ANÁLISE DA INOCULAÇÃO DE CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS, NA PRESENÇA DO FATOR DE CRESCIMENTO FIBROBLÁSTICO 2, NA REGENERAÇÃO MORFOLÓGICA E FUNCIONAL EM MODELO DE LESÃO POR
ESMAGAMENTO DO NERVO FACIAL DE RATOS WISTAR
Lucidio Clebeson de Oliveira
Natal - RN 2019
LUCIDIO CLEBESON DE OLIVEIRA
ANÁLISE DA INOCULAÇÃO DE CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS, NA PRESENÇA DO FATOR DE CRESCIMENTO FIBROBLÁSTICO 2, NA
REGENERAÇÃO MORFOLÓGICA E FUNCIONAL EM MODELO DE LESÃO POR ESMAGAMENTO DO NERVO FACIAL DE RATOS WISTAR
Tese apresentada ao programa de Pós-Graduação em Psicobiologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Psicobiologia (Área: Psicologia Fisiológica) Orientador: Profº. Dr. Jeferson de Souza Cavalcante Co-orientador: Profº. Dr. Fausto Pierdoná Guzen
Natal - RN 2019
LUCIDIO CLEBESON DE OLIVEIRA
ANÁLISE DA INOCULAÇÃO DE CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS NA PRESENÇA DO FATOR DE CRESCIMENTO FIBROBLÁSTICO 2 NA REGENERAÇÃO MORFOLÓGICA E FUNCIONAL EM MODELO DE LESÃO POR ESMAGAMENTO DO
NERVO FACIAL DE RATOS WISTAR
Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Psicobiologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito para obtenção de título de Doutor em Psicobiologia (Área de concentração: Psicologia Fisiológica).
Data de Aprovação: 07/06/2019.
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________________________ Prof. Dr. Jeferson de Souza Cavalcante (Presidente)
Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN
______________________________________________________________ Prof Dr. Eudes Euler de Souza Lucena (Membro Interno)
Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN
____________________________________________________________ Prof Dr. José Rodolfo Lopes de Paiva Cavalcanti (Membro Externo)
Universidade do Estado do Rio Grande do Norte - UERN
______________________________________________________________ Prof Dr. Expedito Silva do Nascimento Júnior (Membro Interno)
Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN
______________________________________________________________ Prof Dr. Marco Aurélio de Moura Freire (Membro Externo)
Epígrafe
O mundo está nas mãos daqueles que tem a coragem de sonhar e correr o risco de viver seus sonhos.
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Severino e Rita (in memorian) que muitas vezes se doaram e renunciaram aos seus sonhos, para que eu pudesse realizar os meus. Quero dizer que essa conquista não é só minha, mas nossa. Tudo que consegui só foi possível graças ao amor, apoio e dedicação que
vocês sempre tiveram por mim. Sempre me ensinaram agir com respeito, simplicidade, dignidade, honestidade e amor ao próximo. À Deus que em sua infinita bondade permitiu e
AGRADECIMENTOS
A Deus, por me ajudar a chegar onde cheguei, por não permitir que fraquejasse.
Obrigado Senhor por me fazer forte diante das adversidades da vida, pois foi através do seu infinito amor que consegui forças para até aqui.
À Virgem Maria que sempre intercedeu por mim junto a seu Filho Jesus, e me cobriu
com o seu manto sagrado todas as vezes que precisei.
Aos meus pais, Rita e Severino (in memorian) pelo apoio em todas as empreitadas da vida, sempre apoiando e incentivando-me, muitas abrindo mão dos sonhos em virtude dos meus.
Seus ensinamentos me guiaram por toda vida, pois os tenho como exemplo de dignidade, amor, honestidade, respeito e sabedoria, pois mesmo não tendo oportunidade de estudar me passaram ensinamentos que não encontrei nem na mais fina filosofia, educando com o exemplo de vida.
Mãe, pessoa mais importante da minha vida, vai partida me deixou em pedaços, até
hoje meu coração sangra e escorre pelos olhos, a vida se tornou menos bela, a saudade passou a me fazer companhia. Parte dessa tese foi escrita dentro de um hospital, enquanto a acompanhava, sua companhia era tão maravilhosa que mesmo em situação tão triste, foi maravilhosa perder tê-la perto, lembro da sua alegria quando mostrei meu trabalho, me dói não poder cumprir a promessa de lhe dizer quando terminasse. Apesar de não entender os desígnios da vida, os aceito, pois sei que Deus em sua infinita bondade sabe o que é melhor para nós. “Por isso, peço senhor, conceda-me a serenidade para aceitar aquilo que não posso mudar”.
O contato físico pode até não ser eterno, mas o amor que sinto pela senhora é, nem toda a distância entre os planos espirituais é capaz de nos separar, sei quem sempre estás ao meu lado, me guiando. À senhora todo amor e carinho do mundo, és luz da minha vida.
Aos meus dez irmãos pelo companheirismo, amor e carinho em todos os momentos da minha vida.
Aos Familiares por todo o apoio.
À Kamilla, que em todo esse período esteve ao meu lado como uma grande companheira, noiva e amiga que me amparou e enfrentou comigo as dificuldades que surgiram pelo caminho. Bob meu companheiro fiel, das noites solitárias, de escrita da tese, e dos experimentos, o amo como filho. Com vocês eu percebo que: É somente nas misteriosas equações do amor que qualquer lógica ou razão pode ser encontrada. John Nash
Ao meu orientador professor Doutor Jeferson Cavalcante, obrigado por aceitar me orientar. Te agradeço pela paciência, associada a sabedoria, competência e responsabilidade. Só tenho a te agradecer por essa conquista, que Deus te abençoe hoje e sempre.
Ao meu orientador professor Fausto Guzen, responsável direta por essa conquista, muito obrigado pela paciência, dedicação, e por ter me ajudado de forma tão brilhante em suas orientações, sem você não conseguiria chegar aqui, és referência de ser humano e profissional para mim.
Ao meu amigo/irmão e também orientador professor Eudes Euller, o considero um irmão e agradeço por toda a ajuda, disponibilidade, para mim é um exemplo de ser humano e profissional.
Ao professor Rodolfo Cavalcante, um exemplo que sigo de honestidade capacidade e competência, uma das referências que tenho na enfermagem e amigo um amigo de longa data. Aos professores Expedito Júnior e Marco Freire que prontamente aceitaram participar da minha banca, enriquecendo o trabalho com suas contribuições, são referências para mim na área da pesquisa.
Aos professores do programa pelas brilhantes contribuições, sendo de extrema importância para a consolidação do trabalho.
Aos colegas, Ramon, Felipe, Caio, Eduardo e André pela disponibilidade em ajudar. À Amélia Carolina e Patrícia Barreto pelo apoio, carinho, dedicação e por mostrar o verdadeiro significa de uma equipe, meu muito obrigado.
À Rafael, Juliane e Lorrainy pelo verdadeiro espírito de irmandade e companheirismo, pelo apoio de sempre e por serem tão presentes em minha vida.
Aos colegas de disciplinas da FACENE/RN, pela parceria, amizade e dedicação. À todos os professores e funcionários que fazem parte do Programa.
À todos os professores e funcionários da FAEN/UERN. À todos os professores e funcionários da FACENE/RN.
À todos do Labneuro, em especial, Samara, Ana Cristina, Eli, Luis, Ianara, Neta, Luciana, Aracele etc.
Aos alunos que foram essenciais para a concretização deste sonho.
Meu muito OBRIGADO A TODOS!!!
