UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Instituto de Biologia
JOÃO GUILHERME PORTUGAL VIEIRA
Controle da homeostase da sinalização do hormônio ácido abscísico em Arabidopsis
thaliana: o papel dos mecanismos de regulação pós-transcricional na expressão dos seus
receptores PYR/PYL/RCAR
Campinas, 2019
JOÃO GUILHERME PORTUGAL VIEIRA
Controle da homeostase da sinalização do hormônio ácido abscísico em Arabidopsis
thaliana: o papel dos mecanismos de regulação pós-transcricional na expressão dos seus
receptores PYR/PYL/RCAR
Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor em Genética e Biologia Molecular, na área de Genética Vegetal e Melhoramento.
Orientador: Prof. Dr. Michel Georges Albert Vincentz Coorientador: Prof. Dr. Gustavo Turqueto Duarte
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA
PELO ALUNO JOÃO GUILHERME
PORTUGAL VIEIRA E ORIENTADA PELO PROF. DR. MICHEL GEORGES ALBERT VINCENTZ.
Campinas, 2019
Campinas, 06 de novembro de 2019
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Michel Georges Albert Vincentz (Presidente da Comissão Examinadora)
Prof. Dr. Jorge Mauricio Costa Mondego
Prof. Dr. Celso Eduardo Benedetti
Profa. Dra. Maria Helena de Souza Goldman
Prof. Dr. Carlos Takeshi Hotta
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
DEDICATÓRIA
Eu dedico esse trabalho para todas as pessoas que veem a ciência como uma vela no escuro.
Entre essas pessoas, o meu pai João Vieira Sobrinho (in
memoriam), cuja a luz de seu ser ainda sinto. Tal como a luz de uma
AGRADECIMENTOS
À toda minha família por todo o apoio incondicional. Em especial, à minha mãe Iracema e minha irmã Olga (Guinha) por serem uma das minhas fontes de inspiração, persistência e fé. Ao Prof. Dr. Michel Vincentz não somente pela orientação e amizade, mas também por criar em mim um novo padrão de cientista que desejo ser.
Aos amigos que passaram pelo Laboratório de Genética de Plantas (LAGEP), tais como Cleverson Matiolli (Tutty), Raphael, Marcos e David pelos momentos de discussões e descontrações.
À Américo, meu irmão acadêmico mais velho, que me orientou não somente nas discussões científicas, mas principalmente nas questões pessoais.
À Gustavo Duarte (Johnny) pelos ensinamentos, broncas e presentes de origem russa. À minha namorada Fernanda Araújo pelo carinho, amor e companheirismo, principalmente, nos momentos mais difíceis.
Aos amigos do CBMEG e do Barracão da Genética, tais como Laura (Xuxu), Daniel, Gabi, Melina, Mariana Vargas, Danilo, Aline, Patrícia, Rebeca, Benício, Stephanie, Chico, André, Clelton e Fernanda pelos ótimos momentos durante esse doutorado.
Aos amigos da república, Renan, André, Lucas, Thiago, Danilo, Camilo e Iago por dividirmos uma casa e muitas histórias.
Aos diferentes amigos feitos aqui em Campinas durante o doutorado, entre eles Gileno, David, Mica Santos, Karin, Ana, Chico e Jú.
Aos amigos do grupo de Jiu Jitsu no CT Covil dos Leões, em especial ao Sensei Maurício (Azul), por ensinar praticar a calma e o controle nos momentos difíceis, mas sem abrir mão da competitividade.
Aos amigos do Curso de Biologia 2009.2, entre eles Zanon, Miny, Cleide e Wesley que sempre se fizeram presentes.
Aos professores Carlos Bernard e Elisa pela oportunidade de vir para Unicamp.
Aos membros titulares e suplentes da minha Banca de Defesa pela análise crítica e sugestões para melhoria desta tese.
Aos professores Dr. Jörg Kobarg, Dra. Camila Caldana e Dr. Carlos Hotta pelas contribuições prestadas a essa tese durante meu exame de qualificação.
Aos funcionários da Unicamp, em especial do CBMEG, entre eles Gabriela, Sandra, Solange, Tânia e Eliseu pelo apoio técnico/logístico.
Á Prof. Dra. Anete Pereira de Souza por conceder seu laboratório para diferentes análises.
Ao Prof. Dr. Fábio Tebaldi e o Dr. Carlos Rojas pelo suporte em diferentes experimentos e discussões.
Ao Prof. Dr. Renato Vicentini pelas contribuições nas análises de bioinformática. Ao Prof. Dr. Pedro L. Rodriguez e Hervé Vaucheret por concederem sementes de diferentes genótipos utilizados nesse trabalho.
À Universidade Estadual de Campinas (Unicamp), o que inclui o Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular.
À Arabidopsis thaliana e Coffea arabica.
À FAPESP por conceder minha bolsa de doutorado (Processo: 2016/04897-3) e tornar esse trabalho possível.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001.
“A ciência não é só compatível com a espiritualidade; é uma profunda fonte de espiritualidade. Quando reconhecemos nosso lugar na imensidão de anos-luz e no transcorrer das eras, quando compreendemos a complexidade, a beleza e a sutileza da vida, então o sentimento sublime, misto de júbilo e humildade, é certamente espiritual (…) A noção de que a espiritualidade e a ciência são de alguma maneira mutuamente exclusivas presta um desserviço a ambas”
RESUMO
Fitohormônios participam de vários aspectos do desenvolvimento e do ajuste a condições de estresse. A detecção do hormônio por um receptor desencadeia uma reprogramação da expressão gênica que caracteriza a resposta ao hormônio. Parte dessa resposta, envolve a ativação de reguladores negativos que promovem a atenuação da via de sinalização hormonal, participando assim, da reinicialização do sistema. O hormônio ácido abscísico (ABA) é responsável por controlar aspectos tanto do desenvolvimento quanto de respostas a estresses abióticos. A via de sinalização do ABA é composta por receptores PYR/PYL/RCAR, fosfatases do clado A PP2C, e quinases SnRK2 da subclasse III. O aumento dos níveis de ABA é percebido pelos receptores PYR/PYL/RCAR. O complexo ABA e receptor sequestra as fosfatases PP2C, liberando as quinases SnRK2 da regulação negativa pelas PP2Cs. Em seguida, SnRK2 fosforila proteínas downstream responsáveis por ativar programa de expressão gênica em resposta ao hormônio. No entanto, como ocorre a reinicialização da via de sinalização do ABA é um aspecto pouco elucidado. Esse trabalho propõe desvendar novos aspectos do controle da homeostase da sinalização do ABA. Mostramos que os transcritos dos
PYR/PYL/RCARs são reprimidos de maneira contínua e robusta por ABA, sugerindo que um feedback negativo atua proeminentemente na expressão dos receptores. Além disso, o
tratamento transiente com ABA, revelou que a recuperação dos níveis iniciais dos transcritos dos receptores é lenta, indicando que o controle da expressão dos receptores representa uma etapa limitante para reinicialização dessa via de sinalização. Abordagens genéticas e farmacológicas sugerem que SnRK2s estão envolvidas na ativação de mecanismos responsáveis pela repressão dos genes dos receptores em resposta ao hormônio. O tratamento com o inibidor transcricional (cordicepina) indicou que ABA promove a desestabilização do RNAm dos receptores PYL1/4/5/6. Análises genéticas e moleculares sugerem que na presença de ABA, miR5628, que é específico de Arabidopsis thaliana, promove a clivagem do transcrito de PYL6. Além disso, na presença do hormônio, os mutantes dcp5-1 e xrn4-5, que são deficientes na atividade de decapeamento e de exoribonuclease, respectivamente, apresentam maior quantidade de transcritos de PYL6 do que no tipo selvagem. Deste modo, sugerimos que após clivagem do RNAm de PYL6, o fragmento RISC-3’ é degradado por XRN4, ao passo que o fragmento RISC-5’ é decapeado e depois degradado por XRN4. A atividade de decapeamento também deve participar no processo de degradação do RNAm de PYL4 e PYL5, sugerindo que o decapeamento dos transcritos dos genes parálogos PYL4/5/6 é uma característica ancestral. Em conjunto, nossos dados indicam que o controle da expressão dos receptores do ABA é um
aspecto importante na regulação da homeostase da sinalização do ABA. Os mecanismos de regulação pós-transcricional participam na atenuação dessa via de sinalização, através da rápida degradação do RNAm de um grupo de receptores parálogos. Por fim, propomos que o miR5628 é uma novidade evolutiva que se integra ao processo da retro-regulação negativa da via de sinalização do ABA, aumentando a eficiência de degradação do RNAm de PYL6.
