Procedimentosdebancparagramposreformulando

Procedimentos de Bancada Para Identificação de:

Cocos Gram Positivos - Staphylococaceae

&

Cocos Gram Positivos - Streptococaceae.

Procedimentos de Bancada Para Identificação da:

Família Streptococcaceae

&

ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS

Estudo Laboratorial dos Streptococcus spp.,

Os Streptococcus spp., são um grupo heterogêneo de microrganismos, os quais apresentam inúmeras espécies capazes de colonizar e infectar homens e animais. Os pertencentes a esta família apresentam características que são compartilhadas por todos os seus membros. Entretanto, aspectos antigênicos, de cultivo e bioquímicos são utilizados na diferenciação deste grupo de bactérias.

1) Material Fornecido:

1) Meios de cultura com crescimento bacteriano devidamente identificado, 2) Caldo BHI contendo a cepa em meio líquido devidamente identificado, 3) Agar CLED/MacConckey estéreis,

4) Alça bacteriológica estéril descartável loop 1/100, 5) Laminas ponta fosca de vidro limpas,

6) Bico de Bunsen. 7) Fósforo,

8) Lápis dermográfico,

9) Placa de Petri contendo meio de cultura estéril (Ágar sangue estéril, Agar Manitol Sal, Caldo BHI, Agar Cled/MacConckey),

10) Coloração de Gram. 11) Agar Bile esculina 12) Novobiocina 13) Optoquina 14) Bacitracina

15) Peróxido de Hidrogênio

16) Plasma humano descomplementado 17) Kit coagu plasma

18) Api Staphylo

2) Procedimentos:

1) Identificar a placa com a seqüência de seu grupo e com a identificação da placa em estudo que foi entregue.

2) ATRÁS da chama do Bico de Bunsen, abrir a placa contendo o cultivo microbiano de 24 horas e recolher uma pequena porção de uma colônia bem isolada com auxílio de alça bacteriológica estéril.

3) Espalhar a pequena porção recolhida na superfície da Placa de Petri contendo o meio de cultura sólido estéril conforme o esquema abaixo:

Estria inicial

Estria Final: obtenção de colônias isoladas para

identificação Piques para hemólise

Incubar as placas em posição invertida (meio de cultura para cima), em estufa bacteriologia a 35-37ºC, durante 24 horas.

4) Método quantitativo:

Método de Inoculação por Varredura de Alça

1 – Inoculação Primária 2 – Semear em estrias retas (90 )

3 – Semear em estrias retas para produzir rede de crescimento

Identificação de Streptococcus spp.,

01) Análise Macroscópica das Colônias em Ágar Sangue de Carneiro:

1) Crescimento em meio sólido: lembre-se as colônias de Streptococcus spp., são sempre

colônias minúsculas que lembram “gota de orvalho”.

2) Efetuar a coloração de Gram dos meios entregue (Agar sangue e BHI)

3) Observar tamanhos, formas e cores das colônias e principalmente se há formação de hemólise

4) Caracterizar a hemólise formada (alfa, beta ou gama) - estes MØ são capazes de promover lise das hemácias presentes no meio de cultura, podendo ser classificadas em

I: Hemólise Total ou ß Hemólise: são reações que resultam em uma formação de uma zona clara ao redor das colônias bacterianas, quando inoculadas em Ágar Sangue

Carneiro.

II: Hemólise Parcial ou α Hemólise: são reações que resultam em uma formação de uma zona esverdeada ao redor das colônias bacterianas, quando inoculadas em Ágar Sangue

Carneiro indicando uma hemólise parcial do meio.

III:Ausência de Hemólise ou γ Hemólise: o Ágar Sangue de Carneiro permanece íntegro ao redor das colônias, após o crescimento bacteriano típico do gênero.

02) Teste da Catalase (realizar SOMENTE a partir de colônia isolada em meio que não contenha

sangue).

1) Separar 02 a 03 colônias IDÊNTICAS com um palito de madeira, ou plástica estéril sobre uma lâmina de vidro limpa, seca, desengordurada e estéril e adicionar 01 a 02 gotas de peróxido de hidrogênio 3% (água oxigenada), diretamente sobre as colônias.

2) Observar a ausência ou presença na formação de bolhas de oxigênio o que poderá ser traduzido respectivamente como um Teste (-) ou (+) para a Catalase Bacteriana e, portanto, positivo para o gênero Staphylococcus spp., (quando há formação de bolhas – teste positivo) ou negativo para Staphylococcus spp., e positivo Streptococcus spp., (quando não há formação de bolhas – teste negativo para catalase bacteriana)

ß- Hemolítico

Teste Bacitracina

Sensível

Resistente

Teste Esculina Biliar

Streptococcus pyogenes

Teste Camp

Positivo

Negativo

- Hemolítico

Teste Optoquina

Sensível

Resistente

Teste Solubilidade em Bile

Negativo

Streptococcus pneumoniae

Positivo

Teste Esculina

03) Teste da Bile Esculina:

Verifica a capacidade que a bactéria possui de hidrolisar a esculina em esculetina e glicose, na presença de bile.

