UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Faculdade de Engenharia de Alimentos
ANGELA DEL PILAR FLORES GRANADOS
EFEITO DA IRRADIAÇÃO GAMA SOBRE A INIBIÇÃO DE FUNGOS E Salmonella spp. E SOBRE AS CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS DO CACAU
CAMPINAS 2016
EFEITO DA IRRADIAÇÃO GAMA SOBRE A INIBIÇÃO DE FUNGOS E Salmonella spp. E SOBRE AS CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS DO CACAU
Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciência de Alimentos.
ORIENTADORA: MARTA CRISTINA TEIXEIRA DUARTE COORIENTADORA: PRISCILLA EFRAIM
CAMPINAS 2016 ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA ANGELA DEL PILAR FLORES GRANADOS E ORIENTADA PELA
PROFA. DRA. MARTA CRISTINA
Profa. Dra. Marta Cristina Teixeira Duarte (Orientadora) Universidade Estadual de Campinas – Titular
Prof. Dr. Flávio Luís Schmidt Universidade Estadual de Campinas – Titular
Dra. Fabiana Fantinatti-Garboggini Universidade Estadual de Campinas – Titular
Profa. Dra. Gabriela Alves Macedo Universidade Estadual de Campinas – Suplente
Dra. Glyn Mara Figueira
Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas - Suplente
Á Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
À minha avó Georgina (In memoriam) por ter sido para mim exemplo de luta, coragem e amor. À minha querida mãe Diosy pelo amor, incentivo e dedicação incansável.
Às minhas irmãs Melissa e Araceli, pelo apoio, compreensão e carinho incondicional. À meu sobrinho Juan Pablo, por ser minha motivação e orgulho.
À Deus, pela oportunidade de conquistar um sonho.
À minha orientadora, Profa. Dra Marta Cristina Teixeira Duarte, pela confiança, apoio, preocupação, amizade e pelos ensinamentos.
À minha co-orientadora, Profa. Dra. Priscilla Efraim, pelo apoio e valiosa orientação.
À empresa CBE pelo auxílio durante a irradiação das amostras. Especialmente a Dra. Gilmara de Luca pela disponibilidade e contribuições na pesquisa.
À Divisão de Microbiologia do CPQBA e toda equipe que me auxiliaram na realização deste trabalho, especialmente a Camila, Marcio, Valeria, Flavia e Adriana.
À Divisão de Recursos Microbianos do CPQBA, pela ajuda na realização dos análises de PCR, especialmente a Dra. Fabiana Fantinatti-Garboggini pelos ensinamentos.
À Nataly Ruiz, pela disponibilidade e auxilio em toda parte experimental desta pesquisa. À meus queridos amigos Ruth, Frank, Myriam, Laura, Kenia, Denisse por cada abraço, conselho, amizade e por ter acreditado em mim até o final.
À todos meus amigos e colegas que foram parte desse projeto. Obrigada pela força.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio financeiro.
Durante o processamento primário, amêndoas de cacau passam por uma série de etapas de manipulação que possibilitam a contaminação por micro-organismos transmissores de doenças de origem alimentar, gerando risco à saúde dos consumidores. A irradiação gama por Cobalto-60 é uma forma eficaz de eliminar a carga bacteriana em alimentos. Assim, o objetivo deste estudo foi verificar os efeitos da irradiação gama sobre as características microbiológicas, no que diz respeito à presença de fungos e Salmonella spp., e sobre as propriedades físico-químicas de amostras de amêndoas de cacau. Amostras de cacau (N=31) foram tratadas com três doses de irradiação gama, ou seja, 2, 3 e 5 kGy, e analisadas quanto à porcentagem de contaminação fúngica por plaqueamento direto, enquanto a presença de Salmonella spp foi determinada pelo método de PCR. Os resultados mostraram uma diminuição significativa (p<0,05) na contaminação por fungos com o aumento da dose de irradiação, sendo que a aplicação de 5 kGy foi capaz de eliminar ao redor de 27 % da contaminação fúngica. Através da análise por PCR foi possível detectar 13 bactérias pertencentes ao gênero Salmonella, quando foram utilizados os primers espécie-específico Salm3 e Salm4. Entretanto a identificação dos 13 isolados foi feita por meio de sequenciamento do gene RNA ribosomal 16S e foram revelados 2 isolados da espécie Salmonella enterica, sete de Klebsiella pneumoniae, três de Enterobacter hormoechei e um de Bacillus simplex. Estes resultados foram obtidos a partir da amostra controle e amostras irradiadas com dose de 2 kGy, enquanto que a radiação de 3 e 5 kGy inibiram totalmente o crescimento das bactérias. A partir de 2 kGy houve inativação do crescimento de Salmonella. Com respeito às outras bactérias foi necessária uma dose de 3 kGy. Em relação às propriedades físicas, houve uma diminuição da quantidade total de amêndoas ardósias e amêndoas danificadas, assim como da presença de insetos com o aumento da irradiação. Não houve diferença significativa entre as propriedades químicas, como Aw, acidez titulável e umidade, porém a irradiação alterou o pH das amostras de amêndoas de cacau.
Palavras chave: Theobroma cacao, cacau, fungos, Salmonella spp., irradiação gama, PCR grupo específico, sequenciamento 16S.
During the primary processing, cocoa beans undergo a series of manipulation steps that enable the contamination by food-borne and pathogen microorganisms and create a risk to consumer health. Gamma irradiation by cobalt-60 is an effective way of eliminating the bacterial load in foods. The objective of this study was to investigate the effects of gamma irradiation on the microbiological characteristics, with regard to the presence of fungi and Salmonella spp., and on the physico-chemical properties of samples of cocoa beans. Cocoa samples (N = 31) were treated with three different doses of gamma irradiation, i.e. 2, 3 and 5 kGy, and analyzed for percentage of fungal contamination by direct plating, while the presence of Salmonella was determined by PCR method. The results showed a significant decrease (p <0.05) in fungal contamination with increasing irradiation dose. However, the application of irradiation at 5 kGy was able to control only around 27 % of fungal contamination. Through the PCR analysis was possible to detect 13 bacteria belonging to the genes Salmonella, when the species-specific with were the primers Salm3-Salm4. The identification of 13 isolates was performed by sequencing of the ribosomal RNA 16S were revealed and two isolates of Salmonella enterica, seven Klebsiella pneumoniae, three Enterobacter hormoechei and one Bacillus simplex. These results were obtained from the control sample and from that irradiated with a dose of 2 kGy, while the irradiation at 3 and 5 kGy completely inhibited the growth of bacteria. Salmonella growth was inactive from 2 kGy. With respect to other bacteria, a dose of 3 kGy was necessary. With respect to physical properties, there was a decrease in the total amount of damaged almond kernels and slates, as well as the presence of insects with increased irradiation. There was no significant difference between the chemical properties such as Aw, titratable acidity and humidity, however irradiation changed the pH of the samples of cocoa beans.
Palavras chave: Theobroma cacao, cocoa beans, fungi, Salmonella spp., gamma irradiation, PCR specific group, sequencing 16S.
Figura 1. Variedades de cacau... 16
Figura 2. Produção de cacau no Brasil – 2015... 17
Figura 3. Esquema geral do pré-processamento do cacau... 19
Figura 4. Quantidade e procedência das amêndoas de cacau... 31
Figura 5. Amostras de cacau irradiadas em bolsas de polietileno esterilizado, identificadas pela dose de irradiação e selos radiossensíveis... 32
Figura 6. Processamento da análise de PCR... 35
Figura 7. Distribuição das amêndoas de cacau nas placas... 37 Figura 8. Avaliação da qualidade da amêndoa de cacau... 38
Figura 9. Critério de avaliação da compartimentação do interior das amêndoas de cacau... 41 Figura 10. Número de colônias típicas de Salmonella selecionadas nos diferentes níveis de irradiação...
42 Figura 11. Eletroforese em gel de agarose segundo método PCR mostrando os produtos de
amplificação para os genes salm3 e salm4... 42 Figura 12. Número de amostras de amêndoas de cacau relacionadas com a infecção por
bactérias... 48 Figura 13. Porcentagem média da presença de fungos em função da dose de irradiação...
