UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE TECNOLOGIA
JOSÉ DOMINGOS BASSOLI
Pós-processamento com o software MetAlign de dados gerados pelo software X-Calibur com GC-MS: Oxidação de herbicidas triazínicos
Limeira 2019
JOSÉ DOMINGOS BASSOLI
Pós-processamento com o software MetAlign de dados gerados pelo software X-Calibur com GC-MS: Oxidação de herbicidas triazínicos.
Dissertação apresentada à Faculdade de Tecnologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Tecnologia, na Área de Ambiente.
Orientadora: PROFA.DRA. MARIA APARECIDA CARVALHO DE MEDEIROS
ESTE TRABALHO CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO JOSÉ DOMINGOS BASSOLI, E ORIENTADA PELA PROF(A). DR(A). MARIA
APARECIDA CARVALHO DE
MEDEIROS.
Limeira 2019
AGRADECIMENTOS
A Deus, por seu cuidado constante e amor incondicional. A minha esposa pela compreensão e pela paciência. A minha filha pelo apoio e pela motivação.
A minha orientadora, Professora Dra. Maria Aparecida Carvalho de Medeiros pela oportunidade, incentivo, confiança, ensinamentos, apoio, compreensão e atenção com que orientou esse trabalho.
Aos Professores Prof. Dr. Luís Fernando de Ávila e Dr. Luiz Roberto Pimentel Trevisan pelas contribuições na banca de defesa deste trabalho.
Aos Professores Dr. Valdemar Luiz Tornisielo e Dr. Luís Fernando Ávila pelas contribuições na banca de qualificação desse trabalho.
As secretárias da Pós-Graduação Karen Tank Mercuri Macedo e Fátima Aparecida Alves, pela atenção e auxilio durante todo o período de mestrado.
Aos meus Professores pelos ensinamentos e pela atenção.
A minha Colega de Laboratório Kelly Adriana Tagliaferro pela convivência durante este período e pelo auxilio nos experimentos e obtenção dos dados.
A todos os meus parentes e amigos que, mesmo não citados, com apoio e carinho contribuíram para que este trabalho fosse realizado.
RESUMO
A análise de reações de oxidação de herbicidas triazínicos é altamente complexa, mesmo usando técnicas avançadas como Cromatografia Gasosa acoplada à
Espectrometria de Massas (GC-MS), mesmo através de software robusto como o
X-CaliburTM, porque nestas reações os subprodutos da oxidação são gerados em
concentrações ao nível de traços, dificultando a detecção dos picos. Portanto, é
necessário a utilização de software, como o MetAlignTM, para otimizar o
processamento de dados cromatográficos e de espectrometria de massas e também exportá-los, permitindo o aumento da relação Sinal/Ruído, tratamento estatístico e análise multivariada. Neste contexto, o objetivo do presente trabalho foi otimizar os
dados, gerados pelo software X-CaliburTM, obtidos em análises de GC-MS durante
reações de oxidação de herbicidas triazínicos (atrazina e simazina) catalisadas por metaloporfirinas de ferro e rutênio, utilizando o peróxido de hidrogênio como oxidante.
Esses dados gerados pelo software X-CaliburTM foram exportados para a plataforma
de software MetAlignTM, onde o pós-processamento de dados foi realizado, resultando
em um aumento na relação Sina/Ruído dos novos dados gerados até mais que 2,5
vezes maiores que os dados originais, melhorando a visualização dos picos analisados, bem como aumentando a probabilidade de identificar o analito em relação aos dados originais. Adicionalmente, a técnica espectrofotométrica UV-Vis permitiu o monitoramento das reações de oxidação dos herbicidas atrazina e simazina, evidenciando a degradação dos catalisadores metaloporfirínicos de ferro e de rutênio, devido às condições fortemente oxidantes com o peróxido de hidrogênio.
Palavras-chave: Software MetAlign, Software X-Calibur, Pós-Processamento, GC-MS, Oxidação, Herbicidas Triazínicos, Catalisadores Metaloporfirinicos.
ABSTRACT
The oxidation reactions of triazine herbicides are highly complex, even using advanced techniques such as Gas Chromatography coupled to Mass Spectrometry (GC-MS),
even through robust software such as X-CaliburTM, because in these reactions’
oxidation by-products are generated in concentrations at the level of traces, making it difficult to detect the peaks. Therefore, it is necessary to use software, such as
MetAlignTM, to optimize the processing of chromatographic and mass spectrometry
data and also to export them, allowing the increase of the Signal to Noise ratio, statistical treatment and multivariate analysis. In this context, the objective of the
present work was to optimize the data, generated by the X-CaliburTM software,
obtained in GC-MS analyzes during oxidation reactions of triazinic herbicides (atrazine and simazine) catalyzed by iron and ruthenium metalloporphyrins, using hydrogen
peroxide as oxidant. This data generated by the X-CaliburTM software was exported to
the MetAlignTM software platform, where data post-processing was performed,
resulting in an increase in the Signal/Noise ratio of the new generated data up to 2.5
times larger than the original data, improving the visualization of the peaks analyzed, as well as the probability of identifying the analyte in relation to the original data. In addition, the UV-Vis spectrophotometric technique allowed the monitoring of the
oxidation reactions of the herbicide’s atrazine and simazine, evidencing the
degradation of iron and ruthenium metalloporphyrin catalysts, due to the strongly oxidizing conditions with hydrogen peroxide.
Key words: MetAlign Software, X-Calibur Software, Post-Processing, GC-MS, Oxidation, Triazinic Herbicides, Metalloporphyrin Catalysts.
Listas de Figuras
Figura 1 – Estrutura molecular e propriedades físico-químicas dos herbicidas atrazina e
simazina e seus subprodutos DIA, DEA...17
Figura 2 - Principais consumidores de pesticidas no mundo, em US$ bilhões...18
Figura 3 - Ferro (III)-protoporfirina IX...21
Figura 4 - Estruturas das metaloporfirinas de ferro(C37H44N4ORu)...21
Figura 5 - Estruturas das metaloporfirinas de ferro(C44H18ClF20FeN4 ) ...22
Figura 6 - Diferentes vias reacionais possíveis na ativação de metaloporfirinas por H202: (A) = via homolítica com geração de HO•, (B) = via heterolítica com a geração de uma espécie de metal-oxo, e (C) = adição de uma segunda molécula de H2O2 para produzir o oxigênio molecular e água (reação de catalase)...22
Figura 7 - Esquema de um analisador “ion-trap”...27
Figura 8 -Tela de entrada do Software X-Calibur™...28
Figura 9 - Tela inicial do Qual Browser Software X-Calibur™. (a) Cromatograma e (b) Espectro de massa...29
Figura 10 - Tela inicial do resultado da pesquisa na biblioteca NIST com o do LIBRARY>SEARCH na opção do Qual Browser software X-Calibur™. (a) Lista de picos com os nomes atribuídos e as respectivas probabilidades. (b) Identificação do pico selecionado, com o nome da fórmula estrutural, a fórmula molecular, e o CAS number. (c) Tem-se o respectivo espectro de massa do pico selecionado e o da biblioteca NIST. (d) Tem-se a diferença dos espectros do pico selecionado com o da biblioteca NIST ...30
Figura 11 - Esquema do reator, que consiste em um frasco âmbar com tampa, utilizado no procedimento de degradação dos herbicidas atrazina e simazina ...34
Figura 12 - Fluxograma representativo do algoritmo do reprocessamento das análises feitas no software X-Calibur™ pelo Software MetAlignTM...38
Figura 13 - Tela de entrada do Software MetAlign™...39
Figura 14 - Espectro de absorção UV-Vis da metaloporfirina de Rutênio 100g L-1...40
Figura 15 Sobreposição dos espectros de absorção UV-Vis das reações de degradação de Atrazina 5 mg L-1 com a Metaloporfirina de rutênio (100gL-1) e peróxido de hidrogênio 1:10 (800mgL-1) ...41
Figura 16 - Espectro de absorção UV-Vis do herbicida atrazina 5mg L-1...42
Figura 17 - Espectro de absorção UV-Vis do herbicida simazina 5mg L-1...43
Figura 18 - Espectro de absorção UV-Vis do subproduto DDA 10mg L-1 ...44
Figura 19 - Espectro de absorção UV-Vis do subproduto DIA 10mg L-1...45
