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ANAIS

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NACIONAl

CUlTUIA

DI IlelOOS VIGIIIIS

1 • 3 de

outubro,

1986

Bmm., DF

Presidente: José Sarney

Ministro da Agricultura: Iris Rezende Machado

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária -EMBRAPA

Presidente: Ormuz Freitas Rivaldo Diretores: Ali Aldersi Saab

Derli Chaves Machado da Silva Severino de Melo Araujo

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~

Vinculada ao Ministerio da Agricultura

'-li'

Centro NaCional de Pesquisa de Hortaliças· CNPH

Brasília, DF

ANAIS DO 1<:> SIMPOSIO NACIONAL

DE CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS

1

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de

outubro

de

1985

Brasília

,

DF

Deparl:lmento de Difusão de Tecnologia

Bras

wa.

DF

EMBRAPA-CNPH. Documentos, 1

Exemplares desta publicação podem ser solicitados ao: Centro Nacional de Pesquisa de Hortaliças · CNPH BR 060, km 9· Brasilia/Anápolis· Fazenda Tamanduá Telefone: 1061) 556.5011

Caixa Postal 11.1316 70000 Brasília, DF

Tiragem: 500 exemplares

Simpósio Nacional de Cultur3 de Tecidos Vegetais. I .. Brasllia, DF, 1985.

Anais do 1. Simpósio Nacional de Cultura de Teci -dos Vegetais. Br3Sllia, EMBRAPA-DDT, 1986.

109 p. (EMBRAPA-CNPH. Documentos, 1). 1. Planta - Cultura de tecidos - Congresso. 2. Plant a-Engenharia Genética · Congresso. I. Título.

MINI

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TÉRIO DA AGRICULTURA

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MPRESA BRASILEIRA DE PESQUISA AGROPECUÁRLA

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EMBRAPA

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CENTRO NACIONAL DE PESQUISA DE HORTALIÇAS - CNPH

PRESIDENTE: RUI LUIZ VAZ

COORDENADOR

: ANTONIO CARLOS

TORRES

COMISSÃO ORGANIZADORA:

-

ADONAI

GlMENEZ CALBO

-

ALBANO SALUSTlANO PEREIRA

-

ANTONIO CARLOS GUEDES

-

ANTONIO CARLOS

TORRES

-

ECILDA

L.

DOS S

.

SOUZA

-

FAUSTO F. DOS SANTOS

-

MARIA FÁTlMA B.F. LIMA

-

NOZOMU MAKISHIMA

-

ORLANDO CAMPELO RIBEIRO

-

RAFAEL E

.

JABUONSKI

-

RENATO A

.

DE SOUZA

-

ROBERTO VICENTE COBBE

-

VERA SHOLZE BORGES

-

WELUNGTON PEREIRA

Cultura de tecidos: potencial e aplicação

Rui Luiz Vaz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

CULTURA DE TECIDOS Cultura de ovários in vitro

Antonio Carlos Torres. . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . • . . • . . 13

Propagação de couve·flor in vitro

Antonio Carlos Torres & José de Almeida Souza. . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

Produção de plantas de batata livres de vírus

Ecilda L. dos S. Souza & José de Almeida Souza. . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

Cul tura de embrião

Oaudinei Andreoli . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

A embriogcnese somática e suas aplicações

Frédéric J. Bakry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . • . . . . . . . . 29

Clonação in vitro de orquídeas através de ápices radiculares

Gilberto B. Kerbauy . . . . ... .. . . .. . . . ... . • . . • . . . .. . .

Cultura de tecidos e biotecnologia

Unda Styer Caldas . . . .

Clonagem e melhoramento de plantas in vitro Dlto J. Crocomo: A. NatalGonçalves& J.B. Cabral

Metodologia de seleção in vitro para resistcncia a fatores causadores de estresse

33

37

39

Rol f Dieter lIIg. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

Cultura de tecidos do alho: alta freqüência de regeneração de plantas a partir de calos

Rolf Dieter Ulg . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . 49

Cultura de tecidos e metabolismo secundário

Ruy de Araújo Caldas . . . . . . .. . . . ... ... . . .. . .. . ... . .. . .. . . 51

Preservação de germoplasma por processo criobiológico

Silvio Lopes Teixeira . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

Produção c uso de haplóides

Walter Handro . . . .. . . .. . . .. . . . .. . . ... .. . .

₅₇

ENGENHARJA GENÉTICA

Microorganismos termofI1icos. ccluloliticos c amilolíticos: isolamento e avaliação

Carlos R. Félix; Sérgio B. Silva:Cirano J. Ulhoa:CI:íudio da Cunha & Ruy de A. Caldas .. . .. . . ... .. 63

Síntese e clonagem do ds·cDNA correspondente a um gene específico

A cultura de protoplastos, embriões, óvulos, ovários e a polinização in vitro são técnicas alternativas que podem ser usadas na recuperação de lubridos raros, em situações onde ocorrem mecanismos de incompatibilidade sexual, que impedem o desenvolvimento normal de sementes. Isto possibilitaria a transferência de genes desejáveis, presen tes em espécies silvestres, para espécies cul tivadas.

As técnicas de biologia molecular e engenharia gené

ti-ca parecem ser as grandes promessas do futuro, para o m e-lhoramento genético das plantas. Entretanto, qualquer pre-visão, agora, sobre onde se poderá chegar com tais métodos. não passa de mera especulação.

Somente um trabalho integrado de todos os segme n-tos dos métodos in vitro possibilitará avanços significativos na criação de genótipos superiores, que poderão atender à crescente demanda de alimentos em nosso Pais.

