MicroRNAs CIRCULANTES EM DOENÇAS HEPÁTICAS NÃO TUMORAIS: POSSÍVEIS BIOMARCADORES PARA
DIAGNÓSTICO E PROGNÓSTICO
Tese submetida ao Programa de Pós-Graduação em Farmácia da
Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do Grau de Doutor em Farmácia.
Orientadora: Profa. Dra. Tânia Beatriz Creczynski-Pasa
Coorientador: Prof. Dr. Leonardo de Lucca Schiavon
Florianópolis 2018
MicroRNAs (miRNAs) apresentam notável potencial como marcadores diagnóstico e prognóstico devido às funções na patogênese das doenças. Os miRNAs podem ser liberados na corrente sanguínea, onde são suficientemente estáveis para serem detectados de forma não tão invasiva. A hipótese do presente trabalho foi que a expressão de miRNAs circulantes, separadamente ou como painel de miRNAs, poderia melhorar o diagnóstico e o prognóstico da cirrose. Nesse sentido, a expressão de 21, 34a, 122, 181b, miR-571 e miR-885-5p foi avaliada de forma prospectiva em amostras de soro de pacientes com cirrose hepática estável. Para isso, o RNA total foi extraído do soro de pacientes com cirrose (n = 186) e de indivíduos saudáveis (n = 28), e as expressões foram determinadas por transcrição reversa-reação em cadeia da polimerase quantitativa. A expressão dos respectivos miRNAs foi correlacionada com parâmetros de função hepática, etiologia e complicações da cirrose. Pacientes com cirrose apresentaram maior expressão de miR-34a, miR-122 e miR-885-5p em relação aos indivíduos saudáveis. Estes miRNAs foram positivamente correlacionados com alanina aminotransferase e aspartato aminotransferase, e a expressão foi maior em pacientes com cirrose relacionada ao vírus da hepatite C e menor naqueles classificados como Child-Pugh C. Os miR-122 e miR-885-5p também apresentaram correlação positiva com γ-glutamil transpeptidase. miR-21 mostrou associação com a sobrevida livre de transplante na análise de regressão univariada de Cox e permaneceu independentemente associado com a sobrevida após ajuste pela idade, classificação Child-Pugh, modelo para doença hepática terminal e história de descompensação prévia na análise de regressão multivariada de Cox. Esses dados sugerem que a expressão em amostras de soro de miR-34a, miR-122 e miR-885-5p pode estar mais relacionada aos processos inflamatórios e de dano hepático em andamento nos pacientes com cirrose. Além disso, a expressão de miR-21 foi independentemente associada com menor sobrevida livre de transplante. O principal achado do presente estudo foi a demonstração de que a expressão de miR-21 circulante pode ser utilizada para complementar a classificação Child-Pugh e o modelo para doença hepática terminal em relação ao prognóstico de pacientes ambulatoriais com cirrose hepática estável.
Palavras-chave: Cirrose hepática. Doenças hepáticas. MicroRNA. MiR. Prognóstico. Sobrevida.
MicroRNAs (miRNAs) have remarkable potential as diagnostic and prognostic markers because of their roles in disease pathogenesis. miRNAs can be released into the bloodstream, where they are sufficiently stable to be detected noninvasively. The hypothesis of the present study was that the expression of circulating miRNAs, separately or as miRNAs panel, could improve the diagnosis and prognosis of cirrhosis. In this sense, the expression levels of 21, 34a, miR-122, miR-181b, miR-571, and miR-885-5p in serum samples from patients with stable cirrhosis was prospectively evaluated. Total RNA was extracted from the sera of patients with cirrhosis (n = 186) and healthy individuals (n = 28), and the expression levels of the target miRNAs were analyzed by reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction. Serum miRNAs levels were correlated with liver function parameters, etiology, and complications of cirrhosis. Circulating miR-34a, miR-122, and miR-885-5p levels were higher in patients with cirrhosis than in healthy individuals. These miRNAs were positively correlated with alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase levels, and the relative expression levels were higher in hepatitis C virus-infected patients and lower in patients with Child-Pugh C cirrhosis. miR-122 and miR-885-5p levels were also positively correlated with γ-glutamyl transpeptidase concentrations. miR-21 was associated with transplant-free survival in univariate Cox regression analysis and remained independently associated with survival after adjustment for age, Child-Pugh classification, Model for End-stage Liver Disease score, and history of previous decompensation in multivariate Cox regression analysis. These data suggested that miR-34a, miR-122, and miR-885-5p levels may be more related to the inflammatory process and ongoing hepatocyte damage in patients with cirrhosis. Moreover, miR-21 levels were independently associated with shorter transplant-free survival and may be used as a prognostic tool in outpatients with stable cirrhosis. The main finding of the present study was the demonstration that the expression of circulating miR-21 can be used to complement the Child-Pugh classification and the model for terminal liver disease in relation to the prognosis of patients with stable cirrhosis.
Keywords: Liver cirrhosis. Liver diseases. MicroRNA. MiR. Prognosis. Survival time.
Figura 1 - História natural da doença hepática crônica. ... 21
Figura 2 - Representação esquemática da biogênese de miRNA. ... 28
Figura 3 - Número de publicações relacionadas à miRNA. ... 31
Figura 4 - Relação de miR-21 com a fibrose hepática. ... 32
Figura 5 - Relação de miR-34a com a p53. ... 33
Figura 6 - Relação de miR-122 com o metabolismo hepático. ... 35
Figura 7 - Relação de miR-181b com a fibrose hepática. ... 37
Figura 8 - Relação de miR-885-5p com o metabolismo hepático de lipídios. ... 38
Figura 9 - Visão geral da estratégia experimental utilizada no presente estudo. ... 49
Figura 10 - Diagrama de Venn demonstrando que mais de um fator etiológico poderia estar presente em casos específicos. ... 54
Figura 11 - Representação esquemática da extração de RNA total. ... 57
Figura 12 - Avaliação da qualidade e quantidade de RNA total. ... 60
Figura 13 - Representação esquemática da RT-qPCR. ... 63
Figura 14 - Representação de LinRegPCR para determinação de eficiência da qPCR. ... 65
Figura 15 - Expressão relativa de miRNAs em soro de pacientes cirróticos. ... 69
Figura 16 - Análise de agrupamento hierárquico. ... 71
Figura 17 - Análise da área sob a curva característica de operação do receptor (AUROC) para miRNAs circulantes. ... 74
Figura 18 - Correlações entre expressão sérica de miRNAs e alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST) e γ-glutamil transpeptidase (GGT) como marcadores de lesão hepática em todos os pacientes com cirrose. ... 76
Figura 19 - Correlações entre expressão sérica de miRNAs e alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST) e γ-glutamil transpeptidase (GGT) como marcadores de lesão hepática em pacientes com cirrose relacionada à hepatite C. ... 79
Figura 20 - Correlações entre expressão sérica de miRNAs e alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST) e γ-glutamil transpeptidase (GGT) como marcadores de lesão hepática em pacientes com cirrose classificada como Child-Pugh A/B. ... 81
Figura 21 - Expressões séricas de 21, 34a, 122 e miR-885-5p em pacientes com cirrose relacionada ou não à hepatite C. ... 84
Figura 22 - Comparações das expressões séricas de miR-21, miR-34a, miR-122 e miR-885-5p entre indivíduos saudáveis e pacientes com cirrose categorizada de acordo com a classificação Child-Pugh. ... 86 Figura 23 - Comparações das expressões séricas de miR-21, miR-34a, miR-122 e miR-885-5p entre indivíduos saudáveis e pacientes com cirrose relacionada à hepatite C categorizada de acordo com a classificação Child-Pugh. ... 87 Figura 24 - Sobrevida livre de transplante em pacientes com cirrose de acordo com a expressão de miR-21 em amostras de soro. ... 92