Resumo:
Estudos mostram a influência do meio no crescimento de fibras Nervosas lesionadas do Sistema Nervoso Periférico (SNP), bem como o potencial do uso de células tronco (CT), associado ou não ao Fator de Crescimento Fibroblástico – 2 (FGF-2), em tornar esse meio mais propício à regeneração Nervosa. Dessa forma, o estudo propõe analisar o efeito da inoculação de CT mesenquimais em combinação ou não com o FGF-2, em promover a regeneração do nervo facial. Ratos Wistar foram submetidos à esmagamento do Nervo facial na altura da região pós-auricular e foram tratados com CT associadas ou não ao FGF-2. Em seguida, foi realizado avaliação comportamental dos animais por 90 dias, posteriormente foi feita a análise tecidual do Nervo facial através da imunohistoquímica para a proteína associada ao crescimento 43 (GAP-43), para a proteína neuronal nuclear (NeuN), para a Proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e para OX-42. O trabalho foi aprovado com o protocolo 005/16 do CEEA/UERN. O estudo mostrou a influência das Células Tronco e do FGF-2 no comportamento da função motora de animais submetidos à lesão do Nervo facial, evidenciado através da análise comportamental. Quando comparamos os quatro grupos na avaliação histológica, estes apresentaram diferenças significativas entre si, ao compararmos os resultados, observa-se que os grupo com administração de CT e o grupo CT associado ao FGF-2 e o grupo FGF-2, apresentaram melhores resultados, sendo que o grupo FGF-2 apresentou um maior número de fibras, demostrando assim um maior brotamento axonal, ratificando assim, as propriedades do FGF-2 em estimular o processo regenerativo. Diante dos resultados, fica evidente que a utilização do FGF-2 potencializou o processo de regenerativo do nervo facial, propiciando uma recuperação funcional e histológica mais significativa.
Palavras-chave: FGF-2, Ratos Wistar, Regeneração, Células Tronco, Nervo Facial.
Summary:
Studies have shown the influence of the environment on the growth of peripheral nervous system (PNS) injured nerve fibers, as well as the potential for stem cell (CT) use, associated or not with Fibroblast Growth Factor - 2 (FGF - 2), in make this environment more conducive to nerve regeneration. Thus, the study proposes to analyze the effect of the inoculation of mesenchymal CTs in combination or not with FGF-2, in promoting facial nerve regeneration. Wistar rats were submitted to facial nerve crushing in the vicinity of the post-auricular region and were treated or not with CT associated or not with FGF-2. Then, the behavioral evaluation of the animals was performed for 90 days, after which the facial nerve tissue analysis was performed through immunohistochemistry for the growth-associated protein 43 (GAP-43), for the nuclear neuronal protein (NeuN), for Protein glial fibrillary acid (GFAP) and for OX-42. The work was approved with protocol 005/16 of CEEA / UERN. The study showed the influence of stem cells and FGF-2 on the motor function behavior of animals submitted to facial nerve injury, evidenced by behavioral analysis. When we compared the four groups in the histological evaluation, they showed significant differences between them. When comparing the results, it is observed that the group with CT administration and the group CT associated with FGF-2 and the group FGF-2, presented better results. The group FGF-2 presented a larger number of fibers, thus demonstrating a greater axonal budding, thus confirming the properties of FGF-2 in stimulating the regenerative process. Given the results, it is evident that the use of FGF-2 potentiated the regenerative process of the facial nerve, providing a more significant functional and histological recovery.
Keywords: FGF-2, Wistar Rats, Regeneration, Stem Cells, Facial Nerve.
Figura 1. Ramos do nervo facial. Moore, 2014, p.479...23
Figura 2. Anatomia do nervo facial...25
Figura 3. Distribuição das fibras do nervo facial. Moore, 2014, p.479...26
Figura 4. Anatomia do nervo facial do rato...28
Figura 5. Trajeto do nervo facial e seus ramos em ratos...28
Figura 6. Modelo de degeneração e remielinização axonal...32
Figura 7. Células multipotentes derivadas de estroma ósseo...36
Figura 8. Animal em decúbito lateral, com a região cervical apoiada sobre um molde com demarcação da região submetida à incisão para promover a lesão do nervo Facial...43
Figura 9. Realização da incisão na região retroauricular direita, permitindo a localização do músculo platisma...44
Figura 10. Dissecação romba e localização do músculo clavotrapeziano...44
Figura 11. Exposição do nervo facial...45
Figura 12. Lesão no nervo facial por esmagamento com uma pinça Kelly nº 14 por 30 segundos...45
Figura 13. Inoculação das substâncias do estudo...46
Figura 14. Realização da sutura da pele com pontos separados...46
Figura 15: Extração e cultivo de células mesenquimais de osso longo...47
Figura 16: Exposição do nervo facial...49
Figura 17. Local de inoculação de CT. ...50
Figura 18: Avaliação comportamental da exploração do ambiente...50
Figura 19: Avaliação do fechamento ocular e reflexo do piscar dos olhos...52
Figura 20. Avaliação de abertura ocular com auxílio de fita Wiso Antropométrica inelástica...53
Figura 21: Avaliação do reflexo das vibrissas ao toque...54
Figura 22: Avaliação do levantamento da pálpebra superior...55
Figura 23: Instilação tópica de fluoresceína...56
Figura 24: Avaliação com oftalmoscópio direto com filtro em azul de cobalto...56
Figura 25: Localização do núcleo do Nervo Facial (Painel 1); Células imunorreativas ao GAP-43 no núcleo na ponte do Grupo Salina...70
Figura 26: Localização do núcleo do Nervo Facial (Painel 1); Células imunorreativas ao GAP-43 no núcleo na ponte do Grupo Células Tronco...71
Figura 27: Localização do núcleo do Nervo Facial (Painel 1); Células imunorreativas ao
GAP-43 no núcleo na ponte do Grupo Células Tronco associado ao FGF-2...72
Figura 28: Localização do núcleo do Nervo Facial (Painel 1); Células imunorreativas ao
GAP-43 no núcleo na ponte do Grupo FGF-2...73
Figura 29: Localização do núcleo do Nervo Facial (Painel 1); Células imunorreativas ao
Neun no núcleo na ponte do Grupo Salina...74
Figura 30: Localização do núcleo do Nervo Facial (Painel 1); Células imunorreativas ao
Neun no núcleo na ponte do Grupo Células Tronco associado ao FGF-2...75
Figura 31: Localização do núcleo do Nervo Facial (Painel 1); Células imunorreativas ao
Neun no núcleo na ponte do Grupo Células
Tronco...76
Figura 32: Localização do núcleo do Nervo Facial (Painel 1); Células imunorreativas ao
Neun no núcleo na ponte do Grupo FGF-2...77
Figura 33: Localização do núcleo do Nervo Facial (Painel 1); Células imunorreativas ao OX
42 no núcleo na ponte do Grupo solução salina...78
Figura 34: Localização do núcleo do Nervo Facial (Painel 1); Células imunorreativas ao OX
42 no núcleo na ponte do Grupo Células Tronco...79
Figura 35: Localização do núcleo do Nervo Facial (Painel 1); Células imunorreativas ao OX
42 no núcleo na ponte do Grupo Células Tronco associado ao FGF-2...80
Figura 36: Localização do núcleo do Nervo Facial (Painel 1); Células imunorreativas ao OX
42 no núcleo na ponte do Grupo Células Tronco associado ao FGF-2...81
Figura 37: Localização do núcleo do Nervo Facial (Painel 1); Células imunorreativas ao
GFAP no núcleo na ponte do Grupo solução salina...82
Figura 38: Localização do núcleo do Nervo Facial (Painel 1); Células imunorreativas ao
GFAP no núcleo na ponte do Grupo células tronco...83
Figura 39: Localização do núcleo do Nervo Facial (Painel 1); Células imunorreativas ao
GFAP no núcleo na ponte do Grupo célula tronco associado ao FGF-2...84
