INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
IMUNOLOGIA E DIP/ GENÉTICA E BIOTECNOLOGIA
JUAN CARLOS AVILA LÓPEZ
ESTUDO DE
ASSOCIAÇÃO AMPLA DO GENOMA (GWAS) PARA A
CARACTERÍSTICA LÁBIO LEPORINO EM BOVINOS DA RAÇA GIR
LEITEIRO
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
JUIZ DE FORA
2019
ESTUDO DE
ASSOCIAÇÃO AMPLA DO GENOMA (GWAS) PARA A
CARACTERÍSTICA LÁBIO LEPORINO EM BOVINOS DA RAÇA GIR
LEITEIRO
Dissertação de Mestrado do Curso de Pós-Graduação em Ciências
Biológicas: Área: Genética e
Biotecnologia, para obtenção do Título de Mestre em Ciências Biológicas: Área: Genética e Biotecnologia.
Orientador: Prof. Dr. Marco Antonio Machado
Co-orientador: Prof. Dr. Marcos Vinicius Gualberto Barbosa da Silva
JUIZ DE FORA
2019
À minha família que, com amor, paciência e esforço me permitiu realizar mais um sonho hoje, obrigada por dar em mim o exemplo de esforço e coragem, de não temer as adversidades, porque Deus está sempre comigo.
À Organização dos Estados Americanos (OEA) que me deu a oportunidade de fazer meus estudos de pós-graduação
Ao Diretor de Relações Internacionais (DRI), sempre atento às minhas necessidades pessoais e acadêmicas, além de ser o principal elo entre a universidade e as organizações internacionais de apoio aos estudantes.
À Universidade Federal de Juiz de Fora que abriu minhas portas e me permitiu seguir esse caminho.
À todas as autoridades, funcionários e amigos do Laboratório de Genética Molecular da Embrapa Gado de Leite, por confiarem em mim, abrirem as portas e me permitirem realizar todo o processo com sua empresa, especialmente meu orientador Marco Antonio Machado e o co-orientador Marcos Vinicius da Silva, que com o ensino de seu valioso conhecimento fez com que você crescesse como profissional no dia a dia, agradeço a cada um pela paciência, dedicação, apoio incondicional e amizade.
O Brasil possui o maior rebanho bovino do mundo, sendo que a genética da raça Gir está presente em mais de 80% dos rebanhos leiteiros, por possuir características fisiológicas especiais. Pela alta utilização de animais de genética superior, doenças relacionadas a diminuição da base genética podem se tornar mais frequentes. O lábio leporino é uma alteração congênita caracterizada pela falha no fechamento dos processos faciais, que impede a alimentação adequada do animal, além de desvalorizar o animal afetado e o seu rebanho. Os estudos de associação ampla do genoma (GWAS) podem ajudar no entendimento da herança e dos mecanismos moleculares envolvidos nessa característica indesejável. Deste modo, o objetivo desse trabalho foi identificar regiões genômicas e genes candidatos para a característica lábio leporino em bovinos da raça Gir Leiteiro. As amostras de animais caso e controle foram enviadas por produtores participantes do Programa Nacional de Melhoramento do Gir Leiteiro. Para tanto, foi utilizada a metodologia GWAS para casos e controles, onde o grupo caso foi representado por 16 animais possuidores do fenótipo lábio leporino e o grupo controle por 48 animais possuidores do fenótipo saudável e menos aparentado com o grupo caso, definidos por meio de uma matriz de similaridade genômica. O DNA foi extraído pela metodologia do fenol clorofórmio e avaliado por espectrofotometria de nano volume. As amostras foram submetidas à análise de array de SNPs por meio do BovineHD Genotyping BeadChip. O controle de qualidade dos genótipos foi realizado por meio do pacote computacional Golden Helix SVS 7 em que foram removidos marcadores não autossômicos com call rate <95%, frequência mínima de alelos (MAF) <2% e equilíbrio de Hardy-Weinberg <10-6.
As análises de GWAS foram realizadas utilizando o modelo aditivo e o modelo dominante no mesmo pacote computacional e os resultados foram apresentados em gráficos do tipo Manhattan. Regiões genômicas onde foram obtidos resultados significativos foram exploradas para identificar genes candidatos localizados dentro ou próximo às regiões mapeadas. Nosso estudo foi capaz de encontrar 265 SNPs significativos divididos em 100 regiões genômicas, nas quais foram identificados 35 genes candidatos associados a fenda labial, o que fornece informações para futuras pesquisas sobre lábio leporino em bovinos.
Brazil has the largest cattle herd in the world and the genetics of the Gir breed are present in more than 80% of dairy herds, due to their special physiological features. Due to the high use of genetically superior animals, diseases related to narrow genetic base may become more frequent. The cleft lip is a congenital alteration characterized by the failure to close the facial processes, which prevents proper feeding of the animal, in addition to devaluing the affected animal and its herd. Genome wide association studies (GWAS) can help understanding the inheritance and molecular mechanisms involved in this undesirable trait. Thus, the aim of this work was to identify genomic regions and candidate genes for cleft lip condition in Gir dairy cattle. Samples of case and control animals were sent by producers who participate in the Brazilian Dairy Gir Breeding Program. GWAS procedure was used to analyse 16 animals with cleft lip phenotype (case group) and 48 animals displaying healthy phenotype (control group) and less related to the case group, defined by a matrix of genomic similarity. DNA was extracted using chloroform phenol methodology and evaluated by nano volume spectrophotometry. All samples were subjected to SNP array analysis thorugh the BovineHD Genotyping BeadChip. Genotype quality control was performed using the Golden Helix SVS 7 computational package, which removed non-autosomal markers with call rate <95%, minimum allele frequency (MAF) <2% and Hardy-Weinberg equilibrium <10-6. GWAS analyses were performed using the additive and
dominant models in the same data set and the results were displayed in Manhattan plots. Genomic regions where significant results were obtained were explored to detect candidate genes located within or near the mapped genomic regions. We were able to find 265 significant SNPs distributed into 100 genomic regions, in which 35 candidate genes associated with cleft labyrinth were identified, providing information for future research on the cleft lip condition in cattle.
Tabela 1. Resultados do GWAS para lábio leporino em gado Vorderwald, Montbeliarde. ... 18 Figura 1. Gráfico de Manhattan do modelo aditivo do estudo de associação do genoma para o lábio leporino (caso/controle) em bovinos da raça Gir. Os valores de Log10P de todo o genoma para cada efeito SNP são plotados em relação à sua posição em cada cromossomo. Os cromossomos são diferenciados por cores e numeração. As cores dos cromossomos são identificadas abaixo do gráfico. ... 32 Figura 2. Gráfico de Manhattan do modelo dominante do estudo de associação do genoma para o lábio leporino (caso/controle) em bovinos da raça Gir. Os valores de Log10P de todo o genoma para cada efeito SNP são plotados em relação à sua posição em cada cromossomo. Os cromossomos são diferenciados por cores e numeração. As cores dos cromossomos são identificadas abaixo do gráfico. ... 33
1 INTRODUÇÃO ... 12
2 REFERENCIAL TEÓRICO ... 13
2.1 Bovinocultura de leite no Brasil ... 13
2.2 Malformações congênitas ... 14
2.3 Lábio leporino ... 16
2.4 Técnicas de reprodução e risco de malformações congênitas ... 18
2.5 Ferramentas genômicas na produção animal ... 19
2.6. Estudos de associação ampla do genoma (GWAS) ... 20
2.6.1 Etapas do GWAS ... 22
2.6.2 Controle de qualidade nos GWAS ... 22
2.7 Estratificação da população ... 23
3 OBJETIVOS ... 25
3.1 Obejtivo Geral ... 25
3.2 Objetivos Específicos ... 25
4 MATERIAL E MÉTODOS ... 26
4.1 Seleção da população alvo ... 26
4.2 Coleta de dados fenotípicos, demográficos, genealógicos e amostras biológicas ... 26
4.3 Extração de material genético (DNA) e genotipagem dos marcadores SNPs ... 27
4.4 Estudos de associação ampla do genoma (GWAS) e estratégias para a identificação de genes candidatos ... 28
4.5 Detalhamento do desenho experimental ... 29
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 30
5.1 Controle de qualidade dos genótipos ... 30
5.2 Estudos de associação ampla do genoma ... 30
7 CONCLUSÕES ... 44
1 INTRODUÇÃO
Os programas de seleção e melhoramento genético de bovinos leiteiros têm como objetivo principal aumentar a produtividade animal para várias características de interesse, no entanto, pela alta utilização de animais de genética superior, doenças relacionadas a diminuição da base genética podem se tornar mais frequentes (MARTÍNEZ & SUÁREZ, 2016; REXROAD et al., 2019). Essas doenças genéticas podem causar grandes perdas devido ao fraco desempenho do animal, que na sua maioria são descartados e, se a doença permanecer sem ser detectada, a frequência dos alelos deletérios podem aumentar nas gerações subsequentes (KALE, 2018; SLMLANER, SOLBU, SCHAEFFER, 1991).