Figura 20 - Espectro de absorção UV-Vis do subproduto DEA 10mg L-1...46
Figura 21 - Cromatogramas de ATZ(a), SIM(b), DEA(c) e DIA(d), com concentração de 0,500 mg L-1 para cada analito injetado no GC-MS...47
Figura 22 - Dados originais gerados pelo software X-Calibur™ com concentração de MIX(ATZ+SIM) com detalhe para a simazina a 0,25 mg L-1, (a) cromatograma com o pico da simazina selecionado e (b) o espectro de massa do pico da SIM, apresentando o pico do íon base (íon mais intenso no espectro) (m/z= 201) e os principais fragmentos (m/z)...49
Figura 23 - Dados originais gerados pelo software X-Calibur™ com a apresentação da probabilidade da identificação da simazina com a concentração 0,25mg L-1. (a) Lista de picos com os nomes atribuídos e as respectivas probabilidades para a simazina; (b) Identificação do pico selecionado (SIM), com o nome, a fórmula estrutural, a fórmula molecular, e o CAS number; (c) Tem-se o respectivo espectro de massa do pico selecionado SIM e o da biblioteca NIST; (d) Tem-se a diferença dos espectros do pico selecionado com o da biblioteca NIST para a simazina...50
Figura 24 - Dados originais gerados pelo software X-Calibur™ com a concentração de MIX(ATZ+SIM), selecionado para o pico da atrazina a 0,25 mg L-1. (a) cromatograma com o pico da atrazina selecionado e (b) o espectro de massa do pico da ATZ, apresentando o pico do íon base (íon mais intenso no espectro) (m/z= 200) e os principais fragmentos (m/z)...51
Figura 25 - Dados originais gerados pelo X-Calibur™ com a apresentação da probabilidade
da atrazina com amostra a 0,25 mg L-1. (a) Lista de picos com os nomes atribuídos e as
respectivas probabilidades para a atrazina; (b) Identificação do pico selecionado (ATZ), com o nome, a fórmula estrutural, a fórmula molecular, e o CAS number; (c) Tem-se o respectivo espectro de massa do pico selecionado ATZ e o da biblioteca NIST; (d) Tem-se a diferença dos espectros do pico selecionado com o da biblioteca NIST para a atrazina...52
Figura 26 - Dados gerados pelo reprocessamento através do software MetAlign™ para a
simazina com concentração 0,25 mg L-1. (a) cromatograma e (b) espectro de
massas ...54
Figura 27 - Dados gerados pelo reprocessamento através do software MetAlign™ para a
atrazina com concentração 0,25 mg L-1. (a) cromatograma e (b) espectro de massas...55
Figura 28 - Dados gerados pelo reprocessamento através do MetAlign™ para subproduto
DDA simazina com concentração 0,25 mgL-1. (a) cromatograma e (b) espectro de massas...56
Figura 29 - Dados gerados pelo reprocessamento através do software MetAlign™ da DIA com
concentração 0,25 mg L-1. (a) cromatograma e (b) espectro de massas...57
Figura 30- Dados gerados pelo reprocessamento através do software MetAlign™ da DEA
com concentração 0,25 mg L-1. (a) cromatograma e (b) espectro de massas...58
Figura 31 - Dados gerados pelo reprocessamento através do software MetAlign™ com a
apresentação da probabilidade da simazina para a concentração 0,25 mgL-1 mostrando que
aumentou a probabilidade. (a) Lista de picos com os nomes atribuídos e as respectivas probabilidades. (b) Identificação do pico selecionado, com o nome, a fórmula estrutural, a fórmula molecular, e o CAS number. (c) Tem-se o respectivo espectro de massa do pico selecionado e o da biblioteca NIST. (d) Tem-se a diferença dos espectros do pico selecionado com o da biblioteca NIST...59
Figura 32 - Dados gerados pelo reprocessamento dos dados através do software MetAlign™
com a apresentação da probabilidade da atrazina com concentração 0,25 mg L-1 mostrando
que aumentou a probabilidade de ocorrência da atrazina. (a) Lista de picos com os nomes atribuídos e as respectivas probabilidades. (b) Identificação do pico selecionado, com o nome, a fórmula estrutural, a fórmula molecular, e o CAS number. (c) Tem-se o respectivo espectro de massa do pico selecionado e o da biblioteca NIST. (d) Tem-se a diferença dos espectros do pico selecionado com o da biblioteca NIST...60
Figura 33 - Dados gerados pelo reprocessamento dos dados através do software MetAlign™
com a apresentação da probabilidade da DDA com concentração 0,25 mg L-1 mostrando que
aumentou a probabilidade de ocorrência da atrazina. (a) Lista de picos com os nomes atribuídos e as respectivas probabilidades. (b) Identificação do pico selecionado, com o nome, a fórmula estrutural, a fórmula molecular, e o CAS number. (c) Tem-se o respectivo espectro de massa do pico selecionado e o da biblioteca NIST. (d) Tem-se a diferença dos espectros do pico selecionado com o da biblioteca NIST...61
Figura 34 - Dados gerados pelo reprocessamento dos dados através do software MetAlign™
com a apresentação da probabilidade da DIA com concentração 0,25 mg L-1 mostrando que
aumentou a probabilidade de ocorrência da atrazina. (a) Lista de picos com os nomes atribuídos e as respectivas probabilidades. (b) Identificação do pico selecionado, com o nome, a fórmula estrutural, a fórmula molecular, e o CAS number. (c) Tem-se o respectivo espectro de massa do pico selecionado e o da biblioteca NIST. (d) Tem-se a diferença dos espectros do pico selecionado com o da biblioteca NIST...62
Figura 35 - Dados gerados pelo reprocessamento dos dados através do software MetAlign™
com a apresentação da probabilidade da DEA com concentração 0,25 mg L-1 mostrando que
aumentou a probabilidade de ocorrência da atrazina. (a) Lista de picos com os nomes atribuídos e as respectivas probabilidades. (b) Identificação do pico selecionado, com o nome, a fórmula estrutural, a fórmula molecular, e o CAS number. (c) Tem-se o respectivo espectro de massa do pico selecionado e o da biblioteca NIST. (d) Tem-se a diferença dos espectros do pico selecionado com o da biblioteca NIST...63
Listas de Tabelas
Tabela 1 - Ingredientes Ativos mais comercializados e líderes em vendas no Brasil, em
2016 ...18
Tabela 2 - Potencial de oxidação de agentes oxidantes mais utilizados...20
Tabela 3 - Dados referentes à programação do UV-Vis para a obtenção das leituras da absorbância ...35
Tabela 4 - Condições de temperatura de análise no detector MS/MS ...36
Tabela 5 - Condições no detector MS/MS...36
Tabela 6 - Rampa de programação no GC-MS/MS...37
Tabela 7 - Representação dos tempos de retenção (média de análises em triplicata) e massa molar dos compostos atrazina, simazina, DDA, DIA e DEA...48
Tabela 8 - Dados da relação Sinal/Ruído referentes a uma curva analítica para o herbicida atrazina, com o processamento dos dados originais gerados pelo software X-CaliburTM, o reprocessamento feito pelo Software MetAlignTM e a comparação dos dados obtidos com ambos, através do ganho no Sinal/Ruído (MetAlignTM/X-CaliburTM)...64
Tabela 9 - Dados da relação Sinal/Ruído referentes a uma curva analítica para o herbicida simazina, com o processamento dos dados originais gerados pelo software X-CaliburTM, o reprocessamento feito pelo Software MetAlignTM e a comparação dos dados obtidos com ambos, através do ganho no Sinal/Ruído (MetAlignTM/X-CaliburTM)...65
Tabela 10 - Dados da relação Sinal/Ruído referentes a uma curva analítica para o subproduto triazínico DDA, com o processamento dos dados originais gerados pelo software X-CaliburTM, o reprocessamento feito pelo Software MetAlignTM e a comparação dos dados obtidos com ambos, através do ganho no Sinal/Ruído (MetAlignTM/XCaliburTM)...65
Tabela 11 - Dados da relação Sinal/Ruído referentes a uma curva analítica para o subproduto triazínico DIA, com o processamento dos dados originais gerados pelo software X-CaliburTM, o reprocessamento feito pelo Software MetAlignTM e a comparação dos dados obtidos com ambos, através do ganho no Sinal/Ruído (MetAlignTM/X-CaliburTM)...66
Tabela 12 - Dados da relação Sinal/Ruído referentes a uma curva analítica para o subproduto triazínico DIA, com o processamento dos dados originais gerados pelo software X-CaliburTM, o reprocessamento feito pelo Software MetAlignTM e a comparação dos dados obtidos com ambos, através do ganho no Sinal/Ruído (MetAlignTM/X-CaliburTM)...67