3.1) Teste muito utilizado na diferenciação de Enterococcus spp., e Streptococcus spp.,

3.2) Procedimento: inocular a cepa teste, através de estrias em superfície do meio inclinado, e

incubar em estufa bacteriologia a 35-37ºC, durante 24 horas.

3.3) Cor original do meio: Palha

3.4) Teste Positivo: desenvolvimento de coloração preta na base e na superfície inclinada do meio

ou apenas na superfície.

3.5) Teste Negativo: o meio não altera a cor, ou fica levemente enegrecida no ápice da superfície

inclinada.

OBS.: apenas crescimento no meio não significa reação positiva.

04) Teste da Bacitracina:

4.1) Deve ser realizado em Agar Sangue sem tensão de CO2, ou poderemos ter resultados

conflitantes.

4.2) Semear uma placa de Agar Sangue pelo método de varredura, e colocar um disco de Ba

0,004U, procedendo incubação 18 a 24h sem tensão de CO2

4.3) Qualquer zona de inibição deverá ser interpretada como sensibilidade, portanto um teste

positivo.

4.4) Resultado (+): Streptococcus pyogenes (GA)

05) Teste da Optoquina:

5.1) Enriquecida a colônia em estudo em caldo BHI por uma hora a 35ºC.

Semear pelo método de varredura uma placa de Ágar Sangue com a colônia α hemolítica em estudo,.

5.2) Aplicar um disco de Optoquina e incubar a 35ºC em jarra de anaerobiose.

5.3) Uma zona de inibição de 14mm ou mais à volta do disco significa sensibilidade e uma

positividade do teste, para Streptococcus pneumoniae.

γ- Hemolítico

Teste Esculina Biliar

Negativo

Positivo

Streptococcus viridans

Enterococcus faecalis

Estudo laboratorial dos Staphylococcus spp.,

O gênero Staphylococcus spp., compreende um grupo de espécies significativamente patogênicas para o homem, causando um amplo espectro de doenças que variam de infecções cutâneas superficiais a doenças sistêmicas fatais, sendo inclusive responsável por muitas infecções adquiridas no ambiente hospitalar. Estão entre as mais resistentes das bactérias patogênicas e são difíceis de serem eliminadas da pele e de membranas mucosas humanas.

1) Material Fornecido:

1) Idem ao item da página 02.

2) Procedimentos:

1) Identificar a placa com a seqüência de seu grupo e com a identificação da placa em estudo (as duas placas entregue).

2) ATRÁS da chama do Bico de Bunsen, abrir a placa contendo o cultivo microbiano de 24 horas e recolher uma pequena porção de uma colônia bem isolada com auxílio de alça bacteriológica estéril.

3) Espalhar a pequena porção recolhida na superfície da Placa de Petri contendo o meio de cultura sólido estéril conforme o esquema abaixo:

4) Após, com a mesma alça, recolher mais outra pequena porção do cultivo fornecido e inocular em outra placa de Agar manitol, repetir este processo pela segunda vez utilizando a última placa

5) ATENÇÃO: para utilizar a mesma alça bacteriológica, deve ser seguida uma seqüência lógica de escolha dos meios de cultura, observando para isso a seletividade do meio (ou seja, pode-se semear a seqüência AGSG → AGMN com a mesma alça, pois parte-se de um meio não seletivo para um com maior seletividade e indicador de pH, porém sem corantes)

6) Incubar as placas em posição invertida (meio de cultura para cima), em estufa bacteriologia a 35-37ºC, durante 24 horas.

Estria inicial

Estria Final: obtenção de colônias isoladas para

Identificação de Staphylococcus spp.,

1) Análise Macroscópica das Colônias em Ágar Sangue de Carneiro e Ágar Manitol Hipertônico:

1) Crescimento (+) ou (-)

2) Em Ágar Sangue de Carneiro observar tamanhos, formas e cores das colônias e se há formação de hemólise

3) Caracterizar a hemólise formada (alfa, beta ou gama)

4) Em Ágar Manitol Hipertônico: observar a fermentação do AGMN 5) (+) = Amarelo

6) ( -) = Vermelho

2) Teste da Catalase – Identificação Preliminar

(realizar somente de colônias isoladas no AGMAN):

1) Separar 02 a 03 colônias IDÊNTICAS com um palito de madeira ou alça descartável estéril sobre uma lâmina de vidro limpa, desengordurada e estéril e adicionar 01 a 02 gotas de peróxido de hidrogênio 3% (água oxigenada), diretamente sobre as colônias. 2) Observar a formação de bolhas de oxigênio (teste (+) para família Staphylococcaceae) 3) Não observação de bolhas de oxigênio (teste (-) = família Streptococaceae)

4) Obs.: aconselha-se não realizar este teste a partir de Ágar sangue (humano ou de carneiro), pois o mesmo além de exibir hemácias que contém Ags e Acs são naturalmente catalase (+).

