Universidade Federal do Rio Grande do Norte Centro de Tecnologia
Departamento de Engenharia Química
Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química
Dissertação de Mestrado
Produção, avaliação da estabilidade e aplicação de enzimas
pectinolíticas de Aspergillus niger IOC 4003 utilizando
resíduos de frutas tropicais como substrato
Juliene da Câmara Rocha
Orientadora: Profa.Dra Gorete Ribeiro de Macedo
Coorientador: Prof. Dr. Francisco Canindé de Sousa Júnior
Natal/RN
2018
Juliene da Câmara Rocha
Produção, avaliação da estabilidade e aplicação de enzimas
pectinolíticas de Aspergillus niger IOC 4003 utilizando
resíduos de frutas tropicais como substrato
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para obtenção do título de Mestre em Engenharia Química, sob a orientação da Profa. Dra. Gorete Ribeiro de Macedo e coorientação do Prof. Dr. Francisco Canindé de Sousa Júnior.
Natal/RN
2018
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Central Zila Mamede
Rocha, Juliene da Câmara.
Produção, avaliação da estabilidade e aplicação de enzimas pectinolíticas de Aspergillus niger IOC 4003 utilizando resíduos de frutas tropicais como substrato / Juliene da Câmara Rocha. - 2018.
107f.: il.
Dissertação (Mestrado) -Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em
Engenharia Química, Natal, 2018.
Orientador: Dra. Gorete Ribeiro de Macedo.
Coorientador: Dr. Francisco Canindé de Sousa Júnior.
1. Fermentação em estado sólido - Dissertação. 2. Pectinases - Dissertação. 3. Pectina-liase - Dissertação. 4. Poligalacturonase - Dissertação. 5. Resíduos agroindustriais - Dissertação. I. Macedo, Gorete Ribeiro de. II. Sousa Júnior, Francisco Canindé de. III. Título.
RN/UF/BCZM CDU 663.15
ROCHA, Juliene da Câmara – Produção, avaliação da estabilidade e aplicação de enzimas pectinolíticas de Aspergillus niger IOC 4003 utilizando resíduos de frutas tropicais como substrato. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. Área de Concentração: Engenharia Química. Linha de pesquisa: Processos químicos, catalíticos e biotecnológicos. Natal/RN, Brasil.
Orientadora: Profa. Dra Gorete Ribeiro de Macedo.
Coorientador: Prof. Dr. Francisco Canindé de Sousa Júnior.
RESUMO – Nas últimas décadas, a demanda por enzimas microbianas para aplicações biotecnológicas tem crescido significativamente. As enzimas pectinolíticas, responsáveis por clivar tanto a pectina como outros polissacarídeos pécticos em resíduos de ácido galacturônico, apresentam aplicação em diversos setores como processamento de suco de frutas e vinhos, recuperação de óleos essenciais, extração de óleos vegetais, além das indústrias têxtil, e de papel e de celulose. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar produção, estabilidade e aplicação de enzimas pectinolíticas pela linhagem de Aspergillus niger IOC 4003 utilizando resíduos de acerola e cajá como substrato da fermentação em estado sólido (FES). Inicialmente, os resíduos de acerola e cajá, lavados e não lavados, foram submetidos à secagem e tiveram determinados sua composição química e físico-química. A porcentagem de pectato de cálcio, indicador de pectina, encontrado nos resíduos foi de 3,46 ± 0,11%; 2,94 ± 0,18%; 5,85 ± 0,01% e 5,34 ± 0,23% para a acerola não lavada, acerola lavada, cajá não lavado e cajá lavado, respectivamente. Em seguida, avaliou-se o potencial destes substratos como indutores para a produção de enzimas pectinolíticas por FES durante 240 h com pH inicial de 4,5; umidade em 40% e concentração de esporos em 1 x 107 esporos/mL. Na etapa de fermentação, destaca-se a produção de poligalacturonase usando o resíduo de cajá lavado que atingiu a concentração enzimática de 38,22 ± 0,63 U/g em 72 h de cultivo. Em seguida, estudou-se a otimização de extração das enzimas e observou-se que a melhor condição ocorreu usando o tempo de contato de 30 minutos e o tampão acetato na concentração de 50 mM e pH 5,4. Na etapa posterior, avaliou-se a estabilidade do complexo enzimático frente à temperatura e pH. As melhores condições de estabilidade da poligalacturonase ocorreram nas temperaturas de 30 e 40 °C, e entre os pHs 4 a 6 por até duas horas de incubação. Depois, utilizaram-se os extratos enzimáticos sintetizados por FES com Aspergillus niger IOC 4003 em resíduo de cajá lavado ou acerola não lavada no processo de clarificação do suco de cajá. Na etapa de clarificação, destacam-se os resultados: 40% de redução da turbidez, 50% da viscosidade, 30% de clareamento e 85% de aumento da capacidade antioxidante do suco de cajá. Dessa maneira, os resultados do presente trabalho demonstraram a viabilidade do uso de resíduos da indústria de polpas como substratos para produção de enzimas de interesse biotecnológico e sua aplicação na indústria de alimentos.
Palavras-chave: Aspergillus niger, fermentação em estado sólido, pectinases, pectina-liase, poligalacturonase, resíduos agroindustriais
ABSTRACT
During the last decades, it has increased significantly the demand for microbial enzymes on biotechnological applications. The pectinolytic enzymes are responsible for cleaving both pectin and other pectic polysaccharides in galacturonic acid monomers and they have application in several industrial sectors such as fruit and wine juice processing, essential oil recovery, vegetable oil extraction, textile industry and, paper and cellulose industry. In this context, this work aimed to evaluate production, stability and application of pectinolytic enzymes by Aspergillus niger IOC 4003 using acerola and yellow mombin wastes as substrate for solid-state fermentation (SSF). Initially, acerola and yellow mombin wastes, washed and unwashed, were submitted to a drying process and they had their chemical and physicochemical composition determined. The percentage of calcium pectate - pectin indicator - found in wastes was 3.46 ± 0.11 %; 2.94 ± 0.18 %; 5.85 ± 0.01 % and 5.34 ± 0.23 % for unwashed acerola, washed acerola, unwashed yellow mombin and washed yellow mombin, respectively. Hereby, the potential of these substrates as inducers was evaluated for the production of pectinolytic enzymes for SSF during 240 h with initial pH of 4.5; moisture at 40% and spore concentration of 1 x 107 spores / mL. In the fermentation stage, the greatest polygalacturonase production was observed using washed yellow mombin waste reaching enzymatic concentration of 38.22 ± 0.63 U / g in 72 h of cultivation. Furthermore, it have been carried out the optimization of enzyme extraction and the best condition of extraction occurred using acetate buffer (50 mM, pH 5.4) and 30 minutes of contact time. On the subsequent step, the stability of enzyme complex was evaluated against different temperatures and pHs. The greatest condition on stability of polygalacturonase occurred at temperatures of 30 and 40 °C, and among pHs 4 and 6 for up to two hours of incubation. Thus, the synthesized enzymatic extract by Aspergillus niger IOC 4003 from washed yellow mombin or unwashed acerola wastes was applied in process of clarifying yellow mombin juice. At the clarification stage, the outstanding results were 40% reduction in turbidity, 50% in viscosity, 30% in clarification and 85% increasing of antioxidant capacity in the juice. Therefore, this study demonstrated the feasibility of using fruit residues of the industry as substrates for production of interest enzymes and its application in the food industry.
Keywords: Aspergillus niger, solid-state fermentation, pectinases, pectin lyase, polygalacturonase, agro-industrial residue.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por todo amor e zelo; toda honra e toda a glória sejam dadas a Ele. Todas as vitórias alcançadas em minha vida são Dele.
À Nossa Senhora, pela sua intercessão e seu carinho, e por me guiar, todos os dias, a estar mais perto de seu filho, Jesus Cristo.
Aos meus pais, Rocha (in memorian) e Jubercília, por todo amor e dedicação. Em especial, a minha mãe, a quem devo tudo do que sou hoje; não há palavras para expressar tamanho afeto e gratidão.
À minha irmã, Juliana, pela amizade, pelo amor e incentivo aos estudos. Aos meus irmãos, Lourival, Luciana e Alexandre.
Aos meus familiares, tios e primos. Em especial, as minhas tias Julita, Janeide e Ana Isabel pela torcida, pelo amor e carinho dedicados a mim durante esses anos.
À minha professora e orientadora, Gorete Macedo, por ter me aceitado com tanta alegria, e pela orientação dada a essa dissertação.
Ao meu professor e coorientador, Francisco Canindé, por todo apoio, toda dedicação e orientação dados nesse trabalho.
Aos meus amigos do mestrado, Gabriela, Luana, Heloisa, Dennys, Isabelly e Guilherme, pela convivência e pelo aprendizado alcançado juntos.