Figura 40: Localização do núcleo do Nervo Facial (Painel 1); Células imunorreativas ao
GFAP no núcleo na ponte do grupo FGF-2...85
Tabela 1. Fatores de crescimento utilizados na regeneração periférica e seus respectivos
alvos...40
Tabela 2: Divisão dos animais por grupo. ...42 Tabela 3. A tabela mostra os resultados das análises estatísticas do movimento de vibrissas da
1a a 13a semana após sofreram lesão por esmagamento do nervo facial e tratadas com inoculação de soução salina, Células Tronco, Células tronco adicionados com fator de crescimento fibroblástico 2 (FGF-2) e somente o FGF-2. p<0,05, p<0,01, p<0,001 representa diferenças intergrupos...60
Tabela 4. A tabela mostra os resultados das análises estatísticas da Abertura Ocular da 1a a 13a semana após sofreram lesão por esmagamento do nervo facial e tratadas com inoculação de soução salina, Células Tronco, Células tronco adicionados com fator de crescimento fibroblástico 2 (FGF-2) e somente o FGF-2. p<0,05, p<0,01, p<0,001 representa diferenças intergrupos...64
Tabela 5. A tabela mostra os resultados das análises estatísticas do reflexo das vibrissas ao
toque da 1a a 13a semana após sofreram lesão por esmagamento do nervo facial e tratadas com inoculação de soução salina, Células Tronco, Células tronco adicionados com fator de crescimento fibroblástico 2 (FGF-2) e somente o FGF-2. p<0,05, p<0,01, p<0,001 representa diferenças intergrupos...66
Tabela 6. A tabela mostra os resultados das análises estatísticas do fechamento Ocular da 1a a 13a semana após sofreram lesão por esmagamento do nervo facial e tratadas com inoculação de soução salina, Células Tronco, Células tronco adicionados com fator de crescimento fibroblástico 2 (FGF-2) e somente o FGF-2. p<0,05, p<0,01, p<0,001 representa diferenças intergrupos...69
Tabela 7. A tabela mostra os resultados das análises estatísticas do levantamento da pálpebra
superior da 1a a 13a semana após sofreram lesão por esmagamento do nervo facial e tratadas com inoculação de soução salina, Células Tronco, Células tronco adicionados com fator de crescimento fibroblástico 2 (FGF-2) e somente o FGF-2. p<0,05, p<0,01, p<0,001 representa diferenças intergrupos...74
Quadro 1. Escala de pontuação para observação do movimento de vibrissas...51
Quadro 2. Escala de observação do fechamento ocular e reflexo de piscamento...52
Quadro 3. Escala de medição da abertura ocular...53
Quadro 4. Escala de reflexo das vibrissas ao toque...54
Quadro 5. Escala ao levantamento da pálpebra superior...60
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1. Valores de médias semanais do movimento de vibrissas dos animais que sofreram
lesão no nervo facial e posterior inoculação de solução salina (grupo salina), Células Tronco (grupo CT), Células tronco adicionadas à 2 (Grupo CT + 2) e 2 (Grupo
FGF-2)...59
Gráfico 2. Valores de médias semanais da abertura ocular dos animais que sofreram lesão no nervo facial e posterior inoculação de solução salina (grupo salina), Células Tronco (grupo CT), Células tronco adicionadas à 2 (Grupo CT + 2) e 2 (Grupo FGF-2)...61
Gráfico 3. Valores de médias semanais do reflexo das vibrissas ao toque dos animais que sofreram lesão no nervo facial e posterior inoculação de solução salina (grupo salina), Células Tronco (grupo CT), Células tronco adicionadas à FGF-2 (Grupo CT + FGF-2) e FGF-2 (Grupo FGF-2)...63
Gráfico 4. Valores de médias semanais do fechamento ocular dos animais que sofreram lesão no nervo facial e posterior inoculação de solução salina (grupo salina), Células Tronco (grupo CT), Células tronco adicionadas à 2 (Grupo CT + 2) e 2 (Grupo FGF-2)...65
Gráfico 5. Valores de médias semanais do levantamento da Palpebra superior dos animais que sofreram lesão no nervo facial e posterior inoculação de solução salina (grupo salina), Células Tronco (grupo CT), Células tronco adicionadas à 2 (Grupo CT + 2) e FGF-2 (Grupo FGF-FGF-2)...68
Gráfico 6. Imunoreatividade ao GAP - 43...86
Gráfico 7. Imunoreatividade ao NEUn...87
Gráfico 8. Imunoreatividade ao OX- 42...88
Gráfico 9. Imunoreatividade ao GFAP...89
ASG: Aferente Somático Geral ANOVA: Análise de variância AVE: Aferente Visceral Especial AVG: Aferente Visceral Geral
BDNF: Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro BSA: Albumina de soro de boi
CEEA: Comissão de Ética em Experimentação Animal CM: Célula Mesenquimal
CS: Célula de Schwann CT: Célula Tronco
CTM: Célula Tronco Mesenquimal D-10: Meio Condicionado
DMEM: Dulbeco´s Modified Eagle´s Medium EDTA: Ácido Etilenodiamino tetra-acético EVE: Eferente Visceral Especial
EVG: Eferente Visceral Geral
FGF-2: Fator de Crescimento Fibroblástico-2 GFAP: Proteína Glial Fibrilar Ácida.
GAP – 43: Proteína Associada ao Crescimento IGF: Fator de Crescimento Tipo Insulina IL-1: Interleucina-1
L-15: Meio Leibovitz 15
LIF: Fator Inibidor de Leucemia NeuN: Proteína neuronal nuclear. NF200: Neurofilamento 200 MAP-2: Microtúbulo 2
NGF: Fator de Crescimento Neural NT-3: Neurotrifina-3
PBS: Tampão Fosfato RPM: Rotações Por Minuto SNC: Sistema Nervoso Central SNP: Sistema Nervoso Periférico
1. INTRODUÇÃO... 19
1.1 ASPECTOS ANATÔMICOS DO NERVO FACIAL ... 22
1.2 REGENERAÇÃO NO SNP E AMBIENTE DE LESÃO ... 29
1.3 CÉLULAS TRONCO (CT)...33 1.4 FATORES NEUROTRÓFICOS ...37 2. OBJETIVOS... 41 2.1 GERAL... 41 2.2 ESPECÍFICOS... 41 3. METODOLOGIA ... 42 3.1 DESENHO EXPERIMENTAL ... 42 3.2 PROCEDIMENTO CIRÚRGICO ... 43
3.3 EXTRAÇÃO E CULTIVO DAS CMS...47
3.4 EUTANASIA DOS ANIMAIS E SECÇÃO DO MATERIAL...48
3.5 INOCULAÇÃO DE CT NA PRESENÇA OU NÃO DO FGF-2 NO NERVO FACIA...49
3. 6 OBSERVAÇÃO COMPORTAMENTAL...50
3.6.1 Abertura ocular espontânea...52
3.6.2 Reflexo das vibrissas ao toque...53
3.6.3 Levantamento da pálpebra superior...54
3.7 AVALIAÇÃO OFTALMOLÓGICA...55
3.8 MARCAÇÃO IMUNOHISTOQUÍMICA...57
3.8.1 Tronco Encefálico (Núcleo do Nervo Facial)...57
3.9 ANÁLISE QUANTITATIVA...58
6.1 ANÁLISE DOS DADOS COMPORTAMENTAIS...59
6.1.1 Avaliação do movimento das vibrissas...59
6.1.2 Avaliação da Abertura Ocular...61
6.1.3 Avaliação do reflexo ao toque...63
6.1.4 Avaliação do fechamento Ocular...65
6.1.5 Avaliação do levantamento da Pálpebra Superior...67
6.2 MARCAÇÃO IMUNOISTOQUÍMICA...70
6.2.1 IMUNORREATIVIDADE AO GAP-43...70
6.2.1.1 Grupo solução salina...70
6.2.1.2 Grupo Células tronco...71
6.2.1.3 Grupo Células Tronco associado ao FGF-2...72
6.2.1.4 Grupo FGF-2...73
6.2.2 IMUNORREATIVIDADE AO Neun...74
6.2.2.1 Grupo Salina...74
6.2.2.2 Grupo Células Tronco...75
6.2.2.3 Grupo Células Tronco associado ao FGF-2. ...76
6.2.2.4 Grupo FGF-2...77
6.2.3 IMUNORREATIVIDADE AO OX-42...78
6.2.3.1 Grupo Salina...78
6.2.3.2 Grupo Células Tronco...79
6.2.3.3 Grupo Células Tronco associado ao FGF-2...80
6.2.3.4 Grupo FGF-2...81
6.2.4 IMUNORREATIVIDADE AO GFAP...82
6.2.4.1 Grupo Solução Salina...82
6.2.4.3 Grupo Células Tronco associado ao FGF-2. ...84 6.2.4.3 Grupo FGF-2. ...85 6.3 RESULTADOS ESTATÍSTICOS...86 7 DISCUSSAO...91 8 CONCLUSÕES...99 REFERÊNCIAS ... 100 APENDICES...115
APENDICE A: PROTOCOLO DE AVALIAÇÃO COMPORTAMENTAL DOS ANIMAIS...115
ANEXOS... 116
ANEXO A: PARECER DA COMISSÃO DE ÉTICA EM EXPERIMENTAÇÃO ANIMAL...116
ANEXO B: ARTIGO PUBLICADO...119
1 INTRODUÇÃO
Demonstramos nossos sentimentos através das expressões faciais, com a movimentação de músculos, expressamos diferentes tipos de emoções e percepções. Além disso, nossa face possui uma participação fundamental na comunicação e interação social por estar integrada ao processo da fala e demonstração de sentimentos, favorecendo assim a empatia entre os indivíduos e consequentemente a interação social (Faria et al., 2006).