Tabela 13 - Comparação dos resultados para as probabilidades obtidas pela biblioteca NIST em injeções no GC-MS para uma curva analítica para a atrazina, análises geradas pelo software X-CaliburTM e reprocessadas pelo Software MetAlign™...67
Tabela 14 - Comparação dos resultados para as probabilidades obtidas pela biblioteca NIST em injeções no GC-MS para uma curva analítica para a simazina, análises geradas pelo software X-CaliburTM e reprocessadas pelo Software MetAlign™. ...68
Tabela 15 - Comparação dos resultados para as probabilidades obtidas pela biblioteca NIST em injeções no GC-MS para uma curva analítica para a DDA, análises geradas pelo software X-CaliburTMe reprocessadas pelo Software MetAlign™...69
Tabela 16 - Comparação dos resultados para as probabilidades obtidas pela biblioteca NIST em injeções no GC-MS para uma curva analítica para a DIA, análises geradas pelo software X-CaliburTMe reprocessadas pelo Software MetAlign™...69
Tabela 17 - Comparação dos resultados para as probabilidades obtidas pela biblioteca NIST em injeções no GC-MS para uma curva analítica para a DEA, análises geradas pelo software X-CaliburTMe reprocessadas pelo Software MetAlign™...70
Tabela 18 - Comparação dos dados obtidos da relação Sinal/Ruído para a atrazina com concentração inicial de 2 mgL-1 em reações de oxidação catalisadas pela metaloporfirina de ferro, apresentação dos dados originais pelo X-CaliburTM e reprocessadas pelo MetAlign™..70
Tabela 19 - Comparação dos dados obtidos da relação Sinal/Ruído para a atrazina com concentração inicial de 5 mgL-1 em reações de oxidação catalisadas pela metaloporfirina de rutênio, apresentação dos dados originais pelo X-CaliburTM e reprocessadas pelo MetAlign™ ...71
Tabela 20 - Comparação dos dados obtidos para a atrazina com concentração inicial de 5
mgL-1 em reações de oxidação catalisadas pela metaloporfirina de rutênio entre as
probabilidades das análises geradas pelo X-CaliburTM e reprocessadas pelo MetAlign™...72
Tabela 21 - Comparação dos dados obtidos para a simazina com concentração inicial de 1
mgL-1 em reações de oxidação catalisadas pela metaloporfirina de ferro entre o Sinal/Ruído
das análises geradas pelo software X-CaliburTM e reprocessadas pelo MetAlign™...73
Tabela 22 - Comparação dos dados obtidos para a simazina, com concentração inicial 5 mgL -1 em reações de oxidação catalisadas pela metaloporfirina de rutênio entre o Sinal/Ruído das
análises geradas pelo X-CaliburTM e reprocessadas pelo MetAlign™...73
Tabela 23 - Comparação dos dados obtidos para a simazina, com concentração inicial de 5 mgL-1 em reações de oxidação catalisadas pela metaloporfirina de rutênio entre as
probabilidades das análises geradas pelo X-CaliburTM e reprocessadas pelo MetAlign™...74
Tabela 24 - Comparação dos dados da relação Sinal/Ruído obtidos para um “Mix” de atrazina
e simazina em reações de oxidação catalisadas pela metaloporfirina de ferro, dados gerados pelo software X-CaliburTM e reprocessados pelo Software MetAlign™...75
Tabela 25 - Comparação dos dados obtidos para o Mix de atrazina e simazina em reações de
oxidação catalisadas pela metaloporfirina de ferro entre as probabilidades das análises geradas pelo software X-CaliburTM e reprocessadas pelo Software MetAlign™...75
Lista de Abreviaturas e Siglas ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ATZ – Atrazina Ar – Gás Argônio
DDA – Desetildeisopropilatrazina DEA – Desetilatrazina
DIA – Deisopropilatrazina
GC-MS – Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas (do inglês Gas Chromatography Mass Spectrometry)
SIM – Simazina
GC-MS/MS – Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massa/Massa (do inglês Gas Chromatography Mass-Mass Spectrometry)
INMETRO – Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia He – Gás Hélio
H2O – Água
HO● – Radical Hidroxila H+ – Íon de Hidrogênio
ISO – Organização Internacional de Padronização (do inglês International Organization for Standardization)
ITMS – Espectrômetro de Massa Íon Trap (do inglês Ion Trap Mass Spectrometer) IUPAC – União Internacional de Química Pura e Aplicada (do inglês International Union Pure and Applied Chemistry)
LD – Limite de Detecção
LLE – Extração Líquido-Líquido LQ – Limite de Quantificação MetFe – Metaloporfirina de Ferro MetRu – Metaloporfirina de Rutênio mg L-1 – Unidade de concentração
MS/MS – Espectrometria de Massa em Tandem
NIST – Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia (do inglês National Institute of Standards and Technology)
N2 - Nitrogênio
O2 – Oxigênio Molecular R● – Radical Orgânico RO2● – Radical Peroxila tr – Tempo de Retenção
Sumário
1 INTRODUÇÃO ...14
2 OBJETIVOS ...16
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...17
3.1 Consumo de herbicidas triazínicos no Brasil ... 17
3.2 Processos Oxidativos ... 19
3.3 Catalisadores Metaloporfirínicos ... 20
3.4 Cromatografia Gasosa ... 23
3.4.1 Desenvolvimento de Métodos Cromatográficos ... 23
3.4.2 Validação de Métodos Cromatográficos ... 23
3.4.3 Figuras de Mérito ... 23
3.5 Espectrometria de Massas (MS) ... 25
3.6 ANALISADOR DE MASSAS “ION TRAP” (ITMS) ... 27
3.7 Software X-Calibur™ ... 27
3.8 Software MetAlignTM ... 31
4 MATERIAL E MÉTODOS ...32
4.1 Equipamentos, Vidrarias e Reagentes ... 32
4.2 Procedimento Analítico para a obtenção dos dados via GC-MS ... 33
4.2.1 Preparo das soluções padrões e das metaloporfirinas ... 33
4.2.2 Procedimento de degradação dos herbicidas triazínicos ... 34
4.2.3 Análises via espectrofotometria UV-Vis ... 35
4.2.4 Análises via GC-MS ... 35
4.3 Condições Cromatográficas ... 36
4.4 Fluxograma do algoritmo do reprocessamento das análises feitas no X-Calibur™ pelo software MetAlignTM. ... 37
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...40
5.1 Resultados obtidos com Espectros de absorção UV-Vis para o caracterização dos compostos triazínicos e das reações de oxidação catalíticas dos herbicidas triazínicos. ... 40
5.2 Resultados obtidos com GC-MS utilizando software X-CaliburTM para o processamento dos dados obtidos para os herbicidas triazínicos. ... 47
5.3 Resultados obtidos para o pós-processamento via o software MetAlignTM com os dados obtidos através do software X-CaliburTM para os herbicidas triazínicos. ... 53
5.4 Comparação dos dados gerados pelo software X-CaliburTM com o reprocessamento através do software MetAlignTM para os herbicidas triazínicos. ... 64
6 CONCLUSÕES ...77
1 INTRODUÇÃO
O desenvolvimento de novos produtos químicos tem melhorado a qualidade de vida da população, sendo inquestionável a importância de seu papel em muitos setores, como agricultura, indústria, transporte e saúde. Dentre tais produtos, os agrotóxicos têm contribuído significativamente com o processo de contaminação ambiental, principalmente em função do descarte inadequado destas substâncias tóxicas e uso muitas vezes em quantidades muito acima do que o necessário.
Os herbicidas constituem uma classe importante de agrotóxicos comercializados no Brasil. Existem no país 721 marcas de herbicidas comerciais registrados (BRASIL, 2019). A comercialização de herbicidas no Brasil, no período de 2012 a 2014 foi de 877.782 toneladas, causando impacto destes lançamentos no meio ambiente (BOMBARDI, 2017). Considerando toda a gama de agrotóxicos (herbicidas, inseticidas, acaricidas, fungicidas e outros), as principais culturas responsáveis pelo elevado consumo de herbicidas são: soja, milho, cana-de-açúcar e arroz (VASCONCELUZ, 2018).
Os herbicidas triazínicos são importantes em consumo no Brasil, ressalta-se que a atrazina esteve em quarto lugar em quantidade consumida com 28,6 mil toneladas em 2016 (VASCONCELOS, 2018), sendo, portanto, um herbicida amplamente utilizado no Brasil.
