Identificação de Salmonella pela técnica de PCR

5.1.2.1 Amplificação do DNA bacteriano utilizando PCR

Um total de 121 colônias típicas de Salmonella foram analisadas para confirmação do gênero utilizando os primers espécie-específico. Os resultados obtidos através da análise de

0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 2 3 5 N ú m ero d e colô n ias t íp icas d e Sa lm o n ella Níveis de irradiação

eletroforese em gel de agarose – PCR estão ilustrados na Figura 9. Foram utilizados como padrão, marcadores de peso molecular de 1kb.

Figura 11. Eletroforese em gel de agarose segundo método PCR mostrando os produtos de amplificação para os genes salm3 e salm4. M: Marcador 1000pb; 1-Controle positivo Salmonella ATTCC 13076; 2- Controle positivo Pseudomonas ATCC 13388; 3- Controle positivo com Escherichia coli ATCC 25922. Colunas 5-6 amplificação 368 pb Salmonella enterica ATCC 13311; Colunas 7, 8, 9, 10, 13, 14, 15 = amplificações.

Através dos resultados obtidos da análise por PCR (Figura 11) foram encontradas 13 bactérias presentes nas amêndoas de cacau. Pôde-se estimar se as amostras analisadas foram amplificadas de acordo com os primers utilizados. As bandas em branco intenso são considerados como resultados positivos, e sua fluorescência é o indicador de que o produto esperado foi amplificado.

5.1.2.2 Sequenciamento e análise filogenética de gene RNA ribossomal 16S

Na Tabela 4 estão indicadas as diferentes enterobactérias que foram encontradas nas amêndoas de cacau, através da identificação por sequenciamento do gene RNA ribossomal 16S utilizando os programas Blast e RDP.

Através da análise de sequenciamento foi possível confirmar a presença da bactéria Klebsiella pneumoniae em sete das amostras de amêndoas de cacau, ou seja, nas amostras controle (não irradiadas) 9, 11, 12 e 15, todas provenientes da Bahia. K. pneumoniae foi ainda confirmada nas amostras 9, 12 e 15 após irradiação à 2 kGy.

100 pb 200 pb 300 pb 500 pb 400 pb 600 pb M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 M

Tabela 4:Identificação do sequenciamento dos genes usando os programas Blast e RDP 4.

Amostra de cacau/irradiação

Blast RDP

A5 / 0kGy Enterobacter hormaechei 89%

CIP 103441 / NR - 042154 Enterobacter hormaechei (T); CIP 103441; AJ508302 A5 / 2kGy E. hormaechei 98% NR - 042154 Enterobacter hormaechei 91,3% CIP 103441 / AJ508302

A7 / 0kGy Salmonella. enterica 98%

ATCC 13311 CP009102

Salmonella enterica (T) subsp. Enterica serovar Typhimurium;ATCC 700720 T; HG323314

A9 / 0kGy Klebsiella pneumoniae strain

ATCC 13883 NR_114506 Klebsiella pneumoniae (T); 96,3% ATCC 13884T; Y17657 A9 / 2kGy K. pneumoniae 99% ATCC 13883 NR-114506 Klebsiella pneumoniae (T); 95,5% ATCC 13884T/ Y17657

A11 / 0kGy Klebsiella pneumoniae 95%

DSM 30104 NR_117683

Klebsiella pneumoniae (T); ATCC 13884T; Y17657

A12 / 0kGy Klebsiella pneumoniae 99%

DSM 30104/ NR_117686 88

Klebsiella pneumoniae (T); 89,9% DSM 30104 T; X87276

A12 / 2kGy Klebsiella pneumoniae strain

DSM 30104 16S ribosomal RNA gene, partial sequence

NR_117683

Klebsiella pneumoniae (T); 87,5% ATCC 13884T; Y17657

A15 / 0kGy Klebsiella pneumoniae 95%

DSM 30104 / NR_117683

Klebsiella pneumoniae (T); 89,7% DSM 30104 T; X87276

A15 / 2kGy Klebsiella pneumoniae 98%

DSM 30104 / NR_117683

Klebsiella pneumoniae (T); 94,2% ATCC 13884T; Y17657

A25 / 0kGy Salmonella enterica subsp. enterica

serovar Typhimurium strain ATCC 13311 CP009102

Salmonella enterica (T); LT2; SGSC 1412; ATCC 700720; AE006468 96,8%

A27 / 0kGy Bacillus simplex strain 98%

LMG 11160 / NR_114919

Bacillus simplex (T); 95,9% DSM 1321T; AJ439078

A29 / 0kGy Enterobacter hormaechei 98%

CIP 103441 / NR - 042154.1

Enterobacter hormaechei 89 %CIP 103441 / AJ508302

É importante salientar que, nos controles das amostras 7 e 25, também provenientes da Bahia, foi confirmada a presença de S. enterica. Entretanto, estas mesmas amostras quando irradiadas com níveis 2, 3 e 5 kGy não apresentaram Salmonella. Além de S. enterica, foi confirmada a presença de Enterobacter hormaechei no controle das amostras 5 (Pará) e 29 (Ghana), que prevaleceu na amostra 5 após a irradiação de 2 kGy. Finalmente, no controle da amostra 27 (Bahia) foi detectada a espécie Bacillus simplex.