Tabela 1 - Classificação Child-Pugh para cirrose hepática. ... 25 Tabela 2 - MicroRNAs circulantes em doenças hepáticas não tumorais (soro ou plasma). ... 39 Tabela 3 - Características dos pacientes incluídos. ... 53 Tabela 4 - Eficiências de qPCR determinadas utilizando-se LinRegPCR. ... 66 Tabela 5 - Coeficiente de correlação de Spearman entre miRNAs e outras variáveis numéricas basais... 78 Tabela 6 - Análises de regressões múltiplas de parâmetros associados com sobrevida geral. ... 90 Tabela 7 - Análises de regressões múltiplas de parâmetros associados com sobrevida geral para o painel de miRNA. ... 91 Tabela 8 - Resumo dos resultados obtidos em relação a toda a coorte de pacientes com cirrose hepática estável. ... 94
AFP – do inglês alpha-fetoprotein (α-fetoproteína) AH – do inglês alcoholic hepatitis (hepatite alcoólica) AIH – do inglês autoimmune hepatitis (hepatite autoimune) ALP – do inglês alkaline phosphatase (fosfatase alcalina)
ALT – do inglês alanine aminotransferase (alanina aminotransferase) APAP – do inglês acetaminophen; N-acetyl-p-aminophenol (acetaminofeno; N-acetil-p-aminofenol)
ASH – do inglês alcoholic steatohepatitis (esteatohepatite alcoólica) AST – do inglês aspartate aminotransferase (aspartato aminotransferase)
AUROC – do inglês area under the receiver operating characteristic
curve (área sob a curva característica de operação do receptor)
cel – Caenorhabditis elegans
CHB – do inglês chronic hepatitis B (hepatite B crônica)
CHB-M – do inglês mild chronic hepatitis B (hepatite B crônica moderada)
CHB-S – do inglês severe chronic hepatitis B (hepatite B crônica grave)
CRP (PCR) – do inglês C-reactive protein (proteína C reativa) DAAs – do inglês direct-acting antivirals (antivirais de ação direta) FC – do inglês fold change
GGT – do inglês gamma-glutamyl transpeptidase (γ-glutamil transpeptidase)
HAI – do inglês histologic activity index (índice de atividade histológica)
HBV – do inglês hepatitis B virus (vírus da hepatite B)
HBV-ACLF – do inglês hepatitis B virus-related acute-on-chronic liver
failure (insuficiência hepática crônica agudizada relacionada à hepatite
B)
HBV-ASC – do inglês hepatitis B virus-chronic asymptomatic carriers (carreadores crônicos assintomáticos do vírus da hepatite B)
HBV-HCC – do inglês hepatitis B virus-related hepatocellular
carcinoma (carcinoma hepatocelular relacionado ao vírus da hepatite B)
HCC – do inglês hepatocellular carcinoma (carcinoma hepatocelular) HCV – do inglês hepatitis C virus (vírus da hepatite C)
HCV-HCC – do inglês hepatitis C virus-related hepatocellular
carcinoma (carcinoma hepatocelular relacionado ao vírus da hepatite C)
HDL – do inglês high-density lipoprotein (lipoproteína de alta densidade)
hsa – Homo sapiens
INR (RNI) – do inglês international normalized ratio (razão normalizada internacional)
IP-10 – do inglês interferon-γ-inducible protein of 10 kDa LC – do inglês liver cirrhosis (cirrose hepática)
LDL – do inglês low-density lipoprotein (lipoproteína de baixa densidade)
MELD – do inglês Model for End-Stage Liver Disease (modelo para doença hepática terminal)
NAFLD – do inglês nonalcoholic fatty liver disease (esteatose hepática não alcoólica)
NAS – do inglês NAFLD activity score (classificação da atividade da NAFLD)
PBC – do inglês primary biliary cholangitis (colangite biliar primária) PCHE – do inglês pseudocholinesterase (pseudocolinesterase)
PT – do inglês prothrombin time (tempo de protrombina)
PTA – do inglês prothrombin time activity (tempo de atividade de protrombina)
RT-qPCR – do inglês reverse transcription-quantitative polymerase
chain reaction (transcrição reversa-reação em cadeia da polimerase
quantitativa)
sma – Schistosoma mansoni
SVR – do inglês sustained virological response (resposta virológica sustentada)
TG – do inglês triglyceride (triglicerídeos)
TGF-β1 – do inglês transforming growth factor-beta 1 (fator de transformação do crescimento-beta 1)
1 INTRODUÇÃO ... 17
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 19
2.1 CIRROSE HEPÁTICA ... 19
2.2 BIOGÊNESE DE miRNA... 26
2.3 miRNAs CIRCULANTES NA CIRROSE HEPÁTICA ... 45
3 OBJETIVOS ... 48 3.1 OBJETIVO GERAL ... 48 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 48 4 ESTRATÉGIA EXPERIMENTAL ... 49 5 MATERIAL E MÉTODOS ... 51 5.1 PACIENTES ... 51
5.2 AMOSTRAS DE SORO E PARÂMETROS LABORATORIAIS ... 55
5.3 EXTRAÇÃO DE RNA TOTAL ... 55
5.4 AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DE RNA TOTAL ... 58
5.5 SELEÇÃO DE miRNA-ALVO ... 61
5.6 TRANSCRIÇÃO REVERSA-REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE QUANTITATIVA (RT-qPCR) ... 62
5.7 ANÁLISES ESTATÍSTICAS ... 67
6 RESUTADOS ... 67
6.1 EXPRESSÃO RELATIVA DE MicroRNAs ... 67
6.2 EXRESSÃO SÉRICA DE miRNAS DE ACORDO COM AS CARACTERÍSTICAS BASAIS DOS PACIENTES INCLUÍDOS ... 75
6.3 miRNAs CIRCULANTES COMO PREDITORES DA SOBREVIDA LIVRE DE TRANSPLANTE EM PACIENTES AMBULATORIAIS COM CIRROSE HEPÁTICA ... 88
7 DISCUSSÃO ... 96
8 CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS ... 100
ANEXO A - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) ... 115 ANEXO B - Análise por absorbância de RNA total de amostra de soro ... 117 ANEXO C - Artigo publicado com dados obtidos através da revisão bibliográfica do presente estudo ... 131 ANEXO D - Artigo publicado com dados obtidos através da avaliação da expressão de miRNAs em pacientes com cirrose estável ... 132
1 INTRODUÇÃO
As principais causas de doença hepática consistem em abuso de álcool, hepatites virais, esteatose hepática não alcoólica (NAFLD, do inglês nonalcoholic fatty liver disease), hemocromatose, hepatite autoimune (AIH, do inglês autoimmune hepatitis), colangite biliar primária (PBC, do inglês primary biliary cholangitis) e colangite esclerosante primária. Álcool e vírus de hepatites B e C (HBV e HCV, do inglês hepatitis B virus e do inglês hepatitis C virus) são as causas mais importantes de cirrose hepática e carcinoma hepatocelular (HCC, do inglês hepatocellular carcinoma) (BLACHIER et al., 2013; MANN et al., 2003; REHM et al., 2010; ZATONSKI et al., 2010). A mortalidade relacionada à doença hepática é crescente, com mais de um milhão de mortes por cirrose hepática em 2010 em nível mundial (MOKDAD et al., 2014). Quando mortes por cirrose hepática são combinadas com mortes por câncer hepático e hepatite aguda, o número anual de mortes devido à doença hepática pode exceder dois milhões (BYASS, 2014).
Na Europa, a cirrose hepática é responsável por cerca de cento e setenta mil mortes por ano e mais de cinco mil e quinhentos transplantes de fígado são realizados a cada ano (BLACHIER et al., 2013). As infecções por HBV e HCV são responsáveis pela taxa de mortalidade de aproximadamente 3 e 11 mortes, respectivamente, por cem mil habitantes por ano na Espanha (GARCIA-FULGUEIRAS et al., 2009). Embora políticas de controle de bebidas alcoólicas, vacinação e estratégias de prevenção tenham contribuído para reduzir a incidência de doenças hepáticas crônicas, estas doenças permanecem como problemas de saúde pública em função das complicações associadas. Além disso, há um elevado custo relacionado ao tratamento antiviral para infecção crônica por HBV e HCV (HAJ-ALI SAFLO; HERNANDEZ GUIJO, 2009; LIU, S. et al., 2012). No Brasil, em 2015, foram estimados aproximadamente vinte e oito mil óbitos (15,7 casos por 100 mil habitantes) relacionados à cirrose, câncer hepático e consumo de álcool (MELO et al., 2017).