Os herbicidas atrazina e simazina, possuem características que permitem sua degradação por processos oxidativos catalisados por metaloporfirinas (REBELO et al., 2009; GOTARDO et al., 2006), sendo que recentemente foram estudadas as reações de oxidações catalíticas biomiméticas da simazina e atrazina (TAGLIAFERRO, 2015), tendo sido observados subprodutos de degradação destes herbicidas, através de análises via Cromatografia Gasosa/Espectrometria de Massas (GC-MS), entretanto, em baixas concentrações, dificultando a detecção e a quantificação destes compostos.
Diante do exposto, neste trabalho foram estudados os pós processamentos dos dados gerados nas análises cromatográficas das reações de oxidações catalíticas biomiméticas de herbicidas triazínicos, obtidos pelo software X-CaliburTM (THERMO XcaliburTM, 2015) via GC-MS, fazendo-se a exportação do arquivo de dados gerados para a plataforma do software MetAlignTM (LOMMEN et al., 2012). O software MetAlignTM é um software de reprocessamento de dados gerados em Cromatografia acoplada à Espectrometria de Massas: Gasosa (GC-MS) e Líquida (LC-MS), que permite ganhos de relação Sinal/Ruído. Para o monitoramento das reações de oxidações catalisadas por metaloporfirinas, pode-se dispor de vários equipamentos para a análise, elucidação e interpretação, tais
como a espectrofotometria de absorção na região do ultravioleta e visível (UV-Vis), a cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS) e a cromatografia gasosa associada à espectrometria de massas em tandem (GC-MS/MS).
Nas análises utilizando a espectrofotometria de absorção da região UV-Vis, é possível monitorar a degradação das metaloporfirinas empregadas, pela medida da intensidade das absorbâncias das bandas características (DOLPHIN, 1978) e nas análises utilizando-se o GC-MS pode-se medir a degradação dos herbicidas atrazina e simazina, adicionalmente, tem-se como diferencial a identificação dos novos picos formados, que são os subprodutos de degradação, através da comparação do espectro de massa obtidos na base de dados “mass spectral library”-NIST(NIST, 2016).
2 OBJETIVOS
O presente trabalho tem como objetivo geral aplicar o pós-processamento com o software MetAlignTM, dos dados obtidos com o software X-CaliburTM para as análises via Cromatografia Gasosa Acoplada à Espectrometria de Massas (GC-MS), nas reações de oxidação biomiméticas de herbicidas triazínicos, buscando fazer a correção de linha de base, permitindo melhorar a identificação e a quantificação dos compostos.
Tendo como objetivos específicos:
➢ Avaliação e correção da linha de base e da melhoria da relação Sinal/Ruído dos picos cromatográficos e das probabilidades geradas na identificação de cada composto analisado pelo software X-CaliburTM, utilizando-se a biblioteca NIST, através de pós processamentos com o software MetAlignTM dos dados obtidos para cada composto triazínico nas curvas analíticas e no monitoramento das reações catalíticas de oxidação de herbicidas triazínicos (atrazina e simazina), utilizando o peróxido de hidrogênio como oxidante, tendo como catalisadores duas metaloporfirinas comerciais: cloreto de 5,10,15,20-tetrakis(pentafluorofenil) porfirina ferro(III) [Fe(TFPP)Cl] e a 2,3,7,8,12,13,17,18-octaetil-21H,23H-porfina rutênio(II) Carbonil (RuOCTP). ➢ Adicionalmente, o monitoramento das reações de oxidação catalítica de
herbicidas triazínicos via UV-Vis, utilizando as metaloporfirinas Fe(TFPP)Cl e RuOCTP, também fazem parte dos objetivos.
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Consumo de herbicidas triazínicos no Brasil
Herbicidas triazínicos são inibidores da fotossíntese e incluem tanto as triazinas simétricas e as assimétricas. Exemplos de triazinas simétricas são cloro-s-triazinas (atrazina, simazina, propazina, terbutilazina e cianazina), o tiometil-s-triazinas (ametrina, prometrina e terbutrin), e os grupos metoxi-s-triazina (prometon). A triazina assimétrica utilizada é metribuzin (GUPTA, 2012).
A atrazina (2-cloro-4-etilenodiamino-6-isopropilamino-s-triazina), cuja fórmula molecular é C8H14ClN5 e a simazina 2-cloro-4,6-dietilamino-s-triazina, cuja formula molecular é C7H12ClN5, são herbicidas seletivos utilizados no controle de ervas daninhas, principalmente em culturas de cana de açúcar, milho e soja. Os herbicidas atrazina e simazina possuem uma massa molar igual a 215,69 g mol-1 e 201,45 g mol-1, respectivamente, são solúveis em solventes orgânicos como éter, acetona, benzeno, clorofórmio, etanol e acetato de etila. São classificados como herbicidas sistêmicos, seletivos e utilizados no controle pré e pós emergente de ervas daninhas de folhas largas (KLEINSCHMITT, 2007).
A atrazina e a simazina são herbicidas de hidrólise lenta, com baixa pressão de vapor e baixa solubilidade (Figura 1), possuindo anel heterocíclico de seis membros (GOTARDO, 2006).
Figura 1 – Estrutura molecular e propriedades físico-químicas dos herbicidas atrazina e
simazina e seus subprodutos DIA e DEA.
Composto Abreviatura Fórmula R1 R2 M.Molar
/mo (g mol-1) Sol. Água (mg L-1) Atrazina ATZ C8h18ClN5 CH3CH2- (CH3) 2CH- 215.7 33 Simazina SIM C7h12ClN5 CH3CH2- CH3CH2- 201.7 5 Desetilatrazina DEA C6h10ClN5 H- (CH3) 2CH- 187.6 3200 Deisopropilatrazina DIA C5h8ClN5 CH3CH2- H- 173.6 670
A comercialização de herbicidas no Brasil, no período de 2012 a 2014 foi de 877.782 toneladas, causando impacto destes lançamentos no meio ambiente (BOMBARDI, 2017). Considerando toda a gama de agrotóxicos (herbicidas, inseticidas, acaricidas, fungicidas e outros), as principais culturas responsáveis pelo elevado consumo de herbicidas são: soja, milho, cana-de-açúcar e arroz (VASCONCELUZ, 2018).
Na Tabela 1 são mostrados os ingredientes ativos mais comercializados líderes em vendas no Brasil (VASCONCELOS, 2018), nota-se que a atrazina está em quarto lugar em quantidade consumida (28,6 mil toneladas em 2016), sendo portanto, um herbicida amplamente utilizado no Brasil.
Tabela 1 - Ingredientes Ativos mais comercializados e líderes em vendas no Brasil, em 2016.
Substância Tipo Vendas
(em mil ton)
GLIFOSATO Herbicida 185,6
2,4-D Herbicida 53,4
MANCOZEBE Fungicida 33,3
ATRAZINA Herbicida 28,6
ACEFATO Inseticida e acaricida 24,8
CARBENDAZIM Fungicida 13,3
DICLORETO DE PARAQUATE Herbicida 11,6
IMIDACLOPRIDO Neonicotinoide 9,1
Fonte: Adaptado de Vasconcelos, 2018, p. 22.
Na Figura 2 são apresentados os principais países consumidores de pesticidas no mundo (Vasconcelos, 2018), nota-se que o Brasil é o que possui maior consumo (10 US$ bilhões), os Estados Unidos estão em segundo lugar com 7,4 US$ bilhões.
Figura 2 – Principais consumidores de pesticidas no mundo, em US$ bilhões.
3.2 Processos Oxidativos
Por serem compostos persistentes e perigosos ao meio ambiente e a saúde humana, os herbicidas triazínicos necessitam de tratamento que possam removê-los ou transformá-los em espécies químicas de menor impacto ambiental, uma vez que apenas as metodologias convencionais de tratamento (coagulação, floculação, sedimentação e desinfecção) não são suficientes para a remoção desses compostos triazínicos (JIANG, 2006).
Os processos de oxidação liberam radicais livres altamente reativos, principalmente radicais hidroxilas, sendo que, esses processos quando combinados, possibilitam a mineralização do poluente orgânico. Conforme Legrini et al. (1993), os radicais hidroxilas são capazes de oxidar os compostos orgânicos por abstração do hidrogênio, como exemplificado na equação 1, essa reação gera radicais orgânicos que com a adição de oxigênio molecular geram radicais peroxilas, os intermediários formados na equação 2 são responsáveis por iniciar reações de degradação oxidativa, transformando a matéria em dióxido de carbono, água e sal inorgânico (SANTOS, 2011).