Eugen S. Gander . . . .. . . .. . . .... .. ... . . .. . . _ . . . . . . . . • . . 77

Tissue culture and genetic engineering; complementary tool for potato improvement

John H. Dodds & Jesse M. Jaymes .. . . _ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83

Utilização da biologia molecular para o melhoramento da qualidade nutritiva do feij50

Luiz A.B. de Castro ... .. . . .... .. . . _ .... _ .. . _ . . . • . 89 ,

. Produção de a-amilase por microorganismos recombinantes "Spartaco A. Filho & Maria B.N.S. de Souza . . . .. . . . .

PROGRAMA DE PESQUISA APRESENTADO PELOS PARTlOPANfES Micropropagação do abacaxi in vitro

José R.S. Cabral .. . . ... .. . . . .. . . .... .. .. . . .. .. _ .... .. . .

Produção de haplóides de cacaueiro pelo cultivo de embrião de sementes chochas in vitro

Luiz R.M. Pinto; Antonio V.P. dos Santos; Messias G. Pereira & Geraldo A. Carletto . . . .. . . ..• . Cultura de anterase embriões in vitrocomo apoio ao melhoramento do trigo no CNPT/EMBRAPA

Maria I.B. de M. Fernandes & Vanderlei da R. Caetano ... . _ . . . .. ... .. . . ... . . ... . [)atura insignis, Barb.Rodr.: cultura de tecidos. u1tra-estrutura foliar e obtenção de protoplastos

MA Esquibel; F.C. Miguens; R.D. Machado & C.G. Costa . . . .. .. . . . ... . ... .. . . . ...• ... . Conservação de gennoplasma vegetal

Marisa de Goes .. . . .... .... ..•. ... •... ...

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3

99 101 103 107 109

CULTURA DE TECIDOS: POTENCIAL E APLICAÇÃO

Rui Luiz Vaz' A biotecnologia inclui uma multiplicidade de técnicas e processos de utilização de sistemas celulares de plantas,

animais e microorganismos para geração de bens ou se rvi-ços. Na área de saúde, produtos importantes como o inter

-feron e a insulina são apenas alguns exemplos da potenc iali-dade do uso de agentes biológicos na solução de problemas

do Homem. Na agricultura, as técnicas biotecnológicas apre

-sentam grande potencial no aumento da produtividade das culturas. Nas últimas décadas. isso foi conseguido mediante o uso de fertilizantes, irrigação. controle fitossanitário, her -bicidas, mecanização e desenvolvimento de variedades m e-lhoradas e condicionadas, em geral, ao uso de insumos. T

o-das estas práticas envolvem altos custos, impossibilitando sua adoção generalizada em países subdesenvolvidos. É necessário utilizar as recentes inovações biotecnológicas para desenvolver genótipos adaptados às condições adversas do meio, como solos de baixa fertilidade. e mais resistentes a pragas e doenças. Utilizar, também, métodos que nos pos

-sibilitem economia de insumos. mediante o uso de Rhizo-bit/m, por exemplo, na fixação simbiótica de nitrogênio, e de micorrizas para melhor aproveitamento do fósforo do s o-lo pelas plan tas.

Uma das estratégias para atingir tais objetivos é o uso da técnica de cultura de tecidos, que tem sido um instru -mento valioso na obtenção de plantas livres de vírus e de outros patógenos, na propagação cional rápida, no desenvol

-vimento de variedades melhoradas. na preservação de ger -moplasma

e no m

elhor entendimento dos princípios básicos relacionados com a fisiologia, bioquímica e desenvolvimen

-to das plantas.

OBTENÇÃO DE PLANTAS LIVRES DE VfRUS

As doenças estão entre os principais fatores responsá -veis pela redução da produtividade das culturas. Isto é b as-tante evidente em plantas propagadas pelos métodos as-sexuais convencionais (estaquia, garfagem, tubérculos, bul-bos e outras estruturas vegetativas) que. em geral, estão in-fectadas por uma ou mais viroses. Portanto, o processo de recuperação e estabelecimento de plantas livres de patóge -nos é importante. Um exemplo prático é o da cultura da batata, cuja produção pode ser aumentada de 25 a 30% em plantações originadas de tubérculos livres de vírus. A el i-minação de viroses mediante cultura de tecidos é baseada

J·ng?-:lgr? Ph.D .. Fl\IOlogl~ Vl'g~I~ll, EMORAI)A/(NPllorl;JIi~·3~. c.P. 07.02t8, 70359 B,co" I",, DF.

na premissa de que a concentração do vírus decresce, pr o-gressivamente, no corpo da planta com o decréscimo do es -tádio de desenvolvimento das folhas, chegando a ser nula no ápice vegetativo. Daexcisão e cul tura de partes da planta. pres

-supostamente não infectadas com viroses, e posterior rege -neração in vitro, normalmente resultam plantas livres de ví

-rus. Este processo está estabelecido para um grande número de espécies, bastando apenas aplicá-lo corretamente.

PROPAGAÇÃO CLONAL RÁPIDA

Este método tem como principal objetivo a obtenção de grande número de plantas, em curto espaço de tempo. É uma técnica bastante eficiente, e as plantas produzidas são, em geral, livres da maioria das doenças. O explante inicial pode ser retirado de várias partes da planta, embora as mais usadas sejam gemas caulinares apicais e gemas laterais. Após a desin festação. os ex plantes são introduzidos em frascos con

-tendo meio de cultivo, o que provoca a diferenciação de brotações que, após seu desenvolvimento, são separadas in

-dividualmente e transferidas para um meio de cultivo da mesma composição, quando o objetivo for a indução e dife -renciação de novas brotações, ou são colocados em meio nu-tritivo que permita a formação e desenvolvimento do sist e-ma radicular, formando assim uma planta.