A mímica facial é controlada por 22 grupos musculares que são oriundos do segundo arco branquial. Todos esses músculos são inervados pela divisão motora do 7° nervo craniano, conhecido como nervo facial (Gardner et al., 1998).
Do ponto de vista funcional, a musculatura facial e os músculos da mastigação atuam sinergicamente. Durante a mastigação, os músculos mastigatórios seguidos dos músculos da língua e faciais, atuam de forma coordenada, promovendo a trituração dos alimentos e a transformação das macromoléculas em micromoméculas, facilitando assim a digestão e conseguentemente a absorção dos nutrientes (Mory et al., 2013).
As lesões do nervo facial possuem uma infinitude de causas, onde as mais frequentes são: acidentes automobilísticos, materiais perfurocortantes, tumores, entre outros. Essas lesões podem provocar uma sintomatologia diversificada, como paralisia uni ou bilateral, dificuldade de interação social, dificuldade gustativa, dificuldade na fonação, entre outros (Salomone et al. 2011).
As lesões podem ser classificadas de acordo com a gravidade, pode ocorrer uma interrupção provisória da bainha de mielina ou até a lesão do axônio, apresentando nesse caso, um pior prognóstico (Griffin et al., 2014).
A lesão do nervo facial pode apresentar, de acordo com a classificação de Sunderland (Sunderland, 1978), cinco graus: neuropraxia, axoniotmese, endoneurotmese, perineurotmese e epineurotmese, sendo as três últimas resultante da subdivisão do grupo de neurotmese descrito pela primeira vez por Seddon, em 1943. Na neuropraxia ocorre um bloqueio neural fisiológico por causa da elavação transitória da pressão intraneural que altera a osmolaridade intracelular e provoca uma mudança na condução do impulso elétrico. A axoniotmese é caraterizada pela diminuição do retorno venoso, com formação de edema e diminuição do fluxo de nutrientese oxigênio; já na endoneurotmese a pressão intraneural continua, e causa necrose dos tubos endoneurais. A perineurotmese e a epineurotmese resultam da transecção
total ou parcial do nervo e são consideradas lesões graves, principalmente a transecção completa (May et al, 2000).
A secção do nervo facial (neurotmese) provoca uma série de modificações em toda a unidade axonal. O corpo celular sofre uma espécie de cromatólise não degenerativa denominada “alteração reativa”, com expansão do volume por aumento do metabolismo celular (Nissl, 1892).
Já no seguimento proximal ocorre a chamada degeneração traumática, com a diminuição do diâmetro dos axônios (Kreutzberg, 1995) e crescimento de brotos axonais (May et al., 2000). O seguimento distal sofre a chamada “degeneração Walleriana” (DW), caracterizada pela desintegração e reabsorção total deste segmento pelas células de Schwann (CS) fagocitárias neoformadas (Sunderland, 1978). Na junção neuromuscular há um aumento da liberação de acetilcolina e nas fibras musculares os núcleos tornam-se arredondados e centralizados, com aumento dos nucléolos e atrofia progressiva (Hess et al., 1970; Ontell, 1974).
As lesões nos nervos periféricos provocam alterações imediatas que perduram durante todo o período de recuperação. Essas mudanças impactam diretamente na qualidade de vida dos indivíduos e a realização de um tratamento adequado e resolutivo é fundamental para a recuperação da funcionalidade (Novak, Christin, Von Der Heyde, 2013).
O Sistema Nervoso Central (SNC) exibe certo grau de adaptação, mesmo na idade adulta. Tal mecanismo é maior durante o desenvolvimento embrionário, quando se formam grande parte dos neurônios. Aqueles que não estabelecem sinapses estáveis com outros neurônios são eliminados. Após lesão do SNC, os circuitos neuronais se reorganizam, graças ao brotamento dos prolongamentos dos neurônios, que formam novas sinapses, para substituir ou compensar as perdidas pela lesão. Assim, estabelecem-se novas comunicações que, dentro de certos limites, podem restabelecer as atividades funcionais dos circuitos perdidos. Essa propriedade do SN é denominada plasticidade neuronal. O processo regenerativo é controlado por diversos fatores de crescimento produzidos por neurônios, células da glia e por células alvo da atividade dos neurônios, chamadas neurotrofinas (Spejo, 2013).
O fato da regeneração do nervo periférico desencadear tanto ações locais quanto sistêmicas, torna o processo mais complexo (Colome et al., 2008). A maioria dos estudos que tratam a regeneração dos nervos, foram realizadas por investigações experimentais, nas quais inúmeras variáveis são controladas, garantindo a confiabilidade dos resultados (Mazzer et al., 2006).
No sistema nervoso periférico, o sucesso da regeneração nervosa depende do suporte dado pelas Células de Schwan, formando as chamadas bandas de Bürgner, provocando a mielinização das fibras axonais neo-formadas, produzindo fatores neurotróficos, moléculas de adesão, citocinas e/ou estruturas juncionais (Martini, 1994; Dubey, 1999; May, Schaitkin, 2000; Hall, 2001; Dezawa et al., 2001; Dezawa, 2002).
Entretanto, o aumento das Células de Schwann (CS) endógenas, provenientes dos segmentos, não é suficiente para suprir a demanda necessária no processo de regeneração nervosa, fazendo-se necessária a complementação exógena (Sulaiman, Gordon, 2000; Dezawa, 2002; Wang et al., 2011). Com o objetivo de suprir esta demanda, diversas fontes alternativas de CS têm sido estudadas, como células-tronco do folículo capilar (Amoh et al., 2005), tronco derivadas do tecido adiposo (Sun et al., 2001; Salamone, 2012), células-tronco da crista neural (Aquino et al., 2006), células-células-tronco embrionárias (Lin et al., 2008), células-tronco provenientes de polpa dental entre outras (Nicola et al, 2016).
As células do estroma da medula óssea são sabidamente células-tronco multipotentes (Prockop, 1997; Pittenger et al., 1999) e satisfazem os requisitos para um transplante ideal de células, principalmente pelo fácil acesso, rápida expansão in vitro e imunigenicidade baixa (Pittenger et al., 1999; Uccelli et al., 2006; Wang et al., 2011). Além disso, quando devidamente cultivadas, as células-tronco mesenquimais, cuja denominação correta é células multipotentes do estroma mesenquimal (CMEM), possuem a capacidade de se diferenciar em células de várias linhagens, inclusive ectodérmica, e expressar o fenótipo de CS, tornando-se uma alternativa excelente para aquisição dessas células exogenamente (Prockop, 1997; Woodburg et al., 2000; Zhang et al., 2004).
A utilização de Células-tronco apresenta uma série de vantagens, como a sua capacidade de autorreplicação ou de produção de novas células desempenhando um papel significativo na regeneração tecidual após lesão (Lucena, et al., 2014).
O controle da plasticidade é um evento complexo que requer a saída de células de um estágio indiferenciado para um determinado estado de desenvolvimento. A determinação celular é vista como um evento estático iniciado por fatores intrínsecos e auxiliado por fatores extrínsecos. A manipulação de sinais ambientais pode induzir diferenciação celular em determinadas linhagens e pode ajudar na compreensão dos mecanismos de desenvolvimento neural e glial (Lucena et al., 2014).
Na busca do modelo mais adequado para pesquisa experimental de substâncias sistêmicas que atuem na regeneração pós-traumática do nervo facial, encontram-se na
literatura diversos métodos, com variações nas espécies animais utilizados, sítio e método de lesão, tempo de evolução, e meios de análise funcional e histológica (Lucena et al., 2014).
Diversos estudos publicados demonstram as influências de inúmeros fatores na recuperação do nervo facial, abordando técnica cirúrgica (Bento e Miniti, 1989), administração de substâncias neurotróficas (Lindsay, 1995; Toriumi et al., 1997; Choi e Dunn, 2001), exposição a pulsos eletromagnéticos), utilização de tubulização, constituídos dos mais diversos materiais (Fields et al., 1989), inoculação de Células Tronco Mesenquimais (Dong et al., 2010).