O lábio leporino é uma alteração congênita caracterizada pela falha no fechamento dos processos faciais que impede a alimentação adequada do animal, além de desvalorizar o animal afetado e também o seu rebanho (PRIETO & MENDOZA, 2006b; PALONE & VARGAS, 2016).
Os estudos de associação ampla do genoma (GWAS) podem ajudar no entendimento da herança e dos mecanismos moleculares envolvidos nessa característica indesejável (EGGEN, 2012) que poderão ser utilizados para desenvolver estratégias de prevenção e tratamento (BUSH & MOORE, 2012).
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Bovinocultura de leite no Brasil
As raças zebuínas desempenham um papel importante na pecuária tropical, pois possuem características fisiológicas especiais, tais como resistência ao calor, resistência a carrapatos e parasitas intestinais, que as tornam mais adequadas para este tipo de ambiente (SILVA, 2010; KAUSHIK & GARG, 2003; LIAO et al., 2013; QUIROZ, GRANADOS, OLIVA, 2014). Estima-se que mais de 70% da população bovina do mundo pertence ou é cruzada com estas raças e, no Brasil, a genética da raça Gir está presente em mais de 80% de rebanhos leiteiros (REIS FILHO et al., 2010; LIAO et al., 2013).
OBrasil possui o maior rebanho comercial do mundo que, de acordo com o censo agropecuário de 2018, o País possuia 213,7 milhões de cabeças de gado. Estima-se que o crescimento da produção aumentou 1,6% comparado com o ano anterior, somando 33,8 bilhões de litros. Pela primeira vez, a produtividade nacional de leite ultrapassou os 2 mil litros por vaca ao ano, crescimento de 4,7% frente a 2017. Acredita-se que a produtividade nacional aumentou devido às condições meteorológicas, melhoramento e nutrição de rebanhos e especialização de produtores (IBGE, 2019).
Nos últimos anos, visando melhorar a produção, tornou-se comum a realização de estudos genéticos em bovinos, no entanto têm sido escassos os estudos populacionais, que são necessários para compreender melhor a variabilidade genética, o fluxo de genes e a distância genética entre os rebanhos (MAIORANO et al., 2018). O que tem sido utilizado para este fim é a informação genealógica, que demonstra a existência de pouca variabilidade na população corrente, o que indica que a população evoluiu a partir de uma base genética estreita (DE OLIVEIRA et al., 2012). No entanto, a preocupação com endogamia,estrutura genética e a diversidade da população do gado Gir tem aumentado, pois já existem relatos sobre os efeitos adversos da endogamia na produção de leite, em características reprodutivas
(CHOUDHARY et al., 2005; JOSÉ et al., 2001; LIAO et al., 2013), e aumento de mudanças no genoma, gerando polimorfismos (STAFUZZA et al., 2017).
O genoma bovino (Bos taurus) é composto por mais de 2,7 bilhões de pares de base, sendo aproximadamente 94% distribuídos nos 29 cromossomos autossômicos, 5% no cromossomo sexual X e o restante no cromossomo Y e DNA mitocondrial (GEER et al., 2010). Mutações genômicas podem ser introduzidas a cada nova geração, sendo o tipo mais abundante os polimorfismos de um único nucleotídeo (SNP) (MOUNTAIN, 1992) .
Um dos grandes desafios para o melhoramento do gado de leite no Brasil é coletar os fenótipos mais relevantes, identificar as mutações causais e os mecanismos exatos pelos quais os fenótipos são produzidos e contribuir com os diferentes níveis mais elevados para as gerações seguintes (EGGEN, 2012).
2.2 Malformações congênitas
As malformações congênitas, anomalias congênitas ou defeitos de nascimento são alterações estruturais ou funcionais que podem ocorrer durante a concepção ou vida intrauterina, que podem ser detectados durante a prenhez, parto ou mais tarde durante a fase de produção do animal (OMS, 2019). Estes defeitos são quaisquer anormalidades na estrutura do corpo, defeitos microscópicos, erros de metabolismo, distúrbios fisiológicos, anormalidades celulares e moleculares,não são necessariamente patológicas e podem aparecer isoladas ou fazerem parte de uma síndrome (ARTURO, FIERRO, TASTEKIN, 2008; FRANCINE, PASCALE, ALINE, 2014; ROJAS & WALKER, 2012). No entanto, devem ser considerados como desvios do desenvolvimento normal e podem ser de relevância clínica significativa maiores ou menores (GONZALES, 2015). As maiores, se não forem corrigidas, comprometem profundamente a função corporal e podem até aumentar a mortalidade (ARTURO, FIERRO, TASTEKIN, 2008).
Em geral, as causas das malformações congênitas podem ser divididas em cinco grandes grupos: (1) defeitos de um único gene (genes mutantes); (2) anormalidades cromossômicas; (3) distúrbios multifatoriais que são o resultado da
interação entre predisposição genética e fatores ambientais; (4) fatores teratogênicos; e (5) aqueles de causa desconhecida (LAMMENS et al., 2002).
Em bovinos, tem sido descrito que uma das principais causas ambientais que ocasionam malformações são os agentes teratogênicos. A suscetibilidade aos agentes tem relação com a genética do animal e a maneira como ele interage com fatores ambientais, o estágio de desenvolvimento alcançado no momento em que é exposto ao teratógeno e a dose do agente. O período mais sensível aos teratógenos se estende entre a terceira e a oitava semana de idade pós-fertilização, pois esta é a fase em que a maioria dos órgãos e sistemas estão sendo formados. Os principais agentes teratogênicos para bovinos são a ingestão dos gêneros de plantas Veratrum, Lupinus, Astragalus, Oxytropis e Conium, assim como diversos vírus, bactérias e parasitas (PAVARINI et al., 2008; ROJAS & WALKER, 2012).
A influência da genética nas malformações congênitas tem sido de difícil estabelecimento, principalmente porque a maioria delas é caracterizada por diversas manifestações fenotípicas, que em muitos casos são aparentemente não relacionadas e que são variáveis nos indivíduos afetados. Por outro lado, os estudos indicam que, frequentemente no desenvolvimento das malformações, há o envolvimento de diversos genes, além de suas interações destes com o ambiente. Para outros casos, no entanto, podem existir determinação monogênica e que as diversas manifestações fenotípicas são produzidas por efeitos pleiotrópicos de um gene (ROJAS; WALKER, 2012).
As doenças poligênicas resultam de múltiplos fatores genéticos e/ou epigenéticos e não se encaixam nos padrões mendelianos tradicionais de herança. Não há uma compreensão das complexidades genéticas da maioria das doenças poligênicas, e a elucidação da patogênese molecular de distúrbios multifatoriais permanece pouco conhecida (REISNER, RIVERBARK, COLEMAN, 2015).
A incidência de anomalias congênitas no gado de leite é de difícil determinação, porque apenas as malformações letais são geralmente relatadas uma vez que alteram significativamente o fenótipo do animal. Há múltiplos casos que não são reportados porque os produtores tem a opinião de que a divulgação da presença de malformações congênitas pode depreciar seu rebanho (ROJAS-LLEONART et al., 2010). Contudo, estima-se que a ocorrência destas anomalias é de 0,2% a 3% em todo o mundo, sendo que o conhecimento destas anomalias depende da frequência em que são estudadas e descritas (MARCOLONGO-PEREIRA et al., 2010).
