectadas a um sistema de vácuo.

2.4 – Determinação de ocratoxina A

O método utilizado foi o descrito por PITTET et al [15]. A ocratoxina A foi extraída com metanol : bicarbonato de sódio

3% (1:1) e o extrato filtrado em papel de filtro de microfibra de 55mm de diâmetro (vácuo). Seguiu-se uma purificação em coluna de imunoafinidade em um fluxo de 2-3mL/minuto. Após lavagem da coluna com 10mL de água destilada, a ocratoxina A foi eluída com 4mL de metanol. Seguiu-se evaporação até resíduo, em atmosfera de nitrogênio, e

resuspensão imediata em 1000µL de fase móvel. Agitou-se em ultrasom por 1 minuto e filtrou-se em membrana de celulose regenerada de 0,45µm de poro. Injetou-se, então,

100µL da amostra (duplicata) e 100µL de cada solução padrão de ocratoxina A (2 repetições). A partir do cálculo da área do pico da ocratoxina A do extrato da amostra e das soluções padrão, foi calculado o teor de ocratoxina A na amostra.

2.5 – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

A separação e quantificação da ocratoxina A foi conduzida em um sistema de Cromatografia Shimadzu com detetor de

fluorescência (exitação:330nm e emissão: 470nm) e com coluna Shim-pack CLC-ODS RP-18, 5µm 4,6 x 250mm,

precedida de pré-coluna Shim-pack G-ODS 5µm 4,6 x 25mm. A coluna foi eluída isocraticamente, à temperatura ambiente, em um fluxo de 1mL/minuto de fase móvel (ver item 2.2). Nestas condições, o tempo de retenção foi aproximadamente 15,6 minutos. Todos os solventes utilizados foram os

recomendados para cromatografia líquida e a água foi

purificada pelo sistema de ultrafiltração (Barnstead). Durante toda a análise foi borbulhado gás hélio na fase móvel. Para evitar variações no tempo de retenção de ocratoxina A, a fase móvel foi preparada na véspera da análise e deixada durante a noite em um fluxo de 0,2mL/minuto. O pH da fase móvel variou de 3,3 a 3,4.

3 — RESULTADOS E DISCUSSÃO

A Figura 1 ilustra a alta seletividade da limpeza através da utilização de coluna de imunoafinidade, onde não se observa interferentes próximos ao tempo de retenção da ocratoxina A, permitindo uma quantificação exata e precisa. Dessa forma, confirma-se o mais importante desenvolvimento dos últimos anos na área de procedimentos de limpeza e na quantificação de micotoxinas, que são as colunas de imunoafinidade [24].

Os resultados dos valores de recuperação e coeficientes de variação em café solúvel e café torrado e moído, após adição de ocratoxina A, são mostrados nas Tabelas 1 e 2. As

recuperações obtidas variaram de 76,5–87%, na faixa de 1,5 a 10,0ng/g de ocratoxina A adicionada em café solúvel (média 82%). Em café torrado e moído, valores de 73 e 86% de

recuperação (média de 80%) foram alcançados quando a

concentração de ocratoxina A adicionada era de 8,4 e 4,2ng/g, respectivamente. PITTET et al [15] utilizando a mesma

metodologia deste trabalho, encontraram valores de

recuperação de 89 – 100% e 80 – 103%, para café torrado e moído e café solúvel, respectivamente, na faixa de 0,5 a

5,0ng/g. TRUCKSESS et al [21] relataram recuperações de 75 a 81% na faixa de 1-4ng/g de ocratoxina A em café torrado, utilizando também cromatografia líquida de alta eficiência e coluna de imunoafinidade. Os valores de coeficientes de variação foram sempre inferiores a 14%. Resultados semelhantes foram descritos por PITTET et al [15].

Os limites de detecção de ocratoxina A em café torrado e moído e café solúvel foram de 0,25ng/g e 0,10ng/g,

respectivamente, que são comparáveis aos relatados por NAKAJIMA et al [12] e PITTET et al [15], de 0,10ng/g e 0,20ng/g, respectivamente, para café torrado e moído,

utilizando a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e coluna de imunoafinidade como técnica de purificação.