OH● + RH R● + H2O (Equação 1)
R● + O2 RO●2 (Equação 2)
Esses processos caracterizam-se por transformar a grande maioria dos contaminantes orgânicos em dióxido de carbono, água e ânions inorgânicos, através de reações de degradação que envolve espécies oxidantes transitórias, principalmente os radicais hidroxilas. Esses radicais, tem potencial redox de 2,8V, sendo somente menor que o do flúor, que é de 3,03 V.
Na Tabela 2 são apresentados os potenciais de oxidação dos principais agentes químicos utilizados na oxidação de água apud NOGUEIRA e GUIMARÃES (1998).
Tabela 2 - Potencial de oxidação de agentes oxidantes mais utilizados.
Espécie Potencial de Oxidação (V)
Flúor 3,03 Radical Hidroxila 2,80 Oxigênio elementar 2,42 Ozônio 2,07 Peroxido de Hidrogênio 1,77 Radical peróxido 1,70 Íon Permanganato 1,67 Ácido hipobromoso 1,59 Dióxido de cloro 1,57 Ácido hipocloroso 1,49 Cloro 1,36 Oxigênio molecular 1,23 Bromo 1,09 Iodo 0,54
Fonte: Adaptado de NOGUEIRA e GUIMARÃES (1998).
3.3 Catalisadores Metaloporfirínicos
Nas últimas décadas, muitos complexos de metais de transição têm sido sintetizados para imitar os catalisadores naturais de oxidação, ou seja, as enzimas do citocromo P450 (CHEN et al., 2013). As enzimas da família do citocromo P450 são naturalmente utilizadas pelos organismos vivos para catalisar oxidações seletivas de substratos orgânicos durante a evolução da vida. Essas enzimas possuem o potencial de ativar o oxigênio molecular por complexação no centro metálico (sítio ativo), ferro (III)-protoporfirina IX (Figura 3), que essas enzimas contêm, propiciando a catálise e seletividade aos processos de oxidação dos substratos orgânicos, uma vez que o oxigênio molecular naturalmente reage de forma lenta e com baixa seletividade com a maioria dos substratos orgânicos. O citocromo P450 possui, portanto, papel fundamental no metabolismo de drogas e xenobióticos como os herbicidas triazínicos (MANSUY, 2007).
Figura 3 - Ferro (III)-protoporfirina IX. Fonte: Vinhado (2005).
Fonte: Adaptado de SIGMA ALDRICH (2014).
A ferro (III)-protoporfirina IX é reduzida à ferro (II) para a complexação do oxigênio molecular no sítio ativo. A adição de elétron e dois íons H+ promovem a monooxigenação do oxigênio molecular coordenado ao ferro (II), em seguida o átomo de oxigênio coordenado ao ferro (II) é transferido ao substrato orgânico alterando a estrutura molecular e produzindo os metabólitos. As metaloporfirinas têm o potencial de catalisar a transferência seletiva do átomo de oxigênio ao substrato orgânico (SANTOS, 2011). A metaloporfirina de ferro – Fe (FTTPCl) possui massa molar de 1063,83 g mol-1 e a rutênio – Ru (OCTTPP) 661,84 g moL-1, e as mesmas podem ser visualizadas nas Figuras 4 e 5.
Figura 4 - Estrutura da metaloporfirina de rutênio (C37H44N4ORu).
Figura 5 - Estrutura da metaloporfirina de ferro(C44H18ClF20FeN4).
Fonte: Adaptado de SIGMA ALDRICH (2014).
A via de ativação desejada das metaloporfirinas sintéticas é o modo heterocíclico que conduz a geração de um complexo porfirínico metal-oxo de alta valência e uma molécula de água através da heterólise (quebra de uma ligação química de um composto no qual se formam íons de cargas opostas – via B, Figura 5) (MEUNIER, 1992, apud TAGLIAFERRO, 2015).
As duas vias indesejáveis são a clivagem homolítica (ruptura da ligação entre átomos de uma molécula, formando radicais livres) de H2O2 (via A, Figura 6), ou a reação de uma segunda molécula de H2O2 com o complexo metal-oxo para produzir oxigênio molecular e água (percurso da catálise – via C, Figura 6) (MEUNIER, 1992, apud TAGLIAFERRO, 2015).
Figura 6 - Diferentes vias reacionais possíveis na ativação de metaloporfirinas por H202: (A)
= via homolítica com geração de HO•, (B) = via heterolítica com a geração de uma espécie de metal-oxo, e (C) = adição de uma segunda molécula de H2O2 para produzir o oxigênio molecular e água
(reação de catalase).
3.4 Cromatografia Gasosa
Na cromatografia gasosa, a amostra é injetada na coluna cromatográfica contendo a fase estacionária; a temperatura programada no injetor permite a vaporização das substâncias contidas na amostra, cujo arraste pela coluna é realizado pela fase móvel. Essas substâncias interagem com a fase estacionária, saindo da coluna em tempos diferentes e passando pelo detector com geração de um sinal elétrico proporcional à quantidade de material eluido (COLLINS et al., 2006).
3.4.1 Desenvolvimento de Métodos Cromatográficos
O procedimento de validação é uma última etapa de um processo bem organizado, planejado e sistematicamente executado anteriormente, que inclui a adequação do laboratório, o desenvolvimento do método e estudos de pré-validação. O planejamento e a otimização do método não devem ser confundidos com a etapa de validação, na qual todos os parâmetros já devem estar otimizados e a probabilidade de ocorrência de desvios deve ser mínima (MORAIS, 2009, apud TAGLIAFERRO, 2015).
3.4.2 Validação de Métodos Cromatográficos
A validação de um método cromatográfico é feita para assegurar que uma metodologia analítica é exata, específica, reprodutível e robusta em uma faixa específica na qual o analito será analisado. Segundo a EURACHEM (2010), a validação está frequentemente associada ao desenvolvimento de um método, pois muitos parâmetros de desempenho do método relacionados à validação do método podem ser avaliados durante o seu desenvolvimento. Entretanto, os dois processos devem ser completamente separados (MORAIS, 2009).
Os procedimentos de validação de métodos analíticos são fundamentados em atender as diretrizes da ABNT ISO 17025:2005 e da EURACHEM (2010), as quais estabelecem requisitos gerenciais e técnicos para implementação de sistemas de gestão de qualidade em laboratórios de análises.
3.4.3 Figuras de Mérito
Os parâmetros de desempenho analítico geralmente utilizados para validação de métodos de separação, como os métodos cromatográficos, são, de acordo com Ribani et al. (2004) e Morais (2009): seletividade, especificidade, limite de detecção, limite de
quantificação praticável e de amostra, linearidade e curva analítica, exatidão, precisão e recuperação.
A seletividade advém de seleção, ato ou efeito de selecionar escolha criteriosa e fundamentada. É a habilidade de um método em quantificar o analito sem equívocos na presença de componentes que podem estar presentes como impurezas, produtos de degradação e excipientes. Um método específico deve medir somente o composto desejado, sem a interferência de outros compostos, sendo que uma separação não é necessariamente requerida.
O limite de detecção é a menor concentração de uma substância que pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada, pelo método utilizado. O limite de detecção pode ser obtido pela equação: LD = 3 σ/S, onde σ é o erro padrão da curva de calibração e S é coeficiente angular da curva de calibração. A determinação do LD também pode ser realizada pela relação sinal/ruído, define-se o LD como sendo 3 vezes o valor da razão do sinal/ruído do equipamento (MAPA, 2014).
Limite de quantificação praticável é a menor concentração de uma substância que pode ser determinada quantitativamente com precisão e exatidão, pelo método utilizado. O limite de quantificação, é considerado como sendo a propriedade do método de mensurar quantitativamente a menor concentração do analito na amostra (FDA, 2011). Essa determinação é calculada por meio de dados da curva de calibração utilizando a equação: LQ = 10 σ/S, onde σ é o erro padrão da curva de calibração e S é o coeficiente angular da curva de calibração. A determinação do limite de quantificação também é realizada com base na relação sinal/ruído do equipamento, nesse caso o LQ é definido por um sinal dez vezes superior ao ruído da análise (FDA, 2011; MAPA, 2011). Outra forma de determinar o LQ é pelo último nível da curva de calibração. Esses valores não devem exceder menos que 5% em relação ao sinal do branco e apresentar coeficiente de variação menor que 20% (FDA, 2011).