2.3 Lábio leporino
O lábio leporino, também conhecido por queilosquise, cheilognathoschisis, fenda labial, fissura labiopalatal ou fenda palatal primária (CALDAS et al., 2014), é uma alteração craniofacial congênita produzida por defeitos embriológicos na formação da face (VERGARA; VELÁZQUEZ, 2012b). Essa doença é caracterizada por falhas de fechamento nos processos faciais, como os processos frontonasal, maxilar e mandibular (MORITOMO, TSUDA, MIYAMOTO, 2002), entre a quarta e décima segunda semana de gestação (VERGARA & VELÁZQUEZ, 2012a). Essa alteração pode ser classificada como sindrômica ou não-sindrômica, relacionada à presença ou ausência de outros defeitos físicos ou de desenvolvimento. No caso dos defeitos sindrômicos, por sua vez, podem ser classificados como cromossômicos, teratogênicos e não categorizados. No entanto, a maioria dos casos (70%) é de origem não sindrômica (PRIETO & MENDOZA, 2006).
De acordo com sua localização e morfologia, o lábio leporino não sindrômico pode ser classificado em três grandes grupos: unilateral (direita ou esquerda), média e bilateral. Os três casos podem ser classificados com ou sem fenda palatina (MORITOMO, TSUDA, MIYAMOTO, 2002; REINARTZ & DISTL, 2017). Em muitos dos processos relatados, a fenda labial é acompanhada pela perda do processo nasal e dos insidiosos. Além disso, tem-se observado um desvio facial lateral que pode ter diferentes graus de severidade (REINARTZ, SINA et al., 2015). Essas deformações causam má oclusão dentária, problemas na função mastigatória e erupção anormal, aumentando a chance de dentes retidos impedindo a alimentação correta do animal (GUTIÉRREZ & OTERO, 2006). As fissuras de palato deixam o canal oral em contato com o nasal, podendo causar complicações respiratórias como sinusite, rinite ou broncopneumonia (ANTUNES & BERNARDO, 2011).
Algumas das raças mais comumente reportadas com malformações orofaciais são: Simental, Charolês, Czech Red Pied, Holandesa, Gir, Hereford, Japonês Brown, Shorthorn e Vorderwald Montbeliarde (REINARTZ & DISTL, 2017). A taxa de incidência de lábio leporino em gado leiteiro, é difícil de determinação, pois é uma condição raramente descrita. Estima se que, no mundo, a frequência de fissuras labiopalatinas em bezerros contabiliza cerca de 5% de todos os defeitos congênitos (USTA, 2017).
Os fatores genéticos envolvidos nos diferentes tipos de fissura labiopalatina não sindrômica são difíceis de identificar devido aos níveis de penetrância, diferenças de sexo e outros fatores ambientais. Os estudos sobre lábio leporino sindrômico, têm dado pistas para identificar alguns genes que causam as fendas não-sindrômicas (AGBENORKU, 2013). Entre os fatores que têm sido reportados como causais de lábio leporino, estão a capacidade materna de manter as concentrações de zinco nos eritrócitos, concentrações de mioinositol, níveis adequados de vitaminas B6 e B12, capacidade de utilizar esses nutrientes e a incapacidade de metabolizá-los adequadamente, o que pode causar erros na síntese e transcrição do DNA. Uma relação próxima também foi encontrada na reação com certos medicamentos administrados, como antibióticos, anti-inflamatórios e analgésicos (AGBENORKU, 2013), assim como a reação com alcaloides da piperidina, tabaco silvestre (Nicotiana glauca), intoxicação com selênio e espécies lupinas, vírus Cache Valley, vírus Akabane, Aino e Chuzan e o vírus da diarreia viral bovina (BVD), sendo que todos eles podem induzir fenda lábio palatina em animais (USTA, 2017).
Em bezerros Shorthorn, o lábio leporino tem sido atribuído à homozigose de um gene autossômico recessivo simples (ZAFER, 2017), mas existe evidência em bovinos Angus, Jersey (LUPP et al., 2012; USTA, 2017), Vorderwald, Montbeliarde (REINARTZ & DISTL, 2017), que indica maior probabilidade de transmissão genética poligênica (LUPP et al., 2012; REINARTZ & DISTL, 2017; USTA, 2017). A pesquisa atual na busca das causas de lábio leporino é baseada em conjuntos de dados fornecidos por estudos GWAS, que demonstraram estatisticamente uma ligação entre o consumo de vitaminas (A, D) periconcepcional e variantes no genoma. Isso pode explicar parcialmente porque o alto consumo de vitaminas por gestantes parece proteger o feto da fenda labial (HAALAND et al., 2018).
Em outros modelos animais, foram propostos outros genes candidatos para lábio leporino em suas diversas formas: CRS1, CRS2, CPS-1, DCP-1, DCP2, MSX1, TGFB3 e AP-2. Em humanos, a deleção de MSX1 e IRF6 inclui fissuras orofaciais. Em ratos quando ocorre uma alteração no comportamento do gene TGFB3, é observada fenda palatina, por outro lado, na descendência dos ratos com alterações no gene de AP-2, são observadas alterações mais generalizadas (GUTIÉRREZ; OTERO, 2006; URIBE et al., 2017). No estudo do genoma bovino publicado por REINARTZ & DISTL (2017), foram identificados dois genes candidatos para lábio leporino: ABCB1 no BTA4 e TENM4 no BTA29 (Tabela 1). No entanto, é recomendada
a realização de mais pesquisas para identificar outras mutações para diferentes tipos de lábio leporino (REINARTZ & DISTL, 2017). O estudo aprofundado desta doença poderá permitir entender os fatores ambientais e genéticos envolvidos, porque a informação existente ainda é controversa (TETTAMANTI et al., 2017). Assim, a partir de novos dados consolidados para esta etiologia um sistema mais eficaz de aconselhamento genético pode ser estabelecido para prevenir a ocorrência destes tipos de anomalias (PALONE & VARGAS, 2016).
Tabela 1. Resultados do GWAS para lábio leporino em gado Vorderwald, Montbeliarde.
2.4 Técnicas de reprodução e risco de malformações congênitas
As técnicas de reprodução assistida vêm sendo utilizadas há muito tempo para solucionar problemas de fertilidade em medicina veterinária, além disso, ferramentas têm sido desenvolvidas para facilitar a seleção de características desejáveis para a produção de animais de genética superior (BRESSAN et al., 2015; IETS & PERRY, 2012). No Brasil, a produção in vitro de embriões (PIV) tem sido particularmente importante uma vez que o Brasil é responsável por 85% dos embriões produzidos no mundo (BRESSAN et al., 2015; IETS & PERRY, 2012). O principal usuário das tecnologias de melhoramento é o gado bovino que, de acordo com dados da Sociedade Internacional de Transferência de Embriões (IETS), em 2013, produziu 546.628 embriões bovinos derivados da fertilização in vitro, que representa 42% do total de embriões desta espécie produzidos em todo o mundo (DUBEIBE, 2016; IETS
Gene Nome Localização Função
ABCB1 ATP-binding cassette transporter subfamily B, member 1; Multidrug resistance protein 1 BTA4
Contribui para a variabilidade das funções proteicas e, portanto, na resistência a drogas, no prognóstico, na toxicidade e na doença.
Implantação do blastocisto,
TENM4 Teneurin transmembrane
protein 4 BTA29
Ligação da molécula de adesão celular, estabelecimento da conectividade neuronal adequada durante o desenvolvimento.
& PERRY, 2012). Frequentemente, as gestações derivadas de processos de PIV, que são mantidos a termo, resultam em distúrbios graves na saúde do animal. Tem sido relatado que a PIV de embriões é rotineiramente acompanhada por problemas epigenéticos, principalmente em consequência da cultura in vitro (BRESSAN et al., 2015). Esses distúrbios incluem aumento de peso ao nascimento, períodos prolongados de gestação, maiores taxas de aborto e taxas aumentadas de mortalidade perinatal (HASLER, 2000; JIANG et al., 2017; SIRARD, 2017), bem como malformações congênitas sindrômicas e não sindrômicas (BRESSAN et al., 2015; JIANG et al., 2017; SIRARD, 2017).
Análises da expressão gênica em blastocistos bovinos produzidos sob diversas condições de cultura mostraram que a abundância de RNAs mensageiros longos é profundamente impactada pelo ambiente artificial (SIRARD, 2017). Os mecanismos epigenéticos têm sido agrupados em três categorias principais: metilação do DNA, modificações das histonas e posicionamento dos nucleossomos, destacando a interação entre os fatores epigenéticos. O mecanismo epigenético mais estudado é a metilação do DNA, uma vez que é o mais estável e o principal regulador da herança epigenética através das gerações (BRESSAN et al., 2015).