As Tabelas 3 e 4 apresentam os resultados da incidência de ocratoxina A em café solúvel e café torrado e moído. Os níveis não foram corrigidos pela recuperação encontrada.

Para café solúvel a faixa de ocratoxina A foi de 0,31-1,78ng/g, com média entre valores positivos de 0,73ng/g. PITTET et al [15] observaram em 75 das 101 amostras analisadas

procedentes de diferentes países, níveis de ocratoxina A em café solúvel, na faixa de 0,2-6,5ng/g e média de 1,0ng/g. Na Inglaterra, PATEL et al [13], detectaram em 64 das 80

amostras de café solúvel, valores de ocratoxina A na faixa de 0,1-8,0ng/g. STEGEN et al [19] analisaram 149 amostras de café instantâneo de diversos países da Europa, e a faixa de ocratoxina A detectada foi de ND-27,2ng/g e média de 1,0ng/g. Observa-se que os níveis de ocratoxina A das

amostras de café solúvel produzidas e consumidas no Brasil, comparados aos resultados descritos na literatura são

adotado práticas visando ao controle da qualidade da matéria prima utilizada.

No café torrado e moído foi detectada ocratoxina A em 41 das 47 amostras analisadas, em uma faixa de 0,99-5,87ng/g e

média de 1,75ng/g. TRUCKSESS et al [21] encontraram ocratoxina A em 9 das 13 amostras de café torrado e moído dos Estados Unidos, na faixa de 0,1-1,2ng/g e média de

0,41ng/g e JORGENSEN [6] detectou ocratoxina A em 10 das 11 amostras analisadas da Dinamarca, em uma faixa de 0,21-3,20ng/g e média de 0,51ng/g. STEGEN et al [19] em um total de 445 amostras de café torrado e moído e 39 de café torrado e moído descafeinado da Inglaterra, verificaram que os níveis de ocratoxina A variaram de ND-8,2ng/g e média de 0,8ng/g. Verifica-se pelos resultados encontrados e

comparados com trabalhos similares, que os níveis de

ocratoxina A de café torrado e moído consumido no Brasil estão no mesmo nível de países de referência tecnológica. O Joint FAO/ WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA) recentemente reavaliou a toxicidade de ocratoxina A e estimou um nível seguro aceitável de ocratoxina A de

100ng/peso corpóreo / semana [13,19]. Para uma pessoa de 60Kg isso significa 857ng/dia. Se considerarmos o consumo de 4 xícaras de café por dia (24g de café torrado e moído ou 8g de café solúvel) que é o consumo per caput total nos países europeus [19], e o valor médio encontrado de ocratoxina A neste trabalho para café solúvel e café torrado e moído, de 0,73ng/g e 1,75ng/g, respectivamente, a ingestão de

ocratoxina A corresponderia a 5,84ng/dia e 42ng/dia. Dessa maneira o consumo de café solúvel e café torrado e moído iria contribuir apenas com cerca de 0,68% e 4,9%,

respectivamente, da fonte de ocratoxina A na dieta.

Esses resultados indicam que os produtos de café no Brasil não são também, como na Inglaterra [13,19], a maior fonte na dieta de ocratoxina A.

4 — CONCLUSÕES

Os níveis de ocratoxina A detectados em café solúvel e café torrado e moído não são expressivos em termos de

contaminação. Entretanto, esses alimentos devem estar sujeitos a um monitoramento constante pelas autoridades governamentais e indústrias alimentícias.

5 — REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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6 — AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao Ministério da Saúde e CNPq pelo apoio financeiro.

1 _{Recebido para publicação em 28/10/99. Aceito para}

publicação em 03/07/00.

2 _{Fundação Ezequiel Dias - Núcleo de Micologia e}

Micotoxinas. Rua Conde Pereira Carneiro, 80. Gameleira - Belo Horizonte-MG. 30510-010. gui@funed.mg.gov.br

3 _{Bolsistas do CNPq.}

4 _{Farmacêutica - Estagiária da Faculdade de Farmácia /}

UFMG.