ABSTRACT
Phytohormones participate in various aspects of development and adjustment to stress conditions. Detection of a hormone by a receptor triggers a reprogramming of gene expression that characterizes the response to the hormone. Part of this response involves the activation of negative regulators, which promotes the attenuation of the hormonal signaling pathway, and thus, participating in the resetting of the system. The hormone abscisic acid (ABA) participates in some developmental processes and is crucial in triggering responses to abiotic stress conditions. The ABA core signaling pathway is composed of PYR/PYL/RCAR receptors, clade A PP2C phosphatases, and SnRK2 subclass III kinases. Increased ABA levels are perceived by PYR/PYL/RCAR receptors. The ABA and receptor complex sequester PP2C phosphatases, releasing SnRK2 kinases from the negative regulation by PP2Cs. Then, SnRK2 phosphorylates downstream proteins that are responsible for activating a gene expression program in response to the hormone. However, how the ABA signaling pathway is resetted is poorly elucidated. This work aims to unveil new aspects of the control of ABA signaling homeostasis. We showed that PYR/PYL/RCAR transcripts are continuously and robustly repressed by ABA, suggesting that negative feedback acts prominently on receptor expression. Moreover, transient ABA treatment revealed that recovery of initial receptor transcript levels is slow, indicating that control of receptor expression represents a limiting step in the resetting of the ABA signaling pathway. Genetic and pharmacological approaches suggest that SnRK2s are involved in the activation of mechanisms responsible for repression of receptor genes expression. Treatment with the transcriptional inhibitor (cordycepin) indicated that ABA promotes destabilization of
PYL1/4/5/6 mRNA receptors. Genetic and molecular analyzes suggest that in the presence of
ABA, miR5628, which is specific of Arabidopsis thaliana, promotes the cleavage of PYL6 transcript. In addition, we have shown that in the presence of the hormone, dcp5-1 and xrn4-5 mutants, which are deficient in decapping and exoribonuclease activity, respectively, show a greater amount of PYL6 transcripts than in wild type. Thus, we suggest that upon cleavage of the PYL6 mRNA, the RISC-3’ fragment is degraded by XRN4, whereas the RISC-5’ fragment is decapped, and then, degraded by XRN4. Decapping activity may also participate in the degradation process of PYL4 and PYL5 mRNAs in response to ABA, suggesting that decapping of the transcripts of PYL4/5/6 paralogues is an ancestral feature. Taken together, our data shed light on the importance of the control of ABA receptor expression in regulating ABA signaling homeostasis. Post-transcriptional regulation mechanisms contribute to attenuate ABA signaling by promoting the fast degradation of mRNA from a group of paralogous ABA receptors.
Finally, we propose that miR5628 is an evolutionary novelty that was integrated in the negative feedback of the ABA core signaling pathway, increasing the degradation efficiency of PYL6 mRNA.
LISTA DE FIGURAS INTRODUÇÃO
Figura 1: Representação esquemática do controle da homeostase...21 Figura 2: Controle da homeostase da via de sinalização da auxina (Au), giberelina (Ga),
citocinina (Ci) e brassinosteróide (Br)...23
Figura 3: Árvore filogenética e conformação proteica dos membros da via central de
sinalização do ABA em A. thaliana...27
Figura 4: Via central de sinalização do ABA...29 Figura 5: Mutação dominante para o gene ABI1 em Arabidopsis thaliana...30 Figura 6: Relação entre os mecanismos de regulação pós-transcricional e sinalização de ABA
em A. thaliana...33
Figura 7: O aumento da concentração atmosférica de gases do efeito estufa, como o dióxido
de carbono (CO2), está envolvido no aumento da temperatura global nos últimos
anos...38
MANUSCRITO
Figure 1: Regulation of the expression of ABA core signaling pathway genes by ABA……...58 Figure 2: MiR5628 promotes the cleavage of PYL6 mRNA in the presence of ABA………...62 Figure 3: Expression pattern of miR5628……….64 Figure 4: Synchronous degradation of different parts of PYL6 mRNA in response to ABA….65 Figure 5: Involvement of the 5’ to 3’ mRNA decay pathway in the repression of PYL6 mRNA
in response to ABA………..………..67
Figure 6: Model of the control of ABA signalization through repression of PYR/PYL/RCAR
Supplemental Figure S1: Effect of ABA treatment on gene expression of ABA core signaling
components………..……….85
Supplemental Figure S2: Changes of mRNA profiles of ABA core signaling pathway genes
in response to long-term treatment with ABA………..………..86
Supplemental Figure S3: Changes in the expression profile of ABA core signaling pathway
genes in response to a short ABA treatment………..87
Supplemental Figure S4: Downregulation of PYR/PYL/RCAR gene expression of requires a
functional ABA core signaling pathway………88
Supplemental Figure S5: Global kinase inhibition by staurosporine affects the expression of PYR/PYL/RCAR and clade A PP2C genes in response to ABA……….……89 Supplemental Figure S6: Involvement of miRNA pathway in the control of PYL6, PYL5 and PYL2 expression………90 Supplemental Figure S7: Analyses of cleavage of PYL6 mRNA by miR5628………92 Supplemental Figure S8: Analysis of PYL4 and PYL5 mRNA degradation in wild type (WT)
and xrn4-5 in response to ABA treatment………..94
Supplemental Figure S9: Divergence of the miR5628 recognition sequence among the 14 A. thaliana ABA receptors……….95
LISTA DE TABELAS
MANUSCRITO
Supplemental Table S1: Sequence of oligonucleotides used for RT-qPCR analysis.………..82 Supplemental Table S2: Sequence of oligonucleotides used for 5’RACE and Dual-luciferase
analyses...………..…83
Supplemental Table S3: ABA-induced changes in the mRNA stability of PYR/PYL/RCAR ………....………...84
LISTA DE ABREVIAÇÕES
ABA: Ácido abscísico
AREB/ABF:ABA-RESPONSIVE ELEMENT-BINDING FACTORS
Au: Auxina