Aos meus amigos do Laboratório de Engenharia Bioquímica, Jaciara, Emilianny, Cleitiane, Carlos, Milena, Waleska, Marcos, Sérgio, Ana Laura, Catherine, Sinara e Vanessa, por todas as risadas e conversas, e pelo café de todo dia.
A Ednaldo Gomes do Laboratório Escola de Farmácia Industrial (LEFI) da UFRN pelo suporte nas análises de viscosidade e a Rafael Alves do Laboratório de Operações Unitárias (LOU) coordenado pelo professor Alfredo Curbelo da UFPB pela análise granulométrica.
E a todos que contribuíram, direta ou indiretamente, para a realização desse trabalho, meu muito obrigada.
“Pois que se uniu a mim, eu o livrarei; e o protegerei, pois conhece o meu nome” – Sl 90, 14.
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 17 2 OBJETIVOS ... 21 2.1 Objetivo geral ... 21 2.2 Objetivos específicos ... 21 3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 23 3.1 Acerola ... 23 3.1.1 Comercialização... 23
3.1.2 Características físico-químicas da acerola ... 24
3.2 Cajá ... 25
3.2.1 Comercialização... 26
3.2.2 Características físico-químicas do cajá ... 26
3.3 Reaproveitamento de resíduos agroindustriais ... 26
3.4 Substâncias pécticas ... 27
3.5 Enzimas pectinolíticas ... 29
3.6 Microrganismos produtores de pectinases ... 31
3.7 Tipos de processos fermentativos ... 33
3.7.1 Agente de extração ... 35
3.8 Aplicação industrial ... 35
3.8.1 Indústria têxtil ... 36
3.8.2 Fermentação de café e chá ... 36
3.8.3 Extração e clarificação de sucos ... 36
4 MATERIAL E MÉTODOS... 39
4.1 Obtenção e preparo dos resíduos ... 39
4.2 Caracterização físico-química dos resíduos ... 39
4.2.1 Densidade aparente ... 39
4.2.2 Granulometria ... 40
4.2.3 Diâmetro médio de Sauter (dps) ... 40
4.2.4 pH ... 40
4.2.5 Açúcares redutores (AR) ... 40
4.2.6 Teor de sólidos solúveis - °Brix ... 41
4.2.7 Umidade ... 41
4.2.8 Extraíveis ... 42
4.2.10 Celulose, hemicelulose e lignina solúvel ... 43
4.2.10.1 Hidrólise com ácido sulfúrico 72% ... 43
4.2.10.2 Determinação de lignina insolúvel ... 43
4.2.10.3 Análise do hidrolisado por CLAE ... 44
4.2.11 Pectina ... 44
4.2.12 Teor proteico (Nitrogênio total) ... 45
4.2.13 Análise morfológica... 46
4.2.14 Difração de Raio-X (DR-X) ... 46
4.2.15 Análise estrutural por FTIR ... 46
4.3 Cultivo em estado sólido ... 47
4.3.1 Microrganismo e manutenção ... 47
4.3.2 Propagação de esporos e inóculo ... 47
4.3.3 Condições de cultivos ... 47
4.3.4 Extração das enzimas ... 48
4.3.5 Determinação da atividade enzimática de poligalacturonase ... 48
4.3.6 Determinação da atividade enzimática da pectina liase ... 49
4.3.7 Determinação da atividade enzimática de celulase total ... 50
4.3.8 Determinação dos açúcares redutores ... 50
4.3.9 Determinação de proteínas totais ... 52
4.4 Otimização do tampão de extração ... 52
4.5 Avaliação da estabilidade da enzima ... 53
4.5.1 Efeito da temperatura na estabilidade da PG ... 53
4.5.2 Efeito do pH na estabilidade da PG ... 54
4.6 Aplicação do extrato enzimático ... 54
4.6.1 Extração do suco de cajá ... 54
4.6.2 Tratamento enzimático da polpa de cajá... 55
4.6.3 Análises físico-químicas e funcionais da polpa de cajá ... 57
4.6.3.1 Intensidade da cor ... 57
4.6.3.2 Turbidez ... 57
4.6.3.3 Viscosidade ... 57
4.6.3.4 Proteínas totais ... 58
4.6.3.5 Densidade ... 58
4.6.3.6 Teor de sólidos solúveis – °Brix ... 58
4.6.3.8 DPPH – atividade antioxidante ... 59 4.6.3.9 Vitamina C ... 59 4.6.3.10 Acidez titulável ... 59 4.7 Análise estatística ... 59 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 62 5.1 Caracterização físico-química ... 62
5.1.1 Análise da difração de raio-X ... 64
5.1.2 Perfil granulométrico dos resíduos ... 65
5.1.3 Análise morfológica... 67
5.1.4 Análise estrutural por FTIR ... 68
5.2 Produção de pectinases ... 70
5.2.1 Microrganismo ... 70
5.2.2 Fermentação em estado sólido... 71
5.2.2.1 Resíduo de acerola (ANL e AL) ... 71
5.2.2.2 Resíduo de cajá (CNL e CL) ... 74
5.3 Otimização da etapa de extração das enzimas... 78
5.4 Estabilidade da enzima ... 81
5.4.1 Influência da temperatura na atividade de PG ... 81
5.4.2 Influência do pH na atividade de PG ... 83
5.5 Clarificação do suco de cajá ... 85
5.5.1 Rendimento da extração ... 85
5.5.2 Propriedades físico-químicas e funcionais ... 86
6 CONCLUSÃO ... 91
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 93
Apêndices ... 105
Apêndice A – Relação umidade versus atividade de água. ... 105
Apêndice B – ANOVA para o modelo do planejamento 23 com triplicata no ponto central na otimização do tampão para extração da enzima poligalacturonase. ... 107
Apêndice C – ANOVA para o modelo do planejamento 23 com triplicata no ponto central na otimização do tampão para extração da enzima poligalacturonase com o teste de curvatura. ... 108
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – A fruta acerola e a aceroleira. ... 23
Figura 2 – Cajazeira e o fruto cajá. ... 25
Figura 3 – Estrutura da pectina. ... 28
Figura 4 – Modo de ação enzimática das pectinases em uma molécula de pectina. ... 30
Figura 5 – Fluxograma do processo de extração do suco. ... 55
Figura 6 – Fluxograma das etapas utilizadas no tratamento enzimático para clarificação da polpa de cajá... 56
Figura 7 – Difração de raio-X dos resíduos cajá não lavado (CNL), cajá lavado (CL), acerola não lavada (ANL) e acerola lavada (AL). ... 65
Figura 8 – Perfil de granulometria dos resíduos. ... 66
Figura 9 – Imagens de microscopia eletrônica de varredura dos resíduos. ... 68
Figura 10 – Análise de FTIR para os resíduos AL, ANL, CL e CNL. ... 69
Figura 11 – Aparência do fungo Aspergillus niger IOC 4003. ... 70
Figura 12 – Cinética do cultivo utilizando resíduo de ANL por FES pelo A. niger. ... 71
Figura 13 – Cinética do cultivo utilizando resíduo de AL por FES pelo A. niger. ... 73
Figura 14 – Aspecto dos resíduos após o processo de autoclavagem. ... 74
Figura 15 – Cinética do cultivo utilizando resíduo de CNL por FES pelo A. niger. ... 74
Figura 16 – Cinética do cultivo utilizando resíduo de CL por FES pelo A. niger. ... 76
Figura 17 – Imagens das superfícies de resposta e dos planos de resposta da atividade de PG após otimização do tampão para extração enzimática em FES usando planejamento 23 com triplicata no ponto central. ... 79
Figura 18 – Diagrama de Pareto de otimização da extração de enzimas. ... 80
Figura 19 – Diagrama de Pareto de otimização da extração de enzimas com teste de curvatura. ... 81
Figura 20 – Estabilidade da enzima PG em função da temperatura para o extrato enzimático obtido por FES pelo A. niger usando CL como substrato. ... 82
Figura 21 – Estabilidade da enzima PG em função da temperatura para o extrato enzimático obtido por FES pelo A. niger usando ANL como substrato. ... 83
Figura 22 – Estabilidade da enzima PG em função do pH para o extrato enzimático obtido por FES pelo A. niger usando CL como substrato. ... 84
Figura 23 – Estabilidade da enzima PG em função do pH para o extrato enzimático obtido por FES pelo A. niger usando ANL como substrato. ... 84