2.5 Ferramentas genômicas na produção animal
Nas últimas décadas, a seleção genômica (GS) tem sido amplamente utilizada na pecuária para aumentar a taxa de ganho genético, por meio de maior precisão das avaliações das caraterísticas produtivas e reprodutivas do animal e também a redução do intervalo de gerações (HAYES et al., 2009; JENKO et al., 2017). As predições dos valores genômicos (GEBV) são feitas utilizando a base de dados genotípicos (marcadores SNP) e a base de dados fenotípicos (PAREEK et al., 2011).
A maioria das doenças mostra um agrupamento em padrões que demonstram que o background genético dos indivíduos desempenha um papel na suscetibilidade em níveis individuais (BERRY et al., 2011; SEVILLA, 2007). A chance de que um parente apresente uma determinada patologia depende do componente genético da própria doença, em contraste, a hereditariedade é a fração da variação populacional que pode ser explicada por fatores genéticos. Doenças comuns de alta prevalência são influenciadas por fatores genéticos e ambientais que interagem entre
si e são chamados de características quantitativas ou QLTs (GODDARD, M. E. et al., 2016; SEVILLA, 2007). Os QTLs são controlados por muitos genes e fatores ambientais e há grande interesse em analisa-los (SCHMID; BENNEWITZ, 2017). Assim, essas regiões genômicas, localizadas em diversas regiões do genoma, controlam diversas caraterísticas e podem possuir efeitos pequenos, moderados ou grandes (KEMPER & GODDARD, 2012; NORDIC CATTLE GENETIC EVALUATION, 2019).
Com os avanços na identificação de milhões de SNPs no genoma bovino e a redução dos custos de genotipagem e ressequenciamento, existe uma oportunidade maior de usar informações de milhares de marcadores moleculares para seleção genômica (CHAGUNDA, MUJIBI, DUSINGIZIMANA, 2018; DAETWYLER et al., 2014) que pode ser utilizada para selecionar positivamente ou negativamente características de interesse na produção do gado leiteiro visando o aumento da produção e qualidade do leite e desempenho geral do animal (CIEPŁOCH et al., 2017; COUTINHO et al., 2007; USDA, 2019) . O desenvolvimento de painéis de marcadores moleculares de alta densidade permitiu a genotipagem de dezenas de milhares, até milhões de SNP por ensaio, possibilitando a criação de ferramentas usadas em estudos de associação genótipo-fenótipo (BOICHARD et al., 2012; DASH et al., 2018; FERNANDES et al., 2015). Atualmente, o Illumina BovineHD BeadChip é a matriz de genotipagem genômica mais abrangente para investigar a variação genética em qualquer raça de gado de corte e leite. Esse array contém mais de 777.000 SNPs e permite uma ampla gama de aplicações, como seleção genômica ampla, identificação de loci de características quantitativas, avaliação de mérito genético, mapeamento de cruzados, estudos de desequilíbrio de ligação e caracterização de raças para avaliação da biodiversidade. Para a raça Gir, o BovineHD BeadChip possui 472,928 loci polimórficos validados, os quais foram submetidos a rigorosos testes funcionais para garantir desempenho e reprodutibilidade (ILLUMINA, 2015).
2.6. Estudos de associação ampla do genoma (GWAS)
Os GWAS permitem a identificação de associações entre milhares de loci genômicos e características complexas (LITTLE; IOANNIDIS, 2008) e esta
associação revela novas rotas e mecanismos biológicos para as características de interesse (BUSH & MOORE, 2012; MAREES et al., 2018; GODDARD, MICHAEL & HAYES, 2009; YANG, J. et al., 2013) e define melhor o papel relativo dos genes e do ambiente no risco de doenças (MILLS & RAHAL, 2019; VISSCHER et al., 2017).
Os GWAS pressupõem que existem mutações causais em desequilíbrio de ligação (DL) com marcadores adjacentes em indivíduos de uma população, além de ter sucedido multiplas gerações e recombinações (BEJARANO et al., 2018). Deste modo é necessário identificar as regiões em DL, construindo um mapa de alta densidade baseado em marcadores moleculares próximos ao locus de interesse (NISHINO et al., 2018; WEINWURM, SÖLKNER, WALDMANN, 2013).
Os GWAS têm sido realizados em famílias ou em populações. Em famílias, possibilitam identificar alelos transmitidos de pais para filhos, determinar a frequência e fazer comparação com a população geral (LAIRD et al., 2019). Em populações, os GWAS são constituídos por indivíduos não aparentados com uma característica específica ou doença e indivíduos saudáveis não aparentados (caso-controle), no qual procura-se a diferença de frequência de alelos entre os grupos estudados (ZONDERVAN; CARDON, 2014).
Para a análise de associação entre grupos caso-controle, é necessária a observação da relação entre os indivíduos. Se estes não estiverem relacionados é aconselhável a utilização do teste X2 de Pearson para diferentes frequências de
genótipos entre os métodos de regressão linear afetado e não-afetado. A estatística do qui-quadrado é uma ferramenta não paramétrica (livre de distribuição) projetada para analisar as diferenças de grupo quando a variável dependente é medida em um nível nominal. Como todas as estatísticas não paramétricas, o qui-quadrado é robusto com relação à distribuição dos dados. Especificamente, não exige igualdade de variâncias entre os grupos de estudo ou homocedasticidade nos dados. Permite avaliar as variáveis independentes dicotômicas e os estudos em múltiplos grupos (MCHUGH, 2013).
A metodología estatistica mais amplamente utilizada nos GWAS é a Bayesiana, pois apresenta vantagens em relação a métodos clássicos pois predizem os efeitos de todos os loci de forma simultânea, assumindo variâncias específicas para cada locus. Tudo isso com a pressuposição de que os marcadores explicam diferentes proporções da variação genética da característica analisada. Mostrando que os
efeitos dos marcadores são efeito de um determinado locus ajustado para todos os outros loci incluídos no modelo (ARMERO et al., 2019; YANG, J. et al., 2013).
Sabe-se que a maior parte do genoma é composta por regiões altamente saturadas de SNPs unidos pelo princípio do desequilíbrio de ligação (DL), com exceção de algumas regiões com alta taxa de recombinação (hotspots) e, com isso, podem formar blocos genômicos, denominados haplótipos, que segregam juntos na população (GABRIEL et al., 2002; WALL & STEVISON, 2016). Então, pode-se dizer que os GWAS pressupõem que pelo menos um SNP está em DL com genes ou regiões genômicas envolvidas com a característica de interesse (LI & STEPHENS, 2003). Como limitantes dos GWAS estariam a adequação de modelos e metodologias estatísticas, o tamanho amostral, a colinearidade advinda do desequilíbrio de ligação entre os marcadores e a interpretação dos resultados que podem conduzir a erros (CANTOR, LANGE, SINSHEIMER, 2010; ELAM et al., 2019; PEARSONS & MANOLIO, 2008).
2.6.1 Etapas do GWAS
Segundo (BUSH & MOORE, 2006; MCKINNEY et al., 2009), tipicamente os GWAS são constituídos por cinco etapas: Planejamento e levantamento de informações para o estudo e fundamentação para a seleção dos grupos caso e controle; Coleta das amostras biológicas e genotipagem do material genético dos indivíduos selecionados; Realização do controle de qualidade sobre os dados gerados pela genotipagem; Realização da análise de associação propriamente dita para os SNPs que passarem pelo controle de qualidade; Validação dos SNPs que se apresentam associados no estudo.