Novos biomarcadores têm sido pesquisados para melhorar o diagnóstico e o prognóstico de doenças hepáticas, incluindo microRNAs (miRNAs) circulantes. MicroRNAs são pequenos RNAs com aproximadamente vinte e dois nucleotídeos de extensão que regulam a expressão gênica através de interação com regiões complementares de RNA mensageiro (mRNA, do inglês messenger RNA) (AMBROS,
2004). MicroRNAs circulantes podem ser detectados em soro de humanos e apresentam concentrações estáveis e reprodutíveis entre indivíduos da mesma espécie (CHIM et al., 2008; VAN ROOIJ, 2011). Desta forma, a hipótese do presente trabalho foi que a expressão de miRNAs circulantes, separadamente ou como painel de miRNAs, poderia melhorar o diagnóstico e o prognóstico da cirrose. Nesse sentido, a expressão de 21, 34a, 122, 181b, miR-571 e miR-885-5p foi avaliada de forma prospectiva em amostras de soro de pacientes com cirrose hepática estável.
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 CIRROSE HEPÁTICA
A cirrose vem sendo considerada uma causa crescente de morbidade e mortalidade em países mais desenvolvidos. É a décima quarta causa mais comum de morte em adultos em todo o mundo, mas a quarta na Europa Central implicando em mais de um milhão de mortes por ano em todo o mundo (LOZANO et al., 2012), cento e setenta mil por ano na Europa (BLACHIER et al., 2013), e mais de trinta mil por ano nos EUA (HOYERT; XU, 2012). A cirrose é a principal indicação para cinco mil e quinhentos transplantes de fígado a cada ano na Europa (BLACHIER et al., 2013). A prevalência da cirrose é difícil de ser avaliada, sendo, provavelmente, maior do que a relatada, uma vez que os estágios iniciais são assintomáticos. Apesar disso, a prevalência foi estimada em até 3% na França e a incidência foi de até 133 casos por 100 mil pessoas em estudos no Reino Unido e na Suécia (BLACHIER et al., 2013; TSOCHATZIS et al., 2014). No Brasil, em 2015, foram estimados aproximadamente vinte e oito mil óbitos (15,7 casos por 100 mil habitantes) relacionados à cirrose, câncer hepático e consumo de álcool. Essas causas são responsáveis por importante carga de mortalidade prematura no Brasil, principalmente entre homens na região nordeste (Sergipe, Ceará, Pernambuco, Paraíba e Alagoas), e reforçam a necessidade de políticas públicas para o enfrentamento ao consumo nocivo de álcool (MELO et al., 2017).
A cirrose consiste no estágio final de qualquer condição em que o fígado torna-se progressivamente cicatrizado. É diagnosticada com base em achados físicos, bem como por exame microscópico de biópsia hepática ou evidências de outros testes diagnósticos, como o ultra-som. Histologicamente, a cirrose aparece como uma faixa generalizada de tecido fibroso que divide o fígado em nódulos. Eventualmente, a cirrose interfere com a função do fígado e pode levar a insuficiência hepática ou câncer hepático. Os principais fatores de risco para o desenvolvimento de cirrose hepática são as infecções por HBV e HCV, doença hepática auto-imune (tais como hepatite autoimune, colangite biliar primária e colangite esclerosante primária), NAFLD (geralmente encontrada em indivíduos obesos que não consomem álcool), doença metabólica hereditária como hemocromatose (acúmulo de ferro), doença de Wilson (acúmulo de cobre) e deficiência de α1-antitripsina, além da exposição prolongada a quantidades excessivas de álcool, que pode culminar em
um processo inflamatório e eventualmente causar cirrose (PUNNOOSE et al., 2012).
A fibrose hepática é a resposta de cicatrização do fígado a muitas causas de lesão crônica, entre as quais a infecção viral, o consumo de álcool e a esteato-hepatite não alcoólica (NASH) são as mais comuns. Independentemente da causa subjacente, lesões iterativas causam danos inflamatórios, deposição de matriz, morte de células parenquimais e angiogênese levando a fibrose progressiva. A matriz cicatricial geralmente acumula-se muito lentamente (o tempo médio para cirrose na hepatite C crônica é de 30 anos). Entretanto, uma vez que a cirrose é estabelecida, o potencial para reverter este processo é diminuído e as complicações desenvolvem-se. Polimorfismos genéticos, características epigenéticas e co-fatores (como obesidade e consumo de álcool) podem modular o risco de progressão da fibrose. Se a causa da fibrose for eliminada, a resolução da fibrose hepática precoce pode ocorrer, ou seja, a reversão completa da arquitetura do fígado próxima ao normal. Já na cirrose estabelecida, embora a resolução não seja possível, a regressão da fibrose melhora os resultados clínicos ainda que não resulte na reversão da mesma. Atualmente, o transplante de fígado é o único tratamento disponível para insuficiência hepática ou para alguns casos de câncer primário de fígado. Tem sido observado aumento na incidência de carcinoma hepatocelular em todo o mundo, sendo uma das principais causas de morte relacionada ao fígado em pacientes com cirrose (Figura 1) (PELLICORO et al., 2014).
Figura 1 - História natural da doença hepática crônica.
A figura representa esquematicamente que lesões iterativas causam danos inflamatórios, deposição de matriz, morte de células parenquimais e angiogênese levando a fibrose progressiva. Se a causa da fibrose for eliminada, a resolução da fibrose hepática precoce pode ocorrer. Já na cirrose estabelecida, a regressão da fibrose melhora os resultados clínicos ainda que a resolução não seja possível. Resolução: reversão completa da arquitetura do fígado próximo ao normal; Regressão: melhora da fibrose sem que ocorra a reversão próxima ao normal. Fonte (adaptada): (PELLICORO et al., 2014).
Quando o fígado não processa adequadamente a bile e a e bilirrubina, o indivíduo pode desenvolver icterícia ou amarelecimento. Além disso, pode ocorrer eritema palmar, angiomas de aranha, ginecomastia, diminuição da quantidade de pelos corporais e encolhimento dos testículos. Os pacientes podem sofrer sangramento espontâneo, uma vez que o fígado torna-se incapaz de produzir fatores coagulação, além de outras proteínas como a albumina. À medida que a cirrose evolui, a resistência para o sangue atravessar os vasos no fígado torna-se cada vez maior aumentando a pressão na veia porta (hipertensão portal) que, por sua vez, pode favorecer a formação de varizes de esôfago, as quais tendem a sangrar facilmente e evoluir para hemorragia digestiva alta. Hipertensão portal e baixas concentrações de albumina causam ascite (acúmulo de líquido no espaço abdominal) e edema (retenção de água levando ao inchaço em áreas dependentes). À medida que a insuficiência hepática se estabelece, o fígado torna-se incapaz de remover toxinas do corpo. Este acúmulo de toxinas pode afetar o nível de consciência de uma pessoa, uma condição denominada encefalopatia hepática (PUNNOOSE et al., 2012).
A função hepática pode ser avaliada através dos seguintes marcadores bioquímicos: alanina aminotransferase (ALT, do inglês
alanine aminotransferase), aspartato aminotransferase, (AST, do inglês aspartate aminotransferase), fosfatase alcalina (ALP, do inglês alkaline phosphatase), γ-glutamil transpeptidase (GGT, do inglês gamma-glutamyl transpeptidase), albumina, razão normalizada internacional
[INR (RNI), do inglês international normalized ratio] e bilirrubina. A lesão hepatocelular, e não necessariamente a morte celular, desencadeia a liberação de ALT (uma enzima citosólica encontrada em concentrações maiores no fígado que catalisa a transferência de grupo amino da alanina para o ácido α-cetoglutárico produzindo o piruvato) e de AST (uma enzima presente tanto no citoplasma quanto na mitocôndria e é encontrada no fígado, músculo esquelético cardíaco, rins, cérebro, pâncreas, pulmões, leucócitos e eritrócitos; catalisa a transferência de grupo amino do aspartato para o ácido α-cetoglutárico produzindo o oxaloacetato) na circulação. A combinação de concentrações aumentadas de ALP (uma enzima encontrada principalmente no fígado e nos ossos e que desempenha um papel na desfosforilação de uma variedade de moléculas) e de GGT (uma enzima encontrada nos hepatóticos e nas células biliares epiteliais e que catalisa a transferência de grupos γ-glutamil de peptídeos para outros aminoácidos) é sugestiva de obstrução do trato biliar. A síntese de albumina é uma importante função do fígado, de modo que uma
diminuição da concentração de albumina no soro pode refletir na síntese diminuída ocasionada pela progressão da doença hepática. De forma semelhante, a síntese de fatores de coagulação (exceto o fator VIII) é também uma importante função do fígado que pode ser avaliada pelo tempo de protrombina (PT, do inglês prothrombin time; fator II; um prolongamento do PT pode sugerir doença hepática). Com a finalidade de padronizar os resultados obtidos pelo PT, utiliza-se a RNI que é calculado pela seguinte equação: RNI = (PT do paciente / PT médio do controle)ISI, em que ISI, do inglês international sensitivity index, é fornecido pelo fabricante do teste. A partir da lise de eritrócitos no sistema reticuloendotelial ocorre a produção de bilirrubina não conjugada que é ligada à albumina e transportada ao fígado onde é conjugada com o ácido glicurônico e, subsequentemente, é secretada no intestino através da bile (assim, a hiperbilirrubinemia pode refletir uma obstrução biliar) (GIANNINI et al., 2005; HALL; CASH, 2012; LIMDI; HYDE, 2003).