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Propriedades físico-químicas da aceroleira. ... 24 Tabela 2 – Características físicas e químicas do cajá (S. mombin L.). ... 26 Tabela 3 – Classificação das enzimas pécticas. ... 31 Tabela 4 – Propriedades físico-químicas e bioquímicas de algumas pectinas liases produzidas por diferentes microrganismos. ... 32 Tabela 5 – Componentes presentes no hidrolisado e seus respectivos fatores de conversão. .. 44 Tabela 6 – Níveis dos fatores para o planejamento 23 com triplicata no ponto central ... 53 Tabela 7 – Matriz do planejamento experimental 23 com triplicata no ponto central para a otimização da extração de enzimas pectinolíticas por FES utilizando o resíduo de CL como substrato. ... 53 Tabela 8 – Volume de extrato enzimático adicionado na polpa de cajá na clarificação... 57 Tabela 9 – Valores da caracterização físico-química dos resíduos de acerola não lavada (ANL), acerola lavada (AL), cajá não lavado (CNL) e cajá lavado (CL). ... 62 Tabela 10 – Diâmetro médio de Sauter dos resíduos de acerola não lavada (ANL), acerola lavada (AL), cajá não lavado (CNL) e cajá lavado (CL). ... 67 Tabela 11 – Significância entre as médias dos parâmetros apresentados no cultivo FES usando o resíduo ANL. ... 72 Tabela 12 – Significância entre as médias dos parâmetros apresentados no cultivo FES usando o resíduo AL. ... 73 Tabela 13 – Significância entre as médias dos parâmetros apresentados no cultivo FES usando o resíduo CNL. ... 75 Tabela 14 – Significância entre as médias dos parâmetros apresentados no cultivo FES usando o resíduo CL. ... 77 Tabela 15 – Matriz do planejamento experimental 23 com 3 pontos centrais para otimização da etapa de extração de PG. ... 78 Tabela 16 – Rendimento da polpa de cajá após a etapa de clarificação. ... 85 Tabela 17 – Valores das propriedades físico-químicas e funcionais da polpa de cajá após clarificação usando complexo enzimático produzido pelo A. niger usando o resíduo de ANL ou CL como substrato. ... 87
LISTA DE QUADRO
LISTA DE ABREVIATURAS ABNT – Associação Brasileira de Normas Técnicas
AL – Acerola Lavada ANL – Acerola Não Lavada ANOVA – Analysis of Variance ART – Açúcares Redutores Totais AR – Açúcares Redutores
BDA – Ágar Batata Dextrose BF – Bradford
BSA – Albumina Bovina Sérica
CCFF – Coleção de Culturas de Fungos Filamentosos CEASA – Central de Abastecimento
CL – Cajá Lavado
CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência CNL – Cajá Não Lavado
DEQ – Departamento de Engenharia Química DNS – Ácido 3,5 dinitrosalicílico
DPPH – 2,2-difenil-1-picril-hidrazil DR-X – Difração de Raio-X
EC – Enzyme Commission
FES – Fermentação em Estado Sólido FI – Força Iônica
FPase – Celulase Total FS – Fermentação Submersa
FTIR – Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier GRAS – Generally Recognized as Safe
IAL – Instituto Adolfo Lutz
IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística IBRAF – Instituto Brasileiro de Frutas
IC – Índice de Cor
IN – Instrução Normativa
IUPAC-IUB – Commission on Biochemical Nomenclature LEB – Laboratório de Engenharia Bioquímica
LEFI – Laboratório Escola de Farmácia Industrial LOU – Laboratório de Operações Unitárias
MAPA – Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento MEV – Microscopia Eletrônica de Varredura
NREL – National Renewable Energy Laboratory PG – Poligalacturonase (pectato hidrolase) PGL – Poligalacturonato Liase (pectato liase) PMG – Polimetilgalacturonase (pectina hidrolase)
PMGE – Polimetilgalacturonato Esterase (pectina esterase) PMGL – Polimetilgalacturonato Liase (pectina liase) PT – Proteínas Totais
SST – Sólidos Solúveis Totais
Trolox – 6-Hidroxi-2,5,7,8-Tetrametilchroman-2-Ácido Carboxílico UFRN – Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Capítulo 1
Introdução
1 INTRODUÇÃO
A busca pelo consumo de sucos tropicais é uma tendência mundial, especialmente, nas áreas de clima quente. Além disso, destaca-se a crescente demanda dos países desenvolvidos por frutas tropicais. O Instituto Brasileiro de Frutas (Ibraf) avaliou que, no ano 2015, 53% das frutas comercializadas foram destinadas para o comércio na forma fresca e o restante encaminhado para processamento de polpas. Desse total, apenas 3% foram destinados ao mercado internacional. Devido à sua diversidade de clima, solo e vocações distintas, o Brasil possui centenas de espécies de frutas distribuídas por todo o território nacional, que o faz produzir frutas durante quase todo o ano, inclusive nos meses nos quais o mercado europeu, asiático e norte-americano estão desabastecidos. Em 2017, a produção frutífera no Brasil foi de 44 milhões de tonelada de frutas frescas. De acordo com o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE-2016), apenas 22 fruteiras são recenseadas (EMBRAPA, 2012; ANUÁRIO BRASILEIRO DE FRUTICULTURA, 2016).
Como consequência de suas atividades, a indústria de alimentos e bebidas gera uma alta quantidade de resíduos orgânicos como subprodutos dos processos de fabricação, representando um potencial poluente para o meio ambiente. Assim, como alternativa, surgem os processos biotecnológicos para a valorização destes resíduos, gerando produtos de alto valor agregado, o que pode resultar em grandes vantagens econômicas e ecológicas. Dentre as frutas produzidas e/ou cultivadas no Brasil, ressaltam-se o cajá (Spondias mombin L.) e a acerola (Malpighia glabra) por conta do pouco aprofundamento na literatura e por serem frutas cultivadas na região Nordeste, ricas em minerais e vitaminas. Portanto, sugere-se a reutilização do resíduo gerado por essas frutas no processo de produção de enzimas, visando o consumo da matéria orgânica pelo microrganismo para sintetizar enzimas de interesse - agregando valor ao complexo enzimático -, que poderá ser recuperado (AHMED et al., 2016; ORTIZ et al., 2017).
Nas últimas duas décadas, a demanda por enzimas microbianas para aplicações biotecnológicas tem crescido significativamente. O mercado global de enzimas foi estimado em cerca de US$ 4,2 bilhões em 2014 e espera-se que se desenvolva entre 2015 e 2020 em uma taxa de crescimento anual de aproximadamente 7%, podendo chegar a US$ 6,2 bilhões no final deste período. Considerando a sua vasta aplicação, é importante obter essas enzimas na sua forma mais ativa e a baixo custo (SANDRI; FONTANA; SILVEIRA, 2015; BEHERA; RAY, 2016; SINGH et al., 2016).
Vários pesquisadores confirmam que a produção de enzimas através do processo fermentativo em estado sólido (FES) seja mais vantajosa do que a fermentação submersa (FS).
Pois, a FES permite a utilização de resíduos agroindustriais como substratos de baixo custo, exige uma baixa quantidade de água, fornece um meio mais concentrado, evita a repressão catabólica e proporciona produtividades volumétricas elevadas. Além disso, os resíduos agroindustriais estão amplamente disponíveis no Brasil. Portanto, a redução dos custos de operação e a revalorização dos resíduos descartados nas empresas de alimentos podem ser obtidas através da indução da produção de enzimas tais como pectinases através dos próprios resíduos agrícolas por elas gerados (PITOL et al., 2016; SUHAIMI et al., 2016; ORTIZ et al., 2017; RODRIGUES et al., 2017).
A pectina é um heteropolissacarídeo constituído principalmente de monômeros de ácido galacturônico ligados na posição 14), podendo conter também outros grupos conectados a cadeia, como os grupos carboxilas metil esterificados. Ela está presente especialmente nas paredes celulares das plantas e tem característica hidrofílica. A pectina presente nos resíduos lignocelulósicos é um fator que pode induzir a produção de pectinase pelo microrganismo. Pois, as enzimas pectinolíticas são as responsáveis por clivar tanto a pectina como outros polissacarídeos pécticos em resíduos de ácido galacturônico (KASHYAP et al., 2001).
As enzimas pectinolíticas são aplicadas industrialmente em diversos setores como processadoras de suco de frutas e vinhos, recuperação de óleos essenciais, extração de óleos vegetais, produção de alimentos funcionais, fermentação de chá e café, além das indústrias têxtil e, de papel e de celulose. Um dos principais problemas na indústria de sucos é a formação de uma dispersão coloidal proveniente da elevada concentração de pectina. Embora as partículas em suspensão possam ser removidas por filtração, a presença de pectina pode dificultar e atrasar o processamento do suco. Portanto, o emprego de pectinases torna-se essencial caso deseje-se processar grandes quantidades de suco em pouco tempo (UENOJO; PASTORE, 2007; SANDRI et al., 2013).