2.6.2 Controle de qualidade nos GWAS
Os GWAS, como qualquer estudo, não são isentos de apresentar erros, sendo que, os mais comumente descritos, são os erros do tipo I (falso positivo) e II
(falso negativo) (MEDICINE & MANOLIO, 2010). Esses podem ser provocados por erros de genotipagem e também pelo grande número de SNP e amostras utilizadas pelo qual são necessários procedimentos que garantam o controle de qualidade (CQ) dos marcadores SNP genotipados (SABOURIN et al., 2019; ZIEGLER, KÆNIG, THOMPSON, 2008). A não remoção de SNPs ou amostras que apresentem erros podem alterar os resultados da análise, sendo esse processo de vital importância para o estudo (BOLORMAA et al., 2011; DO CARMO, 2012; SABOURIN et al., 2019). Os critérios utilizados no CQ dos GWAS podem ser diversos, entre os mais destacados, estão CQ da amostra e CQ dos SNPs. O CQ da amostra inclui eliminação de amostras repetidas, a subestrutura da população e a estratificação da população. Em relação ao CQ dos SNPs, este é influenciado pelo Call Rate (eficiência da genotipagem) que é a proporção de indivíduos no estudo para os quais as informações correspondentes do SNP não estão ausentes, tendo como valores recomendados ≥ 98%; equilíbrio de Hardy-Weinberg; frequência do alelo menos comum (MAF) para o SNP (ANDERSON et al., 2011; FREIMER & SABATTI, 2005; REED et al., 2015; SOUTHAM et al., 2011; STARK, 2005; TURNER et al., 2012). Os SNPs que não atingirem o valor de Call Rate mínimo (98%) podem ser indicativos de associações falso-positivas (BRZYSKI et al., 2017; ZANELLA, 2011). Os critérios no CQ são específicos para cada estudo, não havendo um padrão a ser seguido pois depende dos objetivos da pesquisa e da particularidade do conjunto de dados (DELANO et al., 2008; FREIMER & SABATTI, 2005). Outro critério importante no controle de qualidade é a quantidade e qualidade das amostras de DNA, as quais podem interferir na detecção de SNPs, influenciando a emissão de fluorescência, podendo aumentar o número de No Call (FU et al., 2009; PSIFIDI et al., 2015).
2.7 Estratificação da população
Estratificação populacional é a presença de uma diferença sistemática nas frequências alélicas entre subpopulações, em uma população, devido a diferentes ancestrais-A presença de estratificação populacional em GWAS é considerada como um dos principais fatores de confusão para a interpretação dos resultados do estudo (DO CARMO, 2012; HELLWEGE et al., 2018; LAURIE et al., 2010; SUL & ESKIN,
2018; TUCKER, PRICE, BERGER, 2014). A diferença alélica entre populações estratificadas pode resultar na presença de associação significativa dos SNPs e fenótipos, entretanto sem efeito causal direto (HELLWEGE et al., 2018), pelo qual é recomendado realizar a análise de componentes principais para a verificação da estratificação e identificar grupos originados por diferentes populações ancestrais, impactando diretamente os resultados das analises (BOUAZIZ, AMBROISE, GUEDJ, 2011; DEVLIN & ROEDER, 1999; PRICE et al., 2006; SUL, ID, ESKIN, 2018; TUCKER, PRICE, BERGER, 2014); (LIU, et al., 2013).
3 OBJETIVOS
3.1 Obejtivo Geral
Identificar regiões genômicas associadas à característica lábio leporino na raça Gir leiteiro.
3.2 Objetivos Específicos
1. Identificar SNPs associados à característica lábio leporino.
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Seleção da população alvo
Grupos amostrais independentes foram analisados com a metodologia de casos e controles. O grupo dos casos foi composto por 16 animais (7 fêmeas, 7 machos e 2 não informados) da raça Gir, nascidos entre os anos de 2010 e 2017, filhos de 12 touros e 16 matrizes e escolhidos por apresentar o fenótipo de “lábio leporino”. A seleção dos animais se deu a partir dos rebanhos colaboradores do Programa Nacional de Melhoramento do Gir Leiteiro, desenvolvido pela parceria entre a Embrapa Gado de Leite e a Associação Brasileira dos Criadores de Gir Leiteiro (ABCGIL). O grupo dos controles foi composto por 48 animais machos da raça Gir Leiteiro, apresentando fenótipo saudável e adequado as características do animal modelo, descritas e requeridas pela ABCGIL. Os critérios de exclusão desse grupo incluíram aparente familiaridade com qualquer um dos membros do grupo de casos, selecionados por uma matriz de parentesco genômica, adicionando informações de linhagem obtidas no banco de dados da ABCZ (Associação Brasileira dos Criadores de Zebu).
4.2 Coleta de dados fenotípicos, demográficos, genealógicos e amostras biológicas
Para os animais do grupo caso, os dados fenotípicos, demográficos e genealógicos, assim como amostras de cada animal (sangue ou pelo), foram enviados pelos produtores e posteriormente confirmados na base de dados da consulta individual do Centro de Referência da Pecuária Brasileira – ZEBU da Associação Brasileira dos Criadores de Zebu (ABCZ, 2019).
As amostras foram coletadas de acordo com o guia de “coleta de amostras de sangue e pêlo para extração de DNA” da Embrapa Gado de Leite e posteriormente
encaminhadas para o Laboratório de Genética Molecular desta instituição, seguindo as orientações no que diz respeito ao armazenamento, transporte e expedição.
4.3 Extração de material genético (DNA) e genotipagem dos marcadores SNPs
O DNA das amostras foi extraído por meio da metodologia de fenol/clorofórmio modificada de Sambrook et al., (2001) e avaliado quanto a sua concentração e pureza por meio de espectrofotometria de nanovolume NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA). As amostras foram submetidas a análise de SNPs em painel de alta densidade BovineHD Genotyping BeadChip (Illumina, San Diego, EUA), sob o ensaio de genotipagem Infinium HD na plataforma iScan, de acordo com as instruções do fabricante. As genotipagens foram contratadas de laboratório privado externo e os resultados encaminhados para a equipe da Embrapa Gado de Leite.
Antes da realização das análises de associação, os dados genotípicos de cada grupo amostral foram submetidos aos critérios de controle de qualidade utilizando o software SVS Golden Helix (Golden Helix, Bozeman, EUA), com intuito de reduzir associações espúrias e aumentar a precisão das análises genômicas. Desse modo, foi realizada uma filtragem inicial com remoção de todos os marcadores não autossômicos, ou seja, os SNP dos cromossomos X, Y e DNA mitocondrial. Nessa etapa também foram identificados e removidos os SNPs mapeados para a mesma posição genômica, os SNPs do conjunto de dados com call rate <95%, MAF < 2 % e o equilíbrio de Hardy-Weinberg <10-6. Tambem foi observado o escore de qualidade
de genotipagem de cada SNP (GC score). Todos os casos e controles foram avaliados pela análise de componentes principais para estratificação populacional (ZONDERVAN et al., 2014).
4.4 Estudos de associação ampla do genoma (GWAS) e estratégias para a identificação de genes candidatos
As análises foram conduzidas utilizando o pacote computacional SNP and Variation Suite 7 - SVS7 (Golden Helix, Bozeman, EUA). As análises de associação genômica ampla foram realizadas usando dois modelos, aditivo e dominante, levando em consideração as informações desses modelos e as equações que estimam a chance relativa em odds ratio (RM) ou em coeficientes regressão (β). A correção de bonferroni foi calculada usando o procedimento de teste múltiplo da plataforma SVS7. Os resultados dos testes foram apresentados em gráficos do tipo “Manhattan” e Quantil-Quantil e os valores de controle genômico foram calculados (λGC = 1).
Um SNP foi considerado como significativo quando apresentava um Corr/Trend log10 P ≥ 6 e o Corr/Trend Bonf. P ≤ 0,06. As regiões genômicas onde foram obtidos SNP significativos em cada modelo foram exploradas para identificar os genes candidatos subjacentes aos loci, tendo como ponto central o SNP identificado como significativo e abraçando uma area de ± 1.000.000 pb. A localização de SNPs e anotações gênicas foi baseada na base de dados do UCSC Genome Browser on Cow Nov_2009 (Bos_taurus_UMD_3.1 - bostau6 - Genome - Assembly - NCBI).
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Controle de qualidade dos genótipos
O "call rate" médio dos marcadores antes do QC foi acima de 98%. As análises de QC removeram um total de 313.273 SNPs do conjunto de dados. Com base nos critérios amostrais nenhum animal foi excluído das análises. O total de marcadores autossômicos e de alta qualidade foi de 464.723 SNP correspondendo a aproximadamente 59.73% do total disponibilizado no ensaio empregado para análise.
