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Universidade de Brasília
Faculdade de Medicina
Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical
Estudo da interação de macrófagos murinos com isolados
clínicos de Cryptococcus neoformans
JÉSSICA DOS SANTOS FOLHA
Brasília, DF 2017
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Estudo da interação de macrófagos murinos com isolados
clínicos de Cryptococcus neoformans
JÉSSICA DOS SANTOS FOLHA
Dissertação de Mestrado apresentada ao programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Faculdade de Medicina da Universidade de Brasília, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Medicina Tropical.
Orientadora: Profª Drª Patrícia Albuquerque de Andrade Nicola
Brasília, DF 2017
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COMPOSIÇÃO DA BANCA EXAMINADORA
Jéssica dos Santos Folha
Estudo da interação de macrófagos murinos com isolados clínicos de
Cryptococcus neoformans
Universidade de Brasília
Medicina Tropical: Biologia das Doenças Infecciosas e Parasitárias
Data da defesa da dissertação
16 de fevereiro de 2017
Banca Examinadora
Profa. Drª Patrícia Albuquerque de Andrade Nicola - Universidade de Brasília (Presidente) Prof. Dr. Aldo Henrique Fonseca Pacheco Tavares –
Universidade de Brasília (Banca Interna)
Prof. Dr. Rodrigo Haddad – Universidade de Brasília (Banca Interna)
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DEDICATÓRIA
Aos principais homens da minha vida, meu querido Jeff e meu lindo Dudu, por me ensinarem o verdadeiro significado de amar, por fazerem dos meus dias melhores, por estarem comigo em todos os momentos e
pelo imenso carinho e cuidado que a cada dia demonstram à minha pessoa.
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AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, meu criador e redentor, pelo dom da vida e pela oportunidade de chegar até aqui e por tudo que já fez por mim em todos esses anos.
À minha querida orientadora, Prof.ª Patrícia Albuquerque, pela orientação, paciência, compreensão, dedicação e ajuda. Obrigada pela oportunidade.
À minha família, Paula, José, Izaura, Aluisio, Roberto, por todos esses anos de cuidado e auxílio.
Ao meu amado irmãozinho (Eduardo) por ter sido meu melhor presente já recebido, por seu jeito único e adorável de ser, e pela imensa alegria que proporciona a minha vida a cada dia.
Aos meus queridos professores que até hoje direta ou indiretamente me inspiraram e me ajudaram a ser cada dia melhor. Obrigada Virginia Vilhena, Eleuza Rodrigues, Geraldo Claudino, Marcus Alisson, Adriano Teixeira, Rodrigo Gurgel, Maria Regina, Nadjar Nitz e André Moraes, pela dedicação e amor a docência, e dessa maneira ter me inspirado a crescer profissionalmente e superar meus limites. Muito Obrigada!!
À minha querida amiga Tatiane, por estar comigo ao longo dessa caminhada, dividindo experimentos, sentimentos e frustações.
Aos meus colegas de laboratório, pela ajuda e apoio que desempenharam ao logo do meu mestrado.
Aos meus amigos Jhones, Fabian, Alicia, Herdson e Camila que até hoje estiveram ao meu lado, e que me apoiarem a chegar onde estou.
E por fim agradeço imensamente ao grande amor da minha vida, meu noivo Jeferson Tavares, por todos os momentos que juntos passamos, por ter sido meu refúgio nos momentos difíceis, por sua paciência, amor, carinho, gentileza, por tudo que já fez por mim. Obrigada meu amor por ser essa pessoa alegre que faz dos meus dias melhores. Seu amor me trouxe vida e com você tudo é mais feliz.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Estimativa de casos graves de criptococose que acontecem anualmente. Fonte: http://www.cdc.gov/fungal/diseases/cryptococcosis-neoformans/statistics.html
Figura 2 - Mecanismo de plasticidade e polarização de macrófagos alveolares induzido pelas interleucinas produzidas. IFN-γ, induz polarização do macrófago para classicamente ativado ou M1, IL-4 por sua vez implica na polarização para macrófago alternativamente ativados M2.
Figura 3 - Histograma do percentual de fagocitose dos diferentes isolados clínicos, após a interação de 2h de macrófagos murinos com 16 linhagens clínicas e 2 controles de C. neoformans.
Figura 4- Histograma do índice de sobrevivência fúngica após 24h de interação de macrófagos murinos com 16 linhagens e 2 controles de C.
neoformans.
Figura 5- Indução de produção de citocinas após interação de 2h de macrófagos murinos com 16 linhagens clínicas e 2 controles de C.
neoformans.
Figura 6 - Correlação positiva entre habilidade de fagocitose e sobrevivência das linhagens clínicas estudadas.
Figura 7 - Correlação negativa entre habilidade de fagocitose dos macrófagos murinos e a sobrevida de larvas de G. mellonella infectadas com os diferentes isolados clínicos.