Outros marcadores utilizados para a avaliação de pacientes com cirrose hepática são a proteína C reativa [CRP (PCR) – do inglês
C-reactive protein], o sódio e a creatinina. A PCR, nomeada em função da
capacidade de precipitar o polissacarírdeo C de Streptococcus
pneumoniae, é um marcador de inflamação e também de infecção, é
utilizado em diferentes cenários. A proteína é sintetizada na fase aguda da inflamação principalmente em resposta à IL-6. Em pacientes com cirrose há maior concentração de PCR em relação a pacientes sem cirrose, devido à inflamação hepática crônica ou por outra causa. No entanto, quando ocorre infecção, quanto mais grave a disfunção hepática subjacente, menor o aumento da PCR. Portanto, o poder preditivo da PCR para infecção e prognóstico é fraco em pacientes com cirrose descompensada ou avançada e em unidades de tratamento intensivo. Entretanto, concentrações maiores e também persistentemente elevadas de PCR podem ajudar a identificar pacientes com um maior risco de mortalidade em curto prazo (PIERI et al., 2014). A hiponatremia é uma complicação comum da cirrose avançada relacionada ao comprometimento da capacidade renal de eliminar água livre de soluto, causando uma retenção de água desproporcional à retenção de sódio, levando a uma redução na concentração sérica de sódio e à hiposmolaridade. O principal fator responsável pela hiponatremia é a hipersecreção do hormônio antidiurético (arginina-vasopressina, AVP) pela neuro-hipófise, relacionada à disfunção circulatória. A hiponatremia na cirrose está associada ao aumento da morbidade e
mortalidade (GIANOTTI; CARDENAS, 2014). A disfunção renal é uma complicação importante que acompanha a cirrose e está associada a um mau prognóstico, especialmente após o transplante de fígado. A creatinina é um produto do metabolismo da creatina, que é produzida no fígado a partir de três aminácidos, metionina, arginina e glicina, e é armazenada nos músculos para ser utilizada como fonte de energia uma vez fosforilada. A elevação da creatinina sérica consiste em resultado laboratorial comum em pacientes com cirrose e pode indicar a presença de insuficiência renal aguda ou crônica. A creatinina sérica fornece uma estimativa da taxa de filtração glomerular e é utilizada nos modelos de prognóstico da cirrose Child-Pugh e modelo para doença terminal hepática (MELD, do inglês Model for End-Stage Liver Disease) (MACAULAY et al., 2006; SLACK et al., 2010; WONG et al., 2017).
Os métodos utilizados para prognóstico da cirrose hepática representam uma estimativa quantitativa da função hepática e da capacidade de suportar cirurgia ou outra intervenção terapêutica (DURAND; VALLA, 2005). Entre esses métodos, destacam-se o Child-Pugh e o MELD. A classificação Child-Child-Pugh (PUGH et al., 1973), uma modificação do original (CHILD; TURCOTTE, 1964), inclui duas variáveis clínicas (ascite e encefalopatia hepática) e três variáveis laboratoriais incluindo dosagens de albumina, bilirrubina e RNI; a soma dos pontos individuais destas variáveis permite categorizar os pacientes em classes A (5-6 pontos), B (7-9 pontos) ou C (10-15 pontos; Tabela 1) (DURAND; VALLA, 2005). A classificação MELD atualmente em uso inclui três variáveis laboratoriais (creatinina, bilirrubina e RNI) e é determinada pela seguinte modelo matemático: MELD = 9,6 × loge
(creatinina [mg/dL]) + 3,8 × loge (bilirrubina [mg/dL]) + 11,2 × loge
(RNI) + 6,4; a pontuação resultante corresponde a taxa de mortalidade esperada para um período de três meses: < 9 (1,9%), 10-19 (6,0%), 20-29 (19,6%), 30-39 (52,6%) e ≥ 40 (71,3%) (DURAND; VALLA, 2005; KAMATH et al., 2001; MALINCHOC et al., 2000).
Tabela 1 - Classificação Child-Pugh para cirrose hepática.
Pontos 1 2 3
Encefalopatia Ausente Mínimo Avançado (coma)
Ascite Ausente Controlada Refratária
Bilirrubina, mg/dL < 2,0 2,0-3,0 > 3,0
Albumina, g/dL > 3,5 3,0-3,5 < 3,0
Razão normalizada internacional (RNI) < 1,7 1,7-2,3 > 2,3 Fonte (adaptada): (DURAND; VALLA, 2005).
Embora Child-Pugh e MELD sejam muito úteis na prática clínica, ambos apresentam RNI e bilirrubina como variáveis em comum que podem ser alteradas por intervenções terapêuticas, tais como diuréticos ou por sepse ou hemólise (DURAND; VALLA, 2005). Em função destas limitações, são desejáveis novos parâmetros que complementem os métodos descritos anteriormente de forma a melhorar tanto o diagnóstico quanto o prognóstico da cirrose. Consequentemente, reduziria os impactos na saúde, em âmbito social e econômico associados com doenças hepáticas por permitir a identificação e o acompanhamento médico mais próximo de pacientes com risco de descompensação da cirrose. Para esta finalidade, novos biomarcadores têm sido pesquisados, incluindo microRNAs (miRNA) circulantes.
2.2 BIOGÊNESE DE miRNA
MicroRNAs são pequenos RNAs endógenos, não codificantes, com cerca de 22 nucleotídeos (nt), que regulam a expressão gênica pós-transcrição através da ligação à regiões complementares de mRNA, resultando na repressão da tradução ou degradação do mRNA alvo (AMBROS, 2004). A Figura 2 fornece uma visão geral da biogênese de miRNA. Inicialmente, (1) o DNA é transcrito pela RNA polimerase II (Pol II), produzindo um transcrito denominado miRNA primário (pri-miRNA) (CAI et al., 2004; LEE et al., 2004), o qual usualmente apresenta uma estrutura stem-loop e comprimento acima de mil bases nucleotídicas (kb). Posteriormente, (2) a RNase III Drosha cliva o
hairpin em ~11 pares de bases (bp) da junção basal e ~22 bp da junção
apical conectada ao loop terminal (HAN et al., 2006; ZENG et al., 2005), formando um RNA hairpin de ~65 nt de comprimento, denominado miRNA (LEE et al., 2003). Em seguida, (3) o pré-miRNA forma um complexo de transporte com a proteína exportin-5 e Ran-guanosina-5’-trifosfato (Ran•GTP), permitindo a exportação para o citoplasma. Uma vez no citoplasma, (4) pré-miRNA é clivado pela RNase III Dicer próximo ao loop terminal, liberando um pequeno RNA duplex (BERNSTEIN et al., 2001; GRISHOK et al., 2001; HUTVAGNER et al., 2001; KETTING et al., 2001; KNIGHT; BASS, 2001), o qual é carregado em uma proteína denominada Argonauta (Ago), formando o pré-complexo de silenciamento induzido por RNA (pré-RISC) (HAMMOND et al., 2001; MOURELATOS et al., 2002; TABARA et al., 1999). O duplex é então desenrolado, o que geralmente causa a degradação da fita passenger (miRNA*) e a formação de miRNA maduro (HA; KIM, 2014).