5.2 Estudos de associação ampla do genoma
Para determinar a origem genética da doença, é necessário estar ciente da importância da etiologia, por isso foram revisados estudos semelhantes em outras espécies para tentar elucidar o tipo de herança do lábio leporinoem bovinos. Na maioria dos resultados de GWAS relatados na literatura, o modelo de herança aditiva foi tomado como base, sendo que esse modelo indica que o risco de contrair a doença aumenta por um fator constante a cada cópia adicional do alelo de risco (CLARKE et al., 2011). No entanto, esse modelo pode perder seu poder estatístico se, em alguns locais, o modelo de herança genética for recessivo ou dominante e, com isso, regiões genômicas podem não ser detectadas, uma vez que podem ser uma das principais causas da doença. BÖHMER et al., (2018) investigaram por meio de meta-análise, se os loci de risco das fissuras labiais poderiam ser identificados por meio da análise dos efeitos genéticos dominantes ou recessivos com dados SNP encontrados anteriormente nos estudos da GWAS. No entanto, os dados obtidos neste estudo mostram que não há evidências suficientes para mostrar que os modelos dominantes ou recessivos conferem um risco aumentado de lábio leporino em populações não endogâmicas (BÖHMER et al., 2018). Desse modo, com base na carência de estudos conclusivos na literatura, foram avaliados dois métodos (dominante e aditivo), cujos
resultados combinados podem aumentar a probabilidade de identificação de informações mais relevantes sobre a herança dessa característica.
Um total de 115 SNPs significativos foram encontrados pelo método aditivo e 204 SNPs pelo método dominante, sendo 54 SNPs em comum, sendo que a maioria destes com elevada probabilidade de associação (P < 0,05) com o lábio leporino. Esses dados podem estar apoiando a ideia de um modelo de herança genética dominante em nossa população de estudo.
Manhatan plots do estudo de associação ampla do genoma dos modelos aditivo e dominante são apresentados na Figura 1, onde vários SNPs foram identificados como possíveis candidatos ao fenótipo estudado. Para essas regiões genômicas, foram encontrados 265 SNPs significativos em todo o genoma.
Os resultados da busca por regiões associadas foram organizados em uma tabela (Anexo 1) para identificar os genes candidatos, alocando SNP significativamente associados e sua posição cromossômica determinada pelo GWAS. Áreas em cinza representam overlap ou match das duas metodologias (aditivo, dominante). Na última coluna são mostrados os genes próximos com evidência de causar lábio leporino.
A região genômica associada e sua vizinhança foram rastreadas quanto à anotação gênica e possíveis genes candidatos posicionais próximos a região foram identificados usando o assembly UMD3.1. A listagem de todos os SNP significativamente associados contendo sua posição cromossômica para o estudo de associação ampla do genoma para lábio leporino em bovinos leiteiros da raça Gir está descrita no Anexo 1.
Figura 1. Gráfico de Manhattan referente ao modelo aditivo do estudo de associação ampla do genoma para o lábio leporino (caso/controle) em bovinos da raça Gir. Os valores de Log10P de todo o genoma para cada efeito SNP são plotados contra sua posição em cada cromossomo. Os cromossomos são diferenciados por cores e numeração.
Figura 2. Gráfico de Manhattan referente ao modelo dominante do estudo de associação do genoma para o lábio leporino (caso/controle) em bovinos da raça Gir. Os valores de Log10P de todo o genoma para cada efeito SNP são plotados contra sua posição em cada cromossomo. Os cromossomos são diferenciados por cores e numeração.
Como uma primeira abordagem, foram explorados os genes mais próximos das regiões genômicas que foram significativamente identificadas, no sentido de encontrar relações com genes já descritos na literatura como potenciais responsáveis pelo fenótipo lábio leporino. Adiconalmente, os resultados das análises de associação identificaram várias regiões intergênicas significativas, sugerindo que existem variantes etiológicas do lábio leporino em bovinos leiteiros que se situam fora da sequência interna do gene, talvez em elementos reguladores, e podem funcionar como moduladores da expressão gênica. Apoiando esta teoria vários estudos demostram que as regiões intergênicas são afetadas com mais frequência pela mutação de um único nucleotídeo do que outras regiões transcritas nas proximidades da sequência de codificação, como íntrons, promotores, potenciadores e regiões não traduzidas (MACINTYRE et al., 2014; PASTINEN, 2010).
No total, as análises de associação (caso/controle) foram capazes de identificar 265 SNPs significativos distribuídos em 100 regiões genômicas, nas quais foram identificados 28 genes candidatos associados aos fenótipos lábio leporino, listados a seguir: IGSF11, BASP1, APC, BAMBI, GRIA2, XXYLT1, DMP1, NOX5, SMAD7, TBX2, FGF12, SPOCK1, TPM1, LEFTY2, CYP2S1, SLC33A1, FGD3, LACTB, ADAMTS6, ALKBH8, EPHB1, ZNF462, RPS27, ANKRD50. As funções fisiológicas de cada gene candidato identificado estão descritas na Figura 3.
Figura 3. Classificação dos genes encontrados nas análises de associação (caso/controle) para a característica lábio leporino na raça Gir Leiteiro, em relação às funções fisiológicas. Na primera coluna (Grupo 1), genes com função na formação embrionária e fetal. Na segunda coluna (Grupo 2), genes relacionados ao metabolismo da vitamina B12. Na terceira coluna (Grupo 3), genes relacionados à função do sistema nervoso e neuronal. Na quarta coluna (Grupo 4), genes relacionados à função e estrutura celular. Na quinta coluna (Grupo 5), genes relacionados ao crescimento e função do músculo. Na sexta coluna (Grupo 6), genes relacionados à função espermática. Na sétima e última coluna (Grupo 7), genes relacionados à formação e metabolismo mineral ósseo.
Como parte da descrição fisiológica de cada grupo de genes relacionados ao lábio leporino, o Grupo 1 contém nove genes relacionados ao desenvolvimento embrionário, os quais são discutidos a seguir. O gene BAMBI (inibidor ligado à membrana BMP e ativina) codifica uma glicoproteína transmembranar que funciona como reguladores negativos do TGF-beta durante a embriogênese precoce e particularmente durante a palatogênese (WEIZMANN INSTITUTE OF SCIENCE, 2019). O estudo realizado em camundongos, conduzido por PARADA & CHAI (2012), sugere que a proteína gerada pelo gene BAMBI bloqueia a sinal BMP no desenvolvimento do embrião, gerando malformações como lábio leporino. Esse estudo foi dificultado pela alta taxa de letalidade embrionária precoce de camundongos nulos dos inibidores ligados a membrana BMP e ativina, portanto, a função epitelial da BMP, durante o desenvolvimento craniofacial, ainda não está totalmente esclarecida.
O gene ALKBH8 (AlkB Homogo 8 ARNt Metiltransferase) é necessário para a sobrevivência normal após danos no DNA e pode inibir a apoptose e promover a
sobrevivência e angiogênese das células. (WEIZMANN INSTITUTE OF SCIENCE, 2019). Diversos estudos mostram que esse gene pode causar diversas doenças as quais incluem os distúrbios do desenvolvimento intelectual e físico. (SHIMADA et al., 2009; SPELSBERG; WEBSTER; PIKLER, 1976) como mostram pesquisas conduzidas por KRGOVIC et al. (2011) onde foi descrito o fenótipo clínico em pacientes com deleção da região genômica contendo ALKBH8, que geralmente varia de acordo com o tamanho e a posição da deleção. As características fenotípicas mais comuns observadas nesses pacientes são retardo mental leve a grave, atraso no desenvolvimento, fenda palatina ou arco palatino alto e em muitos casos com lábio leporino.
O gene SPRY1 (Sprouty RTK Sinalização Antagonista 1) funciona como um precursor antagonista do fator de crescimento de fibroblastos (FGF) e pode modular negativamente a organogênese do aparelho respiratório (WEIZMANN INSTITUTE OF SCIENCE, 2019). YANG et al. (2010) descrevem que, durante o desenvolvimento dos vertebrados, as proteínas Spry exibem padrões de expressão sobrepostos, particularmente em estruturas craniofaciais e surtos de membros. Por outra parte, YU et al. (2017) realizou um estudo GWAS, no qual o gene SPRY1 é um gene candidato para nosso fenótipo de interesse. (YU et al., 2017). A literatura mostra um estudo conduzido por ZHOU et al. (2019) no qual foram identificadas interações entre genes da família SPRY em 1.908 humanos com lábio leporino. Esse estudo revelou a importância de possíveis interações gene-gene para entender a arquitetura dessa característica.