Dessa forma, muitas são as vantagens econômicas e ambientais alcançadas ao se revalorizar os resíduos orgânicos produzidos nas indústrias de alimentos para se aplicar nos processos biotecnológicos. Por exemplo, um estudo baseado na análise de ciclo de vida “Life Cycle Assement” relatou uma redução de 18 vezes da emissão de gás carbônico ao se usar enzimas pectinolíticas na etapa de extração do azeite de oliva. Portanto, percebe-se a redução do consumo energético e da poluição ao meio ambiente ao se utilizar pectinases nos processos industriais. No intuito de reduzir os custos operacionais, é possível citar a aplicação de pectinases oriundas de bioprocessos em diversas áreas do setor de alimentos e bebidas tais quais: maceração de fibras naturais, fermentação de café e no chá de folhas, clarificação de suco, extração de óleo vegetal e etc. Tanto as vantagens econômicas quanto as ambientais são
fortes motivos para a utilização de pectinases advindas de processo biotecnológico pelas empresas (ARUNACHALAM; SARITHA, 2009; TRENTINI et al., 2015; ORTIZ et al., 2017). Outra tendência mundial é o uso de alimentos e aditivos produzidos por rota biotecnológica, uma vez que os riscos à saúde humana ou animal são menores do que os alimentos obtidos sinteticamente. Dessa maneira, destaca-se o microrganismo Aspergillus niger, dentre os vários microrganismos reportados na literatura como produtores de pectinases, pelos resultados promissores na síntese de enzimas pectinolíticas. Essas enzimas são caracterizadas como ‘Generally Recognized As Safe’ (GRAS), isto é, geralmente reconhecido como seguro na indústria de alimentos (TARAGANO; PILOSOF, 1999; AHMED et al., 2016). Em virtude dos aspectos citados, buscou-se avaliar o potencial dos resíduos de cajá e acerola como substratos indutores para a produção de pectinases pelo microrganismo Aspergillus niger IOC 4003 por fermentação em estado sólido.
Capítulo 2
Objetivos
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Produzir, caracterizar e aplicar as enzimas pectinolíticas de Aspergillus niger IOC 4003 utilizando resíduos de acerola e cajá como substrato da fermentação em estado sólido.
2.2 Objetivos específicos
Determinar a composição química e físico-química dos resíduos de acerola e cajá, lavados e não lavados;
Avaliar o emprego dos resíduos de cajá e acerola, como indutores, para a produção de enzimas pectinolíticas por fermentação em estado sólido durante 10 dias;
Definir os valores de pH, força iônica e tempo de contato para máxima extração da enzima poligalacturonase, empregando um planejamento experimental 23 com 3 pontos centrais;
Investigar a estabilidade da poligalacturonase obtida em diferentes valores de pH e temperatura;
Avaliar o efeito dos extratos enzimáticos produzidos na clarificação do suco de cajá, verificando sua influência sobre as características físico-químicas (cor, turbidez, viscosidade, ºBrix, acidez titulável) e funcionais do suco (fenólicos totais, atividade antioxidante, vitamina C).
Capítulo 3
Revisão Bibliográfica
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3.1 Acerola
O cultivo de acerola (Malpighia glabra) para comercialização começou a partir da década de 1950 em Porto Rico, se estendendo pelo Havaí, Flórida e Cuba. Após mais de 50 anos, a acerola oriunda de Porto Rico chegou ao Brasil, primeiramente, pelo estado de São Paulo, e se firmou no trópico-árido do Nordeste. O solo e o clima nordestino se mostraram mais favoráveis às diversas espécies de acerola, tornando possível a implementação de vários pomares comerciais. A acerola se destaca pela sua riqueza em vitamina C quando comparada com outras frutas comerciais como a laranja e a goiaba, superando suas quantidades em 100 e 10 vezes, respectivamente (MATTA; CABRAL, 2010; RITZINGER; RITZINGER, 2011).
A árvore da acerola é denominada aceroleira ou cerejeira-das-antilhas (Figura 1). Sua origem advém de duas espécies, Malpighia punicifolia e Malpighia glabra; denominações divergentes entre os botânicos. Pois, um grupo de pesquisadores defende que essas espécies não são diferentes entre si, apenas expressam aspectos botânicos distintos (INTERNATIONAL BOARD OF PLANT GENETIC RESOURCES MALPIGHIA EMARGINATA (ACEROLA), 1986; FRANZÃO; MELO, 1994).
Figura 1 – A fruta acerola e a aceroleira.
Fonte: Google Imagens. ‘a’ – acerola; ‘b’ – aceroleira. 3.1.1 Comercialização
O Brasil é o maior produtor, exportador e consumidor do mundo em acerola tendo cerca de 7.200 ha de terra plantada para o seu cultivo. Por parte do governo não há dados da quantidade produzida de acerola por região, estado ou município. No entanto, a produtividade de acerola, no Brasil, é estipulada em torno de 150 mil toneladas por ano. Dessa forma, é
estimado que haja enormes proporções de resíduo da acerola sendo descartado ao meio ambiente sem qualquer direcionamento de revalorização ou reutilização. Os estados brasileiros com maior produção de acerola são Pernambuco (23,11%), Ceará (14,32%), São Paulo (11,39%) e Bahia (10,48%). Com menor importância estão os estados do Rio Grande do Norte, Paraíba e Piauí. Ao total, os estados nordestinos têm participação em 64% da produção de acerola. No mercado nacional, a produção de acerola é destinada à indústria de processamento (46%) e ao comércio de frutas frescas (54%) (OLIVEIRA; SOARES FILHO, 1998; EMBRAPA, 2012).
3.1.2 Características físico-químicas da acerola
A Tabela 1 apresenta a composição físico-química da acerola. Os parâmetros pH e acidez confirmam a classificação da acerola como fruta cítrica e indicam que o risco de crescimento microbiano é minimizado. Além disso, quanto menor a acidez titulável, maior a taxa de decomposição (NARAIN et al., 1992; OLIVEIRA et al., 1999).
Tabela 1 – Propriedades físico-químicas da aceroleira. Propriedade SANCHO et al.,
(2015)
MÉLO et al., (2014)
Atividade de água 0,38 ± 0,01 -
pH 3,45 ± 0,03 3,54 ± 0,01
Sólidos solúveis totais
(°Brix) 3,00 ± 0,04 29,97 ± 0,20 Acidez (g/ 100 g) 3,60 ± 0,40 - Proteína (g/ 100 g) 0,00 - Açúcares redutores (g/ 100 g) 15,29 ± 0,10 9,40 ± 0,10 Umidade (g/ 100 g) 4,90 ± 0,35 7,98 ± 0,21 Cinzas (g/ 100 g) 2,07 ± 0,07 2,36 ± 0,05 Lipídios (g/ 100 g) 2,92 ± 0,03 -
Fonte: Adaptado pela autora (2018).
O valor baixo para sólidos solúveis totais (SST) sugere a ausência do sabor doce (propriedade organoléptica) da acerola. Na indústria alimentícia é comum associar os sólidos solúveis totais ao conteúdo de açúcar (YUSOF; IBRAHIM, 1994).
A atividade de água representa a quantidade de água livre do meio e a umidade determina a concentração de água presente na fruta. O valor da atividade de água menor que 0,6 reafirma a condição de não propiciar o crescimento microbiano quanto produzir de toxinas (CORREIA, 2004; SANCHO et al., 2015).
3.2 Cajá
O cajá é o fruto da cajazeira, árvore frutífera que faz parte da família Anacardiaceae e tem nome científico de Spondias mombin L. (Figura 2). Nessa família, estão reunidos também o umbuzeiro (Spondias tuberosa Arruda), a cajaraneira (S. dulcis Parkinson), a mangueira (Mangifera indica), a serigueleira (Spondias purpurea L.) e o cajueiro (Anacardium occidentale L.) entre outros. A diversidade da cajazeira é encontrada no Brasil nas regiões de Mata Atlântica e da Amazônia Ocidental também identificada por frutífera perene. No entanto, a família Anacardiaceae pode ser encontrada em regiões tropicais e subtropicais como fontes de exploração econômica – continente da América, da África e da Ásia (SOUZA; LORENZI, 2005; SOUZA et al., 2012; MITCHELL; DALY, 2015).
Mundialmente, o cajá tem várias denominações tendo em português vários nomes: cajá, cajá-mirim, taperebá ou cajá verdadeiro; em espanhol: ciruela marilla; em inglês: hog plum e yellow mombin; e na língua francesa: mombin, mombin jaune, prune dor, prunier mombin e prunier myrobolan (SACRAMENTO; SOUZA, 2000; TIBURSKI et al., 2011).
Figura 2 – Cajazeira e o fruto cajá.