Tabela 1. Condições de amplificação no termociclador... 36 Tabela 2. Primers utilizados na amplificação e sequenciamento do gene RNA ribossomal 16S... 36 Tabela 3. Amêndoa de cacau – Tolerância de defeitos... 40
Tabela 4: Identificação do sequenciamento dos genes usando os programas Blast e RDP4... 43 Tabela 5. Análise de variância do efeito da irradiação gama sobre a presença de fungos em amêndoas de cacau... 46
Tabela 6. Efeito das diferentes doses de irradiação na porcentagem de fungos presentes em amêndoas de cacau. Médias de triplicata em cada dose de irradiação... 46 Tabela 7. Resultados da prova de corte das amêndoas de cacau controle e irradiadas... 50
Tabela 8. Resultados das determinações físico-químicas das amêndoas de cacau - controle e irradiadas... 51 Tabela 9. Análise de variância de pH em amêndoas de cacau irradiadas e controle... 51
2. REVISÃO DE LITERATURA ... 16
2.1. Cultura do cacau ... 16
2.2. Pré-processamento ... 17
2.3. Salmonella ... 20
2.3.1 Salmonella e cacau ... 21
2.3.2. Presença de Aspergillus e Aflatoxinas no cacau ... 23
2.4. Irradiação de alimentos ... 24
2.4.1. Irradiação ionizante ... 25
2.4.2. Tipos de radiação e legislação ... 26
2.4.3. Efeito da irradiação sobre o alimento e os micro-organismos... 27
3. OBJETIVOS ... 30
3.1. Objetivo geral ... 30
3.2. Objetivos específicos ... 30
4. MATERIAL E MÉTODOS ... 31
4.1. Matéria-prima ... 31
4.2. Irradiação das amêndoas de cacau ... 32
4.3. Preparo das amostras ... 32
4.4. Análises microbiológicas ... 33
4.4.1. Isolamento de Salmonella ... 33
4.4.2. Confirmação das colônias de Salmonella por método de PCR ... 34
4.4.2.1 Descrição das cepas ... 34
4.4.2.2 Sequenciamento e análise filogenética de gene RNA ribossomal 16S ... 34
4.5. Determinação da contaminação fúngica por plaqueamento direto ... 37
4.6. Análises físico-químicas ... 38
4.6.1.Prova de corte ... 38
4.6.2. Atividade de água (Aw) ... 39
4.6.3. Teor de umidade ... 39
4.6.4. pH ... 39
4.6.5. Acidez total titulável (ATT) ... 40
4.7. Análise dos resultados ... 40
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 40
5.1. Análises microbiológicas e efeito da irradiação gama sobre as amêndoas de cacau .... 40
5.1.1. Análise de Salmonella ... 40
5.1.2. Identificação de Salmonella pela técnica de PCR ... 41
5.3 Efeitos da irradiação gama sobre as propriedades físico-químicas de amêndoas de
cacau. ... 49
5.3.1. Efeitos sobre as propriedades físicas. ... 49
5.3.2 Efeitos sobre as propriedades químicas. ... 50
6. CONCLUSÕES ... 53
1. INTRODUÇÃO
Desde as civilizações pré-colombianas, o cacau é uma fruta valorizada, principalmente pelos produtos derivados obtidos, entre os quais, destaca-se o chocolate. O número de países interessados na produção de cacau é crescente, bem como os consumidores de chocolate (LIMA, 2012; ELKON, 2004).
De acordo com a International Cocoa Organization - ICCO (ICCO, 2013) aproximadamente 71 % da produção e oferta mundial de cacau vem de países da África Ocidental como Costa de Marfim, Gana e Nigéria. O segundo principal continente produtor é a América Latina, região de origem do cacau. O Brasil, como sexto produtor mundial de amêndoas de cacau, tem sua produção distribuída nas regiões Nordeste (Bahia), Sudeste (Espírito Santo), Centro – Oeste (Mato Grosso) e Norte (Pará, Rondônia e Amazonas).
Durante o processamento primário, os frutos são colhidos cuidadosamente e abertos com facas, sendo as sementes envoltas à polpa separadas e colocadas em recipientes para dar início a uma das etapas mais importantes no processamento do cacau: a fermentação (BECKETT, 2002; WOOD & LASS, 1985).
Diferentes micro-organismos contribuem no processo de fermentação espontânea, que começa quando o fruto é aberto através de ferramentas de corte. Neste momento, os micro-organismos presentes durante a manipulação do fruto vão contribuir com a ocorrência de uma série de reações bioquímicas que culminam com o desenvolvimento do sabor característico do chocolate. Porém, em especial ao término do processo fermentativo, quando as condições tornam-se mais favoráveis, pode ocorrer o crescimento de micro-organismos potencialmente patogênicos transmissores de doenças gerando um problema de segurança alimentar (NASCIMENTO et al., 2011; SCHWAN&WHEALS, 2004).
Após a fermentação, as amêndoas passam pela etapa de secagem, onde ocorre a redução da umidade para 7- 8 %. A secagem não deve ser lenta ou mal conduzida para evitar o desenvolvimento de fungos filamentosos, que proporcionam sabor desagradável ao produto final e podem causar hidrólise da celulose e produção de ácidos (EFRAIM, 2004; SCHWAN&WHEALS, 2004).
Alguns fungos podem produzir micotoxinas. No caso das amêndoas de cacau estudos demostram que são produzidas por espécies do gênero Aspergillus, Penicillium e Fusarium. Estudos recentes mostram a presença de ocratoxina A, considerada um problema de segurança alimentar (COPETTI, 2009, AMEZQUETA et al, 2005; MOUNJOUENPOU et al., 2008; SANCHEZ-HERVAS et al., 2008).
Estudos demostram que as etapas de secagem e armazenamento são consideradas etapas críticas, onde podem ser introduzidas enterobacterias como a Salmonella (NASCIMENTO et al., 2011). No entanto, as boas práticas de higiene reduzem o nível de contaminação, mas não são capazes de eliminar os agentes patogênicos mais importantes oriundos das explorações agrícolas, nem é possível eliminá-los através do processamento primário, particularmente em alimentos comercializados na forma bruta.
São conhecidos vários métodos de descontaminação em alimentos, mas o tratamento versátil entre eles é o tratamento por radiação ionizante. É um processo eficiente e seguro, especialmente na descontaminação do produto final (FARKAS, 1998).
A radiação é um método utilizado para o controle de micro-organismos em alimentos, em que, se empregada adequadamente, pode ser eficiente na redução de intoxicações alimentares e também na inativação de esporos de micro-organismos, incluindo bactérias, fungos e leveduras (JAY, 2005; MOREHOUSE, 2002). O tratamento de radiação em doses de 2 a 7 kGy pode eliminar potencialmente patógenos como a Salmonella spp. e Staphylococcus aureus, bem como Listeria monocytogenes ou Escherichia coli O157: H7 presentes em produtos alimentícios suspeitos, sem gerar alterações sensoriais perceptíveis no alimento, a depender das condições da irradiação utilizadas e do alimento (FARKAS, 1998). Por outro lado, existem pesquisas que consideram que a irradiação pode induzir certas alterações na composição química, no valor nutritivo e alterar o sabor dos alimentos. As mudanças dependerão da composição do alimento, do conteúdo de água, da dose de radiação e da temperatura e da presença ou ausência de oxigênio no processo (KILCAST, 1994).
Zamalloa (1994) explica que as características físico-químicas, como o teor de lipídeos, a umidade, a acidez total, a atividade de água e o pH são frequentemente utilizados como critérios ou parâmetros de avaliação do cacau, para obter chocolates de qualidade. Por
esta razão torna-se importante avaliar esses parâmetros no caso do tratamento de cacau por irradiação, visando verificar se houve modificação de suas características que podem levar a alterações na qualidade do produto final, neste caso do chocolate.
Entre 1977-1987 iniciou-se na Alemanha uma série de pesquisas visando controlar a infestação por insetos e fungos em amêndoas de cacau provenientes de Ghana, consequência do armazenamento nos navios durante o transporte. Uma alternativa foi o uso da radiação, verificando-se as doses para o controle da salubridade, e o efeito nos parâmetros da qualidade nas amêndoas de cacau (IAEA, 1988). Takyi & Amuh et al. (1979) também avaliaram esta técnica visando controlar micro-organismos contaminantes de amêndoas de cacau provenientes de Ghana. Os autores relataram que a irradiação gama com doses 0,10; 0,20; 0,50; 2,00 e 5,00 kGy não apresentaram diferenças significativas em relação a amostra não irradiada, com respeito aos teores e perfil de açúcares redutores, aminoácidos totais e gorduras totais, e verificaram ainda que não houve alteração na viscosidade e caraterísticas principais do chocolate.