Um inconveniente a ser considerado é o aparecimento

de variantes somaclonais. Com prática e experiência é possível manter a incidencia destes em nível baixo.

Esta técnica, no futuro, também tem a potencialidade de ser estendida à cultura de células, para obtenção de em -briões assexuais que, após encapsulados, podem ser manipu -lados á semelhança de sementes.

DESENVOLVIMENTO DE VARIEDADES MELHORADAS A tecnologia de manipulação de células, tecidos e ór -gãos in vitro é promissora para o melhoramento genético das plantas. Variantes somaclonais, neste caso, são de grande significáncia para obtenção de cultivares com carac -terísticas agronómicas superiores. como toleráncia a doe n-ças, a herbicidas, á salinidade e

à

seca, qualidades essas que podem ser aliadas a um alto valor nutricional. No Havaí,

uma das variedades comerciais de cana-de-açúcar resistente ao vírus do Mosaico foi selecionada mediante o uso das t éc-nicas de cultivo in vitro. Em outros trabalhos realizados nos EUA. variantes de tomate, mais produtivas, com maior ta-manho de fruto e porcentagem de sólidos solúveis, foram obtidas a partir de cultura de ex plantes roliares. Na Cru na, os programas de melhoramento genético de arroz e do tri -go foram bastante simplificados pela utilização de hapló i-des. Isto possibilitou a criação de mais de 80 variedades co -merciais da primeira espécie e mais de 20 da segunda, até o presente.

A cullura de 1'rolol>luslo., elllbll 'S, óvulos, OVál'l05 t: a pollnlur; o in vitro .s... u Ic.:CnlWS JIICrnallvJ~ quI..' Plx.h.:m $C, lIsddu nu re upcra o de híbnd s ruro~. em SltUaçÓCS

onde Ck:orrcm nlL'~urll~rno~ dI.! IIlcornpaubllldndl.! ~cxlJu1. qUI! 1I1lJX!(h:m o ol.!sCIlVOIVll1ICnlO lIorlllru lh: semellte$ Isto pmSlbdllaron fi Irall kreneta de !,'''Ie, desejável>, prc>cnlcs em espécIes Ilvcslrcs, pam espécie> culllvadas,

I cmcllS de bIOlogIa molecular l' engenhanu gCII~o·

CII pMCCCIll ~r rL~ gnlflucs prolllcs"<Is do futuro. ptlra 01111. .... IlIoral1l1:lIlo gcnc.:líco O:'IS plantas. Entrcl;lnlu, qualqul'r prc -vlStlO, IIgora, sobre onde", poded chegar com I:IIS m~lodos, ntlo passa de mera l'spcculnção,

Sorncnlc um trabalho 11 11 c gr:Hlo de lodos o~ scglll cn-lOS dos métodos in vitro possihilitará avall,'os sigJlificutivos "" cnnç O de gen611pos superiores, que pooer50 llcllder" eres "llIe demanda de IIlimcnlos em nosso P:I(S.

CULTURA DE OV ÁRIOS IN VlTRO

Antonio C~lrlOS Torrcl)I

ABSTRACT .Culturingo( cxciscd ovubries beg3n with La Rue in 1942. Nitsch (1951) improvcd thc procedure and succccded in obtainingdcvelopmcnt af tomato and gherkin fruits in vitro. Ovulary cuhurcs h:Jvc nQw bccn rcportcd for ncarly 40 spccics. Thc growth pattcrns 01 Iruils in vitro and in vivo h~lvc bccn csscnciaLly thc samc: howevcr, lhe final size 01 truits raiscd in vitro havc becn usually smaJlcr than thosc obtaincd in vivo. Viablc sccds havc bccn obtainablc in some ovulary cultures. Most plant spccics havc rcquircd for ovulary growth in vitro a nutricnt mcdium [h ar COnlalnS mineral salts. vitam.ins and sugar. Currcntly. there is very litrlc rcscarch activity wirh ovulary culturc. as compared with othcr aspccts af plant rissuc cul turco

INTRODUÇÃO

o

interesse pela cultura de nores in vitro iniciou·se com os trabalhos de La Rue (1942). Ele cultivou flores de 92 espécies de angiospermas e observou, em alguns casos, o creseimento dos ovários e o enraizamento do pedicelo. Na

Tabela I são lisladas referéncias sobre cultura de pistilo e ovários. Revisões sobre o assunto foram publicadas por Rangan (1982) e Yang & Zhou (1982).

IMPORT ÁNCIA

A cultura de nores in vitro forneee um sistema con· trolado para estudar aspectos nutricionais e flsiológieos do

desenvolvimento de frutos (Nitsch 1963. Johri & SehgaJ 1963 e Rangan 1982) e formação de sementes (Johri &

Guha 1963). A esta van tagem juntam·se as u tilizaçõcs deste

método no meUlOramento de plantas, que não podem ser obtidas pelos processos normais de cruzamento, na indução

de haplóides partenoeárpicos e no contorno de problema de

abscisão das flores antes que a fertilização ocorra.

PARÁMETROS QUE AFETAM A CULTURA

DE OVÁRIOS ISOLADOS de I. Desinfestação do explante

A desinfestação consiste na remoção de organismos suo perficialmenle associados com o lecido. Várias formulaçõcs

qu imicas podem ser usadas para eSla finalidade. A escolha

do agente desinfeslante e a duração do tratamento varia com o grau de infestação c a sensibilidade do tecido (Yeo· man & MacLcod 1977). A Tabela 2 lista os reagentes mais comuns e o tempo de contato na desin festação de explan tes de ová rios.