Fonte: Google Imagens. ‘a’ - cajazeira; ‘b’ - fruto cajá.
A demanda pelo cajá fresco ocorre principalmente nos mercados locais, feiras-livres e Centrais de Abastecimentos (CEASA), enquanto que as polpas de cajá – suco processado e congelado – são direcionadas mais para restaurantes, lanchonetes e hotéis, devido à facilidade de armazenamento e preservação da polpa por longos períodos. Essa busca por frutos exóticos cresce a cada ano, e o cajá está neste grupo porque apresenta propriedades antioxidantes. Esses compostos antioxidantes são atribuídos ao tratamento de prevenção contra certas enfermidades como câncer, doenças degenerativas e cardiovasculares. (WANG; CHUANG; HSU, 2008; CARVALHO et al., 2015; CARVALHO; CHAVES; ALVES, 2017).
3.2.1 Comercialização
No Brasil, a oferta e o processamento de cajá estão restritos às regiões Norte e Nordeste, onde os estabelecimentos ainda são rudimentares ou de caráter doméstico. Dessa forma, existe a possibilidade de ampliar a produção e a venda de cajá nos mercados internos e externos dessas regiões, visando tanto o mercado nacional quanto o internacional. Devido a esta situação, há muito a se desenvolver para melhorar cultivo, produção e processamento do cajá como também de outras frutas (EMBRAPA, 2009; SOUZA; SOARES; INNECO, 2017).
3.2.2 Características físico-químicas do cajá
A Tabela 2 apresenta a composição físico-química do cajá por diferentes autores. Destacam-se o baixo conteúdo de proteína e lipídios, e os parâmetros pH e °Brix que indicam a não propensão de crescimento microbiano e o alto teor de açúcares, respectivamente.
Tabela 2 – Características físicas e químicas do cajá (S. mombin L.). Propriedades Tiburski et al.,
(2011) Sacramento et al., (2007) Barbosa et al., (1981) Leon; Shaw (1990) Proteínas (g/ 100 g) 1,06 ± 0,04 - - 0,8 a 1,4 Carboidratos (g/ 100 g) - - - 8,7 a 13,8 Lipídios (g/ 100 g) - - - 0,1 a 2,1 Cinzas (g/ 100 g) 0,76 ± 0,01 - - 0,6 a 0,7 pH 2,83 ± 0,01 2,4 a 3,0 2,1 2,1 SST (ºBrix) (g/ 100 g) 14,9 ± 0,1 11,4 a 15,0 10,2 - Açúcares redutores (g/ 100 g) - 6,1 a 10,8 6,7 6,7 a 9,4
Fonte: Adaptado de Embrapa (2009).
As divergências de valores encontrados das propriedades físico-químicas pelos pesquisadores podem ser explicadas por vários fatores tais como localidade da fruta, estágio de amadurecimento, fator genéticoe a época da colheita (EMBRAPA, 2009).
3.3 Reaproveitamento de resíduos agroindustriais
O reaproveitamento de resíduos agrícolas na indústria alimentícia tem sido estudado como matéria-prima em processos produtivos. Um exemplo dessa simbiose ocorre dentro das próprias indústrias de alimentos onde seus resíduos estão sendo reutilizados nos setores que realizam formulação alimentar ou composição de misturas alimentícias. Entre as empresas de alimentos, as processadoras de polpa de frutas estão entre as mais interessadas em agregar valor
aos resíduos produzidos, uma vez que elas perdem em torno de 60% da massa total das frutas processadas (SANCHO et al., 2015; ANDRADE, 2016).
Vários resíduos são conhecidos pelo elevado teor de pectina em suas fibras, tais como a borra de café, casca de limão, bagaço de maça, bagaço da cana-de-açúcar, capítulos de girassol sem sementes e o farelo de trigo. Todos esses resíduos podem ser aplicados ao processo FES ou FS, almejando-se a síntese dos produtos de fermentação, entre eles, as enzimas. Vale ressaltar que as condições de cultivo para a FES assemelham-se aos ambientes naturais (habitat) de certos microrganismos, permitindo assim o seu crescimento e a síntese do produto de interesse em maior rendimento quando comparado ao cultivo por FS (PATIL; DAYANAND, 2006; RODRÍGUEZ-FERNÁNDEZ et al., 2011; AHMED et al., 2016).
Os benefícios dos processos biotecnológicos são encontrados tanto na área econômica quanto na ambiental. Um primeiro aspecto a ser evidenciado é a revalorização dos resíduos orgânicos descartados pelas indústrias de alimentos, gerando produtos de alto valor agregado como enzimas e outros compostos. Além disso, existe uma redução da emissão de gás carbônico ao meio ambiente em 18 vezes como relatado por um estudo baseado na análise de ciclo de vida ‘Life Cycle Assessment’ ao se reaproveitar o resíduo gerado na produção do azeite de oliva. Dessa maneira, empregando processos biotecnológicos, é possível aumentar o lucro líquido da empresa e reduzir a poluição ambiental. Pois, a escolha por materiais lignocelulósicos se torna barata e de fácil acesso, especialmente, quando o país, no caso do Brasil, produz elevados volumes de resíduos agroindustriais (CASTILHO; MEDRONHO; ALVES, 2000; AHMED et al., 2016; ORTIZ et al., 2017).
Resíduos agrícolas ricos em pectina, por exemplo, polpas cítricas ou bagaço de beterraba, estão sendo recomendados a serem hidrolisados por pectinases com o propósito de produzir etanol e produtos químicos nas biorrefinarias. Contudo, as enzimas pectinolíticas precisam ser adquiridas de maneira barata e em grandes quantidades pelas biorrefinarias para que esse tipo de processo seja viável economicamente (PITOL et al., 2016).
3.4 Substâncias pécticas
As frutas são importantes por causa de suas propriedades nutricionais e funcionais. As paredes celulares e a lamela média das frutas são constituídas por várias moléculas poliméricas classificadas tais como proteínas, celulose, hemicelulose e polissacarídeos pécticos. Porém, o conteúdo e a estrutura química dessas moléculas sofrem modificações a depender do estágio de maturação e do tipo de fruta (PAIVA; LIMA; PAIXÃO, 2009; RAVEN, 2001; YAMAMOTO et al., 2011; GHOSH; PRADHAN; SABYASACHI, 2016).
Estudos mostram a possibilidade de extração de compostos bioativos, minerais e agentes antimicrobianos a partir de remanescentes das frutas (bagaço, casca e semente). Uma vez que a pectina presente nos resíduos lignocelulósicos, principalmente nas paredes dos frutos e vegetais, é um componente importante que pode favorecer a produção de pectinases pelo microrganismo. Dessa forma, as pectinases, grupos complexos de enzimas hidrolíticas, atuam sobre a pectina (Figura 3) liberando oligômeros de ácido galacturônico para o consumo pelo microrganismo (SANCHO et al., 2015; ORTIZ et al., 2017).
Figura 3 – Estrutura da pectina.
Fonte: UENOJO e PASTORE (2007).
O agrupamento das substâncias pécticas é dado por protopectina, ácidos pécticos, ácidos pectínicos e pectina. A protopectina é considerada uma substância péctica insolúvel presente nos tecidos das plantas e, após uma hidrólise direcionada, produz pectina ou ácidos pectínicos. Os ácidos pécticos são galacturonanos com quantidade desprezível de grupos metoxílicos e seus sais são denominados pectatos. Os ácidos pectínicos são também galacturonanos, porém com diversas quantidades de grupos metoxílicos, e os pectinatos são os seus sais. As pectinas são compostas por distintos componentes, porém possuem o ácido pectínico como componente principal, e são solúveis (ALKORTA et al., 1998; KASHYAP et al., 2001).
Sabe-se que a pectina (Figura 3), um heteropolissacarídeo, está presente nas paredes celulares das plantas, sendo constituída por uma cadeia péctica formada, principalmente, por ácidos galacturônicos ligados por α-1,4 (maioria), em β-1,4 (minoria), e por ramnose conectados em β-1,2 (2 a 4%), podendo conter grupos carboxilas metil esterificados. Também, encontra-se na estrutura péctica blocos ricos em L-ramnose e cadeias laterais de arabinose, galactose e xilose (ALKORTA et al., 1998; CASTILHO; MEDRONHO; ALVES, 2000; KASHYAP et al., 2001; COELHO; SALGADO; RIBEIRO, 2008; AHMED et al., 2016).