Bonvehi et al. (2000) realizaram um estudo para melhorar a qualidade higiênica do cacau, usando irradiação para controle e eliminação de enterobaterias, fungos e leveduras. O subproduto da indústria utilizado foi a casca de cacau, que contém fibras dietéticas (57 %), proteínas (15 %), minerais (10,7 %), manteiga de cacau (2,3 %) e demais carboidratos (2,8%). As doses de irradiação usadas foram 5, 8 e 10 kGy. Os autores verificaram que uma dose de 5 kGy já foi suficiente para diminuir a contagem microbiana, não havendo alterações sensoriais do produto.
Neste contexto, o presente trabalho visa contribuir com informações complementares sobre a aplicação da técnica de radiação grama em amêndoas de cacau e sua influência nas características microbiológicas e físico químicas. Foram estudados os efeitos de 3 diferentes doses de irradiação (2,0, 3,0 e 5,0 kGy) sobre as principais Enterobactérias e os fungos presentes no cacau.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Cultura do cacau
O cacaueiro é caraterístico das Américas do Sul e Central, e pertence à espécie
Theobroma cacao L, família Malvaceae. Existem dois grupos importantes, o Criollo e o Forastero, além do híbrido Trinitário, já que possui características híbridas entre Criollo e Forastero (BECKETT, 2002; WOOD & LASS, 1985).
Os três grupos apresentam diferenças quanto ao formato, produtividade e susceptibilidade a doenças, e quanto ao sabor final do chocolate. O grupo Criollo apresenta frutos com sementes de cor branca, são mais suscetíveis a pragas e doenças, produzem cacau de sabor bastante aromático e considerado de alta qualidade. O grupo Forastero é considerado mais resistente a pragas e doenças, apresenta maior produtividade, porém, menor qualidade já que é geralmente menos aromático. Por outro lado, o grupo Trinitário apresenta características híbridas entre os dois outros grupos, como melhor qualidade que o grupo Forastero, maior resistência a pragas e doenças que o grupo Criollo. (BECKETT, 2002, WOOD & LASS, 1985). A Figura 1 ilustra os três grupos de cacau.
De acordo com a ICCO, os maiores produtores de cacau no mundo são a Costa do Marfim, que ocupa o primeiro lugar com 1.242 mil toneladas na safra 2009/10, seguida por Gana (632), Indonésia (550), Nigéria (240), Camarões (205) e Brasil (161), que ocupa o sexto lugar (ICCO, 2001; Leite et al. 2013). Entre os estados que se destacam na produção de cacau
Grupo Criollo Grupo Forastero Grupo Trinitario
Figura 1. Variedades de cacau.
no Brasil estão a Bahia (74,6 %), o Pará (19,2 %), Rondônia (2,2 %), o Espirito Santo (2,1 %), e Amazonas (0,7 %) (Grupo de coordenação de Estatísticas Agropecuárias-GCEA/IBGE, 2015). A Figura 2 mostra a produção de cacau no Brasil em 2015.
Figura 2. Produção de cacau no Brasil - 2015 FONTE:GCEA/IBGE, 2015
2.2. Pré-processamento
Após a colheita, os frutos devem ser quebrados para serem retiradas as sementes, que são geralmente colocadas em caixas de madeira, onde serão submetidas à fermentação natural durante três a oito dias. O período entre a quebra e o início da fermentação não deve ser superior a 24 horas para evitar reações químicas indesejáveis (EFRAIM, 2004; WOOD & LASS, 1985). A umidade nesta etapa é de aproximadamente 65 % (BECKETT, 2002).
A fermentação é uma etapa importante para obter amêndoas de qualidade, podendo refletir na qualidade dos produtos obtidos a partir do cacau. A etapa de fermentação e secagem das sementes de cacau é importante no processamento, porque ocorrem reações bioquímicas no interior dos cotilédones e é quando se formam os compostos precursores do sabor caraterístico do chocolate (EFRAIM, 2004; MINIFIE, 1989; BRANDEU, 1970). Os fatores de grande importância são a temperatura do ambiente e da massa em fermentação, o pH e a acidez total da polpa e dos cotilédones, a presença de oxigênio, controlada pelo revolvimento da massa e a microbiota presente (BECKETT, 2002).
De acordo com Schwan & Wheals (2004), as sementes no interior do fruto são estéreis e a contaminação ocorre quando este é aberto com facas, introduzindo uma variedade
BA H I A PA R Á RO N D O N I A ES P Í R I T U SA N T O AM A Z O N A S MA T O GR O S S O 74.60% 19.20% 2.20% 2.10% 0.70% 0.20%
de micro-organismos fermentadores, provenientes das mãos dos trabalhadores, do ambiente e dos cestos utilizados no transporte. As condições para o crescimento dos micro-organismos que se desenvolvem nesta etapa são propiciadas pela polpa mucilaginosa que envolve as sementes de cacau.
Os principais micro-organismos responsáveis pela fermentação identificados em cacau brasileiro proveniente da Bahia são leveduras dos gêneros Saccharomyces, Candida, Pichia, Kloeckera, Torulospora e Kluyveromyces, bactérias lácticas Lactobacillus ssp, Lactobacillus casei, L. plantarum, Leuconostoc mesenteroides e L. lactis e bactérias acéticas Acetobacter pasteurians, A. peroxydans, A. acetti e Gluconobacter oxydans. (SCHWAN, 1996).
Durante as primeiras horas da fermentação ocorre intensa proliferação de leveduras que utilizam os açúcares presentes e os transformam em etanol. Em paralelo, bactérias lácticas, também utilizam os açúcares ou ácido cítrico produzindo ácido láctico. No decorrer da fermentação, o etanol é oxidado a acético e dióxido de carbono, levando a uma queda na acidez inicial e elevação do pH (THOMPSOM et al, 2001; ARDHANA & FLEET, 2003). Na etapa de fermentação, também há presença de diferentes espécies de fungos filamentosos com intensa atividade de lises, e em quantidades significativas nas primeiras 24 a 36 h do processo (ARDHANA & FLEET, 2003). Após a fermentação, as amêndoas apresentam cor marrom, sabor e odor caraterístico de chocolate (BECKETT, 2002).
Logo após a fermentação, deve ser iniciada a etapa de secagem visando reduzir a umidade das amêndoas de cacau. Deve-se controlar para que não seja lenta ou mal conduzida, já que pode-se desenvolver o crescimento de fungos que, quando presentes, o produto final vai ter sabor desagradável e não caraterístico (EFRAIM, 2004). A secagem deve ser concluída quando as amêndoas apresentarem teor de umidade de 6 a 8 % (BECKETT, 2002).
Segundo Copetti (2009), no início da secagem as amêndoas ainda apresentam atividade de água - aw elevada, assim há condições para o desenvolvimento de leveduras, fungos
filamentosos e bactérias. Devido à redução da aw das amêndoas no decorrer da secagem, um
grupo reduzido de micro-organismos é capaz de se desenvolver durante este período (SCHWAN & WHEALS, 2004).
Com a aw reduzida, interrompe-se o desenvolvimento de leveduras e bactérias havendo, contudo, condições para o desenvolvimento de fungos. Nesta etapa já foi verificado
o crescimento de Aspergillus (A. flavus, A. ochraceus e A. parasiticus) e a multiplicação de fungos xerofílicos como o Xeromyces SP, cuja aw mínima para desenvolvimento é de 0,78 e 0,61, respectivamente (PITT; HOCKING, 1977; COPETTI, 2011).
De acordo com Beckett (1994), a umidade das amêndoas deve ser mantida entre 6 e 7 % no armazenamento, evitando problemas ocasionados por ambientes com elevada umidade relativa e pouca circulação de ar, pois as amêndoas são higroscópicas e seu ganho de umidade durante o armazenamento pode propiciar o desenvolvimento de fungos e outros micro-organismos.
Figura 3. Esquema geral do pré-processamento do cacau.
Fonte: http://www.lajedodoouro.com.br/ciclo-producao-amendoa/ing_index.php
Nesta etapa, vários autores têm demostrado o crescimento de vários grupos de fungos produtores de ocratoxina A e aflatoxinas em cacau. Copetti et al. (2011) identificaram o gênero Aspergillus Nigri e Flavi. Estudos revelaram que a presença de A. carbonarius apresenta maior quantidade de ocratoxina A em amêndoas de cacau do Brasil (COPETTI et al., 2010).