A linearidade e curva analítica é a habilidade de um método analítico em produzir resultados que sejam diretamente proporcionais a concentração do analito em amostras, em uma dada faixa de concentração, determinada de faixa linear de trabalho ou intervalo de linearidade. Matematicamente, a estimativa dos coeficientes de uma curva analítica a partir de um conjunto de medições experimentais pode ser efetuada usando o método matemático conhecido como regressão linear. A ANVISA recomenda um coeficiente de determinação igual a 0,99 e o INMETRO um valor acima de 0,90 (MORAIS, 2009).
Os erros de uma amostra são determinados pelos parâmetros exatidão e precisão. A exatidão é o grau de concordância entre uma medida (expressa como um valor médio resultante de uma série de medidas) e o valor esperado. A exatidão do método pode ser avaliada através de estudos de porcentagem de recuperação do analito em amostras fortificadas com concentrações conhecidas.
A precisão descreve o grau de concordância entre medidas independentes obtidas por meio de um procedimento analítico na análise de uma mesma amostra, amostras semelhantes ou padrões, em condições definidas. A precisão está relacionada ao desvio aleatório e mede a dispersão ou espalhamento dos valores ao redor da média e é expressa como estimativa do desvio padrão relativo ou Coeficiente de Variação.
A repetibilidade refere-se a precisão avaliada sobre a mesma amostra (ou amostras semelhantes), utilizando o mesmo método, no mesmo laboratório ou em laboratórios diferentes, mas definindo exatamente quais as condições que irão variar (uma ou mais): analista, equipamento ou tempos diferentes (MORAIS, 2009).
O estudo da robustez de um procedimento analítico tem o objetivo de avaliar a capacidade do método de se manter preciso e exato mediante pequenas variações durante o procedimento analítico (MAPA, 2011). Para isso, são identificados pelo menos três parâmetros críticos no procedimento de análise e, empregar variações controladas nesses parâmetros de modo a definir o quão robusto é o método analítico. Usualmente, definem-se variações dos parâmetros analíticos e os resultados são submetidos à análidefinem-se estatística pelo teste Fisher (ICH, 1996; MAPA, 2011).
3.5 Espectrometria de Massas (MS)
A espectrometria de massas é uma técnica instrumental para identificar e quantificar compostos pela determinação direta da massa molecular. Quando o espectrômetro de massas está acoplado em um sistema cromatográfico possui elevada capacidade quantitativa. Por sua vez, na ausência de um cromatógrafo, apresenta apenas capacidade de identificação qualitativa (HOFFMAN e STROOBANT, 2007). Dentro do espectrômetro, os compostos são ionizados e separados por meio de um campo eletromagnético, de acordo com sua relação massa/carga (m/z), provocando excitação do detector e formação de um espectro (SILVERSTEIN, WEBSTER e KIEMLE, 2005; HOFFMAN e STROOBANT, 2007).
A grande vantagem da utilização do acoplamento da Espectrometria de Massas (MS) com a Cromatografia Gasosa (GC), reside na sua capacidade em responder à maioria dos compostos orgânicos voláteis e semi-voláteis. Quando operada no modo de varredura contínuo (full-scan) permite a identificação de compostos em amostras desconhecidas com recurso de bibliotecas espectrais de referência (por exemplo, NIST Mass Spectral Library (NIST, 2016)). Quando o objetivo reside na quantificação do composto alvo, o modo monitoramento seletivo de íon (em inglês “selected ion monitoring (SIM)), permite elevada sensibilidade e seletividade, tornando-se uma ferramenta analítica muito poderosa (THERMO XcaliburTM, 2015).
Em termos de análises quantitativas, a espectrometria de massas é uma das ferramentas mais versáteis e robustas, principalmente na conformação tandem (i.e. analisadores de massas em sequência) (GENTILLI, 2005; HAN et al., 2015). Nessa configuração é gerado um íon típico do analito, denominado íon precursor, o qual é fragmentado, em íons com relação massa/carga (m/z) menores denominados íons fragmentos, para então, confirmar a molécula e quantificá-la (SKOOG et al., 2006).
É possível separar substâncias que apresentem a mesma massa molar nominal e diferenciá-las em mais de um analito (THURMAN et al., 2013). Esse tipo de análise ocorre devido ao tipo de analisador de massas que o espectrômetro possui e ao seu princípio de funcionamento (SKOOG et al., 2006; HOFFMAN e STROOBANT, 2007).
Todo espectrômetro de massa é composto por fonte de ionização e câmara de ionização das amostras; Analisadores de massa individual ou em sequência (tandem); Cela de colisão (apenas no tandem), local no qual ocorre a fragmentação dos íons através de sua colisão com gases inertes (Ar, He ou N2); Detector e amplificador de sinal, local onde os íons e seus fragmentos são detectados e seus sinais são amplificados para a formação dos espectros (SKOOG et al., 2006; HOFFMAN e STROOBANT, 2007).
Nesta técnica GC-MS, o material examinado é vaporizado em alto vácuo e bombardeado por um feixe de elétrons de alta energia. Muitas moléculas do vapor sofrem fragmentações e formam íons de tamanhos diferentes. Estes íons podem ser identificados mediante a aceleração num campo elétrico, seguida pela deflexão num campo magnético, onde percorre trajetórias determinadas pela razão entre a massa e a carga (m/z), atingindo o equipamento de detecção e registro (VOGEL, 2002).
A técnica da espectrometria de massas tandem é uma técnica universal e específica que permite a redução do efeito de matriz pela exclusão dos íons filhos do analito sob estudo (THERMO SCIENTIFIC, 2012).
As vantagens do emprego desta técnica GC-MS tandem são:
➢ Os íons são produzidos no “trap” e simultaneamente presos dentro dele; ➢ O detector “ion trap” possibilita a obtenção de ambos espectros de massa e espectro de massa-massa usando a técnica frequentemente chamada de tandem-in-time.
3.6 ANALISADOR DE MASSAS “ION TRAP” (ITMS)
A sequência de operação do analisador de massas "ion trap" (ITMS) se inicia com a injeção de um pulso de elétrons dentro do “ion trap” para ionizar a amostra gasosa (Figura 7) (CHIARADIA et al., 2008). Um parâmetro chave na operação do “íon trap” é a pressão de gás de fundo, pois a colisão dos íons com um banho de gás amortece a trajetória do gás em direção ao centro do “ion trap”, provendo melhor resolução e sensibilidade (BUSCH et al., 1988).
Figura 7 - Esquema de um analisador “ion-trap”.
Fonte: CHIARADIA et al., 2008.
3.7 Software X-Calibur™
X-Calibur™ (THERMO X-Calibur™, 2015) é um software de controle e de processamento de dados, utilizado em equipamentos Thermo Scientific™ LC-MS e GC-MS. Baseados em plataforma Windows™, o software X-Calibur™ fornece configuração de métodos, aquisição de dados, processamento de dados e geração de relatórios. Ele oferece
total segurança e monitoramento, o software X-Calibur™ permite a integração com uma vasta gama de outros softwares.
Tópicos abordados no software pelo fabricante: ➢ Visão geral do setup do software;
➢ Preparação para aquisição de amostras com configuração do equipamento; ➢ Inicialização dos instrumentos e criação de sequências automáticas e manuais; ➢ Aquisição de dados utilizando como, por exemplo, uma amostra injetada de uma reação de degradação catalítica de herbicidas triazínicos;
➢ Inicialização dos parâmetros “defaults” para processar as amostras; ➢ Processamento dos dados em lote;
➢ Exportação e importação de sequências de dados;
➢ Tutorial de entrada de dados, de criação de métodos, de processamento de dados gerados, de manipulação e resultados, de preview e impressão dos resultados;
➢ Tutorial de configuração, “setups” e administração dos módulos de programação; ➢ Tutorial de utilização, gerenciamento e buscas na biblioteca do NIST;
Na Figura 8 são representadas as opções que estão disponíveis ao ser acessado o software X-Calibur™(THERMO X-Calibur, 2015) ou seja, configurações: do setup dos instrumentos (Instrument Setup); do setup das sequências (Sequence Setup); setup do processamento (Processing Setup); Browser de qualificação (Qual Browser), Browser de quantificação (Quan Browser) e Browser das bibliotecas (Library Browser).
Figura 8 - Tela de entrada do Software X-Calibur™.