A Figura 12 resume o número de amostras de amêndoas de cacau relacionadas com a infecção por enterobactérias, confirmadas pela análise de sequenciamento

.

Figura 12. Número de amostras de amêndoas de cacau relacionadas com a infecção por bactérias.

Os resultados obtidos mostram a ocorrência de enterobactérias nas amêndoas de cacau, que foram vulneráveis a baixas doses de irradiação, ou seja, de 2 kGy, incluindo as duas amostras provenientes da Bahia onde se detectou a presença de Salmonella. Assim, pode-se considerar que já neste nível de irradiação ocorreu um controle do crescimento bacteriano. Ainda, as doses superiores de irradiação utilizadas, ou seja, de 3 e 5 kGy inibiram totalmente a presença de bactérias.

Bonvehi et al. (2000) realizaram um estudo para melhorar a qualidade higiênica do cacau, usando irradiação para controle e eliminação de enterobaterias, fungos e leveduras. O

0 1 2 3 4 5 6 7 8 Bacillus Enterobacter Klebsiella Salmonella Número de amostras Es p écie d e b act eria

subproduto da indústria utilizado foi a casca de cacau, que contém fibras dietéticas (57 %), proteínas (15 %), minerais (10,7 %), manteiga de cacau (2,3 %) e demais carboidratos (2,8%). As doses de irradiação usadas foram 5, 8 e 10 kGy. Os autores verificaram que uma dose de 5 kGy já era suficiente para diminuir a contagem microbiana, não havendo alterações sensoriais do produto.

O uso da irradiação gama (Co60) foi realizado na descontaminação dos grãos de arroz branco polido, onde os resultados demostraram que doses de 6,5 kGy e 7,5 kGy foram eficientes para eliminar completamente gorgulhos e traças. Apenas o 7,5 kGy foi a dose que conseguiu combater os fungos do gênero Aspergillus e Penicillium. Estas doses alteraram as propriedades da pasta, reduzindo a viscosidade do arroz, porém os grânulos de amido não foram afetados (SOUZA, 2011).

Em duas variedades de café (Arábica e Robusta), foi avaliado o efeito da irradiação gama (Co 60) com o número de unidades formadoras de colônias. O resultado mostrou redução de 120 UFC/g para 4 UFC/g dos fungos quando se aplicou a dose de 5 kGy. Se verificou que doses maiores a 10 kGy houve uma completa ausência de fungos (AHMAD et al., 2002).

Em relação ao uso da irradiação gama para controle de micro-organismos em amêndoas de cacau, não foram encontradas informações na literatura sobre estudos visando a redução da presença de Enterobacteria ou especificamente Salmonella. O principal objetivo dos trabalhos relacionados com o uso da irradiação gama em amêndoas de cacau tem sido o controle do crescimento de fungos e redução de insetos presentes.

Pesquisas têm demostrado a presença de enterobactérias totais, coliformes, E. coli e Salmonella nos chocolates produzidos no Brasil. Nascimento et al. (2011) analisaram 150 amostras de produtos derivados do cacau entre nibs, liquor, torta, manteiga de cacau e cacau em pó. Foi detectada a presença de enterobactérias em 17 % das amostras de nibs; 20 % apresentaram coliformes totais e houve a presença de coliformes tolerantes em uma amostra.

Em outra pesquisa desenvolvida para avaliar a presença de Salmonella e sua resistência térmica durante o processamento térmico do chocolate (Conchagem), Nascimento et al. (2012) avaliaram três diferentes temperaturas, 50 °C, 60 °C e 70 °C. Os autores demostraram que a temperatura de 70 °C permitiu maior inativação do patógeno do que as

temperaturas mínimas (50-60°C), e que a variação foi pequena, demostrando que se houver amostra contaminada proveniente do pré-processamento das amêndoas, não se pode garantir que durante a etapa do processamento (conchagem) a Salmonella possa ser inativada, bem como se assegurar um produto final como chocolate inócuo para o consumidor.