Sánchez-Hervás et al. (2008) identificaram em amêndoas de cacau de Serra Leoa, Guiné Equatorial e Equador, fungos que pertenciam às seções Nigri e Flavi, considerados como fungos toxigênicos. Por esta razão, são necessários tratamentos que ajudem a controlar o crescimento de fungos durante a etapa de armazenamento.
2.3. Salmonella
O gênero Salmonella pertence à família Enterobacteriaceae. Apresentam a forma de bacilos Gram-negativos e são anaeróbios facultativos e fermentadores (CDC, 2011). As Salmonelas spp se mostram difíceis de distinguir da E. coli sob o microscópio, ou mesmo em ágar nutriente. Estão amplamente distribuídas na natureza, sendo seus principais reservatórios o homem e os animais. As infecções alimentares causadas por Salmonella resultam da ingestão de alimentos contendo um número significativo de determinadas linhagens do gênero (CDC, 2011; JAY, 2005).
Constantemente associada a infecções alimentares, esta apresenta um espectro patológico amplo, podendo causar desde enterecolites até infecções sistêmicas, dependendo da sorovariedade. São responsáveis por aproximadamente 15 % das gastroenterites agudas ao redor do mundo (CDC, 2011), além de causar cerca de 200.000 mortes por ano por febre tifóide. Segundo Silva Jr. (2001), a temperatura para multiplicação das Salmonella spp., varia de 8 °C a 47 °C. Germano e Germano (2001) relataram que estas se multiplicam em temperaturas entre 7 °C e 49,5 °C, sendo a temperatura ótima para o desenvolvimento de 37 °C. Segundo Jay (2005), Salmonella spp., são capazes de crescer em diversos meios de cultura, formando colônias visíveis após 24 h a 37 oC.
Vários fatores interferem no crescimento e destruição de Salmonella, dentre estes o calor, mas vai depender do substrato e sorotipo envolvido. Abaixo de 7 °C, a maioria dos sorotipos não se multiplicam, sendo destruídos à temperatura acima de 55 °C. É importante destacar que as salmonelas podem ser destruídas pelas temperaturas de pasteurização (GERMANO E GERMANO, 2001). Outro fator importante é a atividade de água (Aw), pois os micro-organismos necessitam de água disponível para seu metabolismo e multiplicação. Embora o limite mínimo de Aw seja 0,94, estudos têm demostrado que as salmonelas podem sobreviver até mais de um ano em alimentos de baixa umidade como chocolate, manteiga de amendoim, entre outros. O terceiro fator é o pH, sendo o pH mínimo para a multiplicação de pH 4,5 a pH 5,0, com ótimo entre 6,0 e 7,5 (BANWART, 1989).
Os alimentos envolvidos no crescimento de Salmonella spp são aqueles que apresentam alto teor de umidade, alta porcentagem de proteína como produtos lácteos, ovos, carnes e derivados. Segundo Jay (1992), produtos de origem alimentar como carnes e ovos são
os maiores responsáveis pela salmoneloses, pois esses alimentos têm sido responsáveis pela veiculação de numerosos casos de infecção em humanos. Os sintomas que se caracterizam são cólicas abdominais, náuseas, vômitos, diarreias, calafrios, febre e cefaléia. Estes sinais aparecem entre 12 a 36 h após o contato com o micro-organismo, chegando a durar até 4 dias (GERMANO E GERMANO, 2001).
2.3.1 Salmonella e cacau
Muitos sorotipos de Salmonella têm sido encontrados nas últimas décadas em diferentes tipos de alimentos; segundo Lehmacher et al. (1990), alimentos portadores de Salmonella foram relacionados com contaminação a partir de fontes animais ou contato humano e alimentos como cevada, coco, farinha de cereais, cacau em pó, sementes de cacau e chocolate.
Em relação à qualidade microbiológica do chocolate, os micro-organismos mais importantes são os fungos toxigênicos e a Salmonella, considerados como um problema de saúde pública. Assim, a Comunidade Europeia tem destacado o chocolate entre os principais produtos associados com surtos de salmonelose em humanos, que tem ocorrido em diversos países, afetando grande número de pessoas (WERBER et al., 2005 apud NASCIMENTO, 2011).
Os riscos associados com a produção de chocolate são principalmente de origem microbiológica, e estão ligados a três condições principais de seus ingredientes: ter um baixo teor de água, com cerca de 0,3; incorporar um elevado teor de gordura e açúcar; e apresentar um pH ao redor de pH 5,5 (ANON, 2002; BECKETT 2002). Estas três características são vantajosas uma vez que impedem o crescimento de bactérias e fungos, especialmente leveduras e bolores osmofílicos e xerofílicos. Por outro lado, a viabilidade dos esporos de bactérias e fungos não é afetada por tais condições adversas.
Apesar disso foram registrados surtos de salmonelose associados com o consumo de produtos de chocolate. Especificamente, os casos conhecidos foram causados por Salmonella
enterica sub-espécies entérica sorotipo Eastbourne, ocorridos nos Estados Unidos e no Canadá
em 1973 e 1974, em bolas de chocolate, sendo a fonte de contaminação amêndoas de cacau, atingindo 200 pessoas (CRAVEN et al., 1975; D’AOUST et al., 1975). Produtos prontos para o consumo estão sujeitos à contaminação por micro-organismos patogênicos como
S. enteritidis, que foi encontrada em amêndoas prontas para o consumo, o que originou um surto internacional de salmonelose em 2001 no Canadá (ISAACS et al, 2005; SINIGALLIA, 2009). Ainda, infecções por Salmonella ocorreram em Napoli, na Inglaterra e no País de Gales em 1982, devido à contaminação de barras de chocolate, atingindo 272 pessoas (GILL et al., 1983). Casos de surtos por Salmonella typhimurium ocorreram na Noruega e Finlândia em 1987, e foram oriundos de produtos de chocolate contaminados por aves, atingindo 349 pessoas com idade média 6 anos (KAPPERUD et. Al., 1990).
Mais recentemente, surto por Salmonella oranienburg foi registrado na Alemanha em 2001-2002, e a causa foi a contaminação em duas marcas de chocolate, atingindo 439 pessoas (ANON, 2002).
O principal risco microbiológico conhecido no chocolate é a presença de
Salmonella, que não é própria do cacau ou do ambiente em que cresce, mas sim de origem fecal
humana. Esta poderá ser introduzida durante a etapa de coleta, a partir das mãos dos manipuladores que abrem o fruto e tiram as sementes, ou no momento da secagem, que muitas vezes é uma ação feita com os pés. De acordo com Forsythe (2000), os riscos de ocorrência de doenças transmitidas por alimentos devem ser reduzidos ao máximo durante a sua produção.
Segundo Beckett (2002), a única etapa em que se pode eliminar a presença de
Salmonella é durante a torrefação dos grãos. Posteriormente, devem ser tomadas todas as
precauções para minimizar o risco de reintrodução, porque não existe outra etapa dentro do processo tecnológico onde o micro-organismo poderia ser eliminado. A concentração de água no chocolate, assim como o pH são fatores que limitam o desenvolvimento de Salmonella, mas não a sua sobrevivência. Por esta razão, para manter o risco no nível mais baixo possível é necessário manter as boas práticas de fabricação (BPF) em todas as fases de processamento.
Pesquisas tem demostrado a presença de enterobactérias totais, coliformes, E. coli e Salmonella nos chocolates produzidos no Brasil. Nascimento et al. (2011) analisaram 150 amostras de produtos derivados do cacau sendo classificados e separados por 30 amostras de nibs, liquor, torta, manteiga de cacau e cacau em pó. Foram detectadas enterobacterias totais em 17 % das amostras de nibs, além de 20 % apresentar coliformes totais e presença de coliformes tolerantes em uma amostra. Ainda, em 7 % das amostras de liquor e cacau em pó
foi encontrada a presença de coliformes totais, e em uma amostra de manteiga de cacau foi detectada enterobacterias e coliformes totais. Esses achados são resultado do pré-processamento, demonstrando a importância em se determinar os pontos críticos de controle (PPC) dentro das diferentes etapas de processamento de cacau e da fabricação do chocolate, com o objetivo de inativar as enterobacterias e garantir a inocuidade do produto final.
Em outra pesquisa desenvolvida para avaliar a presença de Salmonella e sua resistência térmica durante o processamento térmico do chocolate (Conchagem), NASCIMENTO et al. (2012) avaliaram três diferentes temperaturas, ou seja, 50 °C, 60 °C e 70 °C. Os autores demostraram que a temperatura de 70 °C permitiu maior inativação do patógeno do que as temperaturas mínimas (50-60°C), e que a variação foi pequena, demostrando que se houver amostra contaminada proveniente do pré-processamento das amêndoas, não se pode garantir que durante a etapa do processamento (conchagem) a Salmonella possa ser inativada, bem como se assegurar um produto final como chocolate inócuo para o consumidor.