Na Figura 9-a é apresentado uma visualização de uma análise por GC-MS, onde tem-se um cromatograma obtido pelo Qual Browtem-ser, tem-sendo que clicando-tem-se no pico de interestem-se, é obtido o espectro de massa (Figura 9-b). Após isto, deve-se habilitar o marcador da Figura 9-b e com o botão direito do mouse, dar um LIBRARY>SEARCH (Figura 10) para pesquisar na biblioteca NIST (2016) qual o composto que corresponde a aquele íon.
Figura 9 - Tela inicial do Qual Browser Software X-Calibur™. (a) Cromatograma e (b) Espectro
de massa.
(a)
Figura 10 - Tela inicial do resultado da pesquisa na biblioteca NIST com o do
LIBRARY>SEARCH na opção do Qual Browser software X-Calibur™. (a) Lista de picos com os nomes atribuídos e as respectivas probabilidades. (b) Identificação do pico selecionado, com o nome da fórmula estrutural, a fórmula molecular, e o CAS number. (c) Tem-se o respectivo espectro de massa do pico selecionado e o da biblioteca NIST. (d) Tem-se a diferença dos espectros do pico selecionado com o da biblioteca NIST.
(b) (a)
3.8 Software MetAlignTM
O software MetAlignTM foi desenvolvido por LOMMEN et al. (2012) para reprocessamento, comparação e verificação completa de massa nominal ou exata dos dados gerados por Cromatografia Acoplada à Espectrometria de Massas: Gasosa (GC-MS) ou Líquida (LC-MS). Este software tem sido usado com sucesso em muitos estudos de metabolômica (LOMMEM e KOOLS, 2011; BALLESTER et al., 2010).
A essência do software MetAlignTM (LOMMEM, 2009) é poder trabalhar com uma grande quantidade de dados e simplificar os elementos essenciais em um formato apresentável para posterior análise, sendo uma ferramenta poderosa para o pós-processamento de dados obtidos pelo software X-CaliburTM (Thermo Scientific, 2015) tanto para GC-MS, quanto para LC-MS. O reprocessamento consiste na conversão de formato automaticamente, na precisão dos cálculos de massa, nas correções da linha de base e do Sinal/Ruído dos picos, bem como o alinhamento de até 1000 conjuntos de dados. O software MetAlignTM pode ser obtido gratuitamente (“free download”), sendo facilmente instalado em um computador padrão em execução no Windows, permitindo que sejam trabalhados dados gerados por um software comercial (X-CaliburTM).
A versão atual do MetAlignTM (disponível para um download gratuito em www.metalign.nl) permite que o programa use todos os processadores e núcleos disponíveis de forma eficiente. O software MetAlignTM demonstra processamento como se estivesse sendo executado em vários computadores de um núcleo único, ao mesmo tempo, mas dentro de um sistema de hardware.
Os tópicos abordados no software MetAlignTM pelo fabricante são:
➢ Instalação de administrador de sistemas do MetAlignTM para o Sistema Operacional Windows;
➢ Instalação de administrador de sistemas do MetAlignTM para Sistema Operacional Linux;
➢ Manual operacional do MetAlignTM;
➢ Delineamento experimental e verificações dos dados;
➢ Como melhorar a visualização e a separação dos picos nos cromatogramas; ➢ Como converter os dados gerados pelo X-Calibur™.
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Equipamentos, Vidrarias e Reagentes
➢ Simazina, AccuStandard Lote 120400AG-AC, validade 28/07/2015; ➢ Atrazina, AccuStandard Lote 5378, validade 28/07/2015;
➢ DIA (Atrazina Desisopropil) AccuStandard Lote 012308AG, validade 23/01/2018;
➢ DEA (Atrazina Desetil) AccuStandard Lote 031108AG-AC, validade 25/03/2018;
➢ DDA (Atrazina Desetil-Desisopropil) AccuStandard Lote 21120, validade 17/12/2013;
➢ Acetonitrila grau HPLC, J.T.Baker Lote K02C52;
➢ Porfirina de Ferro: ferro tretakispentafluorofenilprofirina – Fe (FTTPCl): 5, 10, 15, 20 –tetrakis(pentafluorofenil)-21H, 23H-Porfirina de Cloreto de Ferro (III) Sigma Aldrich; ➢ Porfirina de Rutênio: Rutêniooctaetilprofirina–Ru (OCTTPP): 2, 3, 7, 8, 12, 13, 17, 18-octaetil-21H, 23H-Porfirina de Rutênio (II)Carbonil Sigma Aldrich;
➢ Peróxido de Hidrogênio 30% Merck;
➢ Balança analítica Shimadzu AUW220D, Máx. 220g/82g Mín. 1mg;
➢ Espectrofotômetro UV-Vis GBC Cintra 6 com comprimento de onda de varredura variando de 190 a 800 nm;
➢ Cromatógrafo a gás GC-TRACE Thermo Finningan equipado com detector MS/MS, com coluna capilar TR-M5S (com fase 5% de fenil e 95% de polisilfenileno) com 30 metros de comprimento, 0,25 mm de diâmetro interno e espessura da fase estacionária de 0,25 µm;
➢ Micro-reator com frasco de vidro âmbar de capacidade de 25 mL, com tampa, sob agitação magnética em temperatura ambiente;
➢ Pipetadores de 1000 μL e 10000 μL da Eppendorf; ➢ Cubetas de Quartzo de 10 mm;
➢ Seringa de 10 mL;
➢ Agitador de tubos vortex;
4.2 Procedimento Analítico para a obtenção dos dados via GC-MS
O desenvolvimento do procedimento analítico para a obtenção dos dados via CG-MS foi desenvolvido anteriormente por TAGLIAFERRO (2015), neste trabalho foi utilizado a mesma programação de rampa de temperatura e demais condições que foram adequadas ao GC-MS (“ion-trap”, THERMO). A validação dos métodos cromatográficos também foi realizada no trabalho prévio de TAGLIAFERRO (2015), através da análise dos padrões em triplicata com tratamento estatístico dos dados obtidos.
As análises foram realizadas em 3 etapas: a preparação dos padrões, as reações monitoradas por espectrofotometria UV-Vis e as reações monitoradas via GC-MS (TAGLIAFERRO, 2015), durante o presente trabalho, houve a realização de algumas reações de oxidação catalítica dos herbicidas atrazina e simazina, buscando-se o aprendizado das metodologias e da obtenção dos dados via GC-MS com o software X-CaliburTM, que foram utilizados no
pós-processamento com o software MetAlignTM.
4.2.1 Preparo das soluções padrões e das metaloporfirinas
O trabalho desta etapa teve como base o trabalho anterior de TAGLIAFERRO (2015), para o preparo da solução das metaloporfirinas com concentração de 100 mg L-1, pesou-se, em balança analítica, 1 mg da metaloporfirina de ferro em um frasco de 40 mL e acrescentou-se, com o auxílio de um pipetador Eppendorf, 10 mL de acetonitrila HPLC. Agitou-se o frasco com tampa, utilizando-se um agitador de tubos vortex, para homogeneizar a solução. O mesmo procedimento foi utilizado no preparo da solução da metaloporfirina de rutênio. As soluções das metaloporfirinas foram mantidas protegidas da fotodegradação (frasco âmbar protegido com papel alumínio) sob refrigeração.
Para o preparo da solução estoque dos analitos de interesse com concentração de 100 mg L-1, pesou-se, em balança analítica, 1 mg do analito (ATZ, SIM, DEA ou DIA) em um frasco com tampa de 40 mL e acrescentou-se, com o auxílio de um pipetador Eppendorf, 10 mL de acetonitrila HPLC. Agitou-se o frasco com tampa, utilizando-se um agitador de tubos vortex, para homogeneizar a solução. A partir da solução estoque dos analitos com concentração de 100 mg L-1, preparou-se as soluções de trabalho com concentrações de 0,100 – 0,250 – 0,500 – 0,750 – 1,000 – 1,250 – 1,500 – 1,750 – 2,000 – 2,500 – 5,000 – 10,000 – 15,000 – 20,000 e 25,000 mg L-1 através do cálculo das diluições pela equação Cestoque x Vestoque = Cdiluida x Vdiluida.
Para o preparo da solução de peróxido de hidrogênio 1:10, em um frasco contendo 9 mL de acetonitrila HPLC, foi adicionado 1 mL de peróxido de hidrogênio comercial. Agitou-se o frasco, utilizando-Agitou-se um agitador de tubos vortex, para homogeneizar a solução. Todas as soluções preparadas foram mantidas sobre refrigeração, para preservação.