1.1. ASPECTOS ANATÔMICOS DO NERVO FACIAL
Os 12 pares de nervos cranianos se originam no encéfalo, sendo denominados respectivamente de: nervo olfatório (I par), nervo óptico (II par), nervo oculomotor (III par), nervo troclear (IV par), nervo trigêmeo (V par), nervo abducente (VI par), nervo facial (VII par), nervo vestibulococlear (VIII par), nervo glossofaríngeo (IX par), nervo vago (X par), nervo acessório (XI par) e nervo hipoglosso (XII par). Alguns dos nervos são exclusivamente ou totalmente aferentes (I, II e VIII); outros são totalmente eferentes (III, IV, VI, XI e XII); e ainda, outros são mistos, tanto com fibras aferentes como eferentes (V, VII, IX e X) (Gray, 1995).
O nervo facial é responsável por funções fisiológicas importantes, como o lacrimejamento e a proteção ocular, o paladar (dois terços anteriores da língua), a ingestão de alimentos (o músculo orbicular da boca toma parte no início do processo), a salivação, entre outras, por isso, é imprescindível manter a sua integridade (Bento e Miniti, 1989). Várias são as causas de sua disfunção, sendo as mais comuns os processos inflamatórios e lesões traumáticas (Mattox e Felix, 1987).
Desempenha um papel importante em diversas funções do organismo e apresenta uma anatomia bastante complexa. Inerva diversos músculos como o estilo-hióide e o ventre posterior do músculo digástrico do pescoço, é responsável pelo controle da musculatura da mímica facial, abertura da válvula nasal, oclusão palpebral e bucal, além de lubrificar e proteger a córnea com o lacrimejamento (fibras parassimpáticas pré-ganglionares). É responsável pela eferência do reflexo estapediano e sensibilidade da parte posterior do canal auditivo externo. Por meio de suas fibras aferentes, responde pela sensibilidade gustativa dos dois terços anteriores da língua e do controle autonômico das glândulas exócrinas (Salomone et al., 2013).
De acordo com malttox e Felix (1987) o tronco do nervo facial, seguimento que vai desde o ramo auricular posterior até o início de sua bifurcação cervical e cervical posterior, mede aproximadamente 6mm e é facilmente visualizado ântero-inferiormente, passa entre o músculo trapezio e o canal auditivo externo. As artérias occipital e póstero-auricular passam abaixo do ponto médio deste segmento e são separadas do nervo por uma fascia muito fina.
O nervo facial divide-se em duas partes: o nervo facial propriamente dito e uma raiz nervosa adjacente (o nervo intermédio ou raiz intermédia do nervo facial). Ambas as partes saem juntas da superfície ventro-lateral do tronco encefálico, no sulco bulbopontíno (Gray, 1995). Suas origens reais são o núcleo motor, o núcleo sensitivo e o núcleo parassimpático. O primeiro está situado na parte dorsal da ponte (formação reticular). O núcleo sensitivo está situado no extremo superior do núcleo do tracto solitário e recebe fibras provenientes do gânglio geniculado. Por fim, o núcleo parassimpático (núcleo salivatório superior) envia fibras ao gânglio pterigopalatino e ao nervo da corda do tímpano (Figura 1) (Lucena et al., 2014).
Figura 1. Ramos do nervo facial. Moore, 2014, p.479.
O sulco bulbopontino é o local de origem do nervo facial. Daí partem as fibras do nervo facial propriamente dito, através de uma raiz motora, e uma raiz sensitiva e visceral, o nervo intermédio. O segmento motor supre os músculos da expressão facial como o músculo superficial do pescoço, os músculos auriculares e diversos outros músculos derivados do mesênquima situado no segundo arco faríngeo, enquanto sua função sensitiva se dá para os
calículos gustatórios nos dois terços anteriores da língua e para as glândulas salivares, submandibular e sublingual, glândula lacrimal e glândulas faríngea, nasal e palatina (Moore; Dalley, 2014; Gray, 1995).
Greene (1955), Guntinas-Lichius et al. (2005) e Grosheva et al. (2008) descrevem o ramo mandibular do nervo facial que se bifurca em sua extremidade final e resulta em ramos terminais apenas para o músculo do lábio inferior.
Os ramos temporal e zigomático podem emergir tanto do tronco do nervo facial quanto do ramo bucal e não são muito utilizados em estudos experimentais, pois possuem um padrão complexo de anatomia, e se interlaçam com tributárias da veia jugular externa, além de posicionados próximos aos olhos (Greene, 1955; Hebel, Stromberg, 1976; Mattox, Felix, 1987).
De acordo com Hebel e Stromberg (1976), e Mattox e Felix (1987) o segundo ramo do nervo facial, cervical posterior, é o menor e primeiro ramo da divisão. O ramo cervical, terceiro ramo do nervo facial, é o mais posterior e inferior dos ramos, passa na parte inferior da veia jugular externa. O quinto ramo, o bucal, segue entre os músculos masseter e
temporalis e passa abaixo do olho e seguindo em direção ao nariz.
Segundo Semba e Egger (1986) o padrão de ramificação do nervo facial de ratos não difere entre os roedores e assemelha-se bastante ao dos gatos, cachorros e outros mamíferos.
Mattox e Felix (1987) referem que as respostas dos estudos da regeneração do nervo facial de ratos podem não refletir exatamente a situação clínica humana na qual a regeneração dos nervos tem menos escolha de direção do crescimento, uma vez que tenham entrado em fascículos.
Os autores supracitados realizaram um estudo sobre a anatomia cirúrgica do nervo facial de ratos Wistar no qual descrevem algumas vantagens de sua utilização como similaridade anatômica com os de muitos outros mamíferos não primatas, ramos periféricos que repousam sobre a fáscia que recobre os músculos da face, no tecido subcutâneo, facilitando sua visualização e dissecção. Ainda, de acordo com esses autores o nervo facial de ratos, assim como em outros roedores, passa abaixo, e não através da glândula parótida, ajudando seu deslocamento e individualização.
Os dois componentes do nervo facial penetram no meato acústico interno junto com o nervo vestíbulococlear, no interior do qual o nervo intermédio perde sua individualidade, formando, assim, um tronco nervoso único que penetra no canal facial. Em seguida, o nervo facial curva-se fortemente para trás formando o genículo do nervo facial, onde existe um gânglio sensitivo, o gânglio geniculado (Machado e Haertel, 2014). O segmento motor envia
ramos para os músculos da expressão facial. Estes músculos desenvolvem-se a partir do segundo arco branquial, sendo a sua inervação branquiomotora ou eferente visceral especial (EVE). O nervo intermédio contém três componentes sensoriais: aferente visceral geral (AVG), aferente visceral especial (AVE) e aferente somático geral (ASG). Faz também parte este nervo, um componente visceromotor pré-ganglionar parassimpático, eferente visceral geral (EVG) (Figura 2) (Machado e Haertel, 2014; Lucena et al, 2014).
Figura 2. Anatomia do nervo facial (Adaptado: Waxman, 2013).
Os nervos facial e intermédio partem juntos do tronco encefálico, atravessam o meato acústico externo e penetram no canal facial (no osso temporal). O gânglio geniculado, contendo corpos celulares dos neurônios primários ASG, AVG e AVE, fica no canal facial. Os processos centrais desses neurônios chegam ao SNC como parte do nervo intermédio (Madeira, 2010).
No canal facial, o nervo facial dá origem a três ramos: o nervo petroso maior, o nervo para o músculo estapédio e o nervo da corda do tímpano. Ao nível do gânglio geniculado, fibras EVG e AVG do nervo intermédio formam o nervo petroso maior e saem do canal facial. O nervo petroso maior une-se ao nervo petroso profundo (fibras pós-gânglionares simpáticas do plexo carotídeo) e formam o nervo do canal pterigóide (nervo vidiano). Este nervo penetra no canal pterigóide a caminho do gânglio pterigopalatino. Ao atravessar o canal facial, o nervo facial emite o pequeno nervo para o músculo estapédio, suprindo a inervação
branquiomotora para este músculo. O terceiro ramo do nervo facial contém fibras EVG e AVE e forma o nervo da corda do tímpano (Frostick et al., 1998; Lucena et al, 2014).
Após sair da cavidade do ouvido médio, o nervo da corda do tímpano une-se ao nervo lingual, levando sensações gustativas AVE dos dois terços anteriores da língua e fibras prégânglionares parassimpáticas EVG até ao gânglio submandibular (Rosenbauer, 2001). Saindo do crânio pelo forame estilomastóide, o nervo facial passa pelo corpo da glândula parótida e forma vários ramos terminais que fornecem inervação branquiomotora, EVE, aos músculos da expressão facial. No ponto de saída, o nervo facial consiste apenas em fibras EVE, além do componente ASG muito pequeno destinado ao pavilhão da orelha e ao meato auditivo externo (Sobotta e Becher, 2013).