03) Teste da Coagulase

3.1) Prova da Coagulase Conjugada ou Ligada, ou Fator Aglutinante ou “Clumping Factor”. 1) Prova realizada em lâmina: Este fator encontra-se na parede celular bacteriana que

reage com o fibrinogênio do plasma causando a coagulação do mesmo.

2) Procedimento:

A: Colocar 2 gts de salina em uma lâmina e emulsionar a colônia isolada a ser

testada (não usar colônias de meios seletivos - MN)

B: A seguir adicionar 1 gt. de plasma misturar com um palito de plástico, ou

madeira e observar a formação de aglutinação por 10 segundos.

3.2) Coagulase Livre

1) Prova realizada em tubo:

A: Esta prova baseia-se na presença da coagulase livre que reage com o fator plasmático

formando um complexo que atua sobre o fibrinogênio tendo como produto final a formação da fibrina.

B: Adicionar 0,1 mL de caldo BHI incubado por uma noite com a colônia em estudo a um

tubo de ensaio com 0,5 mL de plasma e incubar por 4 horas a 35ºC em estufa ou BM.

C: A formação do coágulo é observada pela suave inclinação do tubo à 90º e visualização

Fluxograma Para Identificação Manual da Família Micrococaceae.

Cocos Gram Positivos em Cachos ao Gram

Prova da Catalase

Negativa

Positiva

Família Streptococaceae

Família Micrococaceae

Prova da Coagulase

Negativa

Positiva

Prova da Dnase

Positiva

Staphylococcus aureus

Staphylococcus coagulase negativo

Teste da Bacitracina

Resistente < 10mm

Sensível > 10mm

Micrococcus

Staphylococcus spp

Teste da Novobiocina

Resistente < 14mm

Sensível > 14mm

Agente

Característica Colonial

Doença

Identificação

Staphylococcus aureus

Colônias cremosas,

brancas, creme opaca e beta

hemolíticas em Ágar Sangue

Carneiro.

Infecções de pele

sistêmicas ou tóxicas

Coagulase positiva

Fermentadora de Ágar Sal

Manitol.

Staphylococcus epidermidis

Colônia cremosa branca

opaca

Infecções

oportunistas, Endocardite,

Infecções associadas a

cateteres e bacteremia.

Coagulase negativa

Sensível a Novobiocina

Não Fermentadora de Ágar

Sal Manitol.

Staphylococcus saprophyticus

Colônias brancas opaca

Infecções do Trato

Urinário em mulheres

sexualmente ativas

Coagulase negativa

Resistente a Novobiocina

Pode fermentar Ágar Sal

Manitol.

Micrococcus

Colônia amarela

Não patogênico

Coagulase negativo

Não fermentador de Ágar

Sal Manitol

Relatório de Aula Prática em Staphylococcus spp., e Streptococcus spp.,

Número das cepas bacterianas entregue: _____ e _____ Descreva o que será solicitado a seguir:

# Para Sexta Feira - Período Noturno

01: Características Macroscópicas das Colônias de cada placa de inóculo bacteriano entregue 02: Descrever a Hemólise (se aplicável), dos meios de cultura entregue.

04: Descrever a capacidade de fermentação de açucares (se aplicável), dos meios de cultura entregue

05: Nome dos meios entregue.

06: Confeccionar lâminas a partir dos meios líquidos e proceder à coloração de Gram, liberando o laudo no relatório que será entregue no sábado;

07: Efetuar varredura de alça em Ágar CLED a partir do Agar sólido.

08: Efetuar esgotamento de alça em Ágar Sangue Carneiro bem como Agar Manitol Sal a partir do Agar indicado realizando os piques para produção de hemólise, quando essa metodologia for aplicável.

09: Efetuar o Teste da Catalase Bacteriana a partir do Agar indicado. 10: Efetuar o teste da coagulase bacteriana conforme o POP

11: Confeccionar Provas Bioquímicas de identificação das duas cepas recebidas

# Para Sábado – Período Vespertino

01: Efetuar Leitura das Provas Bioquímicas confeccionadas no dia anterior e descrever os testes bem como os resultados obtidos.

02: Liberar o laudo de Gram das lâminas coradas no dia anterior.

03: Realizar contagem de colônias do Ágar CLED inoculado no dia anteriores descrever as características macroscópicas das colônias, bem como a contagem de colônias em sua placa de Agar Manitol Sal.

04: Efetuar o descarte dos materiais identificados conforme noções de Biossegurança outrora ministrado (plástico, vidro, luvas e papéis contaminados).