2.3.2. Presença de Aspergillus e Aflatoxinas no cacau
O gênero Aspergillus é considerado um dos fungos filamentosos mais conhecidos para produção de produtos químicos, como por exemplo, ácido cítrico por A. niger, ou alimentos fermentados como molho de soja por A. oryzae e também na produção de enzimas, como as amilases por A. niger. Por outro lado, são também conhecidos como deteriorantes de alimentos e rações, como o A. fumigatus. Algumas espécies são capazes de produzir metabolitos tóxicos ou micotoxinas, sendo a mais conhecida a aflatoxina (SAMSON et. 2002; PITT&HOCKING, 1977).
Os fungos filamentosos vão ocupar uma posição importante durante a etapa de fermentação do cacau, podendo causar hidrólise de celulose e sabores não desejados nas amêndoas. Além disso, algumas espécies de fungos do gênero Aspergillus podem produzir micotoxinas nas amêndoas, especialmente a Ocratoxina A - OTA, sendo considerada como nefrotóxica e cancerígena (COPETTI et al., 2010; SANCHES – HERVAS et al., 2008). A legislação brasileira considera 10 µg/Kg como limite máximo tolerado para micotoxinas em alimentos, incluindo a ocratoxina A.
Pesquisas anteriores mostraram os diferentes tipos de fungos que foram isolados das amêndoas de cacau como Mucor, Penicillium, Rhyzopus, Fuzarium e especialmente Aspergillus. (COPETTI et al, 2011; MOUNJOUENPOU et al. 2008; SANCHES – HERVAS et al. 2008). Os principais fungos isolados de amêndoas de cacau por Sanches – Hervas et al. (2008), em Guine Equatorial e Equador pertenciam às seções Nigri e Flavi. Copetti et al. (2011) relataram presença de espécies de Aspergillus em todas as diferentes fases de processamento primário das amêndoas de cacau, destacando-se as espécies produtoras de ocratoxina A da seção Nigri, que aumentou depois da fermentação.
Em Ghana, durante o ano de 1978 houve grandes perdas durante o transporte e armazenamento de amêndoas de cacau por contaminação de fungos e infestação por insetos. A presença de aflatoxinas em amêndoas de cacau já é conhecido contaminando áreas agrícolas cultivadas com cacau, café, amendoim e milho (COPETTI et al., 2011; FERNANDEZ-PINTO et al., 2001). Uma elevada porcentagem de A. flavus (quase 60 %) foram capazes de produzir aflatoxinas em amêndoas de cacau (COPETTI et al., 2011; SANCHES – HERVAS et al., 2008).
A presença de fungos toxigênicos em cacau é um fato preocupante, especialmente pela contaminação com micotoxinas, pois demandam perdas econômicas e problemas de saúde pública. Por este motivo é importante procurar alternativas para desinfecção e controle dos micro-organismos, como por exemplo, a irradiação das amêndoas, que consiga manter a segurança alimentar do consumidor e a qualidade do produto.
2.4. Irradiação de alimentos
Em 1950 se iniciaram as pesquisas sobre a aplicação de irradiação de alimentos. Atualmente os temperos e especiarias são os produtos mais comumente irradiados (RODRIGUEZ, 2005).
A seguir apresentamos um breve histórico sobre a irradiação dos alimentos:
Em 1954, os Estados Unidos lançaram investigações sobre radiação de alimentos através do Food and Drug Administration (FDA sua sigla em Inglês).
Em 1963, a FDA aprovou a irradiação de trigo, farinha de trigo e batata. Em 1983, a FDA aprovou a irradiação de especiarias e temperos.
Em 1985, a FDA aprovou a irradiação de carne de porco e em 1990, as carnes de aves para evitar a triquinose e a Salmonela, respectivamente.
Em 1986, a FDA aprovou a irradiação de frutas e legumes.
Em 1997, a Organização Mundial da Saúde (OMS) avaliou novamente o uso da irradiação de alimentos, em concordância com a FDA e a Agência Internacional de Energia Atômica (AIEA).
Em 2000, mais de 50 nações, incluindo o México, aprovaram a irradiação de alimentos.
2.4.1. Irradiação ionizante
A irradiação de alimentos é um processo físico de tratamento, e baseia-se em submeter o produto já embalado ou a granel a doses controladas de radiação ionizante com finalidade sanitária, fitossanitária e/ou tecnológica (BRASIL, 2001). A irradiação tem o mesmo objetivo que outros métodos de tratamento de alimentos: reduzir as perdas ocasionadas pela alteração ou decomposição do alimento; combater os microrganismos e outros organismos causantes de doenças de transmissão alimentar (OMS, 1989).
Os raios X, que são uma forma de radiação ionizante, foram descobertos em 1895. A radioatividade e as radiações ionizantes associadas (raios alfa, beta e gama) foram descobertas no ano seguinte. Se expressa “radiação ionizante” porque se qualifica a todas estas radiações que provocam no material irradiado a aparição de partículas eletricamente carregadas, denominadas íons (OMS, 1989). A radiação ionizante utilizada em alimentos é a radiação eletromagnética transmitida por ondas eletromagnéticas (raios X e raios gama) e a radiação por feixe de elétrons (BRASIL, 2001; CENA 2011).
A dose de radiação é a quantidade de energia absorvida pelo alimento, a qual é o fator mais importante do processo de irradiação. Cada alimento precisa de uma dose especifica para que se consiga o resultado determinado. A unidade da dose absorvida denomina-se “Gray” (Gy) e se define como 1 Gray a energia de 1 Joule recebida por Kilo de material irradiado (OMS, 1989; RODRIGUEZ, 2005).
Os macronutrientes presentes nos alimentos como proteínas, carboidratos e lipídeos podem ser afetados pelo uso da radiação. A radiação gama provoca mudanças nas propriedades
físico-químicas das proteínas, dependendo de sua natureza e da dosagem da radiação. O desencadeamento de processos de auto-oxidação de lipídeos com a formação de peróxidos e compostos carbonil voláteis, que são responsáveis pela rancidez é um exemplo das possíveis alterações provocadas por processos de irradiação (DIEHL, 1990). Nos carboidratos, o uso da irradiação pode provocar a quebra em unidades menores. Este processo é responsável pelo amolecimento de frutas e outros vegetais devido à quebra da parede celular. Os micronutrientes, como as vitaminas, são considerados sensíveis a qualquer tratamento, principalmente ao térmico. No processo de irradiação, algumas vitaminas, como a riboflavina, niacina e vitamina D, são bastante estáveis, enquanto outras como a tiamina e vitaminas A, C, E e K são relativamente lábeis (RODRIGUEZ, 2005).
2.4.2. Tipos de radiação e legislação
O processo de irradiação é regulamentado pela Organização para a Agricultura e Alimentação (FAO), pela Agência Internacional de Energia Atômica (IAEA) e pela Organização Mundial da Saúde (OMS).
As fontes de radiação gama mais utilizadas pela maioria das usinas comerciais são o cobalto 60 e o césio 137, que emitem radiações gama de alta energia. Durante o processo, o alimento fica exposto a uma fonte de energia onde absorve uma dose precisa e especifica (OMS, 1989).
A irradiação de alimentos é um método de pasteurização a frio, pois não altera a temperatura do alimento que está sendo irradiado. Trata-se de um processo que controla as doenças de origem alimentar, causadas por micro-organismos patogênicos, que muitas vezes são consumidos em alimentos crus ou parcialmente processados, além disso, apresenta uma vantagem importante de poder ser aplicada em alimentos congelados e embalados (FARKAS, 1998; RODRIGUEZ, 2005).
Em unidades que realizam o processo de irradiação, os alimentos são transportados em uma câmara fechada com paredes de concreto de 2 m de espessura para proteger os trabalhadores envolvidos. A fonte de irradiação fica submersa numa piscina onde a água absorve energia e protege os operadores. Quando se irradia o material, a fonte de Co60 sobe e o material a ser irradiado circula automaticamente através de um labirinto de corredores com um
sistema transportador acionado de fora da unidade. Os operadores ficam do lado de fora, e uma vez terminada a aplicação o material é retirado (RODRIGUEZ, 2005).