O gene TBX2 (T-Box Transcription Factor 2) participa na regulação transcricional dos genes necessários para a diferenciação do mesoderma e é necessário para a formação do canal atrioventricular cardíaco e palatogênese (WEIZMANN INSTITUTE OF SCIENCE, 2019). Um estudo realizado por ZIRZOW et al. (2009) mostra que os espectros fenotípicos de camundongos com deficiência de
Tbx1 se assemelham aos de pacientes heterozigotos da síndrome
DiGeorge/velocardiofacial (DGS / VCFS), que é um distúrbio humano comum, geralmente associado a deleções no cromossomo 22q11, no qual o TBX1 reside. Em outro estudo, realizado por LIU et al. (2018), camundongos nocaute homozigotos para o gene Tbx2 exibem canal atrioventricular, edema pericárdico, fenda palatina, polidactilia e letalidade embrionária, indicando que o gene TBX2 possui papel crucial durante o desenvolvimento embrionário.
O gene SMAD7 (SMAD Family Member 7) é um antagonista de sinalização da superfamília do receptor TGF-1 beta (fator de crescimento transformador beta 1) (WEIZMANN INSTITUTE OF SCIENCE, 2019). XIAOZHUAN et al. (2017) detectaram a expressão de Smad7 em células fetais mesenquimais e parenquimatosas, relacionadas com a aparência de fenda palatina. (BARTZELA; CARELS; MALTHA (2017) sugeriram que o gene XXYLT1 (xilosido xilosiltransferase 1) tem uma relação estreita com a microssomia hemifacial por meio de microduplicações deste gene, e sugeriram que estas microduplicações têm um papel importante durante a organogênese principalmente facial.
O gene FGF12 (fator de crescimento de fibroblastos 12) tem como tarefa a atividade do fator de crescimento e a ligação do canal iônico (WEIZMANN INSTITUTE OF SCIENCE, 2019). Os membros da família FGF possuem extensas atividades mitogênicas e de sobrevivência celular e estão envolvidos em uma variedade de processos biológicos, incluindo desenvolvimento embrionário, crescimento celular, morfogênese, reparo de tecidos, crescimento e invasão de tumores (STANIER & PAUWS, 2012).
Estudos elaborados por JUGESSUR (2011) e ZHANG et al. (2012), em humanos, indicam que o gene FGF12 pode estar associado à fenda labial em populações da Europa e da Ásia. Por esse motivo, DE AQUINO et al., (2013) decidiram fazer um estudo da associação desse gene na população brasileira, porém argumentam que a ancestralidade genética da população é muito variada e a predisposição a esses marcadores de doenças pode ser diferente na mesma população. Portanto, seus resultados indicaram que o gene FGF12 apresenta uma falta de envolvimento com o lábio leporino nessa população, além de sugerir que é um gene de baixa penetrância para o lábio leporino e merece mais estudos.
O gene ZNF462 (Zinc Finger Protein 462) é um fator mesodérmico nuclear do dedo de zinco envolvido na transcrição, regulando a estrutura e organização da cromatina. Participa da pluripotência e diferenciação das células-tronco embrionárias, regulando SOX2, POU5F1 / OCT4 e NANOG. As doenças associadas ao ZNF462 incluem a síndrome do dismofismo facial da ptose-metopia e a síndrome da incapacidade intelectual não-sindrômica autossômica dominante (WEIZMANN INSTITUTE OF SCIENCE, 2019). Num estudo realizado por VIERA et al. (2008) foi identificado o gene ZNF462 e verificaram que anomalias dentárias são parte do espectro DEK fenótipo lábio leporino. Assim, num estudo realizado por WEISS et al.
(2017), esses autores sugerem o envolvimento do gene ZNF462 na regulação transcricional durante a embriogênese que afeta a migração da crista neural e o desenvolvimento do cérebro. Por oura parte, o gene LEFTY2 (fator de determinação esquerdo-direito 2) codifica um ligante secretado da superfamília da proteína TGF beta. A pré proteína codificada é processada proteoliticamente para gerar a proteína madura, que desempenha um papel na determinação da assimetria esquerda-direita dos sistemas orgânicos durante o desenvolvimento (WEIZMANN INSTITUTE OF SCIENCE, 2019). MENO et al. (1997), sugerem a relação desse gene como parte dos precursores do fenótipo do lábio leporino. Confirmando essa suposição, num estudo de correlação da simetria facial em crianças com fissura labial, conduzido por MILLER et al. (2014), foi sugerido que esse gene contribui diretamente para as características do espectro da fissura labial.
O Grupo 2 de genes é relacionado ao metabolismo da vitamina B12, a qual o papel dessa vitamina é pouco estabelecido em gado de leite, mas o metabolismo dela, em outras espécies, é de importância para o aparecimento de lábio leporino. Os genes MMADHC (gene de metabolismo da cobalamina associada D) e o gene LMRBD1 (LMBR1 Domínio Contendo 1) codificam proteínas que ajuda a converter vitamina B12 (cobalamina) em adenosilcobalamina (AdoCbl) ou metilcobalamina (MeCbl), sendo ambos de função enzimática (WEIZMANN INSTITUTE OF SCIENCE, 2019). Como descrito na literatura, biologicamente, causam a elevação da homocisteína ou do ácido metilmalônico, ou ambos, no sangue e na urina e podem levar a defeitos congênitos, incluindo defeitos cardiovasculares e dismorfologia facial e lábio leporino (BLACK, 2008; GADHOK et al., 2011). Como a deficiência de folato ou Cbl pode ter efeitos bioquímicos semelhantes, foi sugerido por MORENO-GARCÍA et al. (2013) que uma deficiência combinada de Cbl e folato contribui para os defeitos do tubo neural (NTD) e outros defeitos congênitos. Nesses casos, podem estar ocorrendo interações genótipo-ambiente, tanto pela quantidade de vitamina B12 ingerida pelo animal, quanto pelo seu metabolismo correto. No estudo realizado por CONSTANTINOU et al. (2015), eles explicam que o distúrbio da cobalamina F (cblF), causado por mutações homozigotas ou heterozigotas compostas no gene LMBRD1, é uma causa reconhecida de atraso no desenvolvimento, pancitopenia e falta de crescimento que podem ocorrer no período neonatal. Ainda, existem casos com características atípicas de sutura incluindo metóticas proeminente, palato, agenesia
renal unilateral e anormalidades do fígado, que se estendem do espectro fenotípico da doença.
O Grupo 3 é formado por genes relacionados à função do sistema nervoso e neuronal, assim, o gene EPBH1 (Ephrine receptor B1) foi identificado como mediador do guia axonal (WEIZMANN INSTITUTE OF SCIENCE, 2019). DAVY, AUBIN & SORIANO (2004) mostraram que, em camundongos, a desativação deste gene produz lábio leporino com fenda palatina. Em estudos de síndrome craniofrontonasal em humanos, foram identificadas mutações nesse gene que resultam em uma variedade de defeitos, incluindo lábio leporino (TORII et al., 2007) e, em pesquisas recentes conduzidas por XAVIER, MILETICH & COBOURNE (2016), têm sido relacionados ao desenvolvimento embrionário do lábio e do lábio leporino. Nesse caso, pode-se observar que o gene está relacionado ao lábio leporino sindrômico e não sindrômico, no entanto, as informações sobre esse assunto são limitadas. O gene GRIA2 (subunidade 2 do tipo de receptor de glutamato iônico AMPA) codifica receptores de neurotransmissores excitadores predominantes no cérebro de mamíferos e são ativados em uma variedade de processos neurofisiológicos normais (WEIZMANN INSTITUTE OF SCIENCE, 2019). CALCIA et al. (2013) relatam que, além de estar relacionado à função cognitiva, esse gene pode estar fortemente relacionado ao lábio leporino. Explicam também que os casos em que a deleção sobreposta existe, mas as mesmas características fenotípicas não ocorrem, podem ser devidas ao nível de penetrância e a um possível efeito de modificação de fatores genéticos.
O Grupo 4 inclui 11 genes fortemente relacionados à função celular. O gene LACTB (Lactamase Beta) codifica uma proteína chamada proteína mitocondrial que atua como um regulador do metabolismo lipídico mitocondrial (WEIZMANN INSTITUTE OF SCIENCE, 2019). Na literatura, já existem relatos de várias características fenotípicas relacionadas ao gene LACTB. Em modelos murinos, conduzidos por BAINZ et al. (2004) e por GAJERA et al. (2019), além de mostrar que o gene interfere na obesidade, mostra seu papel também na característica lábio leporino. Além disso, num estudo em seres humanos, usando casos e controles e estudos de associação familiar, a expressão de LACTB apresentou resultados significativos para o genótipo do lábio leporino (GE et al., 2019). De qualquer maneira, o seu papel no desenvolvimento de lábio leporino não é muito claro, no entanto,
pode-se especular que LACTB tem um papel fisiológico no fluxo de metabólitos mitocondriais, o que poderia afetar o crescimento e desenvolvimento celular.