I·n!!~·ap~, Ph.D. h"iolu~la Vq~l·l:d. I'MBRAPA/CNPHurl~I1"':J\,

c.P. 07.0218.70359 IJ""'I",. DI .

2. Estádio de desenvolvimento do explante

o

ótimo estádio para o excisão dos ovários varia com

a espécie de planta e o objetivo do trabalho.

Nitsch (195 I) observou que ovários de Cucumis ali' guria exeisados 4·5 dias após a polinização produziram se·

mentes com 6 a 7% de poder germinativo. Entretanto. ová·

rios isolados 3 dias após a polinização produziram sementes

inviáveis e aqueles inoculados mais cedo não formaram se· mentes. Em Lycopersico/1 esculef/rum. frutos partenocárpi·

cos foram desenvolvidos in vitro a partir de ovários isolados 2 dias antes da antese. na antese e 2 a 4 dias após a antese

(Nitsch 195 I). Sementes viáveis de Anerhum graveolens.

Trachyspermum ammi e Foeniculum vulgare foram obtidas em cultura de ovários inoculados. respectivamente. aos 3. 6 e 7 dias após a polinização (Johri & Sehgal 1966). Inoma·

ta (1968) conseguiu recuperar sementes 11Ibridas do cruza·

mento entre duas espécies incompativeis. Brassica chinensis

x B. pekinensis. mediante a utilização da técnica de cultura

de ovários excisados 4 dias após a polinização. Crescimento

e maturação in vitro de (rutos de Pn/l/us cerasus foram

observados a partir de ovários inoculados 45 dias após a

no-ração (Wittenbach & Bukovac 1980).

3. Partes florais

o

crescimento dos frutos e a formação de sementes

in vitro podem ser beneficiados pela preservação do cálice ou brácteas. por ocasião da inoculação dos ovários. Prova· velmente. estas duas estruturas são fontes de compostos ni·

trogenados essenciais (Nitsch 1963. Guha & J ohri 1966).

Desta forma. ovários de Iher;s amora. cultivados aos I. 2 e 4 dias após a polinização. produziram frutos normais so·

mente quando o cálice foi deixado intacto (Mahesllwari & Lal 1961

l.

Em trabalho rcali7.ado com f-Iyoscyall/us niger (Bajaj 1966). ovários excisados 3 dias após a polinização

produziram frutos normais apenas quando o cálice não era

removido na ocasião da inoculação. Em Nicolilll/o rahacum.

TABELA 1. Plantas em que 8 cultura de ovário já foi relatada. Espécies de plantas Aerva tormentosa AI/ium cepa Alth888 roStIB Ammi msjus Anethum gravfJO/ens Anri"hinum ,."..j4Js

Brsss;ca pekinensis x Brassica chinensis Brassica campescris

Citrus Burantifolis C. sinensis C. msxima C. lemon Chryssnthemum spp. Cucumis anguria Foeniculum vulgare Fragaria anans$S8 F. chiloensis )( F. virginiana G/ycinB max Haworthia turgida Hordsum vulgare Hyoscyamus niger Iberis amara Linaria marocClJna Lycopersicon esculenrum L peru via num

L. pimp;nelifoUum Nicotiana rusriea N. tsbacum Oryza sativa Psspslum a/mum Pe/srgonium x domesttcum Perunia v;o/se88 Phlox drummondii Pisum $8tivum Prunus cerasus Ranunculv$ sceleratus Trschyspermum ammi Trifolium repens

r.

umbiguum Tríticum Btit;vum T. spl'1rs Trops8olvm m.jvs Z8B msys Referências Murgai 119591

Guha 119621. Johri & Guha 119631. Guha & Johri 119661 Chopra 119621

Sehgal 119721

Johri & Sehgal 11963. 19661

Usha 119651. Balatkova & Tupy 119731 Inomata 1196BI

Inomata 119761

Mitra & ChatulVedl (1972)

Mitra & ChatulVedi (1972), Gülsen et aI. (19811 Mitra & Chaturvedi (19721

GÜlsenetal.I19Bl1 Watenabe 119771 Nitsch 119511 Johri & Sehgal 119661 Bajaj & Collins 1196BI De Capite 119551 Obendorf et aI. 119631 Majumbar 119701 La Croix et alo (19621 Bejaj 119661

Maheshwari & Lal 119611 Sachar & Baldev 119581

Nitsch I 194ge. 1949b. 1951. 19631. Kano 119621 Torres 119841

Jansen & Bonner (19491

Rao 119651. Rao & Rangaswamy 119721 Duli.u 11963.19661. McHug.n 11982)'

Nishi & Mitsuoka 119691. e.auville 119BOI. Chang & Hong-Yuan 119811 BO\IO & Quarin 119631

Dodd 119631 Shivanna 119651 Rau 119561

De Cepite 119551. Baldev el aI. 119651. Hahn aI ai. 119741. Krechling el el. 119781 Wittenbach & Mu k""'" 119801

Sachar & Guha 119621 Johri & Sehgall19661 Richards & Ruparl 119801 Richards & Rupert 119801

Rédei & Redei 119551. Donovan & L .. 119771 Réd,i & Redei 119551

Sachar & Kanl. 119581

Sladky & H8IIel 119761. Gengenbach 119771. Dhaliwel & King 119781. Hllllel & Novék 119811

frutos de tamanho menor e com poucas sementes, quando comparados com aqueles cultivados com cálice intacto.