No Brasil é uma tecnologia aprovada pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), através da Resolução RDC n° 21 de 26/01/2001, que aprovou o “Regulamento Técnico para a Irradiação de alimentos que permite a irradiação de qualquer alimento, com a condição de que a dose máxima absorvida seja inferior àquela que comprometa as propriedades funcionais e/ou os atributos sensoriais do alimento, e que a dose mínima absorvida seja suficiente para alcançar o objetivo pretendido” (BRASIL, 2001).
2.4.3. Efeito da irradiação sobre o alimento e os micro-organismos
A irradiação pode destruir os micro-organismos presentes no alimento, especialmente bactérias Gram-negativas como é o caso da Salmonella. Do mesmo modo, inativa micro-organismos deteriorantes dos alimentos, incluindo bactérias, fungos e leveduras. Este processo aumenta a vida útil do alimento através da redução dos níveis de bactérias patogênicas, outros micro-organismos e parasitas que causam doenças alimentares (OMS, 1989; RODRIGUEZ, 2005).
Existem três categorias de tratamento por irradiação:
a. Radapertização (> 10 kGy): que consiste em aplicações com doses altas, equivalente a esterilização comercial, deixando o alimento livre de patogênicos e de deteriorantes, que possam se desenvolver nas condições de estocagem de produto. Causa destruição total de micro-organismos, como por exemplo o C. botulinum, considerado o mais resistente entre os microrganismos esporulados, e possibilita a estocagem longa sob refrigeração;
b. Radicidação (1 a 10 kGy): destrói os não esporulados patogênicos de forma similar a pasteurização, deixando o produto livre de riscos de Saúde Pública. Exemplos são as bactérias Salmonella spp em carnes de frango, a Shigella e a E. coli, e finalmente
c. Radurização (< 1,0 kGy): que consiste em reduzir o número de micro-organismos para estender a vida útil, e ter melhor qualidade. Em frutas frescas, limita o crescimento de bolores e em peixes reduz o crescimento de Pseudomonas, Acinetobacter e Aeromonas (DIEHL, 1995; RODRIGUEZ, 2005).
A irradiação em grãos e cereais normalmente é aplicada como forma de proteção contra insetos e para eliminar fungos, já que alguns destes micro-organismos produzem micotoxinas. As pesquisas relacionadas com irradiação gama para eliminar Salmonella comumente focam a carne de frango, carne bovina e ovos. Santos (2003) recomendou a dose de 3,8 kGy para garantir segurança em relação à Salmonella spp. em carne de frango.
As formas esporuladas são mais resistentes que as vegetativas. Os micro-organismos Gram-negativos, como Pseudomonas, Vibrio, Proteus, Aeromonas e Serratia são muito sensíveis e podem ser destruídos com uma dose de 1-3kGy, enquanto E. coli, Salmonella e Shigella são um pouco mais resistentes. Acinetobacter e Moraxella são os mais resistentes dentre os Gram-negativos (RODRIGUEZ, 2005).
Pesquisas em alimentos demostram que a irradiação gama reduziu a contaminação fúngica em amendoim previamente desinfetado, nas três doses de irradiação utilizadas (1, 5 e 10 kGy) durante o tempo de armazenamento de estudo (0, 20, 60 e 180 dias). Com a aplicação da dose de 10 kGy, não houve crescimento fúngico mesmo após 6 meses de armazenamento em temperatura ambiente (PRADO et al., 2006).
A radiação também é usada para o controle de fungos em alimentos. Sua contaminação direta pode ocasionar vários problemas aos produtos armazenados. Quando se desenvolvem fungos em nozes ou sementes pode ocorrer a perda do seu poder germinativo, afetando a qualidade, produzindo alterações sensoriais e diminuindo o valor nutritivo das proteínas (FONSECA, 2004; SINIGALLIA, 2009).
Em um estudo da avaliação do efeito da radiação gama em castanhas de cajueiro no Brasil, que foram irradiadas com doses de 1,5; 3; 6 e 12 kGy, demostrou-se que houve redução dos fungos nas amostras que receberam níveis altos de irradiação, de 6 e 12 kGy. (FREIRE & MASTRO, 2000).
CAMARGO et al. (2011) avaliaram o efeito da irradiação gama na cor, teor de fenólicos totais, atividade antioxidante e perfil de ácidos graxos em amendoins que foram submetidos a doses de 5; 7,5; 10 e 15 kGy. Não foram identificadas diferenças na cor e atividade antioxidante, mas houve alteração a partir da dose de 10 kGy, recomendada para eliminação
fúngica de amendoim, do perfil de ácidos graxos, diminuindo os saturados e aumentando os insaturados.
A irradiação em grãos de soja submetidos a doses de 2, 4 e 8 kGy não promoveu alterações na composição centesimal, nem na digestibilidade, porém promoveu o aumento na porcentagem de desaminação das amostras conforme o aumento das doses. A desaminação é importante na quantificação do valor nutritivo das proteínas (TOLEDO et al., 2007).
Em estudos conduzidos na Alemanha foi utilizada a irradiação para substituir o uso de brometo de metila no controle de fungos e insetos em amêndoas de cacau fermentadas e secas. O nível aceitável de irradiação foi 4 kGy e os resultados foram promissores, sendo que as amêndoas de cacau submetidas a armazenamento durante quatro meses a 28 °C e 80 % de umidade relativa (HR) apresentaram diminuição do crescimento de bolores e a infestação por insetos foi mínima. (IAEA, 1988). No mesmo estudo, foi estabelecida uma dose mínima de 0,8 kGy para o efetivo controle de insetos presentes em grãos armazenados e amêndoas de cacau. Por outro lado, para descontaminação de fungos e leveduras foi necessária a combinação de calor úmido (85 % de HR), aplicada a 60 °C durante 30 min, seguida de uma dose de 4 kGy, recomendada para as amêndoas de cacau. No mesmo estudo, não foi encontrada diferença significativa na qualidade sensorial dos produtos de cacau não tratados, com as amêndoas tratadas com calor úmido e radiação gama. As curvas do teor de gordura sólida de cacau preparadas a partir de amêndoas de cacau não tratadas e tratadas foram muito semelhantes (IAEA, 1988).
A irradiação gama também foi usada como técnica para melhorar a qualidade higiênica da casca de amêndoas de cacau (subproduto da indústria de processamento de cacau). Uma dose de irradiação de 5 kGy foi considerada suficiente para diminuir as contagens microbianas para um nível muito baixo. Nenhuma alteração nas fibras alimentares foi encontrada no produto irradiado (BONVEHI, 2000).
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo geral
O objetivo deste estudo foi avaliar as alterações das características microbiológicas e físico-químicas das amêndoas de cacau submetidas a diferentes doses de irradiação gama.
3.2. Objetivos específicos
Avaliar a influência de diferentes doses de irradiação gama sobre a contaminação fúngica e por Salmonella spp. em amêndoas de cacau, nos níveis 0,0 (controle), 2,0, 3,0, e 5,0 kGy.
Avaliar a influência das diferentes doses de irradiação gama sobre os parâmetros físico-químicos das amostras irradiadas.
Determinar a dose necessária que apresente eficiência na redução de micro-organismos e não interfira nas caraterísticas do produto final.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Matéria-prima
Foram utilizadas 31 amostras de amêndoas de cacau (Theobroma cacau L.) fermentadas e secas provenientes do Pará-Brasil (6); Bahia-Brasil (21); Costa do Marfim (2) e Gana (2), conforme a Figura 4. As amostras foram fornecidas por uma empresa processadora de cacau que opera no Brasil em quantidade aproximada de 2 kg / lote.
As amostras foram encaminhadas para o laboratório da Divisão de Microbiologia do Centro Plurisdisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas – CPQBA/UNICAMP. Foi necessário realizar uma limpeza de cada um dos lotes através da separação de corpos estranhos, tais como pedras, folhas, entre outros. Em seguida, cada lote de 2 kg foi dividido em amostras de 500 g, que foram colocadas em embalagens de polietileno esterilizado, etiquetadas com as diferentes doses de irradiação a que seriam submetidas (0, 2, 3 e 5 kGy), e finalmente armazenadas a 7 °C.