Figura 8 - Correlação entre a habilidade fagocítica dos macrófagos e indução de produção das citocinas detectadas pelos kits utilizados. Figura 9- Correlação entre a sobrevivência fúngica em macrófagos e indução de produção das citocinas detectadas pelos kits utilizados.
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Principais fatores de virulência do C. neoformans e seus atributos clínicos no hospedeiro após infecção.
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LISTA DE ABREVIATURAS
% – Por cento
AIDS Síndrome da Imunodeficiência Adquirida BMM Macrófagos Derivados de Medula Óssea CDC- Centers for Disease Control and Prevention CFU- Unidade Formadora de Colônias
CrAg- Antígeno criptocócico
DC- célula dentritica
DNA – Ácido desoxirribonucleico
ELISA- Ensaio de ligação imunoenzimático g – Gramas
GalXM – Galactoxilomanana
GM-CSF Fator de Crescimento de Granulócitos e Macrófagos GXM – Glicuronoxilomanana
GXM- glicuronoxilomanana h – Hora
HEPES- (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) HIV – Vírus da imunodeficiência humana
IFN- Interferon IL- Interleucina
INOS- Óxido Nítrico Sintase
L-DOPA - 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine LFA- Lateal Flow Assay
MAP- Mitogen Activated Protein
MCP- Proteína quimiotática de macrófagos MOI: Multiplicity Of Infection
mL – Mililitros
NKT- Células natural killer ºC – Graus Celsius
PAMP – Padrões moleculares associados a patógenos PBS- Tampão Fosfato Salina
10 pH – Potencial hidrogeniônico
PL- Fosfolipases
PRR- Receptores de Reconhecimento Padrão RBC- Rede de Criptococose Brasileira
RNA- Ácido Ribonucleico
RNS- Espécie Reativa de Nitrogênio ROS - Espécie Reativa de Oxigênio RPM - Rotações por minuto
RPMI- Meio Roswell Park Memorial Institute SNC- Sistema nervoso central
TLR- Receptor do Tipo toll TNF- Fator de Necrose Tumoral
TWEEN- Polietileno Glicol Monoestearato de Sorbitano UCB- Universidade católica de Brasília
UnB- Universidade de Brasília μL – Microlitro
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FINANCIAMENTO
Projeto financiado pelo Edital Auxílio à Pesquisa DPP-UnB Nº 02/2016 - Auxílio Financeiro a Estudantes para o Desenvolvimento de Pesquisas de Natureza Científica.
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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 18 1.1. Criptococose ... 18 1.2. Patogênese da criptococose ... 19 1.3. Diagnóstico da criptococose ... 19 1.4. Cryptococcus neoformans ... 191.4.1. Fatores de virulência do Cryptococcus ... 22
1.4.2. Cápsula polissacarídica ... 23
1.4.3. Melanização ... 24
1.4.4. Termotolerância ... 25
1.4.5. Atividade das fosfolipases ... 26
1.4.6. Urease ... 26
1.4.7. Vesículas extracelulares ... 27
1.5. Interação do fungo com o hospedeiro ... 29
1.5.1. Resposta imune contra o fungo ... 29
1.5.2. Importância dos macrófagos ... 31
1.6. Rede de criptococose brasileira ... 33
2. JUSTIFICATIVA ... 34 3. HIPÓTESE ... 34 4. OBJETIVO ... 35 4.1. Objetivo Geral ... 35 4.2. Objetivos Específicos ... 35 5. METODOLOGIA ... 35
13 5.1.2. Obtenção e preparação das linhagens fúngicas para interação com
os macrófagos murinos BMMs ... 36
5.2. Macrófagos murinos BMMs ... 36
5.2.1. Meio utilizado para obtenção de BMMs ... 36
5.2.2. Animais ... 37
5.2.3. Preparação de macrófagos obtidos da medula óssea (BMMs) ... 37
5.2.4. Obtenção de macrófagos murinos de medula óssea ... 38
5.2.5. Ensaio de fagocitose ... 38
5.2.6. Ensaio de morte fúngica (CFU) ... 39
5.2.7. Dosagem de citocinas ... 40
5.3. Análise estatística ... 40
6. RESULTADOS ... 41
6.1. Fagocitose e sobrevivência das diferentes linhagens clínicas...41
6.2. Dosagem das citocinas ... 44
6.3. Correlações dos isolados e seus fatores de virulência ... 45
7. DISCUSSÃO ... 50
8. CONCLUSÃO ... 56
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RESUMO
Estudo da interação de macrófagos murinos com isolados clínicos de
Cryptococcus neoformans. Jéssica dos Santos Folha. A criptococose,
micose sistêmica causada por leveduras do gênero Cryptococcus, atinge principalmente indivíduos imunocomprometidos, e é atualmente uma importante doença fúngica sistêmica em todo mundo. Está fortemente ligada ao estado imunitário do hospedeiro, sendo os macrófagos considerados as principais células efetoras na imunidade contra essa levedura. Nosso grupo de pesquisa faz parte da Rede de Criptococose brasileira que tem por objetivo estudar o perfil epidemiológico e a evolução clínica dos casos de criptococose primária e oportunista no Brasil, identificando fatores de risco associados aos diversos desfechos clínicos. Mais especificamente, nosso grupo vem trabalhando na caracterização fenotípica de isolados clínicos de
Cryptococcus quanto a sua habilidade de produzir diferentes fatores de