4. Constituintes do meio de cultivo Entretanto, a integridade do cálice e outras partes

flo-rais parecem não ser regra geral. Crescimento de frutos e de-senvolvimento de sementes in vitro têm sido observados em cultura de ovários de

Nicotialla

tabacum

(DuJieu 1966) e

Pisum sativum

(Hahn et alo 1974), desprovidos de cálice.

Em algumas espécies de plantas, por exemplo:

CUcu-mis anguria

(Nitsch 1951),

Tropaeo7um majus

(Sachar & Kanta 1958),

[bens

amara

(Maheshwari &

La!

1961) e

Nicotiana tabacum

(Dulieu 1966), o desenvolvimen to de frutos in vitro ocorre em um meio nutritivo simples,

com-TABELA 2. Reagentes e perfodo de e_posição empregados na desinfestação de explantes de ovários.

Espécies de plantas Desinfetantes

AI/ium cepa Agua clorada

AntJthum graveolens Água clorada

Crhysanthemum specles Hipoclorito de sódio 10% Citrus lemon Hipoclorito de cálcIo 9% Citrus smensis Hipoclorito de cálcio 9% Fragaria ananassa Água clorada 5%

G/ycine max Hipoclorito de cálcio 10% Iber;s amara Hipoclorito de cálcio 10%

Lycopersicon escuJentum Hipoclorito de cálcio 5% Oryza sativa Cloreto de mercúrio 0.1%

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substâncias reguladoras de crescimento depende da espécie. Exemplos dc plantas cujos ovários são capazes de

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volverem em meio desprovido de homlónios são:

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morocCQna (Sachar & Baldev 1958). Tropaeolwn 1/WjÚS ($achar & Kanta 1958). Alrlwl'l1 roseo (Chopra 196 ~). Nieoriana rabacum (Oulieu 1963). Perunia I'iolaeea (Shiva·

nna (1965) e Anri"hinum moius (B:uatkova & Tupy 1973).

Em

Iberis amora. a incorporação ao meio nutritivo de 5 mg,lml de AlA proporcionou crescimento máximo do ovário e desenvolvimento normal do embrião. Substituição

do AlA por 2,4·D inibiu o desenvolvimento do embrião (Maheshwari & L1l 1961). Frutos partenocárpicos de L yco-persieon esculenrum foram obtidos pela cul tura de ovários

nlIo·polinizados. em meio suplementado com ácido nafta· xiacético (NiLSch 1951) ou 2,4-D (Kano 1%2). A inclusão

de

GA

3•

AIA

e cinetina no meio de cultivo inibiu o desenvol· vimento de embriões em ovários de Alrhaea roseo (Chopra

1962). Crescimento máximo de frutos de Anerhum graveo-le/lS. maiores que os produzidos in natura. foram obtidos in vitro suplementando o meio nutritivo com cinetina a

0.1 mg/l (Jolui & SehgaJ 1963). t) Substãncias complexas

Caseína hidrolizada água de coco, extrato de malte e suco de frutos tem sido adicionados aos meios de cultivo

para promover maior crescimento dos frutos e desenvolvi· menta de sementes em cultura de ovários de algumas espé· cies.

g) Condições de incu bação Temperatura

Em

geral, temperaturas entre 20 e 30°C têm sido ade· quadas para cultura de ovários. Temperatura constante de 25°C foi satisfatória para cultura de ovários de Anerhum groveolens (Johri & Sehgal 1963), Haworrhia (urgido (Ma·

jumbar 1970), Zea mays (Uchirniya et al. 1971), Antirrhi· num maius (BaJatkova & Tupy 1973). Em Lyeopersieon escl/' lel/rum, frutos partenocárpicos foram obtidos mediante cul·

tura de ovários no regime de temperatura diurna/noturna de 27/ 17°C, respectivamente (Nitsch 1951).

Luz

lnomata (1976) obteve maior produção de semen tes de Brassiea campestris spp. ehinensis em cultura de ovários expostos

à

baixa intensidade luminosa (300·500 lux). Luz difusa de 100 a 2.000 lux de intensidade foi usada na cultu·

ra de ovários de Hyoseyallll/s niger (Bajaj 1966) e Fragaria

anal/assa (Bajaj & Collins 1968). Em geral. intensidade lu· minosa de 1.000 luz tem sido adequada p3rJ cultura de ová·

rios de diversas espécies.

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PROPAGAÇÃO DE COUVE-FLOR IN VITRO Antonio Carlos Torre"

José de Almeida Souza'

ABSTR.ACT - Exp!'''ts of :Ibout 4 mm in length taken from the surface of the marketabic curd of c.uliOower were cultu -red on mcdium composed of Murashige and Skoog salts. 3% sucrosc. and in mg/I: i -inositol, 100; thiamine . HCI, 1.0; pyridoxinc. HCI. O.S: nicotinic .cid. O.S: glycine. 2: kinctin, 1.0: indole -3-butiric acid, 4.0: and agar, 8,000. The pH of the medium was set at S.7. Thc cultures were iUurrunatcd 16 hr per day with 1,000 lux cold whitc light and exposcd to a constant tcmperature af 27°C. Undcr thcse conditions shoots wcrc obtained withi.n 30 days.

INTRODUÇÃO

O uso de IlIbridos de Brássicas no Brasil tem sido muito aumentado nos últimos anos. Atualmente, existem no mercado várias companhias competindo pela oferta de tais materiais. Há grande necessidade de procurar melhores

11Ibridos. dai a necessidade de se trabalhar com maior nú -mero possivol de linhagens para aumentar a probabilidade de obter as melhores combinações.