A substância péctica, protopectina, presente nas células vegetais possui a função de evitar o amadurecimento da fruta mantendo-a no aspecto verde. Portanto, na fruta madura, já ocorreu o processo de hidrólise parcial dessa protopectina em pectina, substância péctica encarregada de tornar a fruta macia e degustável. Em abundância, a pectina é situada nas paredes celulares primárias (planta jovem) ou na lamela intermediária das plantas superiores. A região intercelular dos vegetais e as paredes primárias das plantas jovens contém a pectina
como polissacarídeo estrutural (CASTILHO; MEDRONHO; ALVES, 2000; KASHYAP et al., 2001; COELHO; SALGADO; RIBEIRO, 2008; AHMED et al., 2016; SUHAIMI et al., 2016).
3.5 Enzimas pectinolíticas
As pectinases são um grupo heterogêneo de enzimas capazes de hidrolisar substâncias pécticas (Figura 4), sendo assim consideradas valiosas e demandadas em diversas áreas da indústria. As enzimas pectinolíticas são as responsáveis por clivar tanto a pectina, como outros polissacarídeos pécticos, em resíduos de ácido galacturônico. A família enzimática denominada pectinases, as quais catalisam ácido péctico e pectina, é composta por poligalacturonases e são subdivididas em endopoligalacturonases e exopoligalacturonases. Em geral, as pectinases se dividem em três principais grupos: enzimas desterificantes, enzimas despolimerizantes e protopectinases (ALKORTA et al., 1998; RODRÍGUEZ-FERNÁNDEZ et al., 2011; SUHAIMI et al., 2016).
As enzimas desterificantes, conhecidas por pectinesterases, atuam na desesterificação dos grupos metoxilados da pectina gerando os pectatos ou ácidos pécticos (Figura 4). Estão, provavelmente, envolvidas nas alterações do conteúdo péctico presente nas frutas e vegetais durante o processo de amadurecimento, estocagem e processamento. Os pectatos também são mencionados na literatura como os grupos de ácido galacturônico desmetilados (SAKAI et al., 1993; PEDROLLI et al., 2009).
O segundo grupo, as enzimas despolimerizantes, é decomposto em enzimas hidrolases e liases que apresentam a função de clivar a ligação α-1,4-glicosídica entre os monômeros galacturônicos em produtos pécticos. Pelas hidrolases, as ligações são quebradas por hidrólise e pelas liases, o rompimento acontece por β-eliminação. Existe preferência de clivagem das enzimas despolimerizadoras em relação a subtância péctica. Por exemplo, nas hidrolases, as poligalacturonases (PG) agem nos pectatos e as polimetilgalacturonases (PMG) na pectina. Nos tipos liases, há as enzimas poligalacturonato liases (PGL) que desempenham a quebra no pectato formando os monômeros de ácido galacturônico, e as enzimas polimetilgalacturonato liases (PMGL) na pectina (Figura 4). Por último, as protopectinases são as responsáveis por solubilizar as protopectinas liberando pectinas altamente polimerizadas e solúveis em água (PITT, 1988; ALKORTA et al., 1998; UENOJO; PASTORE, 2007; HEERD et al., 2012).
Figura 4 – Modo de ação enzimática das pectinases em uma molécula de pectina.
Fonte: Uenojo e Pastore (2007). PMGL - polimetilgalacturonato liase (pectina liase); PMG - polimetilgalacturonase (pectina hidrolase); PMGE - polimetilgalacturonato esterase (pectina esterase); PGL - poligalacturonato liase (pectato liase); PG - poligalacturonase (pectato hidrolase).
Na Tabela 3, apresenta-se um resumo da classificação das pectinases com as nomenclaturas recomendadas pela IUPAC-IUB (Commission on Biochemical Nomenclature) de acordo com a comissão de enzima (EC – Enzyme Commission). Os prefixos endo- ou exo- adicionados aos nomes das enzimas são usados para indicar o modo de atuação enzimática como ação aleatória ou ação no terminal da cadeia.
Tabela 3 – Classificação das enzimas pécticas.
Tipo de pectinase Nome sugerido pela EC Sigla Nome comum Número EC
Desesterificante Polimetilgalacturonase esterase PMGE Pectina esterase 3.1.1.11 Hidrolase Endo poligalacturonase Endo-PG Poligalacturonase 3.2.1.15 Exo poligalacturonase 1 Exo-PG 1 Poligalacturonase 3.2.1.67 Exo poligalacturonase 2 Exo-PG 2 Poligalacturonase 3.2.1.82 Endo polimetilgalacturonase Endo-PMG Pectina hidrolase
Exo polimetilgalacturonase Exo-PMG Pectina hidrolase
Liase Endo poligalacturonase liase Endo-PGL Pectato liase 4.2.2.2 Exo poligalacturonase liase Exo-PGL Pectato liase 4.2.2.9 Endo polimetilgalacturonato liase Endo-PMGL Pectina liase 4.2.2.10
Exo polimetilgalacturonato liase Exo-PMGL Pectina liase
Fonte: UENOJO e PASTORE (2007).
Segundo Ahmed et al. (2016), as cascas de frutas cítricas são bem conhecidas por seu conteúdo de pectina, fonte indutora na obtenção das enzimas pectinases. Os resíduos cítricos apresentam baixa quantidade de gordura em seu material, sendo mais rico em carboidratos e proteínas. Além disso, 25% da produção mundial de enzimas alimentares advêm das enzimas pectinolíticas, sendo a maioria delas aplicada em processadoras de frutas (JAYANI; SAXENA; GUPTA, 2005; PATIL; DAYANAND, 2006).
3.6 Microrganismos produtores de pectinases
Diversos microrganismos são estudados com a finalidade de produzir enzimas pectinolíticas. Em cada pesquisa, variam-se as condições operacionais como temperatura, pH, tempo de cultivo, umidade, entre outras, baseando-se encontrar os requisitos ótimos de cultivo para cada microrganismo (Tabela 4). Destaca-se que o desempenho do Aspergillus niger para sintetizar enzimas pectinolíticas ocorreu em pH 5,5 e temperatura de 35°C conforme apresentado por Yadav et al. (2009).
Em meados da década de 1990, intensificaram-se os estudos sobre os microrganismos produtores de pectinases e o uso de A. niger foi recomendado como possível bom produtor dessas enzimas. Recentemente, foram determinadas, no âmbito científico, as espécies A. niger e A. sojae como precursores na formação de pectinases em ambiente favorável (PATIL; DAYANAND, 2006; ORTIZ et al., 2017).
O crescimento microbiano depende do ambiente proporcionado como temperatura, umidade, pH e fonte energética. E a síntese das enzimas pectinolíticas está associada aos teores de carboidratos presentes no meio de cultivo, em especial, a pectina – carboidrato indutor.
Diante do exposto, o gênero Aspergillus tem a característica peculiar de produzir complexos pectinolíticos em meio favorável. A espécie A. niger produz pectinases perante a hidrólise e assim permite que o microrganismo consuma 60% de substrato, pectina ou ácido péctico. Por exemplo, as poligalacturonases (PG) atuam na faixa de pH 4 a 5, e as pectinoliases (PMGL), do tipo endo-PMGL, no pH 5 (VITOLO, 2001; RODRÍGUEZ-FERNÁNDEZ et al., 2011; SANDRI; FONTANA; SILVEIRA, 2015; ANDRADE, 2016).
Tabela 4 – Propriedades físico-químicas e bioquímicas de algumas pectinas liases produzidas por diferentes microrganismos.
Fonte pH ótimo Temperatura
ótima (°C) Massa molecular (kDa) Km (mg/mL) Aspergillus sojae 5,5 – 32 – Erwinia aroideae 8,0 40,0 28 – Aspergillus joponicus 6,0 55,0 – 0,16 Penicillium paxilli 5,0 35,0 – 2,5 Aspergillus oryzae 8,5 40,0 34,0 1,36 Collectrotrichum lindemuthianum 9,3–9,8 – 23,5–28,5 – Rhizoctonia solani 7,0 – 35,0 – Fusarium oxysporum 9,5 50,0 18,0 – Bacillus sp. 6,0 40,0 52 – Paenibacillus amylolyticus 7,9 40,0 – 4,6 Thermoascus aurantiacus 10,5 65,0 – – Aspergillus niger 5,5 35,0 – – Cystofilobasidium capitatum 8,0 40,0 42,0 36,6 Penicillium canescens 5,5 60,0 38,0 – Penicillium expansum 7,0 45,0 36,5 9,0 Penicillium italicum 9,0 50,0 34,0 15,0 Penicillium oxalicum 8,0 50,0 50,0 1,1 Penicillium viridicatum 10,5 50,0 – – Pythium splendens 8,0 – 23,0 – Pseudomonas fluorescens 8,5 – 32,0 3,2 Rizopus oryzae 7,5 50,0 31,0 3,87 Aspergillus flavus 8,0 50,0 38,0 0,59 Aspergillus ficuum 5,0 50,0 31,6 0,60
Muitos estudos já demonstraram o potencial e a capacidade de fungos filamentosos serem usados para a síntese de enzimas pectinolíticas. O cultivo de fungos filamentosos é uma alternativa barata e de alto rendimento, e ressalta-se o gênero Aspergillus como um produtor bem-sucedido. Dentro desse gênero, a espécie A. niger destaca-se pela versatilidade de seu metabolismo, permitindo a produção de ácidos orgânicos e diferentes tipos de enzimas industriais de acordo com o substrato disponível e as diversas circunstâncias ambientais. Portanto, observa-se que a composição do meio de cultivo pode ser determinante na produção de pectinases por A. niger. (PILI et al., 2015; SÁNCHEZ et al., 2015; ORTIZ et al., 2017; SUHAIMI et al., 2016).