Br: Brassinosteróides
CBC: Cap Binding Complex
CCR4-NOT complex: CARBON CATABOLITE REPRESSOR 4-NEGATIVE ON TATA complex
CDS: Coding sequence (sequência codificante) Ci: Citocinina
Cord: Cordycepin (cordicepina) Ct:Threshold cycle
Ctr: Untreated control (controle não tratado) C - : Controle negativo
C + : Controle positivo DMSO: Dimetilsulfóxido
ESRL: Earth System Research Laboratory FT: Fator de Transcrição
Ga: Giberelina
GFP: Green Fluorescent Protein microRNA: miRNA
NOAA: National Oceanic and Atmospheric Administration PABs: POLY-A BINDING PROTEINS
PARN: POLY (A)-SPECIFIC RNASE
PCR: Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase) OE: Overexpression (superexpressão)
RISC: RNA induced silencing complex (complexo de silenciamento induzido por RNA) RNP: ribonucleoproteínas
RT-qPCR: Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR (PCR quantitativa em tempo
real a partir da transcrição reversa)
snRNP: small nuclear RNPs (complexos proteicos compostos por pequenos RNAs nucleares) STA: staurosporine (estaurosporina)
UTR: untraslated region (região não traduzida) WT: wild type (tipo de selvagem)
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ... 20
Homeostase ... 20
Controle da homeostase das vias de sinalização hormonal em plantas ... 21
Via central de sinalização de ABA ... 25
Controle da expressão gênica em resposta a ABA ... 30
Relação entre a sinalização de ABA e mecanismos envolvidos no metabolismo de RNAm ... 32
A importância da compreensão da sinalização de ABA em um planeta ameaçado pelas mudanças climáticas. ... 37 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 40 OBJETIVO ... 50 MANUSCRITO ... 51 ABSTRACT ... 53 INTRODUCTION ... 54 RESULTS ... 56
Repression of PYR/PYL/RCAR gene expression is part of the negative feedback of ABA signaling ... 56
MicroRNA5628 (miR5628) controls PYL6 mRNA stability in response to ABA ... 60
ABA induces miR5628 expression ... 63
Dynamic of PYL6 mRNA decay... 64
MiR5628 has emerged in A. thaliana ... 67
DISCUSSION ... 68
MATERIAL AND METHODS ... 72
Plant material and growth conditions ... 72
Staurosporine and Cordycepin treatments ... 73
5’RACE analysis ... 73
DNA constructions ... 73
Agroinfiltration and Dual-luciferase assay ... 74
Bioinformatics analysis ... 75 ACKNOWLEDGEMENTS ... 75 LITERATURE CITED ... 75 SUPPLEMENTAL MATERIAL ... 82 CONCLUSÕES ... 96 PESPECTIVAS ... 98
Implicações fisiológicas do controle da sinalização do ABA ... 98
Aspectos mecanísticos do controle da estabilidade do RNAm dos receptores PYR/PYL/RCAR em resposta a ABA ... 99
REFERÊNCIAS ... 101
ANEXOS ... 114
DECLARAÇÕES ÉTICAS ... 115
INTRODUÇÃO
Homeostase
O desenvolvimento e reprodução dos organismos está atrelada à sua capacidade de monitorar as variações nos estímulos ambientais, os quais devem ser traduzidos em sinais endógenos para adequar a sua fisiologia e desenvolvimento. Essa habilidade de um sistema biológico regular seu estado interno em face de perturbações externas variáveis é conhecida como homeostase (Somvanshi et al., 2015). Um sistema homeostático consiste em uma via de sinalização capaz de perceber os sinais externos (inputs) e traduzi-los em uma resposta (output). Essa percepção e sinalização está acoplada a um circuito de retro regulação (feedback) negativa (Ang and McMillen, 2013; Somvanshi et al., 2015; Tang and McMillen, 2016). Assim, alterações no ambiente são percebidas pelos organismos e traduzidas em uma resposta, parte dessa resposta envolve ativação de mecanismos de feedback negativo, os quais atuam reprimindo essa sinalização, e assim, restaura a sinalização ao seu estado original (i.e., antes das alterações do ambiente) (Lestas et al., 2010; Ang and McMillen, 2013; Tang and McMillen, 2016) (Figura 1). Esse padrão de reinicialização, após um evento de perturbação, é conhecido como adaptação (Ang and McMillen, 2013; Tang and McMillen, 2016) (Figura 1).
O controle da homeostase em um sistema biológico é importante para impedir que uma via responda permanentemente a um determinado input. Tal comportamento pode promover não somente a perda de eficácia de resposta, quando o input for grande o suficiente para saturar a resposta, tornando o mecanismo de percepção incapaz de detectar alterações adicionais no nível de estímulo (Ang and McMillen, 2013; Tang and McMillen, 2016; Ruiz et al., 2018); como também promove um gasto exacerbado de energia, que poderia comprometer processos associados ao desenvolvimento.
O controle da homeostase pode ser exemplificado nas vias de sinalização hormonal em plantas, onde a percepção de um sinal, proveniente de estresses ou condições de desenvolvimento, estimula a biossíntese de determinados hormônios, os quais promovem a ativação de um programa de expressão gênica para responder ao sinal estresse/desenvolvimento (Santner et al., 2009; Depuydt and Hardtke, 2011). Contudo, parte desse programa de expressão gênica está envolvido na ativação de mecanismos de feedback negativo que atuam sobre a própria via de sinalização hormonal, deste modo, as plantas controlam a extensão das respostas hormonais, para que essas não afetem negativamente a sua sobrevivência e reprodução.
Figura 1: Representação esquemática do controle da homeostase. Um sistema biológico gera uma resposta (output) a um sinal (input), por exemplo, a sinalização hormonal em plantas que disparam respostas para atender condições de desenvolvimento ou de estresses. Assim, uma condição de estresse ou de desenvolvimento, gera um sinal (i.e., induz um aumento nos níveis dos hormônios). O sistema percebe esse aumento do nível hormonal e o traduz em uma resposta. Parte dessa resposta está envolvida em atenuar a sinalização inicial, através de mecanismos de feedback negativo, os quais promovem a reinicialização do sistema (Adaptação). Diz-se que um sistema é homeostático quando a sinalização em análise retorna ao seu estado estacionário original (P1 = P2), após um evento de perturbação.