Pelo processo normal de obtenção de linhagens paren· tais homozlgotas para o gen 5. que con fere a au to-inco mpa-tibilidade em Brássicas. normalmen te levaria de 4 a 5 anos. Primeiramente. deve-se proceder

a

:

identincação de plantas auto-incompat iveis na geração 50: obtenção e reconheci -mento de plantas homozigotas para os gens da scrie 5 nas

gerações subseqüentes: multiplicação da população de plan

-tas auto-incompativeis: e produç,io de hibridos F entre as

linhagens (Ikula 1969). I

A estabilização das linhagcns parentais dos hibndos requer. sucessivamente. várias autofecundações. Por outro lado. sua manutenção exige polinização manual das Oores no estádio dc botão Ooral. Este procedimen to leva as plan -tas a uma rápida endogamia. a qual se maJ1ifesta de v;irias

formas. sendo uma delas a perda da capacidade reprodutiva das linhagens.

Mediante o uso das técnicas de cultura de tecidos. p o-der·se·ia manter indefinidamente linhagens de hlbridos. contornando assim os problemas da endogamia e

eliminan-do também a traballlOSa ""efa de autopollllllaç50 manual dos botões florais para a manu tenção das mesmas (Crisp

& Walkey 1974: Andcrson & Carlens 1977: Torres et aI.

1978).

I EngO_agro. Ph.D .. Fisiologia Vegetal. EMBRAPA/CNPHortaliças. c.P. 07.0218. 70359 Brasília. DF.

La boratorista. EM BRAPA/CNPHortaliças.

DIFERENCIAÇÃO DE PARTE A~REA

Plantas de couve-Oor, variedade Piracicaba Precoce.

em estádio de colheita. foram utilizadas como fonte de ex-plantes. Estes. de 3 a 4 mm de comprimento. retirados da superficie da cabeça. foram desinfestados em solução de hipoclorito de cálcio a 2%. durante 10 minutos. e em se gui-da lavados 3 vezes em água destilada esterilizada.

O meio nutritivo consistia em macro e micr~lemen­ tos de Murashige & 5koog (1962). 3% sacarose e em mg/1: i·inositol. 100: tiamina . HCI. 1,0: piridoxina . HCI, 0.5: ácido nicot inieo. 0.5: glicina. 2.0; ágar. 8.000: ácido 3-in-dolbutirico. 4.0: cinctina 1.0: com pH ajustado a 5.7 ± 0.1. O meio foi distribuido em quantidades de 25 ml por frasco de 130 ml. Os frascos foram fechados com tampas de poli -propileno e au toelavados a 121

°c

e I .05 kg/cm' . durante 15 minutos.

A inoculação foi feita em capela de fluxo larrunar in -troduzindo-se os explantcs, individualmente. em cada fr as-co. Após inoculação. os frascos foram mantidos em câmara de crescimento com intensidade luminosa de 1.000 lux. ciclo fotoperiódico I ó horas e temperatura de 270 ± 20C constante.

OBTENÇÃO DE PLÁNTULA

Após diferenciação e desenvolvimento da parle aérea. repicaram-se. individualmente. porçõcs apicais desta, de 2 a 3 cm de comprimento. para recipientes que continham meio de cultivo composto de sais minerais de Murashige & 5koog (1962). 3% SUCrose e em mg/I: i-inositol. 100: tiarru-na.HCI. 1.0: piridoxina.HCI 0.5: ácido nicotinico, 0.5; g1ici-na. ~.O: ágar. 8.000: e ácido 3-indolbutirico. 3. O pH do meio foi ajustado a 5.7 ± 0.1. Após a inoculação. o material foi incubado nas mesmas condições descritas acima.

REFERfNOAS

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TORRES. A.C.: DELLA VECCHIA. P.T. & CALDAS. L.S. Pr

opaga-ção vegetativa de couve-nor t8rassica o/erocea var. bOlryt;s subvar. caulifloro D.C.) in vitro visando ao melhoramento de

PRODUÇÃO DE PLANTAS

DE BATATA LIVRES DE VfRuS

Ecild. Luci dos Santos Souza' José de Almeida Souz.'

ABSTRACT - Since 1984 the National Vegetable Crop Research Center (CNPH/EMBRAPA) has been producing pre-basic potato seeds. Virus-frcc plants havc becn obta~cd throug~ shoots tip, culturc techniques" and tested for X, Y, S and leaf-roU viruscs. In tilc ,hoot tip culturcs and rap,d propagatlon MS medlUm supplcmented wlth 0.5 mg/I ofGA) has been used. Parts of the apical partion af the shoots are transfcrrcd to a medium consisting af MS salts s~~pleme.nt~d wlth 0.05 mg/I of ANA, 0.05 mg/I of KIN, 0.2 mg/I of GA). and 0.6% of agar for enhancing th~ process of dtlferentlatlon and developmeot of tilc root system. The potato ,eed theo obta.lf1ed ts dehvcred to EMBRAPA, Semce of Bastc Seed Produ

c-tio O (SPSB) for multiplicatioo.

INTRODUÇÃO

A batata é um alimento importante devido ao seu alto

valor nutritivo, sendo rica em carboidratos, sais minerais. aminoácidos e vitaminas. e também pela eficiência de pro-dução por unidade de área num curto espaço de tempo.

No Brasil, a cultura da batata ainda não atingiu maior

im-portância, devido principalmente a fatores como: elevado

custo de produção: baixa produ tividade; e necessidade de expansão para novas regiões ainda sem tradição com a m

es-ma.