Seguindo um trajeto tortuoso através do osso temporal, o nervo facial emerge do crânio pelo forame estilomastóideo, atravessa a glândula parótida, onde forma o plexo parotídeo, e distribui-se em cinco ramos terminais: o ramo temporal, ramo zigomático, ramo da bochecha, ramo marginal da mandíbula e ramo cervical. Esses ramos inervam os músculos mímicos, músculos estilo-hioideo e ventre posterior do músculo digástrico (Figura 3) (Moore; Dalley, 2014).
Figura 3. Distribuição das fibras do nervo facial. Moore, 2014, p.479.
O nervo facial não fornece inervação parassimpática para a glândula parótida. Em vez disso, essa inervação chega à glândula parótida por meio do nervo glossofaríngeo, o gânglio óptico e o ramo auriculotemporal do nervo trigêmeo. Na glândula parótida, ramos terminais
do nervo auriculotemporal, proporcionando inervação motora e sensorial mista, à face e aos músculos de expressão facial (Schunke, 2013; Lucena, 2014).
Tais músculos derivam do segundo arco branquial e as fibras a eles destinadas são eferentes viscerais especiais, constituindo os componentes funcionais do VII par. Os quatro outros componentes funcionais do VII par pertencem ao nervo intermédio, que possui fibras aferentes viscerais gerais, eferentes viscerais gerais, aferentes somáticas gerais e aferentes viscerais especiais. As fibras aferentes são prolongamentos periféricos de neurônios sensitivos no gânglio geniculado (Machado, Haertel, 2014).
O nervo facial de ratos Wistar emerge do forame estilomastoídeo, na parte lateral do crânio. O ramo auricular posterior é responsável pela inervação da musculatura auricular e emerge logo após este forame (Mattox e Felix, 1987).
O rato não possui veia jugular interna, por isso toda a drenagem venosa da cabeça ocorre por tributárias da veia jugular externa, a qual passa lateral à maioria dos ramos (Greene, 1955; Hebel, Stromberg, 1976; Mattox, Felix, 1987).
Malttox e Felix (1987) realizaram um estudo sobre a anatomia cirurgica do nervo facial de ratos Wistar no qual descrevem algumas vantagens de sua situação como similaridade anatômica com os de muitos outros mamíferos não primatas, ramos periféricos que repousam sobre a fascia que recobre os músculos da face, no tecido subcutaneo, facilitando sua visualização e dissecção. No entanto, uma desvantagem é o fato do rato não possuir veia jugular interna, por isso toda a drenagem venosa da cabeça ocorre pela veia jugular externa, a qual passa lateral à mioria dos ramos (Figura 4).
Figura 4. Anatomia do nervo facial do rato. Fonte: Mattox, Felix, 1987.
Logo após o tronco principal emergir, o ramo auricular posterior deixa o nervo superiormente, indo inervar o músculo auricular. A divisão temporofacial do tronco inclui o ramo temporal, que vai em direção ao músculo orbicular do olho e o ramo zigomático menor, que segue em direção ao músculo bucinador e lábio superior. A divisão cérvico inferior do tronco principal contém os ramos zigomáticos e bucais superiormente e, inferiormente, os ramos cervical e marginal da mandíbula para o láo inferior (Figura 5) (Yetiser et al., 2005).
Figura 5. Trajeto do do nervo facial e seus ramos em ratos (Adaptada de YETISER et al.,
O século XVII marca o início dos estudos médicos sobre a reparação de lesões ao NF. Durante a Segunda Guerra Mundial, em decorrência do grande número de feridos nos campos de batalha, os estudos nessa área cresceram consideravelmente, e tratados de medicina em cirurgia neurológica foram publicados, dando base científica ao tratamento de lesões dessa natureza (Davis, et al., 1945).
O conhecimento da anatomia cirúrgica do nervo facial e suas correlações com a glândula parótida e músculos faciais são muito importantes para uma adequada preservação nos casos de cirurgia nesta área. Dessa maneira, a escolha da abordagem cirúrgica é muito relevante na cirurgia da parótida por causa da extrema variabilidade anatômica e importância funcional dos seus ramos (Rodrigues et al., 2009; Lucena, 2014).
O nervo facial de ratos tem sido utilizado como modelo para estudos experimentais, pois apresenta diversos pontos que podem ser estudados, devido a sua ramificação, não sendo difícil seguir a sua trajetória até seus ramos terminais, mesmo sem o auxílio de um microscópio cirúrgico, o que possibilitou a realização de diversas técnicas e utilização de várias substâncias e condutos (Buchaim, 2014).
1.2. REGENERAÇÃO NO SNP E AMBIENTE DE LESÃO
A ocorrência de lesões dos nervos periféricos é comum na prática clínica, sendo responsáveis por problemas graves, como dor e sequelas muitas vezes irreversíveis. Dentre os danos que diminuem a qualidade de vida dos indivíduos acometidos, estão incluídas a incapacitação física e a perda total ou parcial de suas atividades produtivas, o que origina importantes consequências sócio-econômicas (Noble et al., 1998). Além do altíssimo custo social gerado pelo aumento nas despesas da saúde pública e previdenciária, é importante ressaltar o impacto que as lesões desta dimensão são capazes de provocar sobre o indivíduo, seus familiares e sociedade como um todo (Lucena, 2014).
A regeneração é um fenômeno comum a todos os sistemas do organismo, no entanto, quanto mais especializado for o tecido, menor é a capacidade regenerativa do mesmo. Neste sentido, os neurônios, por serem células muito especializadas, apresentam regeneração mais complexa e dificil se compararo à células de outros tecidos (Dong, yi, 2010).
Em comparação ao SNC, o SNP, apresenta o sucesso da regeneração neural depende do suporte dado pelas CS, formando as chamadas bandas de Burgner, mielinizando as fibras axonais neo-formadas, produzindo fatores neurotróficos, moléculas de adesão, citocinas e/ou estruturas juncionais (Salomone, 2012), no entanto, a proliferação das CS endógenas,
provenientes dos segmentos, é insuficiente para suprir a demanda necessária no processo de regeneração, tornando importante uma complementação exógena (Wang et al, 2011). No intuito de suprir esta demanda, diversas fontes alternativas de CS exógenas tem sido estudadas, como células–tronco do folículo capilar, células tronco derivadas do tecido adiposo, polpa dental (Di Summa et al, 2011), células tronco embrionárias (lin et al, 2008), dentre outras.
Outra característica que difere o ambiente de lesão dos axônios do SNC do SNP, é o fato dos nervos, ao contrário dos axônios do SNC não serem estruturalmente separados por bainhas perineurais e neurilemas, estruturas que fornecem um substrato anatômico para o crescimento da fibra lesada, favorecendo assim o processo regenerativo do SNP (Guzen, 2011).
Quando o neurônio é lesionado, ocorre uma quebra do equilíbrio e como resposta, inicia-se uma ação coordenada visando à sobrevida e à restauração da função. Waller (1850) foi o primeiro a descrever essas ações, provocando mudanças nos mecanismos intracelulares, caracterizados por modificações na morfologia dos constituintes nervosos, tanto proximal quanto distal. Diante deste quadro, vários trabalhos têm sido realizados nas últimas décadas, com intuito de se obter uma técnica de reparo em lesões de nervos periféricos que traga como resultado uma melhor recuperação funcional das estruturas inervadas por tais nervos. Assim, técnicas envolvendo membrana cartilagínea (Bunnell, 1939), enxerto arterial (Rodrigues, 2000), microssuturas e tubos de pericárdio bovino são utilizadas em vários modelos experimentais.
Após a lesão do nervo por esmagamento, axotomia ou transecção, o coto distal do nervo periférico sofre degeneração Walleriana. Este processo leva à remoção e reciclagem de fragmentos derivados do axônio lesionado gerando um ambiente permissivo para a regeneração axonal. Os macrófagos são recrutados para o local da lesão, e junto com as células de Schwann, contribuem para a depuração de detritos. Enquanto o coto distal sofre degeneração, no coto proximal inicia o processo de regeneração (Makwana e Raivich, 2005).