Controle da homeostase das vias de sinalização hormonal em plantas
As plantas apresentam um estilo de vida séssil e, portanto, precisam ajustar sua fisiologia à inúmeros estímulos externos a fim de coordenar seu desenvolvimento. Os hormônios vegetais, ou fitohormônios, são elementos centrais neste ajuste fisiológico, uma vez que eles atuam tanto no controle do desenvolvimento vegetal, quanto em respostas a estresses bióticos e abióticos (Santner et al., 2009; Depuydt and Hardtke, 2011). Os fitohormônios são caracterizados como um grupo diverso de moléculas orgânicas, encontradas em pequenas quantidades nas células, cuja a ação pode ser dividida em três etapas: metabolismo, transporte e percepção (Bai et al., 2010; Boursiac et al., 2013). Na primeira metade do século XX os fitohormônios "clássicos" foram identificados, são eles a auxina, ácido abscísico, citocinina, giberelina e etileno (Santner and Estelle, 2009). Nos últimos anos, vários compostos adicionais
foram reconhecidos como hormônios, incluindo brassinosteróides, ácido jasmônico, ácido salicílico, óxido nítrico e estrigolactonas (Santner and Estelle, 2009). Além disso, pequenos peptídeos têm sido classificados como fitohormônios (Christmann and Grill, 2018; Takahashi
et al., 2019).
No organismo modelo, Arabidopsis thaliana, os fitohormônios supracitados têm sido caracterizados quanto à sua função, modo de ação e o controle da homeostase de sua sinalização. Os principais componentes envolvidos nas vias de sinalização hormonais encontrados em A. thaliana são conservados ao longo do reino vegetal (Rensing et al., 2008; Wang et al., 2010; De Smet et al., 2011; Depuydt and Hardtke, 2011; Sun, 2011; Thaler et al., 2012; Huang et al., 2015; Decker et al., 2017; de Vries and Archibald, 2018), ainda assim, mais estudos são necessários para caracterização molecular dessas vias hormonais em outras espécies vegetais. Alguns exemplos do controle da homeostase hormonal em plantas estão exemplificados em seguida e informações adicionais podem ser obtidas na literatura (Loake and Grant, 2007; Domingos et al., 2015; Lopez-Obando et al., 2015; Rai et al., 2015; Jeandroz
et al., 2016; Couto and Zipfel, 2016; Chamizo-Ampudia et al., 2017; Waters et al., 2017).
Auxina é um nome genérico para um grupo de moléculas (ácido indolacético, ácido naftaleno-acético e ácido diclorofenoxiacético) que estão envolvidas no controle da divisão, do alongamento e diferenciação celular em plantas (Teale et al., 2006). Assim, a auxina regula processos associados ao desenvolvimento das plantas, o que inclui embriogênese, diferenciação vascular, organogênese, crescimento trópico, arquitetura de raízes e folhas etc. (Quint and Gray, 2006). Tais processos são regulados por meio de uma via de sinalização que consiste do receptor de auxina TIR1, fatores de transcrição (FTs) do tipo ARFs e seus reguladores negativos Aux/IAA (Quint and Gray, 2006; Teale et al., 2006). Aux/IAA ligam-se aos ARFs, bloqueando a transcrição de genes responsivos a auxina (Quint and Gray, 2006; Teale et al., 2006). O aumento dos níveis de auxina, é percebido pelos receptores TIR1, uma proteína F-box que media a degradação dos Aux/IAAs pelo proteassoma 26S. Dessa forma, os ARFs estão livres da repressão negativa dos Aux/IAAs, e se ligam nos promotores de genes responsivos à auxina, ativando um programa de expressão gênica em resposta ao hormônio. Esse programa de expressão gênica também inclui a indução dos reguladores negativos Aux/IAAs (Quint and Gray, 2006; Teale et al., 2006) (Figura 2). Esse módulo de regulação, que é caracterizado como um feedback negativo, atenua a via de sinalização de auxina à medida que os níveis do hormônio diminuem. A reinicialização dessa via ocorre quando a repressão dos ARFs pelos Aux/IAA é restaurada.
Figura 2: Controle da homeostase da via de sinalização da auxina (Au), giberelina (Ga), citocinina (Ci) e
brassinosteróide (Br). Mudanças nas condições ambientais ou condições intrínsecas das plantas induzem o aumento dos níveis hormonais, os quais são percebidos pelos seus respectivos receptores que disparam uma cascata de sinalização culminando em um programa de respostas. Parte dessas respostas, envolve a indução de reguladores negativos e/ou repressão de reguladores positivos da própria via (feedback negativo) resultando na atenuação da sinalização hormonal. Deste modo, a intensidade das respostas hormonais aos diversos estímulos é controlada a fim de promover a homeostase do sistema. A via de sinalização da auxina é composta por: receptor do tipo TRANSPORT INHIBITOR RESPONSE 1 (TIR1), repressor transcricional INDOLE-3-ACETIC ACID INDUCIBLE (Aux/IAA) e fatores de transcrição do tipo AUXIN RESPONSE FACTOR (ARF); a via de sinalização da giberelina é composta pelo: receptor do tipo GA INSENSITIVE DWARF1 (GID1) e pela família de reguladores transcricionais do tipo DELLA (GA‐INSENSITIVE e RGA REPRESSOR OF GA1); a via de sinalização da citocinina compreende: os receptores HISTIDINE KINASE (HK), as fosfo-transferases do tipo AUTHENTIC HISTIDINE PHOSPHOTRANSFERASES (AHPs) e os fatores de transcrição RESPONSE REGULATORS (RRs) do tipo B (RR tipo-B); a via de sinalização dos brassinosteróides é composta pelo receptor BRASSINOSTEROID INSENSITIVE1 (BRI1), por membros da superfamília de quinases RLCK (BRASSINOSTEROID-SIGNALLING KINASE1/BSK1 e CONSTITUTIVE DIFFERENTIAL GROWTH1/CDG1, pela fosfatase BRI1-SUPPRESSOR1 (BSU1), pela quinase BRASSINOSTEROID INSENSITIVE2 (BIN2), e os fatores de transcrição BRASSINAZOLE RESISTANT1 (BZR1) e BRI1-EMS-SUPPRESSOR1 (BES1).
Outra classe de hormônio são as giberelinas (GA), que estão envolvidas no controle da germinação de sementes, no alongamento de caules, na expansão de folhas, no desenvolvimento de tricomas, na maturação de pólen e indução de florescimento (Davière and Achard, 2013). O aumento dos níveis endógenos de GA é percebido pelos receptores GID1, que por sua vez interagem com as proteínas DELLA, formando o complexo GA-GID1-DELLA (Davière and Achard, 2013). Esse complexo induz a degradação das proteínas DELLA, que atuam como repressores transcricionais inibindo as respostas à giberelina (Davière and Achard, 2013). Deste
modo, a degradação das proteínas DELLA ativa o programa de expressão gênica em resposta a giberelina. Contudo, DELLA induz a transcrição dos genes dos receptores GID1 e da biossíntese de GA, além de reprimir a transcrição dos seus próprios genes. Assim, ao induzir a degradação de DELLA, a giberelina também promove a atenuação de sua via de sinalização, pelo aumento do nível de transcritos de DELLA (regulador negativo) e redução dos níveis de transcritos de GID1 e genes da biossíntese de GA (reguladores positivos) (Middleton et al., 2012) (Figura 2).