Uma vez integrado ao RISC, o miRNA maduro é funcional e capaz de regular a expressão gênica. Esta regulação pode ocorrer por: (I) inibição da tradução, o mecanismo mais comum em humanos, o qual é dependente de Ago1, Ago3 ou Ago4, e envolve pareamento imperfeito de bases entre o miRNA e a 3’-untranslated region (UTR) do mRNA (SU et al., 2009); (II) clivagem do mRNA, um mecanismo dependente de Ago2, o qual envolve pareamento perfeito de bases entre miRNA e 3’-UTR do mRNA; e (III) ativação da tradução, a qual envolve a interação de miRNA com a 5’-UTR do mRNA (IORIO; CROCE, 2012; LYTLE et al., 2007; MORETTI et al., 2010; OROM et al., 2008; QIN et al., 2010; VASUDEVAN et al., 2007). O miRNA maduro pode alcançar a corrente sanguínea por (A) liberação ativa (pela incorporação em complexos lipoprotéicos e microvesículas ou exossomos) ou (B) liberação passiva em corpos apoptóticos (causada pela morte celular) (CORTEZ et al., 2011; CREEMERS et al., 2012; RODERBURG; LUEDDE, 2014). Na forma associada, miRNAs circulantes são resistentes à atividade nuclease presente no sangue, tornando-os uma fonte promissora de biomarcadores de diagnóstico ou prognóstico (ENACHE et al., 2014).
Inicialmente, (1) o DNA é transcrito pela RNA polimerase II (Pol II) formando o miRNA primário (pri-miRNA). Em seguida, (2) a RNase III Drosha cliva o hairpin formando o pré-miRNA, o qual (3) é transportado para o citoplasma pelo complexo exportin-5 e Ran-guanosina-5’-trifosfato (Ran•GTP) onde (4) é clivado pela RNase III Dicer liberando um RNA duplex, o qual é carregado em uma proteína Argonauta (Ago), formando um pré-complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC). O duplex é, então, desenrolado causando, geralmente, a degradação da fita passenger (miRNA*) e a formação de miRNA maduro. Uma vez integrado ao RISC, o miRNA maduro pode causar (I) inibição da tradução através de pareamento imperfeito de bases entre o miRNA e a 3’-untranslated region (UTR) do mRNA, (II) clivagem do mRNA através de pareamento perfeito de bases entre miRNA e 3’-UTR do mRNA ou (III) ativação da tradução através da interação do miRNA com a 5’-UTR do mRNA. O miRNA maduro pode alcançar a corrente sanguínea por (A) liberação ativa (pela incorporação em complexos lipoprotéicos e microvesículas ou exossomos) ou (B) liberação passiva em corpos apoptóticos (causada pela morte celular). Na forma associada, miRNAs circulantes são resistentes à atividade nuclease presente no sangue. Fonte (adaptada): (DO AMARAL et al., 2018).
Embora miRNA tenha sido descoberto em 1993 por Lee e colaboradores (LEE et al., 1993) quando estudavam o desenvolvimento do nematódeo de vida livre Caenorhabditis elegans, o termo “miRNA” foi instituído por volta de 2001 (LAGOS-QUINTANA et al., 2001; LAU et al., 2001; LEE; AMBROS, 2001; MOURELATOS et al., 2002). Desde o início dos anos 2000, quando foi demonstrado que havia correlação entre a expressão de miRNAs e doenças em humanos (CALIN et al., 2002; IORIO et al., 2005; MURAKAMI et al., 2006), o número de estudos sobre aplicações de miRNAs como biomarcadores e terapêuticas aumentaram progressivamente (Figura 3). Em 2015, houve 11.216 novas citações relacionadas à “miRNA” na base de dados PubMed (Figura 3A), das quais 978 (9%) foram relacionados tanto à “miRNA” quanto a “liver” (Figura 3B). Em 2016, o número de citações relacionado à “miRNA” foi de 11.230 e a proporção destas citações também relacionadas à “liver” foram semelhantes (960/11.230, 8%) ao observado para o ano de 2015. Considerando todas as 55.756 citações contendo a palavra-chave miRNA até 2016, 4159 (7%) foram relacionadas tanto à “miRNA” quanto à “liver”. Números de citações semelhantes foram observados para o ano de 2017. Neste sentido, aproximadamente um décimo das citações identificadas utilizando os termos de pesquisa Medical Subject Headings (MeSH) “microRNA” e “miRNA” foram também registrados com o termo MeSH “liver” (DO AMARAL et al., 2018).
Figura 3 - Número de publicações relacionadas à miRNA.
As figuras demonstram os números de publicações envolvendo miRNA na base de dados PubMed. (A) número de publicações para os termos Medical Subject
Headings (MeSH) “microRNA” e “miRNA”; (B) número de publicações para
os termos MeSH “microRNA”, “miRNA” e “liver”. A pesquisa foi estabelecida por ano e de forma acumulada até completar o período de 01/01/2001 a 31/12/2017. Fonte (adaptada): (DO AMARAL et al., 2018).
0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 C it a ç õ e s P u b M e d M e S H : m ic ro R N A and m iR N A Ano A Acumula do Por a no 0 800 1600 2400 3200 4000 4800 5600 C it a ç õ e s Pu b M e d M e S H : m ic ro RN A and m iRN A a n d l iv e r Ano B
MicroRNAs têm sido implicados na regulação de diversos processos biológicos importantes, tais como crescimento e diferenciação celular, desenvolvimento, apoptose e modulação da resposta do hospedeiro às infecções virais (BARTEL, 2004). miR-21 foi descrito como relacionado à fibrose hepática (Figura 4) (MARQUEZ et al., 2010), pulmonar (LIU et al., 2010) e cardíaca (THUM et al., 2008), além de ter sido encontrado com expressão aumentada em diversos tumores, incluindo HCC (MENG et al., 2007; VARNHOLT, 2008), em pacientes com HCV (BIHRER et al., 2011b) e naqueles com hepatite autoimune (MIGITA et al., 2015).
Figura 4 - Relação de miR-21 com a fibrose hepática.
A sinalização do fator de transformação do crescimento-beta (TGF-β) pode ser estimulada através da inibição de SMAD7 (do inglês Mothers against
decapentaplegic homolog 7), um regulador negativo da sinalização de TGF-β,
causada por miR-21 resultando em fibrose. Por outro lado, miR-21 pode promover a regeneração hepática estimulando a tradução da ciclina D1 através da inibição direta da expressão de Ras homolog gene family member B. →, ativação; –|, inibição. Fonte (adaptada): (MARQUEZ et al., 2010; NG et al., 2012).
miR34a foi descrito como um mediador da função de p53 e, assim, pode estar envolvido no desenvolvimento de alguns câncer (HERMEKING, 2007). Neste sentido, miR-34a foi encontrado estar tanto diminuído em alguns tipos de câncer humanos (HERMEKING, 2007) quanto aumentado em HCC (MIZUGUCHI et al., 2011) (Figura 5).
miR-21
TGF-β
Fibrose hepática
Ciclina D1
SMAD7 Ras homolog gene family member B
Figura 5 - Relação de miR-34a com a p53.
Os danos causados ao DNA podem induzir a expressão de miR-34a após a ativação de p53, uma proteína supressora de tumor. Foi demonstrada que a expressão de miR-34a está aumentada em HCC. Além disso, miR-34a pode reforçar a função da p53 (inibindo os reguladores negativos da p53 e aumentando a estabilidade da proteína p53) ou pode inibir a função da p53 (reprimindo diretamente TP53, o gene que codifica a proteína p53, e muitos dos genes ativados por p53). Assim, os efeitos de miR-34a sobre a p53 dependerão do equilíbrio dessas vias, permitindo um ajuste fino da resposta da p53 ao estresse genotóxico. →, ativação; –|, inibição. Fonte (adaptada): (HERMEKING, 2007; MIZUGUCHI et al., 2011; NAVARRO; LIEBERMAN, 2015). miR-34a apoptose repouso em G1 senescência micro-processamento RNA interferência ativação de oncogene estresse de replicação estresse oxidativo, encurtamento do telômero dano no DNA E2F3 Ciclina E2 CDK6 MET Bcl2 etc.
miR-122 representa um papel importante na fisiologia hepática, uma vez que está envolvido na aquisição e manutenção do fenótipo hepato-específico, participa na regulação do metabolismo hepático de colesterol a ácidos graxos (Figura 6) (BANDIERA et al., 2015; WU et al., 2015). miR-122 foi encontrado diminuído em pacientes com estágios avançados de HCC (COULOUARN et al., 2009; ZENG et al., 2010) e aumentado em pacientes com hepatite C (BIHRER et al., 2011a; CERMELLI et al., 2011). Além disso, a propagação de HCV-RNA ocorre pós a ligação de miR-122 à 5’-noncoding region do genoma do HCV (BANDIERA et al., 2015; JANSSEN et al., 2013; JOPLING et al., 2005).