Quando lesionado, o SNP, ocorre uma inflamação dos corpos celulares e com isso uma elevação da demanda metabólica necessária para o processo regenerativo. Com isso, os neurônios proximais começam a entrar em apoptose, diminuindo, assim, a quantidade de neurônios regenerantes (Kerschensteiner et al., 2005). As células de Schwann, principais células da glia no sistema nervoso periférico, passam a ser fagocíticas e gerar sinais quimiotácticas e recrutam macrófagos ao local da lesão (Guertin et al., 2005; Coleman, 2005). Assim, inicia-se o processo de degeneração walleriana que objetiva eliminar os detritos
axoniais e de mielina para preparar e estimular o rebrotamento axonal (Nguyen et al., 2002). Na neurotmese ocorre a interrupção deste processo, com diminuição da regulação e função das células de Schwann, perda do suporte axonal e ausência de recuperação funcional.
Como alternativa para proteger o Sistema Nervoso após uma lesão, ocorre um aumento na produção de fatores neurotróficos, substâncias como fator neurotrófico ciliar (CNTF), fator de crescimento fibroblástico–2 (FGF-2), fator neurotrófico derivado do cérebro e da glia (BDNF, GDNF) e neurotrofina-3 (NT-3). Porém, os níveis dessas substâncias não são altos o bastante para efetivamente proteger o tecido contra a injúria (Spejo, 2013).
Concomitantemente à ocorrência da degeneração Walleriana, inicia-se a regeneração axonal advinda do coto proximal, em contato com os corpos de neurônios axotomizados. Essa regeneração é considerada um fenômeno altamente complexo, o qual resulta em uma sucessão de eventos expressa de forma cronológica e sincronizada, objetivando reajustar o microambiente do nervo e reinervação do órgão alvo (Ide, 1996). O sistema nervoso é capaz de se regenerar após uma lesão, no entanto, tal capacidade, é dependente da correta expressão temporal dos diversos fatores de crescimento e componentes da matriz extracelular, bem como da interação entre os axônios em regeneração com as células não neuronais presentes no nervo (Barnes, 1985; Ide, 1996). No microambiente do SNC, contudo, a regeneração axonal é bastante reduzida, sendo impedida pela cicatriz glial que se estabelece após a injúria.
Nos anos 80, os experimentos de Aguayo et al. (1981) demonstraram o potencial de crescimento de fibras de neurônios no modelo de transecção de nervo óptico de ratos adultos, que aloja as fibras nervosas que ligam a retina aos núcleos subcorticais responsáveis por algumas das funções visuais. Após a transecção, segmento de nervo isquiático foi interposto entre o coto proximal do nervo óptico seccionado e o colículo superior, no mesencéfalo. Todo o trajeto do nervo interposto se fez do lado de fora do crânio. Após alguns meses, a regeneração foi constatada pela obtenção de registros elétricos no mesencéfalo após estimulação visual (Lucena, 2014).
Como os neurônios dos mamíferos geralmente não se dividem, a destruição de um neurônio representa perda permanente. Seus prolongamentos, no entanto, dentro de certos limites podem regenerar-se devido à atividade dos respectivos corpos celulares. Por isso, os nervos se regeneram, embora com dificuldade. Quando uma célula nervosa é destruída, as que a ela se ligam nada sofrem, exceto nos raros casos em que um neurônio recebe impulsos exclusivamente de outro. Neste caso, o neurônio que fica completamente privado de impulsos nervosos, pela destruição do outro, sofre a chamada degeneração transneuronal (Purves et al., 2010; Lucena, 2014).
Ao contrário dos elementos nervosos, as células da glia do SNC, e as do SNP (CSs e células satélites dos gânglios), são dotadas de grande capacidade de proliferação. Os espaços deixados pelas células e fibras nervosas do SNC destruído por acidentes ou doença são preenchidos por células da neuroglia (Alberts et al., 2010). Quando um nervo é seccionado, ocorrem alterações degenerativas, seguidas de uma fase de reparação. No nervo lesado deve-se distinguir a parte da fibra que, pela lesão, desligou-deve-se do deve-seu neurônio (parte distal) e a parte que continua unida ao neurônio (parte proximal). O segmento proximal, por manter contato com o corpo celular, que é o centro trófico, frequentemente é regenerado, enquanto o segmento distal degenera totalmente e acaba por ser reabsorvido (Machado e Haertel, 2014).
No coto distal, tanto o axônio, agora separado de seu centro trófico, como a bainha de mielina degeneram totalmente. Enquanto se processam essas alterações, as CSs proliferam, formando colunas celulares compactas. Essas colunas servirão de guia para os axônios que vão crescer durante a fase de regeneração. Por outro lado, o segmento proximal do axônio cresce e se ramifica, formando vários filamentos que progridem em direção às colunas de CSs. Todavia, somente as fibras que penetram nessas colunas têm possibilidade de alcançar um órgão efetor (Figura 6). Quando o segmento distal do nervo é perdido, como ocorre na amputação de um membro, as fibras nervosas crescem ao acaso (Junqueira e Carneiro, 2013; Lucena, 2014).
A eficiência funcional da regeneração depende das fibras ocuparem as colunas de CSs destinadas aos locais corretos. Num nervo misto, por exemplo, se as fibras sensitivas regeneradas ocuparem colunas destinadas às placas motoras de um músculo estriado, a função do músculo não será restabelecida. A possibilidade de recuperação funcional é aumentada pelo fato de cada fibra em regeneração dar origem a vários prolongamentos e cada coluna receber prolongamentos de várias fibras (Purves et al., 2010).
Após a lesão, axônios fragmentados e restos de bainha de mielina não são rapidamente e eficientemente removidos do sítio da ferida no SNC, em parte porque o processo de ativação microglial é inferior ao observado pelos macrófagos nos nervos. Alguns trabalhos sugerem que células como as de linhagem glial e os fagócitos são decisivas no processo de reparo e cicatrização, com interferência no fenômeno de crescimento de fibras nervosas (Chan et al., 2001; Markus et al., 2002b).
1.3 - CÉLULAS TRONCO (CT)
A presença de células-tronco não hematopoiéticas na medula óssea foi sugerida, primeiramente, pelas observações realizadas pelo patologista Alemão Cohnheim em 1867 (Prockop, 1997). Goujon em 1869 foi o primeiro a documentar a presença de células mesenquimais progenitoras na medula óssea (Sell, 2003).
Caplan (1991) define células-tronco como células que apresentam três características: autorrenovação, habilidade de se diferenciar em outros tipos celulares e capacidade in vivo de reconstruir um novo tecido. Caplan (1991) e Gimble et al. (2008) definem células-tronco mesenquimais como células-tronco não hematopoiéticas multipotentes presentes em vários tecidos adultos.
Segundo Pittenger et al. (1999), Hori et al. (2003) e Uccelli et al. (2006) as células-tronco apresentam imunigenicidade baixa e são capazes de sobreviver em ambientes não imunes. Woodburg et al. (2000), Cuevas et al. (2002), Barcelos et al. (2003) Gomillion e Burg (2006), Cho et al. (2010) e Sun et al. (2001) relatam que as CT indiferenciadas, assim como as diferenciadas, são capazes de secretar fatores neurotróficos, proporcionando um microambiente favorável para a sobrevivência das células neurais, estimulando e apoiando o crescimento, a maturação e a diferenciação das CS.
As CT constituem uma pequena população celular da medula óssea, correspondendo a cerca de 0,001 a 0,01% de todas as células nucleadas medulares. Podem ser usadas em
transplante autólogo, dispensando uso de imunossupressores, sendo células prontamente disponíveis e de baixo potencial oncogênico (Spejo, 2013).
De acordo com Shi et al. (2001), Dezawa et al. (2004) Dezawa et al. (2005) e Gimble et al. (2008), as células-tronco produzem citocinas como a IL-6, a qual sabiamente atua no processo de regeneração de fibras nervosas. A Sociedade Internacional de Terapia Celular (2005) atualmente recomenda que se use o termo “células multipotentes do estroma mesenquimal” para as células aderentes ao substrato plástico, isoladas da medula óssea e que, frequentemente, são rotuladas como células-tronco mesenquimais.
Tratamentos experimentais com CT no SN podem ser agrupados em duas estratégias principais, neuroproteção e neuroregeneração. Neuroproteção se refere à inibição da morte de células do tecido danificado, enquanto regeneração se refere ao reparo de axônios danificados ou brotamento de axônios intactos para reinervar os alvos (Azari et al., 2010).