As citocininas (CI) compreendem uma classe de moléculas sinalizadoras derivadas da adenina e que foram descritas por controlar a proliferação celular na região dos meristemas caulinar e radicular, assim, regulando processos de diferenciação vascular, biogênese de cloroplastos, desenvolvimento de sementes, crescimento e ramificação da raiz, do caule e inflorescência, senescência foliar e respostas a estresses bióticos e abióticos (Mizuno, 2004; Müller and Sheen, 2007a; Bari and Jones, 2009; Kieber and Schaller, 2018). O aumento dos níveis de citocinina é percebido por receptores do tipo HISTIDINE KINASE (HK), os quais apresentam um domínio extracelular para ligação à citocinina, e um domínio intracelular de histidina quinase (Kieber and Schaller, 2018). Após ligar-se às moléculas de citocinina, HK promove sua auto-fosforilação, e esse fosfato é transferido para AUTHENTIC HISTIDINE PHOSPHOTRANSFERASES (AHPs), que por sua vez transfere o fosfato para membros da família de FTs RESPONSE REGULATORS (RRs) do tipo B (RR tipo-B), que são essenciais para ativar um programa de expressão gênica em resposta à citocinina (Müller and Sheen, 2007a,b; Kieber and Schaller, 2018). Entre os genes induzidos por esses FTs, estão alguns reguladores negativos da sinalização da via de citocininas, a exemplo dos FTs RR tipo-A que devem atuar como substrato que compete tanto pelos íons fosfato transferido por AHP, quanto pela interação com proteínas alvos da sinalização de citocininas (Müller and Sheen, 2007a,b; Kieber and Schaller, 2018). Além disso, a sinalização de citocinina induz enzimas envolvidas no seu catabolismo (CKXs e glucosil-transferases) (Müller and Sheen, 2007a,b; Kieber and Schaller, 2018) (Figura 2).
Os brassinosteróides (BR) são hormônios esteroides essenciais para o controle de vários aspectos do desenvolvimento das plantas, incluindo germinação de sementes, divisão e alongamento celular, florescimento, desenvolvimento reprodutivo e senescência, assim como respostas à estresses abióticos e bióticos (Bari and Jones, 2009; Zhu et al., 2013). A sinalização dos brassinosteróides começa na superfície da membrana celular, onde o hormônio é percebido por uma pequena família de proteínas transmembranar BRI1, que são receptores no seu domínio extracelular, e quinases no seu domínio intracelular. BR une o receptor BRI1 ao seu coreceptor
BAK1, que também é uma proteína transmembranar semelhante a BRI1 (Zhu et al., 2013; Belkhadir and Jaillais, 2015). A formação do complexo ternário BRI1-BR-BAK1, libera BRI1 de seu regulador negativo, BKI1 e dispara uma cascata de fosforilação/desfosforilação de proteínas. Incialmente, BRI1 fosforila membros da superfamília de quinases RLCK (RECEPTOR-LIKE CYTOPLASMIC KINASE), incluindo as BSKs e CDGs. Em seguida, essas quinases fosforilam e ativam as fosfatases BSU1/BSLs, que por sua vez desfosforila e inativa a quinase BIN2, repressora dos FTs BES1 e BZR1 (Zhu et al., 2013; Belkhadir and Jaillais, 2015). Uma vez livres da regulação negativa de BIN2, esses FTs interagem com outros reguladores transcricionais (i.e., FTs e enzimas modificadoras de histonas) para ativar um programa de expressão gênica de resposta ao hormônio (Zhu et al., 2013; Belkhadir and Jaillais, 2015). Como parte integrada nesse programa de expressão gênica, a sinalização dos brassinosteróides reprime a expressão de genes envolvidos na sua biossíntese e dos reguladores transcricionais que se associam com os FTs BES1 e BZR1, bem como induz reguladores negativos como BIN2 (Li and Jin, 2007; Clouse, 2011; Zhu et al., 2013; Belkhadir and Jaillais, 2015; Planas-Riverola et al., 2019) (Figura 2). Desta forma, o feedback negativo promove a atenuação e, consequente, reinicialização da via de sinalização dos brassinosteróides.
De maneira similar aos exemplos dos hormônios aqui mencionados, o controle da homeostase da sinalização do ácido abscísico (ABA) envolve a repressão dos reguladores positivos (receptores PYR/PYL/RCAR) e indução de reguladores negativos (fosfatases PP2C) da sua via central de sinalização (Santiago et al., 2009; Szostkiewicz et al., 2010; Chan, 2012; Song et al., 2016; Wang et al., 2018a).
Via central de sinalização de ABA
ABA controla diversos processos fisiológicos nas plantas, tais como: (i) o controle da dormência de sementes; (ii) tolerância à dissecação de sementes; (iii) inibição do crescimento vegetativo, durante os estágios iniciais de desenvolvimento em condições de estresse; (iv) o controle do movimento estomático para reduzir a perda de água; (v) controle do crescimento da raiz; (vi) a senescência foliar; (vii) as respostas a estresse biótico; e (viii) principalmente na regulação central da tolerância a estresses abióticos como seca, calor, frio, baixa humidade relativa do ar e salinidade (Ton et al., 2009; Seiler et al., 2011; Daszkowska-Golec and Szareijo, 2013; Finkelstein, 2013; Maia et al., 2014; Chiang et al., 2015; Pacifici et al., 2015; Mittler and Blumwald, 2015).
Em condições regulares de desenvolvimento, os níveis basais desse hormônio, que em
(Yoshida et al., 2019a). Contudo, sob condição de estresse, os níveis desse hormônio podem aumentar mais de 30 vezes (Christmann et al., 2007; Ikegami et al., 2009; Geng et al., 2013; Waadt et al., 2014; Urano et al., 2017; Tischer et al., 2017; Yoshida et al., 2019a), promovendo uma reprogramação da expressão gênica para que as plantas possam lidar com as alterações no ambiente (Umezawa et al., 2010). ABA controla tanto o desenvolvimento quanto as respostas a estresses através de uma via central de sinalização, composta pelos receptores PYRABACTIN RESISTANCE 1 (PYR1)/ PYR1-LIKE (PYL)/ REGULATORY COMPONENT OF ABA RECEPTOR (PYR/PYL/RCAR) do ABA; pelos co-receptores PROTEIN PHOSPHATASE tipo 2C (PP2C) e pelas quinases SNF1-RELATED PROTEIN KINASE 2 da subclasse III (SnRK2) (Ma et al., 2009; Park et al., 2009; Umezawa et al., 2009) (Figura 3).