Além do mais, a utilização de enzimas produzidas pelo fungo Aspergillus spp. é caracterizada como GRAS por autoridades reguladoras, e sua recuperação do meio de cultivo é facilmente viável devido excreção extracelular das pectinases para o meio pelo microrganismo. Tais vantagens potencializam o uso de A. niger como produtor dessas enzimas para aplicação na indústria de alimentos (TARAGANO; PILOSOF, 1999; HEERD; DIERCKS-HORN; FERNÁNDEZ-LAHORE, 2014; BARMAN et al., 2015)
3.7 Tipos de processos fermentativos
A obtenção de enzimas a partir de fungos pode ser conduzida tanto pela FES quanto pela FS. Alguns aspectos de ambas as fermentações podem ser observados no Quadro 1.
Industrialmente, a FS é priorizada em função da facilidade de controle das variáveis pH, temperatura, oxigenação e homogeneização, bem como permite a viabilidade do aumento de escala. No entanto, as condições propiciadas pela FES são favorecidas porque a FES imita o habitat natural dos fungos filamentosos que crescem e excretam enzimas. Além disso, existe uma maior produção de enzimas por FES do que por FS, uma vez que a FES evita a repressão catabólica e eleva a produtividade de enzimas por massa de resíduo. E por fim, o volume de resíduo líquido gerado pela FES é menor do que a FS (CASTILHO; MEDRONHO.ALVES, 2000; POLETTO et al., 2015; SANDRI; FONTANA; SILVEIRA, 2015).
A FES é uma das possibilidades para produzir pectinases a partir de subprodutos agroindustriais. Dessa forma, vale salientar a dificuldade em controlar a temperatura da matriz sólida para escalas industriais posto que existem limitações de transferência de calor e massa (PITOL et al., 2016).
Quadro 1 – Comparação das características da FES e da FS.
FES FS
Menor gama de produtos obtidos e de microrganismos aptos a crescer nessas condições
Maior demanda energética associada à esterilização do meio e à remoção de produto do meio fermentado
Menor possibilidade de contaminação, pela ausência de água livre no sistema
Em que pese a menor concentração de produtos obtida pela FS, a purificação dessas moléculas é facilitada pela ausência ou baixa concentração de partículas de substrato
Menor disponibilidade de informações na literatura, no que tange a fenômenos de transporte e cinéticas de crescimento e de produção enzimática
O alto teor de água e a natureza diluída do meio facilitam o controle da temperatura de cultivo, reduzindo a degradação do produto, em especial enzimas com baixa termoestabilidade
O extrato obtido é em geral de três a quatro vezes menos diluído que na FS, de forma que a produtividade e a concentração final de produto são maiores na FES
Quando operando com elevadas concentrações de substrato, podem ocorrer problemas reológicos no sistema
Maior dificuldade no controle do processo e na adição de soluções desejadas
Processos difusionais e de mistura são facilitados devido ao caráter homogêneo do sistema
Menor volume de resíduos líquidos gerado Tecnologias de monitoramento de variáveis on line mais amplamente disponíveis
Fonte: CASTRO e PEREIRA JR (2010).
A vantagem primordial de se utilizar a FES para produzir pectinases em detrimento da FS – tradicionalmente em uso – é a grande disponibilidade de subprodutos agroindustriais que podem ser utilizados como substrato, sendo possível alcançar altas produtividades volumétricas, e evitar a repressão catabólica, mesmo em um meio mais concentrado. Outros benefícios da FES na obtenção de enzimas são a estabilidade das enzimas em intervalos de pH e temperatura. Portanto, é razoável prever redução de custos do processo (HEERD; DIERCKS-HORN;FERNÁNDEZ-LAHORE, 2014; PITOL et al., 2016).
Na escolha da estratégia de produção, é preciso levar em consideração a composição do meio de cultivo, pois existe a perspectiva de um dos componentes da composição do cultivo ser responsável pela repressão, inibição ou indução à produção da enzima de interesse pelo microrganismo estudado. Por exemplo, alta concentração de glicose no meio sólido ocasiona diminuição na produção de pectinases utilizando o fungo Aspergillus niger; fenômeno este reportado por pesquisadores (THOMAS; LARROCHE; PANDEY, 2013; SANDRI; FONTANA; SILVEIRA, 2015).
Estudos mostram que a fonte de carbono presente no meio de fermentação é o fator crucial para favorecer o crescimento celular, tal como a produção da enzima de interesse. Além disso, as condições do cultivo como umidade, meio de cultura, fonte de nitrogênio e temperatura
influenciam na produção de enzimas pectinolíticas. Segundo Jayani et al. (2005), a baixa porcentagem inicial de ácido galacturônico favorece a produção de enzimas pectinolíticas, uma vez que uma alta concentração de açúcares (5%) ou derivados de ácido galacturônico se apresentam de maneira prejudicial ao microrganismo, fenômeno conhecido por repressão catabólica. (SANTOS et al., 2008a; SUHAIMI et al., 2016).
Além disso, a disponibilidade de água no meio reacional durante a FES é sugerida por pesquisadores como outro fator importante para o crescimento microbiano e formação do produto, uma vez que esse parâmetro ditará o fracasso ou o sucesso da produção de pectinases pelo microrganismo. A solubilização da matriz sólida beneficia o acesso do fungo à água como também torna o substrato intumescido, melhorando a infiltração do micélio ao mesmo. Outra importância sobre a eficácia do conteúdo de água é a melhora na transferência de oxigênio no interior do meio de cultivo (GONZALEZ et al., 1988; CASTILHO; MEDRONHO; ALVES, 2000).
3.7.1 Agente de extração
Na FES, a enzima está retida na matriz sólida, portanto, é necessário fazer a extração da enzima usando um solvente. No entanto, não existe ainda consenso entre os pesquisadores a respeito do solvente ideal para extração líquido-sólido. Na literatura, diferentes fatores são destacados como responsáveis pela eficiência do processo de extração: razão líquido/sólido, tipo de solvente, temperatura e tempo de exposição ao solvente (POLETTO et al., 2015).
De acordo com Santos et al. (2008b), a recuperação adequada das enzimas é uma etapa importante, pois uma baixa eficiência na extração da enzima pode anular economicamente a FES na produção da mesma. Como os parâmetros, temperatura, tempo de contato e tipo de solvente são variáveis importantes no processo de extração, é imprescindível avaliar a estabilidade térmica da enzima em função do tempo de exposição, como também o efeito do pH do solvente (CASTILHO; MEDRONHO; ALVES, 2000).
3.8 Aplicação industrial
As primeiras aplicações comerciais de enzimas pectinolíticas ocorreram na década de 1930, na fabricação de sucos de frutas e vinhos. No entanto, apenas após 1960, com a descoberta da composição química dos tecidos das plantas, as enzimas passaram a ser usadas de maneira mais eficiente nos processos industriais (KASHYAP et al., 2001).
Para aplicação industrial de uma enzima, um primeiro aspecto a se conhecer é o pH ideal, em que o biocatalisador mantém sua atividade em alto desempenho, para assim lhe atribuir nos sistemas pH similar. Por exemplo, para soluções ácidas, as pectinases são indicadas para os seguintes processos: extração, clarificação e liquefação de sucos de frutas ou vinhos. Enquanto para meios alcalinos, a indústria de tecidos as utilizam no retalhamento de fibras vegetais, como também, na etapa de branqueamento mecânico da celulose e no tratamento dos efluentes dos moinhos de papel na indústria de papel (SUHAIMI et al., 2016).
Além dessas aplicações, as pectinases são aplicadas também em outros setores, por exemplo, fermentações de café e chá, tratamento de desengomagem das fibras das plantas (remoção da mucilagem das frutas), bebidas alcoólicas e na extração de óleo vegetal. Uma vez que a característica principal e mais importante das pectinases é a atuação sobre o substrato sem deteriorar o produto final (PATIL; DAYANAND, 2006; RODRÍGUEZ-FERNÁNDEZ et al., 2011;THANGARATHAM; MANIMEGALAI, 2014; PITOL et al., 2016).