Na década de 50, teve início a produção de batata-se

-mente. através do Projeto ETA na 10 e da Cooperativa

Agrícola de Cotia. Somente em 1972, pelo acordo Brasil

-Alemanha, foi criado um Centro de Multiplicação de Bata

-ta-semente. em Santa Catarina, atualmente sede da Geréncia Local de Canoinhas. do Serviço de Produção de Semen tes

Básicas (SPSB) da EMBRAPA.

Em 1973/74, foram importadas 673 mil caixas. d e-crescendo para 250 mil no período de 1983/84.

A batata-semente certificada é produzida nos Estados

de Santa Catarina, Rio Grande do Sul, Paraná. Minas Gerais e São Paulo. Anualmente são plantados aproximadamente 200 mil hectares de batata para consumo. necessitando de 10 milhões de caixas. Em 1983 o Brasil produzi

:0"

...

dessa

necessidade. importou 2.5% e o restante da batata plantada foi de origem desconhecida. Dentre as principais doenças

que justificam a importação. destacam-se a murcha

bacteria-na e as de origem virótica. que causam grandes perdas, co -mo o vírus do enrolamente da folha (pLRV) e o vírus Y (pVY).

Até recentemente quase todos os testes de vírus em batata eram feitos visualmente, permitindo um alto índice de escape. Hoje. com o advento de técnicas como Látex e

lllg:~-agr~. M.Sc" Fitotccnta, EM BRAPA/CNP Hortaliças C.P. 07.0218.70359 Br",ill •. DF.

L.tbOralon,ta, EM BHAPA/CNPHortallça\.

ELISA, é possível testar rapidamente um grande número de

amostras: bem como detectar concentrações muito baixas

de vírus, as quais não seriam percebidas visualmente.

Para a obtenção de plantas sadias. a partir de material

infectado, usa-se a cultura de meristemas. associada ou não

à

quimioterapia, ou

à

termoterapia.

Há aproximadamente quatro anos o Centro Nacional

de Pesquisa de Hortaliças (CNPH) vem trabalhando com a cultura de meristemas e in dexação de plantas para a prod

u-ção de lotes sadios de clones provenientes dos programas de melhoramento e. nos últimos dois anos. para a produção de

batata-semente pré-pré-básica.

Inicialmente, o material a ser limpo é testado para os vírus X (PVX), Y (PVY). S (PVS), enrolamento da folha

(PLRV) e para O viróide do broto amado (pSTV). A seguir,

é

efetuada a cultura de meristemas, que consiste na retirada

dos meristemas do ápice e dos brotos laterais em

crescimen-to. Esses meristemas são inoculados em meio líquido. co

n-lendo macro e micronutrientes, segundo Murashige & Skoog (1962), acrescido de 3% de sacarose. vitaminas e 0.5 mg/I de ácido giberélico (GA ), que constituem o meio na I. Após a formação de

um

~

pequena planta. a partir de cada meristema_ esta é seccionada e transferida para outros meios:

I) O ápice da planta. contendo três a quatro gemas, é inocu -lado em meio con tendo sais minerais de Murashige &Skoog,

acrescido de 3% sacarose. vitaminas, 0.6% de ágar. 0.05 mg/I de ácido naftaleno acético. 0,05 mg/l de cinetina e 0.2 mg/I

de ácido giberélico. que constituem o meio na

2

:

2) O

restante da planta é cortado em pequenos pedaços. contendo uma

ge-ma. e são inoculados em meio líquido(meio na I). Ambos os tuboscontêmo mesmo número de identificação. Quinze a vin-te dias após. as plantas produzidas no meio sólido são testadas

para os vírus X. Y, S e o en rolamento da foUla. As plantas sa-dias são propagadas in vitro por multiplicação rápida (meio na I) e enraizadas (meio na 2), e então transferidos para vasos. em casa de vegetação. Periodicamente. as plantas em

casa de vegetação são inspecionadas e testadas por amostra

-gem. Aí as plantas produzem. em média. oito tubérculos

é-Pklnl:J ill \;lrO

~

Tr . .lInlcrrrJJ I);IIJ "-)10_ MultlpllcJção _ 10 plJlllJS

+

rap/da

l

8lubl;rculos 80 planta~

t

&kção_ 31ubérculos $('kç:Io _ 30 tubérculos + pequenos

l

(X'qul.'nos 5lubl'rculos Scrncnlc pr é--bãslca Semente básIca 50 tubérculos ~P"'PI<.bJ"<O'

55 IUbl'rclIlos prc-prr-b:íslcos COm('rCIJIS

/ 1' fIlulllp"CaçJo "O SI' B (1:8 lub.)

.4-'Olubcrculos

/ 2a fIlul lIplicaç;o no SPSB (1:8 lub.)

J.5:!O tubCrculos

/ 3' multiplicação no SPSB (I :6 I ub.)

.120 tubérculo" ou

60 caixas de semente básica

-pré-básica) e três menores, que são utilizados em nova mul

-tiplicação (Fig. I).

Além de multiplicação rápida. em larga escala. para a

produção de plantas in vitro. utiliza-se também a

multipli-cação rápida, em casa de vegetação. A partir de uma planta

produzida

in

vitro podem ser obtidas sessenta caixas de

sc-mente boisica. num período de dois anos, de acordo com o

seguinte esquema:

Em 1984/85, O CNPH enviou ao SPSB 29 mil

tubér-culos. Ao final de três multipUcações pelo SPSB, serão pro-duzidos 11.136 milhões de tubérculos, o que representa

cer-ca de 32 mil caixas. Considerando que no final do mês de

setembro de 1985 uma caixa de batata-semente importada custará em méclia 16 dólares (um dólar= 10 mil cruzeiros). conclui-se que 32 mil caixas correspondem a uma economia

de importação de 512 mil dólares ou 5 bilhões de cruzeiros .