Figura 6 - Relação de miR-122 com o metabolismo hepático.
A derivação gástrica Y-de-Roux (RYGB) causa alterações no metabolismo resultando em aumento do transporte de glicose, aceleração da glicólise e inibição da gliconeogênese no fígado. De particular importância, ocorre uma diminuição significativa na expressão de miR-122 circulante e uma diminuição mais modesta na expressão hepática após a cirurgia. Em estudos mecanísticos, a manipulação da expressão de miR-122 em um modelo celular induziu mudanças na atividade de enzimas
chave envolvidas no metabolismo energético do fígado: transporte de glicose, glicólise, ciclo de ácido tricarboxílico, derivação de pentoses fosfato, oxidação de ácidos graxos e gliconeogênese, consistente com os achados das respostas mediadas por cirurgia in vivo em ratos, indicando um papel relevante da atividade homeostática de miRNAs. Fonte (adaptada): (WU et al., 2015).
miR-181b foi descrito estar relacionado com a fibrose hepática em pacientes com cirrose (CHEN, Y. J. et al., 2013; WANG et al., 2012) em resposta à sinalização do fator de transformação do crescimento-beta 1 (TGF-β1, do inglês transforming growth factor-beta
1) (WANG et al., 2012) (Figura 7).
Figura 7 - Relação de miR-181b com a fibrose hepática.
Em resposta à sinalização de fator de transformação do crescimento-beta 1 (TGF-β1) ocorre um aumento na expressão de miR-181b em amostras de soro de pacientes com cirrose hepática, que, por sua vez, poderia inibir o regulador do ciclo celular p27 promovendo, assim, o crescimento de células hepáticas estreladas, mediadores importantes da fibrose hepática. →, ativação; –|, inibição. Fonte (adaptada): (WANG et al., 2012).
miR-885-5p foi encontrado aumentado em pacientes com cirrose hepática e HCC (GUI et al., 2011). Além disso, miR-885-5p foi descrito como um supressor tumoral tanto em neuroblastoma (através da ativação de p53) (AFANASYEVA et al., 2011) quanto em HCC (através da diminuição da atividade da via Wnt/β-catenin) (ZHANG et al., 2016). ATP binding cassette subfamily A member 1 (ABCA1) (GUI et al., 2011) e oxysterol-binding protein-related protein 2 (OSBPL2) (RAITOHARJU et al., 2016), proteínas importantes na regulação do metabolismo de colesterol e fosfolipídios, foram descritas como alvos em potencial de miR-885-5p, sugerindo que este miRNA possa desempenhar um papel no acúmulo de lipídios no fígado através da
miR-181b TGF-β1
Células hepáticas estreladas (HSC)
Fibrose hepática p27
interferência na expressão de proteínas relacionadas ao transporte de lipídios no hepatócitos (Figura 8).
Figura 8 - Relação de miR-885-5p com o metabolismo hepático de lipídios.
ATP binding cassette subfamily A member 1 (ABCA1) e oxysterol-binding protein-related protein 2 (OSBPL2), proteínas importantes na regulação do
metabolismo de colesterol e fosfolipídios, foram descritas como alvos em potencial de miR-885-5p, sugerindo que este miRNA possa desempenhar um papel no acúmulo de lipídios no fígado através da interferência na expressão de proteínas relacionadas ao transporte de lipídios no hepatócito. →, ativação; –|, inibição. Fonte (adaptada): (GUI et al., 2011; RAITOHARJU et al., 2016).
Além dos miRNAs descritos acima, a seção seguinte aborda outros miRNAs que também foram identificados como alterados em soro de pacientes com cirrose hepática e a Tabela 2 apresenta de forma resumida miRNAs circulantes que foram descritos em pacientes com diferentes doenças hepáticas não tumorais; uma vez que HCC está associado a diversas doenças hepáticas crônicas, alguns estudos envolvendo o tema também foram incluídos.
A nomenclatura de miRNAs é composta por um prefixo de três letras que identifica a espécie do organismo, o prefixo “miR” que indica miRNA maduro, e uma identificação numérica única que é simplesmente sequencial. Os braços 5’ e 3’ são indicados pelos sufixos 5p e 3p, respectivamente. Por exemplo, “hsa-miR-122-5p” corresponde ao braço 5’ do miRNA 122 maduro em Homo sapiens (hsa) (AMBROS et al., 2003; GRIFFITHS-JONES et al., 2006) (www.mirbase.org). Como o foco do presente trabalho é miRNA humano, o prefixo que especifica o organismo foi omitido.
miR-885-5p
↓ HDL extra-grandes
Acúmulo de lipídios no fígado
ATP binding cassette subfamily A member 1 (ABCA1) Oxysterol-binding protein-related protein 2 (OSBPL2)
Tabela 2 - MicroRNAs circulantes em doenças hepáticas não tumorais (soro ou plasma).
miRNA Expressão Grupo referência Doença Variáveis correlacionadas Referências
miR-885-5p up Indivíduos saudáveis LC, CHB, HCC NC AFP, ALT, AST, GGT (GUI et al., 2011)
miR-122 down LC compensada LC descompensada
- + NC
Creatinina, RNI, MELD AFP, ALT, AST, GGT Albumina, bilirrubina, proteínas totais
(WAIDMANN et al., 2012)
miR-181b up Indivíduos saudáveis LC NA (WANG et al., 2012)
miR-571 up Indivíduos saudáveis LC
- + NC Albumina, PCHE Child-Pugh Creatinina (RODERBURG et al., 2012) miR-106b down
Indivíduos saudáveis Cirrose CHB NC Bilirrubina, AST, ALT, RNI, PT (CHEN, Y. J. et al., 2013) miR-181b up
16
miRNAs1 up Crianças saudáveis CHB + HBV DNA (WINTHER et al., 2013)
miR-29 down Indivíduos saudáveis LC + NC HBV DNA
ALT (XING et al., 2014)
miR-29 up CHB
miRNA Expressão Grupo referência Doença Variáveis correlacionadas Referências
miR-15b up
Indivíduos saudáveis HBV-HCC NA (LIU, A. M. et al., 2012)
miR-130b up miR-15b down Indivíduos saudáveis CHB NA (LI et al., 2014) miR-15b up HBV-HCC miR-125b up CHB miR-125b down HBV-HCC miR-130b down CHB miR-130b up HBV-HCC let-7b up Indivíduos saudáveis ASC, CHB, HBV-ACLF - NC
Idade (miR-122, miR-194) ALT, HBV DNA (miR-122, miR-194) (JI et al., 2011) miR-16 up miR-20a up miR-92a up miR-106a up miR-194 up miR-122 up HBV-ASC, CHB miR-19b up CHB, HBV-ACLF miR-223 up
miRNA Expressão Grupo referência Doença Variáveis correlacionadas Referências
miR-21 up
Indivíduos saudáveis HBV-ACLF + - RNI, MELD, PT (miR-130a) PTA (miR-130a) (ZHENG et al., 2016) miR-122 up miR-130a up miR-143 up miR-148a up miR-192 up miR-200a up miR-486-5p up
miR-210 up Indivíduos saudáveis CHB-M, CHB-S, HBV-ACLF
- +
PTA
ALT, AST, bilirrubina (SONG et al., 2014) miR-122 up Indivíduos saudáveis HCV
+ NC
ALT, AST, HAI
Albumina, bilirrubina, HCV RNA, RNI, fibrose hepática
(BIHRER et al., 2011a)
miR-21 up Indivíduos saudáveis HCV, HCV-HCC
+ NC
ALT, AST, bilirrubina, GGT, HAI, RNI
Albumina, HCV RNA
(BIHRER et al., 2011b) miR-122 up Indivíduos saudáveis HCV + ALT, AST, HCV RNA (KUMAR et al., 2014) miR-122 up Pacientes não-SVR HCV
+ NC
ALT, HAI
HCV RNA, fibrose hepática (Metavir)
(SU et al., 2013) miR-122 up Indivíduos saudáveis HCV NC ALT, HCV RNA, classificação
Ishak (WANG et al., 2015)
miRNA Expressão Grupo referência Doença Variáveis correlacionadas Referências
miR-143 up
Indivíduos saudáveis HCV, HCC NA (ZHANG et al., 2014)
miR-215 up miR-122 up
Indivíduos saudáveis APAP overdose
+ ALT (miR-122)
(STARKEY LEWIS et al., 2011)
miR-192 up NC ALT (miR-192); bilirrubina,
creatinina, PT (miR-122)