Os receptores PYR/PYL/RCAR compreendem 14 membros em A. thaliana que são divididos em três subgrupos (Figura 3A). Os membros pertencentes ao subgrupo I possuem maior afinidade por ABA (i.e., mais sensíveis sob concentrações basais de ABA) em comparação ao subgrupo II e III, os quais respondem em níveis mais elevados do hormônio (Tischer et al., 2017; Yoshida et al., 2019a). Esta relação de afinidade entre receptor e hormônio, indica que PYR/PYL/RCARs do subgrupo I poderiam estar envolvidos no controle do desenvolvimento por terem o potencial de serem ativados sob concentrações baixas do hormônio, enquanto os receptores dos subgrupos II e III teriam um papel mais proeminente nas respostas a estresses, quando as plantas induzem o aumento dos níveis de ABA, vindo a ativar os receptores que possuem menor afinidade pelo hormônio (Tischer et al., 2017; Yoshida et al., 2019a). O domínio de ligação ao ABA dos receptores PYR/PYL/RCAR é conservado ao longo das espécies vegetais (Jiang et al., 2014). O complexo binário receptor e ABA expõe uma interface de interação com as fosfatases PP2C do clado A (Ma et al., 2009; Park et al., 2009; Umezawa et al., 2010; Melcher et al., 2010; Jiang et al., 2014)(Figura 3B).
As fosfatases PP2C do clado A compreendem nove membros em A. thaliana (Umezawa
et al., 2010) (Figura 3A). As proteínas para essas fosfatases apresentam um domínio que é
importante para interação tanto com o complexo binário receptor e ABA, quanto com o segmento C-terminal denominado ‘ABA box’ das quinases SnRK2 da subclasse III (Figura
3B) (Rodriguez, 1998; Kerk et al., 2002; Umezawa et al., 2010; Xie et al., 2012; Soon et al.,
2012; Fuchs et al., 2013; Jiang et al., 2014) (Figura 3B). A interação entre PP2C e SnRK2 resulta na desfosforilação dessas quinases pelas fosfatases (Umezawa et al., 2010; Ng et al., 2011; Soon et al., 2012). A subclasse III das quinases SnRK2 é composta por três membros em
A. thaliana, os quais são responsáveis por fosforilar diferentes proteínas em resposta a ABA
Figura 3: Árvore filogenética e conformação proteica dos membros da via central de sinalização do ABA em
A. thaliana.
(A) Árvores filogenéticas dos componentes da via de sinalização do ABA: receptores PYR/PYL/RCAR, fosfatases PP2C do clado A e quinases SnRK2 da subclasse III. Os receptores PYR/PYL/RCAR são divididos em três subgrupos (subgrupo I – verde; subgrupo II – azul e subgrupo III - vermelho) (Ma et al., 2009; Park et al., 2009; Umezawa et al., 2009). As sequências de aminoácidos dos membros da via de sinalização do ABA foram obtidas do banco de dados TAIR10 (https://www.arabidopsis.org/), e as árvores de semelhança foram inferidas a partir do método Neighbor-Joining utilizando o programa MEGA7 (Kumar et al., 2016).
(B) Conformação proteíca de membros representativos da via de sinalização do ABA. Os receptores PYR/PYL/RCAR apresentam um domínio conservado de ligação ao ABA. O complexo binário receptor e ABA interagem com um domínio conservado das fosfatases PP2C. Na ausência do complexo binário, esse domínio das fosfatases interagem com o domínio “ABA box” das quinases SnRK2 da subclasse III, essa interação promove a desfosforilação das quinases SnRK2. As representações tridimensionais das proteinas receptoras PYL2, ABI1, SnRK2.2 e SnRK2.6 foram adaptadas dos trabalhos Melcher et al. (2010); Ng et al. (2011) e Fuchs et al. (2013).
A sinalização do ABA é melhor investigada em condições de estresse, portanto, abordaremos o efeito da sinalização de ABA no controle de respostas a condições de estresse. O efeito da sinalização de ABA, sob concentrações basais do hormônio, no desenvolvimento das plantas foi abordado nos trabalhos de Yoshida et al., (2019b,a). Em condições regulares de desenvolvimento, as fosfatases PP2C desfosforilam as quinases SnRK2 da subclasse III, reprimindo constitutivamente a atividade dessas quinases, desta forma, mantendo a via de sinalização do ABA atenuada. Por outro lado, em condições de estresse abiótico, como a seca, a planta induz a biossíntese de ABA, que é percebido pelos receptores PYR/PYL/RCARs. O complexo binário ABA e PYR/PYL/RCAR sequestram as fosfatases PP2C, liberando as quinases SnRK2 da subclasse III de sua repressão (Ma et al., 2009; Park et al., 2009; Umezawa
et al., 2009) (Figura 4). Uma vez liberadas da regulação negativa, SnRK2 ativa um programa
de expressão gênica de respostas a ABA, através da fosforilação de diversos FTs, componentes de maquinarias de regulação pós-transcricional e proteínas envolvidas em rápidas mudanças fisiológicas (Umezawa et al., 2010; Wang et al., 2013; Yan et al., 2017) (Figura 4). Interessantemente, a literatura apresenta que uma mutação no domínio de interação da fosfatase PP2C ABI1, o mutante abi1-1, promove a interação constante da proteína mutada ABI1-1 com SnRK2, mesmo na presença do complexo receptor e ABA (Umezawa et al., 2010). Portanto, no mutante abi1-1, mesmo na presença de ABA, a via de sinalização desse hormônio está atenuada pela repressão constitutiva das SnRK2s (Figura 5) (Umezawa et al., 2010).
Parte das respostas disparadas pelo ABA, envolve a repressão dos transcritos dos receptores e indução dos transcritos das fosfatases, o que deve resultar na atenuação da atividade dessa via de sinalização do ABA (Santiago et al., 2009; Szostkiewicz et al., 2010; Chan, 2012; Song et al., 2016; Wang et al., 2018a) (Figura 4). Contudo, como a regulação da expressão gênica dos componentes da via central de sinalização de ABA em resposta ao próprio hormônio ocorre e quais os mecanismos subjacentes envolvidos são aspectos que precisam ser explorados em detalhe.
Figura 4: Via central de sinalização do ABA. O nó central de sinalização do ABA é formada pelos receptores
PYR/PYL/RCAR, as fosfatases PP2C e as quinases SnRK2. Em condições regulares de desenvolvimento, onde os níveis de ABA são reduzidos, PP2C regula negativamente SnRK2, mantendo essa via de sinalização atenuada. Em condição de estresse, as plantas induzem a biossíntese de ABA. O ABA se liga aos receptores PYR/PYL/RCAR, que por sua vez sequestram as fosfatases PP2C, liberando SnRK2 da regulação negativa. Em seguida, as SnRK2s ativam um programa de expressão gênica, o que envolve a fosforilação de seus alvos
downstream, como fatores de transcrição, componentes de maquinarias de regulação pós-transcricional e
proteínas envolvidas em rápidas mudanças fisiológicas. Parte dessa resposta envolve a indução dos transcritos das fosfatases PP2C e a repressão dos transcritos dos receptores.