REFER~NCIAS

MURASHIGE. T. & SKOOG. F. A revised medium for rapid gro\Vlh and bio-assays with tobacco tissue culture. Physiol. Plant., 15:473-97.1962.

Teste para

Tubérculo vírus X,Y,

S, enro la-mento e vi róide

-Teste de ELISA vírus X,Y,S,en rolamento -Planta sadia mui tipl icação

rápida meio n9 1

o

_·

GJ

Cultura de meristemas (meio n9l) Enraizamento meio n9 2 Planta aos 30-60 dias

•

produção de tubérculos em casa de vegetação

•

meio n9 1 Batata-semente pré-pré-básica IV W

CULTURA DE EMBRIÃO

Cluudillei "ndrcoli I

ABSTRACT - In this arriclc. the diffcrcnt faclors affccting in vitro embryo culturc are rcvicwcd. Thc practicaJ appljcations

,lnd limitations of that tcchniquc ;lrc also discusscd. INTRODUÇÃO

o

ponto marcante que expandiu o campo da cultura de embriões foi a descoberta de que estes poderiam ser se-parados dos tecidos maternais e de reserva, e cultivado. a'5epticamente em substrato artificial. Hanning (1904) • considerado o pioneiro na cultura de embrião. Ele culti -vou, in vitro. embriões relativanlente maduros de Raphonus saril'l1s,

R.

landra.

R.

caudalIls e Cochlearia danica, em meios salinos suplementados com açúcar. Suas observações forneceram respostas para a identificação dos fatores que controlam o crescimento de embriões cultivados. Por exem -plo. a função do endosperma líquido. a necessidade de uma concentração de sacarose como fonte de energia. c um alto potencial osmótico no substrato. para crescimento dos e m-briões.

Subseqüentemente. avanços na técnica da cultura de embriões foram estendidos a várias espécies de planta. Knudson (1922) fez germinar embriões de orquídeas na auséncia de fungo simbiótico. em meio de ágar contendo açúcar. O estímulo ao crescimento de embriões de o rquí-deas por um carboidrato simples sugere a função da mico r-riza na conversão de amido e de outros polissacarídeos em forma reduzida. A propagação não-simbiótica de orquídeas. em escala comercial, deve aos princípios deste experimento. Dieterisch (1924) fez importantes observações nos estudos de fisiologia, crescimento c germinação de embriões. Embriões cultivados in vitro. usualmente não apresentam um período de repouso como ocorre em semente intacta. Além disso, foi constatado que no meio nutritivo de Knop, suplemen tado com 2,5 - 5% de sacarose. os embriões torn a-ram-se fisiologicamente maturos e germinaram normalmen -te. Porém. aqueles ainda imaturos germinaram diretamente para plãntulas, divergindo dos estádios da embriogenia nor-mal. Dieterisch introduziu o terno "Kunstuche Fruhgebrit" para expressar este tipo de crescimento. agora conhecido como germinação precoce em cultura de embrião. Salienta --se que este fenómeno é aplicado a algumas sementes (em-briões) de espécies vivíparas. por exemplo: mutantes de Zea mays

L.

.

certas cultivares de Triricum aesrivum

L.

e Arachls hypogaea L. Este aspecto de germinação precoce é discutido posteriormente.

I EngO_agro. Ph.D .. Fisiologia de Semente<. EMIlRAPA/CNPHor -(aliça,.C.P. 07.02t8. 70359 Bra>llia. DF.

As aplicações práticas das técnicas de cultura de em· briões foram demonstradas nos trabalhos de Laibach (1925, 1929). Plãntulas híbridas resultantes do cruzamento de

Li

-num perene e L. ansrrianum foram obtidas a partir de em -briões excisados de sementes. Desde ent.i!o, esta técnica tem sido extensivamente usada para produzir híbridos raros em situações onde o mecanismo de incompatibilidade sexual ocorre. Em adição. esta técnica oferece um sistema contro -lado para estudar os problemas nutricionais. fisiológicos e bioquímicos dos embriões em vários estádios de desenvol -vimento_

00 ponto de vista técnico. as duas mais importantes considerações na cul tura do embrião são: a composição do meio de cultura e a excisão do embrião. A composição do meio e a preparação asséptica do embrião variam en tre as espécies. Recentes revisões sobre o assunto foram feitas por

Bhojwani & Razdan (1983) e Nortog (1965, 1973).

PARÃMETROS QUE AFETAM

A CULTURA DE EMBRIÃO

Fonte de explante

A seleção da planta a ser usada para a cultura de em-brião é normalmente prognosticada pelas prioridades e pe -los objetivos do trabalho_ Entretanto. se a escolha existe como prática inicial, é recomendável começar com embriões que são facilmente dissecados. Por exemplo. embriões ma -duros de algumas leguminosas e alguns citros de semen tes grandes são ótimos materiais de partida_ Por outro lado, maior cuidado no uso desta técnica é necessário quando se-mentes de Daucus carOla

L.

e Apium graveolells

L.

são utilizadas.

()esinfestaçào do explan te

Os embriões zigóticos, protegidos dentro de um sist e-ma estéril no tecido ovular, não necessitam de desinfestação superficial. Entretanto. os frutos são desinfestados segundo os métodos descrito por Bhojwani & Razdan (1983). Após esta assepsia, os embriões sã" excisados e cultivados em meio nutritivo.

Em orqu ídeas onde as sementes não possuem endosp er-ma funcional c o tegumento é muito reduzido. ovários intei-ros são desin festa dos e cul tivados (Raghavan 1976).