Figura 4. Quantidade e procedência das amêndoas de cacau
21 2 2 6 B A H I A G A N A C O S T A D O M A R F I M P A R Á Q UA N TIDA DE PROCEDÊNCIA
QUANTIDADE VS PROCEDÊNCIA
4.2. Irradiação das amêndoas de cacau
As amostras foram irradiadas em doses de 0 kGy (controle) e 2, 3 e 5 kGy no irradiador multi-propósito da Companhia Brasileira de Esterilização CBE/EMBRARAD, sediada em Jarinú-SP. As amostras foram identificadas com as doses de irradiação e receberam os selos radiossensíveis – que indicam a efetividade do processo (amarelo - não tratado; laranja e vermelho - tratado), conforme Figura 5. As amostras foram expostas aos raios gama, emitidos pelo radioisótopo Co-60. Após a realização do tratamento as amostras foram encaminhadas ao laboratório da Divisão de Microbiologia do CPQBA, sendo armazenadas a 7 °C para as análises pertinentes.
4.3. Preparo das amostras
Para a análise de Salmonella foram homogeneizadas 25 g de amostra moída em 225 mL do meio de pré-enriquecimento, neste caso, água peptonada tamponada (BPW).
Para a análise de fungos foram usadas 10 amêndoas, em triplicata, sendo antes desinfetadas pela imersão em solução de hipoclorito de sódio 0,4 %, durante 2 min.
Figura 5. Amostras de cacau irradiadas em bolsas de polietileno esterilizadas, identificadas pela dose de irradiação e selos radiossensíveis.
4.4. Análises microbiológicas
4.4.1. Isolamento de Salmonella
O isolamento de Salmonella foi feito segundo o método da Food and Drug Administration (FDA, 2007), de acordo com o Manual de Métodos de Análise Microbiológicos de Alimentos e Água (Da Silva et al., 2010).
O pré-enriquecimento foi realizado inoculando as amostras anteriormente moídas em água peptonada tamponada (BPW), controlando o pH a 6,8 + 0,2 com as amostras mantidas em reposo durante 60 min. Em seguida foram as amostras foram incubadas a 35 + 2 oC durante 18 a 24 h, período após o qual foram transferidas do meio de pré-enriquecimento para os tubos com caldo de enriquecimento seletivo de 10 mL. Empregaram-se dois diferentes meios de enriquecimento seletivo, o caldo Rappaport-Vassiliadis Modificado (RV) e o Caldo Tetrationato (TT), com transferência de 0,1 mL e 1 mL do inóculo, respectivamente. Em seguida, foi feita a incubação a 42 + 0,2 ºC e 35 + 1 °C por 24 h, respectivamente.
Para o plaqueamento seletivo diferencial foi estriada uma alçada do caldo Tetrationato (TT), em triplicata, em placas de Ágar Entérico de Hectoen (HE), Ágar Bismuto Sulfito (BS) e Ágar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD). O mesmo procedimento foi repetido com o caldo Rappaport-Vassiliadis Modificado (RV). As placas de HE e XLD foram incubadas na posição invertida à 35 °C por 24 h, e as placas de BS à 35 °C por 48 h. Após o período de incubação, foi observada a presença de colônias típicas em cada meio:
1. Ágar HE: Colônias transparentes, verde azuladas, com ou sem centro preto. Colônias de cepas fermentadoras de lactose ou sacarose são de cor salmão e não transparentes.
2. Ágar XLD: Colônias de cor rosa escuro, com centro preto e uma zona avermelhada levemente transparente ao redor. Cepas lactose positivas produzem colônias amarelas com ou sem centro preto.
3. Ágar BS: Colônias castanhas, cinzas ou pretas, com ou sem brilho metálico. Algumas cepas podem apresentar colônias verdes com pouco ou nenhum escurecimento do meio ao redor.
As colônias típicas e atípicas foram coletadas em tubo de BHI e incubadas a 35 oC, durante 24 h.
Para o isolamento e identificação de Enterobacteriaceae de outros bastonetes Gram-negativos, as colônias foram estriadas em placas de ágar MacConkey e incubadas a 35
oC durante 24 h.
4.4.2. Confirmação das colônias de Salmonella por método de PCR
4.4.2.1. Descrição das cepas
Nos estudos comparativos realizados foram utilizadas cepas controle de S. enteritidis (ATCC 13076), P. aeruginosa (ATCC 13388) e E. coli (ATCC 25922). As bactérias pertencem à Divisão de Microbiologia do Centro Plurisdisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas – CPQBA/UNICAMP.
A análise por PCR, para confirmação das colônias típicas de Salmonella foi realizada na Divisão de Recursos Microbianos (DRM) do CPQBA – UNICAMP, sob orientação da Dra. Fabiana Fantinatti Garboggini. Para tal, os isolados foram reativados em caldo BHI e incubados a 35 °C por 24 h. Em seguida, foram transferidos para ágar McConkey para verificação da pureza e novamente incubados a 35±2 °C, durante 24 h. As colônias com características típicas de Salmonella obtidas foram transferidas para ágar nutriente, incubadas como anteriormente e separadas para identificação molecular.
Foi realizada extração de DNA a partir do repique de cinco colônias isoladas das placas com ágar nutriente que resultaram colônias típicas de Salmonella, as colônias isoladas foram colocadas em 50 µL de água miliQ (água ultrapura esterilizada para PCR). Após homogeneização, o tubo foi incubado em termociclador (Eppendorff, Mastercycler) à 95 °C durante 3 min, para lise celular e exposição do DNA genômico. O DNA genômico obtido da amostra foi utilizado como molde em reação de amplificação com primers espécie-específica e para identificação das bactérias por meio de sequenciamento do gene RNA ribosomal 16S.
A amplificação com primers espécie-específico foi realizada utilizando os primers
Salm3 (5’-GCTGCGCGCGAACGGCGAAG- 3’) e Salm4
(5’-TCCCGCCAGAGTTCCCATT-3’) (Cocolin et al, 1998). A mistura da reação usada foi a solução Tampão de PCR (INVITROGEN), 2,5 mM de cloreto de magnésio (MgCl2), 200 μM
de cada dNTP, 20 pmoles de cada primer, 1 U de Taq DNA polymerase (Invitrogen Brasil Ltda). Na Figura 6 ilustra o processamento da análise de PCR.
Figura 6. Processamento da análise de PCR
Na Tabela 1 se observa as condições de amplificação no termociclador foram as seguintes: desnaturação a 95 °C durante 5 min, 35 ciclos de 95 °C durante 1 min, 65 °C durante 1 min e 72 °C por 1,5 min até a extensão final de 72 °C durante 10 min (SMITH et al., 2012). As amostras isoladas com características típicas de Salmonella foram visualizadas e quantificadas através da comparação do DNA λ em diferentes concentrações em gel de agarose a 1,2 % TBE 1X submetido à eletroforese durante 30 min sobre condições de 5V por cm. Os resultados obtidos da PCR foram amplificados com os primers Salm3-Salm4 de Salmonella spp., que foram usadas para confirmação nas reações de sequenciamento.
Tabela 1. Condições de amplificação no termociclador.
Primers Salm3 e Salm4
Desnaturação inicial 95 °C 5 min 1 vez
Desnaturação 95 °C 1 min
Repete-se o ciclo 35 vezes.
Hibridação 65 °C 1 min
Extensão 72 °C 1,5 min
Elongação final 72 °C 10 min 1 vez
4.4.2.2. Sequenciamento e análise filogenética de gene RNA ribossomal 16S Aqueles isolados que mostraram bandas com os primers específicos foram sequenciados amplificando-se as regiões homologas do RNA ribossomal 16S da bactéria. Foram utilizados os primers de 10-F (5 'CCGCTAATTTCAAAAACTAAG 3') e 1100R (5'AGGGTTGGGGTGGTTG 3 ') (LANE et al., 1985). Os resultados da PCR foram purificados utilizando mini-colunas (GFX PCR DNA e gel band purification kit, GE Health Care), e as reações de sequenciamento foram realizadas usando o kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Life Technologies), e foram submetidas a sequenciamento utilizando o sequenciador automático ABI3500XL Series (Applied Biosystems). A Tabela 2 mostra os primers utilizados na amplificação e sequenciamento do gene RNA ribossomal.
Tabela 2. Primers utilizados na amplificação e sequenciamento do gene RNA ribossomal 16S.