4.2.2 Procedimento de degradação dos herbicidas triazínicos
O trabalho desta etapa também teve como base o trabalho anterior de TAGLIAFERRO (2015), após o preparo das soluções de trabalho dos analitos, do peróxido e das metaloporfirinas, as reações foram conduzidas através do seguinte procedimento:
➢ Adicionou-se 3 mL da solução do analito (ATZ, SIM ou solução equimolar ATZ+SIM) na concentração de estudo (neste trabalho foi 5 mg L-1) em um frasco âmbar de 20 mL;
➢ Ao frasco adicionou-se uma barra de agitação, e o mesmo foi colocado sobre um agitador magnético, montando desta forma o esquema do reator (Figura 11);
➢ Adicionou-se, com o auxílio de uma micropipeta, 100 µL da metaloporfirina (MetFe ou MetRu) e manteve-se o frasco sobre agitação;
➢ Ao frasco, adicionou-se, com o auxílio de uma micropipeta, 100 µL do peróxido de hidrogênio e o mesmo foi mantido sobre agitação. A cada 10 minutos de reação, adicionou-se 100 µL do peróxido de hidrogênio, totalizando uma adição final de 800 µL de peróxido de hidrogênio em 80 minutos de reação.
Figura 11 - Esquema do reator, que consiste em um frasco âmbar com tampa, utilizado no
4.2.3 Análises via espectrofotometria UV-Vis
O trabalho desta etapa também teve como base o trabalho anterior de TAGLIAFERRO, 2015, as análises de oxidação dos analitos (ATZ, SIM) foram monitoradas a cada 10 minutos de reação através da leitura das amostras, com o auxílio de uma seringa de vidro de 5 mL para transferência de 2,8 mL do analito em reação para a cubeta de quartzo de 10 mm do UV-Vis e posterior devolução de seu volume ao frasco reacional.
Através do monitoramento das reações de degradação via UV-Vis foi observado o comportamento das metaloporfirinas no meio oxidante com peróxido de hidrogênio e a degradação dos compostos de interesse, assim como foi feito a comparação dos dados obtidos entre as metaloporfirinas de ferro e rutênio. Os dados referentes à programação do espectrofotômetro GBC CINTRA UV-Vis para a obtenção das leituras de absorbância podem ser visualizados na Tabela 3.
Tabela 3 - Dados referentes à programação do espectrofotômetro GBC CINTRA UV-Vis para a obtenção das leituras da absorbância.
Dados da programação do UV-Vis
Comprimento de Onda () 220 nm Upper 800 nm Lower 200 nm Speed 1000 nm/min. Step Size 0,427 nm Slit Width 1,5 nm 4.2.4 Análises via GC-MS
O trabalho desta etapa também foi baseado no trabalho anterior de TAGLIAFERRO, 2015. Para confirmar o tempo de retenção (tr) de cada analito, os mesmos foram injetados isoladamente no GC-MS na concentração de 2,00 mg L-1 , além de outras concentrações em faixa inferior a esta concentração, com posterior confirmação dos analitos, através da comparação do cromatograma obtido, clicando-se no pico para a obtenção do espectro de massa e a posterior comparação com o espectro da biblioteca NIST. Após a determinação do tr de cada analito, injetou-se os padrões dos analitos em triplicata para obtenção das curvas analíticas.
As análises de oxidação dos analitos (ATZ e SIM) foram injetadas a cada 20 minutos de reação com a ajuda do amostrador automático TriPlus do equipamento. Os dados referentes à temperatura das condições de análise, condições do MS, condições do GC e rampa de programação podem ser visualizados nas Tabelas 4 e 5, respectivamente, conforme o trabalho anterior de TAGLIAFERRO, 2015.
Tabela 4- Condições de temperatura de análise no detector MS.
Item Temperatura (ºC)
Íon Source 250
Right PTV 280
MS Transferline 250
Tabela 5 - Condições no detector MS.
Modo Full Scan
Inicio do Scan 2,50 min
Faixa de Massa 50 – 650
Tempo total Scan (sec) 0,58
Íons Positivo
Microscans 3
Tempo máximo de ionização
(ms) 25
4.3 Condições Cromatográficas
Para monitorar adequadamente os analitos de interesse durante as reações de oxidação, foi utilizada a técnica GC-MS, conforme as condições do trabalho anterior de TAGLIAFERRO, 2015. Ressaltando-se que o registro do sinal obtido sinal do detector em função do tempo é o cromatograma, sendo que as substâncias aparecem neste cromatograma como picos, com área proporcional à sua massa, possibilitando a análise quantitativa. A cromatografia gasosa tem um elevado poder de resolução e baixos limites de detecção, o que requer pequenas quantidades da amostra, podendo gerar resultados da ordem de picogramas a miligramas (COLLINS et al., 2006).
Dados das condições de análise do GC-MS, THERMO ion trap (ITQ 900) : - Fluxo da Coluna → 1,0 mL/min (Hélio),
- Modo do Fluxo → Fluxo constante.
Na Tabela 6 é apresentado a rampa de programação de temperatura no GC-MS. Tabela 6 - Rampa de programação no GC-MS.
Etapa Taxa de Aquecimento
(ºC/min) Temperatura (ºC) Tempo de Espera (min.)
Inicial 90 --- 0,5
Rampa 1 160 25 0,5
Rampa 2 180 3 0,5
Final 200 5 3
4.4 Fluxograma do algoritmo do reprocessamento das análises feitas no X-Calibur™ pelo software MetAlignTM.
Na Figura 12 tem-se o fluxograma que representa uma forma macro do processo de reprocessamento utilizado neste trabalho, dos dados gerados no software X-CaliburTM, utilizando-se o software MetAlignTM. Nota-se que os dados gerados após o reprocessamento pelo software MetAlignTM possuem Relação Sinal/Ruído melhorada.
Figura 12 - Fluxograma representativo do algoritmo do reprocessamento das análises feitas
no software X-Calibur™ pelo Software MetAlignTM.
Para o desenvolvimento do presente trabalho, foi feito o download do software MetAlignTM (download gratuito em www.metalign.nl). É importante ressaltar que para que sejam possíveis a instalação e utilização do software MetAlignTM, o usuário tem que ter acesso como administrador do computador. Foram necessários alguns testes para que a configuração dos parâmetros necessários para o software MetAlignTM fosse bem-sucedidas. Foram criados dois tutoriais, um de instalação e o outro de configuração e disponibilizados no computador do Laboratório LACAN-FT-UNICAMP.
Gráfico comparativo entre os dados gerados pelo software X-Calibur™ e os novos dados gerados reprocessamento pelo Software MetAlign™ Análise de amostras no software X-Calibur™ Armazenamento das análises software X-Calibur™ Reprocessamento das análises armazenada pelo
Software MetAlign
Novos dados gerados com diminuição de ruído e melhor visualização, totalmente compatíveis com o software X-Calibur™
Subgrupos de produtos melhor visualizados Relação Sinal/Ruído melhor Visualizada
Na Figura 13 é apresentada a tela de entrada do software MetAlignTM.
Figura 13 - Tela de entrada do Software MetAlign™.
Foi feita uma configuração de sincronização do software MetAlignTM com o software X-Calibur™ para que os dados gerados no X-Calibur™ pudessem ser utilizados pelo software MetAlignTM.
5RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Resultados obtidos com Espectros de absorção UV-Vis para o caracterização dos compostos triazínicos e das reações de oxidação catalíticas dos herbicidas triazínicos.
O espectro de absorção UV-Vis da metaloporfirina de rutênio possui 3 bandas que a caracterizam, nos comprimentos de onda 392, 515 e 548 nm (Figura 14).
Com a adição do peróxido de hidrogênio ao meio reacional, pode-se observar a redução da absorbância das bandas da metaloporfirina de rutênio nos espectros de absorção UV-Vis (Figura 15). Este mesmo comportamento de diminuição das absorbâncias das bandas também ocorreram nos espectro de absorção UV-Vis da metaloporfirina de ferro, sendo que as intensidades das bandas se aproximaram da linha de base ao final das reações, evidenciando que ocorreram as degradações de ambas metaloporfirinas de rutênio e de ferrro, devido às fortes condições oxidantes das reações com os analitos de interesse atrazina (ATZ) e simazina (SIM).
Figura 14 – Espectro de absorção UV-Vis da metaloporfirina de Rutênio 100g L-1.
392
515 548
Figura 15 – Sobreposição dos espectros de absorção UV-Vis das reações de degradação
de Atrazina 5 mg L-1 com a Metaloporfirina de rutênio (100gL-1) e peróxido de hidrogênio 1:10