As alterações metabólicas e morfológicas dos motoneurônios lesados podem ser explicadas em parte, pela desconexão entre o corpo celular do neurônio e o órgão alvo, o que leva à interrupção do aporte de fatores neurotróficos para o corpo celular. O efeito neuroprotetor promovido pelas CT pode estar associado à produção de fatores neurotróficos localmente, capazes de ampliar e promover a regeneração de fibras nervosas no sítio da lesão (Li et al., 2002; Mahmood et al., 2004) e influenciar positivamente na sobrevivência neuronal e plasticidade sináptica (Hell et al., 2009).
Além do papel neuroprotetor, as CT são ainda capazes de promover a regeneração de fibras nervosas no sítio da lesão (Li et al., 2002; Mahmood et al., 2004). A expressão de BDNF por CT se correlaciona com a sua capacidade em promover a sobrevivência e o crescimento de neuritos, em linhagens celulares de neuroblastoma. Entretanto, os efeitos produzidos pelas CT são apenas parcialmente inibidos pela neutralização do BDNF por anticorpos específicos contra esta proteína, indicando que estas produzem outros fatores que contribuem para a sobrevivência neuronal e regeneração nervosa (Lu et al., 2003; Crigler et al., 2006).
Ao transplantar células-tronco para a medula espinal de camundongos que apresentam degeneração motoneuronal (camundongos mdf -muscle deficient), houve um aumento da sobrevivência de motoneurônios e consequente melhora funcional, apesar destas células apresentarem um fenótipo microglial. Tal fato foi atribuído à produção local de GDNF pelas células hematopoiéticas transplantadas (Cabanes et al., 2007). Adicionalmente, quando células-tronco neurais foram transplantadas para a medula lombar de camundongos com específica perda de motoneurônios (camundongos pmn- progressive motor neuropathy),
houve um aumento significativo de 56% do tempo de vida destes animais, reforçando tal papel neuroprotetor. Após o transplante, essas células apresentaram-se pequenas e arredondadas e não expressavam nenhum marcador neuronal, sugerindo que permaneceram em um estágio indiferenciado (Ferrer-Alcon et al., 2007). Tal melhora poderia ser atribuída ao fato de que as células-tronco neurais secretam constitutivamente fatores neurotróficos (Lu et al., 2003).
Contudo, nas últimas décadas, a terapia celular tem assumido o foco das atenções no tratamento das injúrias traumáticas do sistema nervoso periférico. O transplante de células de Schwann, de precursores neurais, de células-tronco (CT) e até mesmo de fibroblastos tem mostrado efeitos benéficos na regeneração de nervos periféricos (Hood et al., 2009, Zang et al., 2011).
As CT não hematopoiéticas são facilmente isoladas a partir de diversos tecidos adultos e caracterizadas por sua extensa habilidade proliferativa em cultura e de se diferenciar in vitro em diversas linhagens mesenquimais (Chamberlain et al., 2007; Dominici et al., 2006). Devido aos mecanismos de hipoimunogenicidade demonstrados, tais como a modulação do fenótipo das células T, imunossupressão do microambiente e baixa expressão de alguns epítopos de superfície, as CT podem ser transplantadas em receptores alogênicos ou xenogênicos com incompatibilidade imunológica in vivo e in vitro. Contudo, ainda não existe um consenso, uma vez que se tem demostrado que pode ocorrer reação imunológica decorrente de transplantes alogênicos (Le Blanc et al., 2003; Di Nicola et al., 2002).
No SNP, as CS respondem rapidamente a lesão, antes da degeneração do axônio. Alguns receptores que permanecem nas microvilosidades das células de Schwann são ativados após a axonotomia, resultando na posterior ativação das proteínoquinases por mitógenos regulando a expressão gênica, mitose e diferenciação das células de Schwann. No processo de DW, a separação e fragmentação da bainha de mielina é rápida, separando-se do soma e encurtando-se, formando assim pequenos ovóides e, posteriormente, as células de Schwann degradam, fagocitam e apresentam a mielina para os macrófagos, evitando-se a presença de moléculas inibitórias por parte das CS danificadas, como a glicoproteína associada a mielina (MAG) (Guertin et al., 2005).
CT neurais têm sido usadas para reparar lesões nervosas com sucesso regenerativo (Murakami et al., 2003; Heine et al., 2004; Aquino et al., 2006), no entanto, são de difícil obtenção. Por outro lado, CT adultas tem a vantagem de serem disponíveis a partir de procedimentos relativamente não invasivos, métodos de coleta autólogos, e são provavelmente a mais promissora escolha para a maioria das lesões nervosas. Células estromais de medula óssea têm atraído vários grupos interessados em estratégias para complementar o reparo nervoso (Dezawa et al., 2001; Tohill et al., 2004; Keilhoff et al., 2006; Chen et al., 2000; Hu et al., 2007; Shimizu et al., 2007; Wang et al., 2008). São coletadas a partir de ossos longos, e quando colocadas em meio de cultura contendo citocina transdiferenciam-se em CSs aderentes com fenótipo expressando a proteína S-100, GFAP e p75 (Figura 7) (Dezawa et al., 2001; Tohill et al., 2004; Lucena; 2014).
Figura 7. Células multipotentes derivadas de estroma ósseo (Adaptado: BD biosciences,
2006)
Há inúmeros paradigmas para descrever os mecanismos regulatórios da divisão e da autorenovação celular. O mecanismo de expansão tem sido descrito como assimétrica ou simétrica. Na divisão assimétrica, cada CT sofre uma divisão na qual uma permanece em repouso (estágio original de repouso) e outra denominada progenitora, adquire a capacidade de se diferenciar. Na divisão simétrica, duas CTs filhas ou duas células diferenciadas são formadas a partir de cada CT. O ambiente influencia as propriedades bioquímicas e morfológicas das CTs. Estas ajustam suas propriedades de acordo com o meio circundante e
selecionam linhagens específicas de acordo com os estímulos recebidos pelo seu nicho (Fuchs e Segre, 2000). De maneira geral, há fatores extrínsecos e intrínsecos relacionados a divisão e diferenciação celular (Lucena, 2014).
1.4. FATORES NEUROTRÓFICOS
Os fatores neurotróficos são polipeptídeos que auxiliam no processo regenerativo do SNP. Compreendem basicamente um conjunto de famílias de moléculas e seus receptores responsáveis por manter o crescimento e a sobrevivência dos axônios e neurônios motores e sensitivos, após danos teciduais. Diversos fatores tróficos, também conhecidos como fatores de crescimento, são utilizados e testados in vitro e in vivo na regeneração de nervos periféricos. Essas proteínas atuam diretamente na proliferação e diferenciação de diferentes tipos celulares, sendo capazes de promover reparo tecidual e recuperação funcional (Boyd e Gordon, 2003; Lucena, 2014).
Vários fatores neurotróficos são liberados e atuam conjuntamente após uma lesão neural periférica a fim de estimular a regeneração neural; incluem o fator de crescimento do nervo (NGF), o fator neutrófico derivado do cérebro (BDNF) (Boyd e Gordon, 2003), a neurotrofina-3 (NT-3) (Markus et al., 2002ª), os fatores de crescimento tipo insulina (IGF-I e IGF-II) (Perlson et al., 2004) e o fator de crescimento fibroblástico 2(FGF-2) (Terenghi, 1999).
Diversos fatores tróficos, também conhecidos como fatores de crescimento, são utilizados e testados in vitro e in vivo na regeneração de nervos periféricos. Essas proteínas atuam diretamente na proliferação e diferenciação de diferentes tipos celulares, sendo capazes de promover reparo tecidual e recuperação funcional (Millesi, 2006).
Fatores de crescimento também são aplicados no reparo de nervo periférico em função de seus efeitos neurotróficos; dentre eles destacam-se o fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF), e o fator de crescimento similar à insulina (IGF) (Hobson, 2000). O IGF desempenha um papel crucial na regulação da proliferação e na diferenciação celular. Tem efeitos mitogênicos e antiapoptóticos, tanto sobre células normais quanto transformadas, e é sintetizado por diversos tecidos, atuando de modo endócrino, autócrino e parácrino (Yakar, 2002).
Estas proteínas apresentam-se em níveis elevados após transecção ou esmagamento de nervos, e sua expressão temporal e espacial, assim como sua meia vida biológica (que pode