Primer Sequência de nucleotídeos Referencia
Salm3 5’ GCTGCGCGCGAACGGCGAAG 3’ Cocolin et al, 1998
Salm4 5’ TCCCGCCAGAGTTCCCATT 3’ Cocolin et al, 1998
10f 5 'CCGCTAATTTCAAAAACTAAG 3' LANE et al., 1985
1100r 5'AGGGTTGGGGTGGTTG 3 ' Lane, 1985
As sequências parciais de DNAr 16S que foram obtidas com os diferentes primers foram montadas em um contig (sequência única combinando os diferentes fragmentos obtidos). Para isso foi usada a versão 7.2.5 do programa Bioedit, e foram comparadas com as sequências
de organismos representados nas bases de dados do Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), and RDP Release 10 (http://rdp.cme.msu.edu/) (KIM et al., 2005).
4.5. Determinação da contaminação fúngica por plaqueamento direto
As amêndoas estocadas foram desinfetadas pela imersão em solução de hipoclorito de sódio 0,4 %, durante 2 min. Em seguida, 10 amêndoas foram dispostas em 3 placas de Petri contendo ágar Dicloran Glicerol 18 % (DG18), em triplicata, totalizando 30 amêndoas, conforme exemplificado na Figura 7. Em seguida, as placas foram incubadas à 25 °C por 7 dias e os resultados foram expressos em porcentagem de amêndoas infectadas internamente, conforme a metodologia de Pitt & Hocking (1997).
4.6. Análises físico-químicas
4.6.1.Prova de corte
A prova de corte foi feita segundo a Instrução Normativa n° 57, de 12 de Novembro de 2008 (BRASIL, 2008) – Tabela 3 e Figura 8. Foram coletadas, ao acaso, 100 amêndoas de cacau em triplicata, as quais foram avaliadas. Realizou-se corte longitudinal e as amêndoas cortadas foram dispostas em uma tábua de corte, onde os cotilédones foram avaliados quanto à cor, sendo marrom, violeta, branca e ardósia. Outro critério de avaliação foi a compartimentação dos cotilédones, sendo classificadas em bem, parcialmente ou pouco compartimentadas, como mostra a Figura 9. Além disso, foram contabilizados os defeitos, como por exemplo amêndoas mofadas ou infestadas por insetos. A tolerância de defeitos nas amêndoas de cacau está descrita na Tabela 4.
Figura 8. Avaliação da qualidade da amêndoa de cacau.
Figura 9. Critério de avaliação da compartimentação do interior das amêndoas de cacau.
Marrom (boa fermentação) Violeta (fermentação insuficiente) Branca (genética) Ardósia (sem fermentação) bem compartimentada parcialmente compartimentada não compartimentada
Tabela 3. Amêndoa de cacau – Tolerância de defeitos
(*) N. da COEJO: Republicada no DOU DE 30/06/2008, Seção 1.
4.6.2. Atividade de água (Aw)
A atividade de água das amostras foi determinada no aparelho Aqualab, modelo 3TE, (Decagon, USA). As análises foram realizadas em triplicata a 25°C ± 0,1.
4.6.3. Teor de umidade
Determinada por método gravimétrico, com os resultados expressos em % de umidade perdida, conforme procedimento descrito por AOAC (1995). Foi realizada em estufa de circulação forçada de ar a 105 °C, até peso constante.
4.6.4. pH
Após a trituração da amêndoa de cacau, mediante pH-metro e segundo normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz (IAL, 1985) Foram feitas três repetições por amostra.
Enquadramento do Produto
Defeitos Mofadas Fumaça Danificadas
por Insetos
Ardósia Germinadas Achatadas
Tipo I De zero até 4,0 % De zero até 1,0% De zero até 4,0% De zero até 5,0% De zero até 5,0% De zero até 5,0% Tipo II Acima de 4,0% até 6,0% Acima de 1,0% até 4,0% Acima de 4,0% até 6,0% Acima de 5,0% até 10,0% Acima de 5,0% até 6,0% Acima de 5,0% até 6,0%
Tipo III Acima
de 6,0% até 12,0% Acima de 4,0% até 6,0% Acima de 6,0% até 8,0% Acima de 10,0% até 15,0% Acima de 6,0% até 7,0% Acima de 6,0% até 7,0%
Fora de Tipo Acima de 12,0% até 25,0% Acima de 6,0% Acima de 8,0% Acima de 15,0% Acima de 7,0% Acima de 7,0%
4.6.5. Acidez total titulável (ATT)
Foi determinada pelo procedimento electrométrico e titulometria com NaOH 0,1 N, através de procedimento de mergulho do eletrodo do pH-metro na solução contendo 10 mL da amostra triturada, mais 90 mL de água destilada. A titulação foi efetuada até o pH atingir pH 8,2 (referente ao pH de mudança de coloração do indicador fenolftaleína), segundo Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz (IAL, 1985). Foram feitas três repetições por amostra.
4.7. Análise dos resultados
Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância ANOVA e teste Tukey de comparação de médias ao nível de 5% de significância com auxílio do software estatístico SAS versão 9.2 (2005).
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Análises microbiológicas e efeito da irradiação gama sobre as amêndoas de cacau
Amostras de amêndoas de cacau foram submetidas a análises microbiológicas para detecção da presença de Salmonella e fungos. Estas análises foram realizadas para a amostra controle (sem irradiação) e para as amostras submetidas à irradiação gama nos níveis de 2, 3 e 5 kGy.
5.1.1. Análise de Salmonella
As análises de Salmonella foram realizadas nas amostras de amêndoas não irradiadas (controle) e irradiadas nos três diferentes níveis, conforme descrito no ítem 4.4.1. Após observação das características morfológicas das colônias típicas crescidas nos meios XLD, BS e HE foi selecionada uma colônia de cada placa para a confirmação preliminar. Assim, foram obtidas 242 colônias típicas e atípicas, que apresentaram características semelhantes com Salmonella. Em seguida, a etapa de plaqueamento em ágar McConkey permitiu uma redução
importante de colônias típicas, resultando em um total de 121 colônias com características suspeitas de Salmonella.
Os resultados estão ilustrados na Figura 8, representando o total de colônias obtido para cada nível de irradiação.
A Figura 10 mostra que das 242 colônias selecionadas das placas, a maioria, ou seja, 150 colônias foi proveniente das amostras controle (sem irradiação), seguido da irradiação mínima, de 2 kGy, com 72 colônias. Um total de 20 colônias típicas foi selecionado das amostras tratadas com 3 kGy e nenhuma foi encontrada nas amostras irradiadas a 5 kGy.
Figura 10. Número de colônias típicas de Salmonella selecionadas nos diferentes níveis de irradiação.
5.1.2. Identificação de Salmonella pela técnica de PCR
5.1.2.1 Amplificação do DNA bacteriano utilizando PCR
Um total de 121 colônias típicas de Salmonella foram analisadas para confirmação do gênero utilizando os primers espécie-específico. Os resultados obtidos através da análise de
0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 2 3 5 N ú m ero d e colô n ias t íp icas d e Sa lm o n ella Níveis de irradiação
eletroforese em gel de agarose – PCR estão ilustrados na Figura 9. Foram utilizados como padrão, marcadores de peso molecular de 1kb.
Figura 11. Eletroforese em gel de agarose segundo método PCR mostrando os produtos de amplificação para os genes salm3 e salm4. M: Marcador 1000pb; 1-Controle positivo Salmonella ATTCC 13076; 2- Controle positivo Pseudomonas ATCC 13388; 3- Controle positivo com Escherichia coli ATCC 25922. Colunas 5-6 amplificação 368 pb Salmonella enterica ATCC 13311; Colunas 7, 8, 9, 10, 13, 14, 15 = amplificações.
Através dos resultados obtidos da análise por PCR (Figura 11) foram encontradas 13 bactérias presentes nas amêndoas de cacau. Pôde-se estimar se as amostras analisadas foram amplificadas de acordo com os primers utilizados. As bandas em branco intenso são considerados como resultados positivos, e sua fluorescência é o indicador de que o produto esperado foi amplificado.
5.1.2.2 Sequenciamento e análise filogenética de gene RNA ribossomal 16S
Na Tabela 4 estão indicadas as diferentes enterobactérias que foram encontradas nas amêndoas de cacau, através da identificação por sequenciamento do gene RNA ribossomal 16S utilizando os programas Blast e RDP.
Através da análise de sequenciamento foi possível confirmar a presença da bactéria Klebsiella pneumoniae em sete das amostras de amêndoas de cacau, ou seja, nas amostras controle (não irradiadas) 9, 11, 12 e 15, todas provenientes da Bahia. K. pneumoniae foi ainda confirmada nas amostras 9, 12 e 15 após irradiação à 2 kGy.
100 pb 200 pb 300 pb 500 pb 400 pb 600 pb M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 M