virulência e interagir com diferentes modelos hospedeiros. E esse trabalho teve como objetivo analisar fatores associados à interação de 16 isolados clínicos de Cryptococcus neoformans obtidos pela FIOCRUZ (Fundação Oswaldo Cruz) RJ/Brasil com macrófagos murinos primários (BMMs). Após ensaios de interação dos diferentes isolados clínicos com macrófagos, foram analisados os diferentes percentuais de fagocitose, as taxas de sobrevivência fúngica, bem como produção de citocinas inflamatórias produzidos pelos macrófagos. Tais resultados foram então correlacionados com resultados previamente obtidos da análise de produção in vitro de fatores de virulência por esses isolados realizadas por outros componentes do nosso grupo de pesquisa (produção de cápsula, melanização, mediana de sobrevida de larvas de Galleria mellonella infectadas com os diferentes isolados, etc). As porcentagens de fagocitose e sobrevivência fúngica apresentaram valores bastante variados entre os diferentes isolados clínicos estudados. Além disso, as diferentes linhagens foram capazes de promover aumento na produção de citocinas pró-inflamatórias como TNF-α, IL-1β, IL-6 e MCP-1 pelos macrófagos. Foram obtidas correlações significativas entre a
15 taxa de sobrevivência fúngica após a interação com macrófagos e a porcentagem de fagocitose (p= 0,0066) e também entre porcentagem de fagocitose e a sobrevida de larvas de G. mellonella infectadas com os diferentes isolados (p= 0,0052). Também observamos uma correlação significativa da produção das citocinas pró-inflamatórias detectadas com a porcentagem de fagocitose dos diferentes isolados. Esses resultados demostram a variabilidade fenotípica desses diferentes isolados clínicos de
C. neoformans na sua interação com macrófagos. Uma melhor
caracterização desses fungos, bem como a correlação desses fenótipos com características clínicas desses isolados poderão colaborar futuramente como o estabelecimento de estratégias mais eficazes para o tratamento de criptococose no Brasil.
Palavras chave: Cryptococcus neoformans; criptococose; isolados clínicos; macrófagos murinos; interação patógeno-hospedeiro, fagocitose, sobrevivência fúngica.
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ABSTRACT
Study of the interaction of murine macrophages with clinical isolates of
Cryptococcus neoformans. Jéssica dos Santos Folha. Cryptococcosis, a
systemic mycosis caused by yeasts of the genus Cryptococcus, is currently an important systemic fungal disease affecting mainly immunocompromised people worldwide. It is strongly associated with the immune status of the host, being macrophages considered the main effector cells against the immunity against this yeast. Our group is part of the Brazilian Cryptococcosis Research Network which aims to study the epidemiological and clinical evolution of primary and opportunistic cases of cryptococcosis in Brazil, identifying risk factors associated with clinical outcomes. Our group is more specifically working on phenotypic characterization of clinical isolates of
Cryptococcus regarding their ability to produce different virulence factors and
interact with different host models. This work aimed to analyze factors associated with the interaction of sixteen clinical isolates of Cryptococcus
neoformans obtained from FIOCRUZ (Oswaldo Cruz Fundation) Rio de
Janeiro/Brazil with primary murine macrophages (BMMs). After interaction assays of the different isolates with macrophages, we analyzed the different percentages of phagocytosis, rates of fungal survival and production of inflammatory cytokines by macrophages. Those results were correlated to previous results regarding the in vitro production of virulence factors obtained from our group (capsule production, melanization, mean survival of infected
Galleria mellonella larvae, etc). The percentages of fungal phagocytosis
viability post interaction showed a significant variation among the clinical strains studied. Additionally, all the strains were able to induce production of inflammatory cytokines such as TNF-α, IL-1β, IL-6 and MCP-1 by macrophages. We observed a significant correlation between fungal survival and the percentage of phagocytosis (p=0,0066), and also between percentage of phagocytosis and median survival of G. mellonella larvae infected with the different fungal isolates (p=0,0052). Also, there was a significant correlation of production of all the detected cytokines with the percentage of phagocytosis. These results demonstrated the phenotypic
17 variability of those clinical isolates of C. neoformans. Further characterization of these fungal isolates, and the correlation of this features to their clinical profiles may help in the development of new strategies more efficient for the treatment of cryptococcosis in Brazil.
Key words: Cryptococcus neoformans, cryptococcosis, clinical isolates, murine macrophages, host-pathogen interaction, phagocytosis, fungal survival.
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