3.8.1 Indústria têxtil
É comum no processamento têxtil o uso de pectinases juntamente com outras enzimas tais como as celulases, amilases, hemicelulases e lipases com a finalidade de remover partículas grudentas advindas do algodão ou melhoramento na qualidade final do produto. Essas ações vêm sendo implementadas com o propósito de desenvolver etapas ambientalmente amigáveis na manipulação das fibras de tecido (HOONDAL et al., 2000; SINGH et al., 2016).
3.8.2 Fermentação de café e chá
Na fermentação do chá, as pectinases são aplicadas para acelerar este processo e evitar a formação de espuma proveniente dos sachês de chá instantâneo pela despolimerização da pectina. Enquanto na fermentação do café, faz-se o uso de pectinases para retirar o revestimento mucilaginoso do grão de café (CARR, 1985; JAYANI; SAXENA; GUPTA, 2005).
3.8.3 Extração e clarificação de sucos
Um grande desafio encontrado pelas processadoras de frutas é manter o frescor dos sucos após seu processamento, pois as condições ambientais podem deteriorar o produto, alterando suas características organolépticas e nutricionais. Outras preocupações do setor de bebidas de frutas são melhorar a etapa de extração e o rendimento do suco através de novas estratégias. Neste contexto, as enzimas pectinolíticas são um produto de importante aplicação
na clarificação de sucos de frutas e vinho, no melhoramento da homogeneização do suco de frutas e no aumento de rendimento da extração do suco (BARMAN et al., 2015; GHOSH; PRADHAN; SABYASACHI, 2016; ORTIZ et al., 2017).
Durante a extração da polpa, a pectina presente nas frutas maduras é transferida para os sucos, tornando-os mais viscosos e turvos. Por consequência, essa pectina dificulta as etapas seguintes de clarificação e filtração do suco extraído, além de interferir na cor e no aroma. Em contrapartida, as opções de separação por membrana e processamento enzimático do suco extraído seguidos pelo processo de clarificação são consideradas etapas avançadas pelas processadoras de frutas (SANDRI et al., 2011; COELHO; SALGADO; RIBEIRO, 2008; GHOSH; PRADHAN; SABYASACHI, 2016).
Além disso, a combinação de pectinases com outras enzimas (celulases, amilases, etc) é recomendada como uso no processamento de suco para melhorar a eficiência de prensagem das frutas: reduzindo o tempo de filtragem em até 50%, melhorando aroma e coloração (GAILING; GUIBERT; COMBES, 2000; JAYANI; SAXENA; GUPTA, 2005; KARLUND et al., 2014; SINGH et al., 2016).
Capítulo 4
Material e Métodos
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Obtenção e preparo dos resíduos
O resíduo de acerola (Malpighia glabra) foi adquirido através da empresa Polpa de Frutas Ideal situada em João Pessoa/PB, Brasil. O resíduo de cajá (Spondias mombin L.) foi obtido pela processadora de frutas Sterbom localizada em Parnamirim/RN, Brasil. Os resíduos foram divididos em duas porções: a primeira fração foi submetida diretamente à secagem em estufa com circulação forçada de ar a 60 ºC por 48 h, sendo classificado como resíduo não lavado. A segunda parte de cada resíduo foi lavada com água em um ciclo de 5 vezes (2 L água/ kg resíduo) e, entre cada lavagem, submetida a agitação mecânica por 10 min. Em seguida, os materiais foram submetidos à secagem em estufa com circulação de ar a 60 ºC até completa secagem durante 48 h, sendo classificado como resíduo lavado. Após secagem, os resíduos lavados e não lavados foram triturados separadamente em moinho (TE-680 Tipo Willye da Tecnal) com abertura de 20 mesh e armazenados em recipientes fechados à temperatura ambiente.
4.2 Caracterização físico-química dos resíduos
A caracterização físico-química dos resíduos foi realizada determinando-se densidade aparente, granulometria, diâmetro médio, pH, açúcares redutores, °Brix, umidade, extraíveis, cinzas totais, celulose, hemicelulose, lignina, pectina e proteína. Ambos tipos de resíduos foram determinados pelos parâmetros acima. Os procedimentos individuais são descritos a seguir.
4.2.1 Densidade aparente
Pesaram-se 100 g do resíduo em proveta evitando a compactação do mesmo e realizou-se a medição do volume preenchido (CORREIA, 2004). A equação (1) foi usada para estimar a densidade aparente:
𝐷𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑎𝑝𝑎𝑟𝑒𝑛𝑡𝑒 = 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 (𝑔)
4.2.2 Granulometria
A granulometria foi obtida através da pesagem de 100 g de cada resíduo e uso do agitador de peneiras (Moo: 53TE, Série nº: TE 8248) durante 10 minutos. O conjunto de peneiras foi constituído por 5 peneiras de acordo as regras da Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT): 20 mesh (0,83 mm), 24 mesh (0,71 mm), 35 mesh (0,42 mm), 48 mesh (0,30 mm) e 60 mesh (0,27 mm) (MCCABE; SMITH; HARRIOTT, 1993). Realizou-se previamente a pesagem de cada peneira e, após a execução do procedimento acima, a fração mássica retida em cada peneira foi obtida por diferença de massa. As frações mássicas foram expressas em percentagem (CORREIA, 2004).
4.2.3 Diâmetro médio de Sauter (dps)
O diâmetro médio de Sauter das partículas fornece a razão superfície/volume de todas as partículas (TANNOUS e ROCHA). O cálculo foi realizado conforme equação (2):
dps = 1 ∑ (xi
di)
(2)
Sendo: xi – fração mássica retida entre as peneiras; di – diâmetro médio entre as aberturas das peneiras superiores e inferiores de cada nível.
4.2.4 pH
Para determinação do pH, uma solução de 10 mL de água destilada foi preparada e adicionando-se 1,0 g de resíduo. Após homogeneização em vórtex por 30 segundos, a suspensão foi deixada em repouso por 30 minutos e, em seguida, mediu-se o pH em um potenciômetro digital (Multi3403, WTW, Alemanha), previamente calibrado com as soluções padrões (IAL, 2008).
4.2.5 Açúcares redutores (AR)
Inicialmente, foi misturado 1,0 g de resíduo com 10 mL de água destilada. Após homogeneização, a suspensão foi deixada em repouso por 30 minutos e, em seguida, uma alíquota foi retirada para análise. A determinação dos açúcares redutores foi feita pelo método proposto por Miller (1959).
Com o propósito de se construir uma curva de calibração para a solução de ácido 3,5 – dinitrosalicílico (DNS), diluições foram preparadas a partir de uma solução de glicose (1,0 g/L). Em seguida, 0,25 mL da alíquota de concentração conhecida de glicose foi adicionado a tubos de ensaio contendo 0,25 mL de DNS; realizou-se agitação dos tubos em vórtex para homogeneizar a mistura. Depois, esses tubos foram imersos em banho-maria a 100 ºC por 5 minutos, resfriados em banho com gelo por mais 5 minutos, adicionados 2,0 mL de água destilada e agitados em vórtex. Ao final, a leitura da absorbância (λ = 540 nm) foi realizada em espectrofotômetro (Thermo Spectronic, Genesys 10 UV, USA).
Portanto, as amostras seguiram o mesmo protocolo descrito acima. Em casos particulares, amostras foram diluídas em tampão correspondente, para permitir que os valores de absorbância se mantivessem dentro da faixa da curva padrão. A curva padrão construída possuía diferentes concentrações de glicose [0,1 – 1,0 g/L].
4.2.6 Teor de sólidos solúveis - °Brix
O teor de sólidos solúveis foi estimado pela mistura de 1,0 g de resíduo com 9,0 mL de água destilada, homogeneizando-se, e deixando-se em repouso por 30 minutos. Nesse caso, agitava-se em intervalos não contínuos e filtrou-se com algodão a suspensão. O líquido filtrado foi levado ao refratômetro digital (Smart-1/Atago/n° 3150) para medição do °Brix (IAL, 2008).
4.2.7 Umidade
Em um cadinho, previamente tarado, foi pesado 1,0 g da amostra. O conjunto cadinho/amostra foi levado à estufa por 24 horas na temperatura de 105 °C. Após esse período, o conjunto cadinho/amostra seco novamente foi pesado para se obter a massa seca do resíduo. O cálculo da umidade é determinado pela equação (3):
𝑈𝑚𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 (%) = (1 − 𝑀𝑠𝑒𝑐𝑎 (𝑔)
𝑀ú𝑚𝑖𝑑𝑎 (𝑔)) 𝑥 100 (3)
Sendo: Mseca = massa seca do resíduo (diferença entre a massa do conjunto
cadinho/resíduo após estufa e a massa do cadinho) e Múmida = massa úmida do resíduo (a massa