miR-122 up Indivíduos saudáveis APAP overdose + ALT (WARD et al., 2014) miR-122 up Crianças saudáveis APAP overdose +
NC
APAP (adutos protéicos)
ALT (YANG et al., 2015)
miR-122 up Baseline Colestiramina
(tratamento) NC ALT (SINGHAL et al., 2014)
miR-122 up Indivíduos saudáveis Paraquat (intoxicação) + ALT (DING et al., 2012)
miR-16 up
Indivíduos saudáveis NAFLD, HCV
+
NC
Inflamação, estágio da fibrose (miR-34a, -122); ALT, AST, LDL, colesterol total (miR-122) HCV RNA
(CERMELLI et al., 2011) miR-34a up
miR-122 up
miR-122 up Pacientes com
esteatose leve NAFLD
- + NC
Estágio da fibrose miR-122 hepático ALP, ALT, AST, colesterol total, GGT, NAS, TG
(MIYAAKI et al., 2014)
miR-122 up
Indivíduos saudáveis NAFLD + ALT, AST, GGT (miR-122) (PIROLA et al., 2015) miR-192 up
miRNA Expressão Grupo referência Doença Variáveis correlacionadas Referências
miR-21 miR-122
up
up Indivíduos saudáveis AIH
- + NC
Estágio da fibrose
ALT, AST; necroinflamação (miR-21)
colágeno tipo IV; necroinflamação (miR-122)
(MIGITA et al., 2015)
miR-197-3p down
Indivíduos saudáveis PBC NA (NINOMIYA et al., 2013)
miR-505-3p down miR-26b-5p down
Indivíduos saudáveis PBC NA (TAN et al., 2014)
miR-122 up miR-141-3p up miR-135b up
Indivíduos saudáveis ASH NA (CHEN, Y. P. et al., 2013)
miR-490 up miR-761 up miR-203 down miR-214 down
miR-182 up Indivíduos saudáveis AH NC miR-182 hepático, gravidade da
doença, mortalidade (BLAYA et al., 2016) miR-223 up Indivíduos saudáveis Alcoólicos NA (LI et al., 2017)
sma-miR-277 up
Indivíduos ovo-negativo
Esquistossomose
(Schistosoma mansoni) NA (HOY et al., 2014)
sma-miR-3479-3p up sma-bantam up
AH, hepatite alcoólica; AIH, hepatite autoimune; APAP, acetaminofeno (N-acetil-p-aminofenol); ASH, esteatohepatite alcoólica; CHB, hepatite B crônica; CHB-M, hepatite B crônica moderada; CHB-S, hepatite B crônica grave; HBV, vírus da hepatite B; HBV-ACLF, insuficiência hepática crônica agudizada relacionada à hepatite B; HBV-ASC, carreadores crônicos
assintomáticos do vírus da hepatite B; HBV-HCC, carcinoma hepatocelular relacionado ao vírus da hepatite B; HCC, carcinoma hepatocelular; HCV, vírus da hepatite C; HCV-HCC, carcinoma hepatocelular relacionado ao vírus da hepatite C; LC, cirrose hepática; NAFLD, esteatose hepática não alcoólica; PBC, colangite biliar primária; sma, Schistosoma mansoni; SVR, resposta virológica sustentada. -, correlação negativa; +, correlação positiva; NA, não aplicável; NC, correlação não significativa; AFP, α-fetoproteína; ALT, alanina aminotransferase; AST, aspartato aminotransferase; GGT, γ-glutamil transpeptidase; HAI, índice de atividade histológica; RNI, razão normalizada internacional; IP-10, interferon-γ-inducible
protein of 10 kDa; LDL, lipoproteína de baixa densidade; MELD, modelo para doença hepática terminal; NAS, classificação
da atividade da NAFLD; PCHE, pseudocolinesterase; PT, tempo de protrombina; PTA, tempo de atividade de protrombina; TG, triglicerídeos. 116 miRNAs que foram encontrados com expressões aumentadas: miR-99a, miR-100, miR-122, miR-122*, miR-125b, miR-192, miR-192*, miR-193b, miR-194, miR-215, miR-365, miR-455-5p, miR-455-3p, miR-483-3p, miR-885-5p, and miR-1247. Fonte (adaptada): (DO AMARAL et al., 2018).
2.3miRNAs CIRCULANTES NA CIRROSE HEPÁTICA
A expressão de diferentes miRNAs foi encontrada alterada em amostras de soro de pacientes com doenças hepáticas. Gui e colaboradores encontraram uma maior expressão de 146a, miR-215, miR-224, miR-574-3p e miR-885-5p em soro de pacientes com HCC e cirrose hepática. Os autores também avaliaram a expressão destes miRNAs no soro de pacientes com hepatite B crônica (CHB, do inglês chronic hepatitis B) ou câncer gástrico (GC); o miR-885-5p apresentou maior expressão em pacientes com HCC, cirrose hepática e CHB em relação aos pacientes com GC e indivíduos saudáveis. Além disso, a área sob a curva característica de operação do receptor (AUROC, do inglês area under the receiver operating characteristic
curve) para miR-885-5p foi 0,904, com sensibilidade e especificidade de
90,5% e 79,2%, respectivamente, em distinguir pacientes com doença hepática de indivíduos saudáveis. Entretanto, miR-885-5p não se correlacionou com os marcadores de função hepática α-fetoproteína (AFP, do inglês alpha-fetoprotein), ALT, AST ou GGT. Apesar disso, miR-885-5p apresentou melhor performance diagnóstica que ALT (AUROC de 0,742) (GUI et al., 2011).
Por outro lado, outros autores encontraram correlação positiva entre miR-122 e AST, ALT, GGT e ALP em pacientes com cirrose hepática. Waidmann e colaboradores avaliaram a expressão de miR-122 em soro de pacientes com cirrose compensada e descompensada, incluindo 107 pacientes em uma coorte teste e 143 pacientes em uma coorte de validação independente. Os pacientes com cirrose descompensada apresentaram menor expressão de miR-122 em relação aos pacientes com cirrose compensada. Além disso, a menor expressão de miR-122 foi associada com menor tempo de sobrevida na análise de regressão de Cox mesmo após ajuste para MELD (WAIDMANN et al., 2012).
Além dos miRNAs descritos acima, a expressão de miR-181a e miR-181b em amostras de soro de 22 pacientes com cirrose hepática foi avaliada por Wang e colaboradores (WANG et al., 2012). Enquanto que miR-181a não apresentou diferença significativa comparado ao grupo controle (n = 17), a expressão de miR-181b foi significativamente maior em pacientes com cirrose hepática. Além disso, os autores demonstraram, in vitro, que o TGF-β1 induziu a expressão de miR-181b em células hepáticas estreladas-T6 (HSC-T6). Por sua vez, miR-181b promoveu a proliferação de HSC-T6 por ter como alvo o regulador de
ciclo celular p27. Assim, TGF-β1 induziu a expressão de miR-181b promovendo a proliferação de células hepáticas estreladas, as quais são mediadores importantes da fibrose hepática (WANG et al., 2012). Em outro estudo, foi demonstrado que células hepáticas isoladas (hepatócitos e células hepáticas estreladas) apresentaram expressão aumentada de miR-571 em resposta ao tratamento com TGF-β (RODERBURG et al., 2012). Estes autores identificaram alterações em três miRNAs (miR-513-3p, miR-571 e miR-652) em amostras de soro de 67 pacientes com cirrose hepática induzida por consumo de álcool ou hepatite C em relação à indivíduos saudáveis (n = 17); as expressões de miR-513-3p e miR-571 foram aumentadas e a de miR-652 estava diminuída. A AUROC para miR-571 foi 0,91, mas quando miR-571 foi combinado com os outros dois miRNAs (miR-513-3p e miR-652) a AUROC foi de aproximadamente 0,97, mostrando poder ainda maior em discriminar pacientes com doença hepática crônica e cirrose hepática de indivíduos saudáveis. Entretanto, apenas o miR-571 foi associado com o estágio da doença, o qual foi categorizado de acordo com a classificação Child-Pugh; miR-571 apresentou-se significativamente elevado em pacientes com cirrose classificada como Child-Pugh C em relação aqueles classificados como Child-Pugh A (RODERBURG et al., 2012).