5.2 Presença de fungos e efeito da irradiação gama em amêndoas de cacau

Foi realizada análise de fungos através da técnica de plaqueamento direto para verificar o efeito da irradiação gama na microbiota fúngica. Cada uma das 31 amostras foi analisada em triplicata. Os resultados da análise de variância (ANOVA) realizada para as amêndoas infectadas e respectivos tratamentos de irradiação (0, 2, 3 e 5 kGy) estão apresentados na Tabela 5. Os resultados médios obtidos para as 31 amostras de amêndoas de cacau foram também comparados através do teste de Tukey (Tabela 6). Os resultados foram considerados independentemente um do outro para cada tratamento.

Tabela 5. Análise de variância do efeito da irradiação gama sobre a presença de fungos em amêndoas de cacau.

Variação

Graus de liberdade (G.L)

Soma dos Quadrados

(SQ) MQ Valor F P-valor Tratamentos 3 14646,3805 4882,126832 5,6167 0,001228 Resíduo 120 104305,9553 869,2162938 Total 123 118952,3357

Tabela 6. Efeito das diferentes doses de irradiação na porcentagem de fungos presentes em amêndoas de cacau. Médias de triplicata em cada dose de irradiação.

Dose de irradiação (kGy) Médias (%)

0 86,88a

2 70,22b

3 65,38b

5 59,89b

A análise de variância (ANOVA) mostrou que houve diferença significativa entre os tratamentos nos diferentes níveis de irradiação (p<0,5) (Tabela 5). Através da comparação de médias foi possível verificar que todos os níveis de irradiação avaliados foram estatisticamente significativos em relação ao controle (Tabela 6), porém não diferiram entre si. Além disso, a porcentagem de fungos nas amostras foi inversamente proporcional ao nível de irradiação.

Em relação ao nível mais alto de irradiação testado, cabe salientar que a dose de 5 kGy não foi capaz de eliminar totalmente a presença de fungos nas amêndoas de cacau, havendo uma prevalência de cerca de 60 % de contaminação fúngica após o tratamento. Porém em relação ao total de amêndoas infetadas no controle com referência as amêndoas tratadas com doses de irradiação, cabe salientar que as doses de 2, 3, 5 kGy foram capazes de diminuir a contaminação fungica em 17%; 22% e 27% respetivamente em relação ao controle.

A Figura 13 mostra a diferençana porcentagem de infeção fúngica observada para o controle (sem irradiação) em relação às amostras tratadas com as diferentes doses de irradiação.

A FAO/OIEA/OMS segundo informe técnico N° 604 (1977) e 659 (1981) recomendam que em amêndoas de cacau a dose de irradiação recomendada para combater a infestação de insetos durante o armazenamento é de 1 kGy. Porém doses de 5 kGy são consideradas ótimas para reduzir a carga microbiana das amêndoas de cacau fermentados, seja com ou sem tratamento térmico.

Existem poucas pesquisas como uso da irradiação para o controle de fungos em cacau. Amoako-Atta em 1979, para evitar a infestação por insetos que estava afetando na produção de amêndoas de cacau em Ghana, fez uso de doses menores a 1 kGy de irradiação gama com Cobalto 60 durante o armazenamento. O resultado demostrou desinfecção das amêndoas de cacau e maior tempo de armazenamento.

Amuh (1977) demostrou que amêndoas de cacau tratadas a níveis de irradiação de 5 kGy e armazenadas em condições de umidade relativa de 80-85% e temperatura de 27°C, foi eficiente para controlar o crescimento de fungos e a infestação de insetos durante o armazenamento. A mesma pesquisa mostrou que as amêndoas irradiadas conseguiram prolongar o tempo de armazenamento em 12 meses a diferença que as não irradiadas só podem ficar armazenadas durante dois meses.

Figura 13. Porcentagem média da presença de fungos em função da dose de irradiação. A. Sem irradiação (0 kGy) B. (2 kGy)

Restaino et al.(1984) realizaram estudo em amêndoas de cacau provenientes da Bahia, as quais foram contaminadas artificialmente com esporos de Arpergillius flavis e Penicillium citrinum. Os autores demostraram que a aplicação de doses de 4 e 5 kGy foram suficientes para reduzir drasticamente a contaminação fúngica com esporos de Arpergillius flavis e Penicillium citrinum nas amêndoas de cacau. O autor recomenda que para incrementar o tempo de armazenamento, é necessário irradiar as amêndoas de cacau imediatamente após a etapa de secagem e assim evitar a contaminação por fungos xerofílicos que contaminam as amêndoas de cacau durante o armazenamento. Nesse mesmo estudo foram analisadas amêndoas de cacau provenientes de Costa de Marfim. As bacterias encontrados no estudo foram Bacillus, B. brevis e B. megaterium. Foram analisadas doses de 2, 3, 4 e 5 kGy. Os resultados demonstraram que a dose 5 kGy foi eficiente para reduzir mas não eliminar a presença de Bacillus nas amêndoas de cacau.

5.3. Efeitos da irradiação gama sobre as propriedades físico-químicas de amêndoas de cacau.