Figura 5: Mutação dominante para o gene ABI1 em Arabidopsis thaliana. Em condição de estresse, a via de
sinalização do ABA é ativada a partir da repressão da atividade das fosfatases PP2C pelo complexo binário PYR/PYL/RCAR e ABA, que resulta na liberação das quinases SnRK2 da regulação negativa, que por sua vez, atuam ativando um programa de expressão gênica em resposta a ABA. Por outro lado, a proteína mutada do tipo ABI1-1, que é uma fosfatase do tipo PP2C, não reconhece o complexo PYR/PYL/RCAR e ABA, resultando na inativação constitutiva das SnRK2s. Desta forma, mesmo na presença de ABA, a via de sinalização desse hormônio está atenuada no mutante abi1-1, o que reflete no seu fenótipo de insensibilidade à presença do hormônio. Figura adaptada a partir de Umezawa et al. (2010).
Controle da expressão gênica em resposta a ABA
A ativação das quinases SnRK2 sob condições de estresse, como o efeito da repressão das fosfatases PP2C pelo complexo ABA-PYR/PYL/RCAR, permite a ativação de diferentes respostas a ABA. SnRK2 promove a fosforilação de proteínas envolvidas em rápidas alterações fisiológicas, como por exemplo, o fechamento dos estômatos para reduzir a perda de água pela transpiração (Assmann and Jegla, 2016). Em resposta a ABA, SnRK2 fosforila e ativa proteínas de membrana, como SLOW ANION CHANNEL-ASSOCIATED 1 (SLAC1) e ALUMINUM ACTI- VATED MALATE TRANSPORTER 12 (ALMT12), as quais promovem a despolarização da membrana plasmática pelo efluxo de ânions, e consequente, efluxo de que
K+ (Umezawa et al., 2010; Assmann and Jegla, 2016). Essa série de efluxos, impulsionam a
perda de turgor celular, propiciando o fechamento dos estômatos. Assim, as plantas retém mais água durante eventos de estresses, como a seca (Umezawa et al., 2010; Assmann and Jegla, 2016).
Em resposta a ABA, SnRK2 também promove a fosforilação e ativação dos FTs ABA-RESPONSIVE ELEMENT-BINDING FACTORS (AREB/ABFs). Os AREB/ABF são FTs do tipo bZIP que pertencem à subfamília do grupo A, que é composta de nove homólogos no genoma de Arabidopsis (Umezawa et al., 2010). Após fosforilação por SnRK2, os AREB/ABF ligam-se nas regiões promotoras dos genes responsivos a ABA, os quais apresentam sequências (elementos cis) conservadas de resposta ao hormônio (Umezawa et al., 2010; Yoshida et al., 2010, 2015). Entre os diversos genes, cuja a transcrição é regulada pelos FTs do tipo AREB/ABF, inclui os genes da classe LATE EMBRYOGENESIS ABUNDANT/LEA (a exemplo do RD29B, AIL1, RAB18, EM1 e EM6) e dos fatores de transcrição do tipo MYB (a exemplo de AtMYB74, AtMYB79, AtMYB102, and AtMYB121), que estão envolvidos na tolerância ao estresse hídrico, calor, frio e salinidade (Umezawa et al., 2010; Yoshida et al., 2010, 2015). Deste modo, os FTs do tipo AREB/ABF são importantes reguladores positivos da sinalização de ABA, pois regulam a transcrição de genes envolvidos na tolerância aos diferentes estresses abióticos.
Os FTs do tipo AREB/ABF também estão envolvidos na atenuação da via central de sinalização do ABA, pois esses FTs ligam-se nos promotores dos genes das fosfatases PP2C do clado A, e promovem sua transcrição em resposta a ABA (Wang et al., 2018a). Deste modo, parte do feedback negativo da via central de sinalização do ABA, depende da fosforilação e ativação dos FTs AREB/ABF pelas SnRK2 (Wang et al., 2018a). Os genes dos receptores
PYR/PYL/RCAR também são reprimidos em resposta a ABA, no entanto, os mecanismos de
regulação transcricional não foram completamente elucidados.
Por fim, em resposta a ABA, SnRK2s da subclasse III também fosforilam diferentes componentes de maquinarias de controle pós-transcricional. SnRK2 é capaz de fosforilar in
vitro as proteínas HYPONASTIC LEAVES 1 (HYL1) e SERRATE (SE), afetando a expressão
de diferentes microRNAs (miRNAs) e de seus alvos (Yan et al., 2017). SnRK2 também fosforila componentes do complexo de decapeamento (VARICOSE/VCS) (Wang et al., 2013). No entanto, como essa fosforilação afeta a capacidade de VCS regular a estabilidade dos transcritos alvos ainda não foi explorado (Wang et al., 2013). Possivelmente, as quinases da subclasse III SnRK2 podem regular a atividade de VCS de maneira similar às quinases SnRK2 da subclasse I, que pertencem a um grupo de quinases filogeneticamente próximo (Umezawa
et al., 2010). Recentemente, em condições de estresse hídrico, SnRK2 da subclasse I
mostrou-se capaz de fosforilar VCS, afetando não somente a especificidade dos alvos de VCS, mas também a estabilidade dos mesmos (Soma et al., 2017). Interessantemente, a literatura reporta uma intrínseca relação entre sinalização por ABA e mecanismos de controle pós-transcricional, sugerindo que o programa de expressão gênica ativado em resposta a ABA também envolve o controle da estabilidade de transcritos.
Relação entre a sinalização de ABA e mecanismos envolvidos no metabolismo de RNAm
A regulação da expressão gênica em nível pós-transcricional diz respeito aos eventos que ocorrem após a transcrição, trata-se do controle do processamento, da estabilidade e da tradução do RNAm em proteína (Floris et al., 2009) (Figura 6). A literatura reporta que, em
A. thaliana, alguns componentes das diferentes maquinarias de controle pós-transcricional
regulam a expressão de genes envolvidos nas respostas a ABA, e que os mutantes para esses componentes apresentam uma sensibilidade diferenciada ao hormônio ou a condições de estresse abiótico, assim, sugerindo uma relação próxima entre sinalização de ABA e o metabolismo de RNA (Figura 6).
Figura 6: Relação entre os mecanismos de regulação pós-transcricional e sinalização de ABA em A. thaliana.