O gene RPS27 (proteína ribossômica S27) codifica um membro da família S27e de proteínas ribossômicas e um componente da subunidade 40S. A proteína codificada contém um domínio de dedo de zinco do tipo C4 que pode se ligar ao zinco e se ligar ao ácido nucléico. Mutações nesse gene foram identificadas em vários pacientes com melanoma e em pelo menos um paciente com anemia de Diamond-Blackfan (DBA) (INSTITUTO DE CIÊNCIA WEIZMANN, 2019), a qual tem entre as anormalidades mais comumente relatadas microcefalia, hipertelorismo, epicanto, ptose, microtia, orelhas baixas, ponte nasal larga e deprimida, fenda labial/palato, palato alto e arqueado, micrognatia, linha fina anterior baixa (CLINTON & GAZDA, 2009).
A proteína codificada pelo gene MACROD2 (ribossil- hidrolase 2 mono-ADP) transloca-se do núcleo para o citoplasma após dano ao DNA. As doenças associadas ao MACROD2 incluem hipogonadismo hipogonadotrópico 21 com ou sem anosmia e síndrome de Kabuki que é tipicamente caracterizada por retardo de crescimento pós-natal, dismorfismo craniofacial, defeitos cardíacos e lábio leporino (INSTITUTO DE CIÊNCIA WEIZMANN, 2019; LEI et al., 2016). Paik et al. (2016), observaram incidência de fenda palatina isolada em 50% a 69,7% dos pacientes e fenda palatina submucosa em 15,2% a 50% dos pacientes. O gene ANKRD50 (Ankyrin Repeat Domain 50) pode causar, em humanos, a síndrome de deleção cromossômica 4q que é uma condição rara, com incidência estimada de 1 em 100.000. Segundo relatado por STREHLE et al (2012) e CONTE (2016), o espectro clínico geralmente inclui problemas no desenvolvimento craniofacial, digital, esquelético e cardíaco. Também é reportado que o gene SLC33A1 (Solute Carrier Family 33 Member 1) está associado a anomalias tais como esfingolipidose, lábio leporino, aneurisma da aorta, família torácica, alterações morfológicas e aterosclerose (COMPUTATIONAL MOLECULAR DESIGN & METABOLOMICS LABORATORY, 2019; PIETROCOLA et al., 2015).
O gene SPOCK1 (SPARC Osteonectina, Cwcv e Kazal como domínios proteoglicanos 1) está envolvido na ligação do íon cálcio e a atividade do inibidor da endopeptidase do tipo cisteína (WEIZMANN INSTITUTE OF SCIENCE, 2019). Estudos conduzidos por BEATY et al. (2010) e ZHANG, CHEN & ROSS, (2012) apontam que a relação entre SPOCK1 e lábio leporino poderia ser mediada por MafB
que é mais conhecido como um regulador do desenvolvimento embrionário inicial. Assim, num estudo realizado por Moreno et al. (2009) destinado a identificar o risco de lábio leporino, foi realizado um GWAS em 388 famílias multiplex de sete populações, revelando genes candidatos potenciais com base na expressão do gene ou papel conhecido nas síndromes labiais das fissuras que incluíam o gene FGD3.
O gene APC (Regulador da Via de Sinalização WNT da APC) codifica uma proteína supressora de tumor que atua como antagonista da via de sinalização de Wnt e participa de outros processos, como migração e adesão celular, ativação transcricional e apoptose. Num estudo em seres humanos, com uma população de etnia caucasiana, VIJAYAN et al. (2018) investigaram a associação direta desse gene e do lábio leporino. Este estudo mostrou, pela primeira vez, a associação direta desse gene candidato ao lábio leporino. Num estudo realizado por REYNOLDS et al. (2019) explicam como fendas sindrómicas e não sindrômicas orofaciais foram atribuídas a mutações em genes de componentes múltiplos de sinalização de Wnt. JACOBS et al. (2013) destacam que o CYP2S1 pode modular a toxicidade induzida por dioxinas e ácido retinóico durante o desenvolvimento do palato. Em outras pesquisas em modelo murino, conduzidos por LAN & YU (2018), foi realizado um sequenciamento completo do exoma seguido por genótipos de alelos específicos e descobriram que a fenda palatina e os defeitos esqueléticos na linha de camundongo estudada segregam com uma mutação sem sentido no gene ADAMTS6. Na literatura, é descrito um estudo com modelos murinos, liderados por UZUMCUA et al. (2009), que indicam que a síndrome de Möbius poderia estar envolvida na regulação dos transcritos codificados pelo gene BASP1. A síndrome de Möbius é um distúrbio raro caracterizado principalmente por paralisia facial congênita, frequentemente acompanhada de anormalidades de abdução ocular e ocasionalmente associada a malformações orofaciais, de membros e músculo-esqueléticas (HERNÁNDEZ, ROJAS, GARCÍA, 2017).
Em relação ao Grupo 5, foi identificado um gene candidato relacionado com a função muscular. Esse gene, chamado de TPM 1 (tropomiosina 1), é um membro da família das proteínas de ligação à actina da tropomiosina que participam do sistema contrátil dos músculos estriados e lisos e do citoesqueleto de células não musculares (WEIZMANN INSTITUTE OF SCIENCE, 2019). Evidências adicionais aportadas por RAFIGHDOOST et al., (2019) suportam uma forte associação entre TPM 1 e o risco de lábio leporino não sindrômica com ou sem fenda palatina. Outros trabalhos indicam
que polimorfismos de TPM1 e sua regulação podem contribuir para o lábio leporino durante o desenvolvimento craniofacial em fases precoces da embriogênese (LUDWIG et al., 2017; QIAN et al., 2016), embora o seu papel específico para a morfogênese do palato não é clara (MORENO URIBE et al., 2017).
Os genes do Grupo 6 a serem descritos possuem uma forte ligação com a função dos espermatozóides. O gene NOX5 (NADPH-oxidase 5), que se expressa predominantemente em testículos e áreas ricas em linfócitos dos nodos linfáticos e do baço, codifica uma NADPH oxidase dependente de cálcio que gera superóxido e funciona como um canal de prótons dependente de cálcio que pode regular processos dependentes de redox em linfócitos e espermatozóides e pode desempenhar um papel no crescimento e apoptose celular (WEIZMANN INSTITUTE OF SCIENCE, 2019). BANFI et al. (2001) sugerem que o superóxido e seus derivados estão envolvidos na regulação das funções fisiológicas, desde a detecção de oxigênio e regulação da pressão arterial até a ativação de linfócitos e a fusão de espermatozóides. Isso se torna muito importante quando pensamos nas técnicas de reprodução bovina e na idade dos touros destinados à reprodução. AITKEN & CLARKSON (1987) relataram que o esperma pode gerar seu próprio dano ao DNA como resultado de altos níveis de geração de radicais livres. A presença de tais danos aumenta a capacidade do esperma de gerar NADPH, o substrato para a geração de Nox5. Em conjunto a esse aumento no dano ao DNA, aumenta a incidência de mutações genéticas dominantes, como fenda labial e fenda palatina.
O gene IGSF11 (Membro da Superfamília da Imunoglobulina 11) compartilha uma homologia significativa com o receptor coxsackievirus e adenovirus e a molécula seletiva de adesão celular endotelial (ESAM) (WEIZMANN INSTITUTE OF SCIENCE, 2019). ISHORST et al. (2018), utilizando GWAS em amostras humanas, indicaram ao gene IGSF11 como candidato fortemente associado ao lábio leporino.
No Grupo 7, é descrito o papel do gene DMP1 (fosfoproteína ácida da matriz dentina), envolvido no metabolismo ósseo mineral, e que codifica uma proteína da matriz extracelular a qual é essencial para a mineralização adequada do osso e da dentina, estando presente em várias células dos tecidos ósseo e dentário. Em humanos, sabe-se que mutações no gene causam hipofosfatemia autossômica recessiva, uma doença que se manifesta como raquitismo e osteomalácia. É importante enfatizar que a estrutura do gene é conservada em mamíferos