O miRNA-122 também foi estudado em pacientes com infecção crônica por HCV, em que foi demonstrada uma maior expressão em amostras de soro dos pacientes em relação a indivíduos saudáveis (BIHRER et al., 2011a). Embora não tenha sido observada uma correlação entre o miR-122 e a RNI, a fibrose hepática ou a carga viral (HCV-RNA sérico), miR-122 mostrou correlação com ALT, AST, índice de atividade histológica (HAI, do inglês histologic activity index) e atividade necroinflamatória. Além disso, os autores demonstraram que a expressão de miR-122 não diferenciou indivíduos saudáveis de pacientes com ALT normal. Portanto, a expressão aumentada de miR-122 pode refletir atividade inflamatória em pacientes com infecção crônica por HCV (BIHRER et al., 2011a). Em outro estudo, foi encontrada a expressão aumentada de miR-21 em soro de pacientes como hepatite C crônica (n = 62) e HCC associado a HCV (n = 29) em relação a indivíduos saudáveis (n = 19) (BIHRER et al., 2011b). Entretanto, miR-21 não foi capaz de diferenciar entre pacientes HCV com e sem HCC, pois a expressão de miR-21 nestes grupos foi equivalente. Por outro lado, miR-21 correlacionou-se com HAI, ALT, AST, bilirrubina, GGT e RNI. Para avaliar a correlação entre miR-21 e atividade necroinflamatória, foi desenvolvido um estudo de coorte de
validação com pacientes HCV crônicos (n = 47), sendo demonstrado que miR-21 foi capaz de diferenciar entre necroinflamação mínima e leve a grave (AUROC: 0,76; sensibilidade: 53,3%; especificidade: 95,2%) (BIHRER et al., 2011b).
Cermelli e colaboradores avaliaram a expressão de 16, miR-21, miR-34a e miR-122 em pacientes HCV crônico e naqueles com NAFLD (CERMELLI et al., 2011). Os autores demonstraram que a expressão de miR-16, miR-34a e miR-122 foi maior tanto em pacientes HCV quanto em NAFLD em relação a indivíduos saudáveis, e que a expressão de miR-21 não foi alterada em nenhum dos dois grupos de pacientes. Além disso, miR-34a e miR-122 correlacionaram-se positivamente com ALT, AST, estágio de fibrose e atividade inflamatória. Em pacientes com NAFLD, miR-122 também correlacionou-se com lipídios séricos [colesterol total e lipoproteína de baixa densidade (LDL, do inglês low-density lipoprotein)]. Os miR-34a (AUROC: 0,75) e miR-122 (AUROC de 0,70) foram capazes de discriminar entre pacientes NAFLD com simples esteatose (NAFLD-SS) e NASH, em que foram categorizados utilizando-se a classificação de atividade NAFLD (NAS) (CERMELLI et al., 2011). Considerando-se o envolvimento destes miRNAs em outras doenças relacionadas, o objetivo do presente estudo foi investigar o valor diagnóstico e prognóstico de 21, 34a, 122, 181b, 571 e miR-885-5p em amostras de soro de pacientes com cirrose hepática estável.
3OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Estudar o significado diagnóstico e prognóstico e os fatores associados à expressão de 21, 34a, 122, 181b, miR-571 e miR-885-5p em amostras de soro de portadores de cirrose hepática estável.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
a) Determinar, por meio de revisão da literatura, os principais miRNAs alterados em amostras de soro de pacientes com doença hepática não tumoral (cirrose hepática);
b) Avaliar a expressão de 21, 34a, 122, miR-181b, miR-571 e miR-885-5p por transcrição reversa-reação em cadeia da polimerase quantitativa (RT-qPCR do inglês
reverse transcription-quantitative polymerase chain
reaction) a partir de amostras soro de pacientes portadores de
cirrose hepática estável;
c) Comparar a expressão relativa destes miRNAs entre pacientes com cirrose hepática estável e indivíduos saudáveis;
d) Comparar a expressão relativa destes miRNAs entre os pacientes com diferentes etiologias da cirrose (álcool, HBV e HCV) e suas complicações (ascite, encefalopatia hepática, hemorragia digestiva alta e varizes de esôfago);
e) Investigar a correlação destes miRNAs com parâmetros de função hepática (albumina, ALP, ALT, AST, bilirrubina total, GGT, PCR, contagem de plaquetas, RNI, sódio); f) Analisar o potencial prognóstico de miRNAs em pacientes
portadores de cirrose hepática estável (regressão de Cox e método de Kaplan-Meier).
4ESTRATÉGIA EXPERIMENTAL
Figura 9 - Visão geral da estratégia experimental utilizada no presente estudo.
2. Alíquotas de soro 1. Coleta de sangue
Tubo ativador de coagulacão
3.000 g por 10 min a ~25 C
16.000 g por 10 min a ~4 C
3. Parâmetros laboratoriais
Laboratório de Análises Clínicas HU/UFSC
Albumina ALP ALT AST Bilirrubina total Creatinina GGT PCR Plaquetas RNI Sódio
5. Extração de RNA total
mirVana PARIS RNA
6. Avaliação da qualidade de RNA total por absorbância
NanoVue Plus
7. RT-qPCR
TaqMan Custom Plating
Eficiência: LinRegPCR
8. Análises estatísticas
IBM SPSS Statitics
Teste de Kolmogorov-Smirnov Coeficiente de correlação de Spearman
Teste U de Mann-Whitney Regressão de Cox Método de Kaplan-Meier
4. Parâmetros clínicos
Serviço de Gastroenterologia HU/UFSC
Etiologia da cirrose Ascite Encefalopatia hepática Hemorragia digestiva alta
Varizes de esôfago Child-Pugh
ALP, fosfatase alcalina; ALT, alanina aminotransferase; AST, aspartato aminotransferase; GGT, γ-glutamil transpeptidase; MELD, modelo para doença hepática terminal; PCR, proteína C reativa; RNI, razão normalizada internacional; RT-qPCR, transcrição reversa-reação em cadeia da polimerase quantitativa.
5MATERIAL E MÉTODOS 5.1 PACIENTES
Este foi um estudo de coorte prospectivo que incluiu indivíduos adultos em acompanhamento (≥ 18 anos de idade) no Ambulatório do Hospital Universitário Professor Polydoro Ernani de São Thiago da Universidade Federal de Santa Catarina (HU/UFSC), Florianópolis, Brasil. O diagnóstico da cirrose foi estabelecido histologicamente (quando disponível) ou pela combinação de achados clínicos, de imagem e laboratoriais em pacientes com evidência de hipertensão portal. A cirrose foi considerada estável em pacientes ambulatoriais sem qualquer sinal de deterioração aguda nas respectivas condições (MEHTA et al., 2015; TAYLOR et al., 2014).
Pacientes com HCC, terapia baseada em interferon nos últimos 30 dias ou ausência de soro sob condições adequadas para as análises (amostras hemolisada, ictérica ou lipêmica) foram excluídas do estudo. Vinte e oito indivíduos pareados por sexo e idade avaliados durante os testes laboratoriais de rotina serviram como grupo controle. Todos os participantes forneceram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido assinado (ANEXO A). O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa com Seres Humanos da UFSC, encontra-se registrado sob o parecer número 948.198 e foi desenvolvido de acordo com os princípios éticos da Declaração de Helsinki de 1975.
Toda a coorte foi avaliada no Ambulatório da Divisão de Gastroenterologia ao longo do período de junho de 2012 a fevereiro de 2014. O desenvolvimento de complicações, mortalidade ou transplante hepático foram avaliados por ligações telefônicas periódicas e durante as consultas ambulatoriais. A reavaliação final foi realizada entre junho e outubro de 2015. As seguintes variáveis clínicas foram coletadas: idade, sexo, raça, abuso de álcool, etiologia da cirrose, história de prévia descompensação e hospitalização, diagnóstico de varizes do esôfago, presença de ascite e encefalopatia. Todos os pacientes foram submetidos à avaliação laboratorial no mesmo dia da avaliação clínica e os seguintes exames laboratoriais foram realizados para este estudo: ALT, AST, GGT, ALP, albumina, bilirrubina total, RNI, creatinina, sódio, contagem de plaquetas e PCR. O consumo significativo atual de álcool foi definido como um consumo geral médio de 21 ou mais drinques por semana para homens e 14 ou mais drinques por semana para mulheres durante as 4 semanas anteriores à inclusão no estudo (um drinque é