Após transcrição, o pre-RNAm é sujeito ao processamento, etapa que envolve a remoção de íntrons (em cinza) e junção dos éxons (em azul) realizada pelo spliceossomo, seguido pela adição do cap-5’ e da cauda poli (A) promovido pelo complexo CBC (CAP BINDING COMPLEX) e PABs (POLY-A BINDING PROTEINS), respectivamente. Após etapa de processamento, o RNAm pode ser traduzido, armazenado ou degradado. A principal via de degradação de RNAm citoplasmático é a via de deadenilação. Nessa via, deadenilases que pertencem ao complexo CCR4-NOT ou fazem parte do grupo das PARNs, promovem a remoção ou encurtamento da cauda poli (A). Em seguida, o transcrito deadenilado pode ser submetido a degradação pelo exossoma, cujos
principais componentes são exoribonucleases de sentido 3’-5’. Alternativamente, o transcrito deadenilado pode entrar na via de degradação de RNA 5’-3, que consiste na remoção do cap-5’, realizado pelo complexo de decapeamento (VCS, DCP1, DCP2, DCP5 e LSM1-7), seguido pela degradação por XRN4, uma exoribonuclease de sentido 5’-3’. O RNAm também pode ser degradado por microRNAs, cuja biogênese depende da transcrição de um pri-miRNA, que é processado em pre-miRNA, e por fim em um miRNA maduro. Esse miRNA é incorporado no complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC - RNA induced silencing complex) que vasculha a célula buscando RNAm-alvos que são complementares ao miRNA, que então procede a clivagem desse RNAm-alvo. Os produtos dessa clivagem, os fragmentos RISC-5’ e -3’, podem ser degradados pelo exossoma e XRN4, respectivamente. Alternativamente, o fragmento RISC-5’ pode ser submetido a via de degradação de RNA 5’-3’. Essas vias de regulação pós-transcricional controlam a expressão de genes responsivos a ABA, o que reflete nos fenótipos de hipo ou hipersensibilidade a ABA ou as condições de estresse osmótico, salino, por calor e frio, dos mutantes para os diferentes componentes dessas vias de regulação pós-transcricional. Os painéis destacam os componentes das vias de processamento (verde), de deadenilação (rosa) e microRNAs (azul) que estão envolvidos nas respostas a ABA. Outras vias de degradação de RNAm são discutidas nas revisões de Chantarachot e Bailey-Serres (2018) e Martínez de Alba et al., (2013).
A transcrição de genes que codificam proteínas origina um precursor de RNAm (pre-RNAm), que em seguida é submetido ao processamento, etapa que envolve a adição do cap-5’, da cauda poli (A) e remoção de íntrons (splicing) com a união dos éxons, essa etapa ocorre dentro do núcleo. A precisão do splicing de pre-RNAm é essencial para as funções celulares, pois impede a formação de transcritos aberrantes. Além disso, splicing pode ser constitutivo ou alternativo, o que permite produzir uma extensa diversidade proteômica (Deng and Cao, 2017).
O splicing é realizado pelo spliceossomo, um grande complexo de ribonucleoproteínas (RNP) composto por small nuclear RNPs (snRNPs)-ricos em uridina (U1, U2, U4 e U5) em conjunto com outras proteínas reguladoras de splicing (Lorković et al., 2000; Deng and Cao, 2017; Shang et al., 2017). RBM25 é uma dessas proteínas reguladoras de splicing. O mutante
rbm25 é hipersensível a presença de ABA, e na presença do hormônio RBM25 controla o splicing alternativo de diversos transcritos envolvidos na sinalização de ABA, incluindo a
fosfatase do tipo PP2C HAB1 (Zhan et al., 2015; Wang et al., 2015). A proteína SERINE/ARGININE-RICH45 (SR45) também contribui para o splicing alternativo de HAB1 (Xing et al., 2015). O mutante (sr45) e a super-expressão (OE:SR45) desse gene foram hiposensíveis e hipersensíveis, respectivamente, ao ABA (Xing et al., 2015). Além disso, SR45 se associa in vivo com outros transcritos envolvidos na sinalização de ABA, entre eles os transcritos para os receptores PYR1, PYL5, PYL7 and PYL8 (Xing et al., 2015). Dessa forma, o
splicing de pre-RNAm desempenha um papel na sinalização do ABA, contudo, ainda não foi
caracterizado sua função regulatória na expressão dos receptores PYR/PYL/RCAR citados em resposta ao ABA.
A adição do cap-5’ é realizado pelo complexo de adição do cap (Cap Bindind
CBP80 (ou ABA HYPERSENSITIVE1) (Hugouvieux et al., 2001; Chantarachot and Bailey-Serres, 2018). O mutante abh1 é hipersensível a ABA, e genes associados a respostas a estresses abióticos foram desregulados nesse mutante, a exemplo dos genes COR15b e COR6 que estão envolvidos em resposta a frio (Hugouvieux et al., 2001). Esse resultado sugere uma relação entre a sinalização de ABA e mecanismos de capeamento de transcritos.
Poliadenilação é um processo de adição da cauda poli (A) à porção final 3’OH do pre-RNAm, para tanto é necessário a formação de um complexo proteico conhecido como POLY (A) - BINDING PROTEINS (PABPS) (Chantarachot and Bailey-Serres, 2018). Uma das subunidades desse complexo é FIP1, que conecta a polimerase poli (A) (PAP) à outras subunidades, como os fatores de clivagem do tipo CPSF (Hunt et al., 2008; Telléz‐Robledo et
al., 2019). FIP1 também está envolvido na poliadenilação alternativa de transcritos em resposta
a estresse salino (Telléz‐Robledo et al., 2019). O alelo mutante para FIP1, fip1-2, apresenta reduzida tolerância ao estresse salino e é hipersensível a presença de ABA em relação ao tipo selvagem. Análises de transcriptômica e proteômica revela que genes envolvidos na adaptação ao estresse salino e respostas a ABA estão desregulados em fip1-2 (Telléz‐Robledo et al., 2019). Esses resultados sugerem que a sinalização de ABA também está envolvida no controle da poliadenilação de transcritos em resposta ao estresse salino.
Após processamento do pre-RNAm em um RNAm maduro, esse RNAm é transportado para o citosol e poderá ser sujeito a tradução, ou ser armazenado, ou ainda ser submetido às vias de decaimento de RNAm (Chantarachot and Bailey-Serres, 2018). A degradação de RNAm citoplasmático geralmente começa pela remoção ou encurtamento da cauda poli (A) (deadenilação), entre as deadenilases envolvidas nesse processo, podemos destacar: o complexo CARBON CATABOLITE REPRESSOR 4-NEGATIVE ON TATA (complexo CCR4-NOT) e POLY(A)-SPECIFIC RNASE (PARN) (Chantarachot and Bailey-Serres, 2018). Uma das subunidades catalíticas do complexo CCR4-NOT, CAF1a, regula expressão de genes envolvidos em estresse abiótico, além disso o mutante caf1a é hiposensível ao estresse salino (Walley et al., 2010). Por sua vez, o mutante para deadenilase PARN/ ABA HYPERSENSITIVE GERMINATION2 (AHG2), ahg2-1, é hipersensível a ABA, onde diferentes genes de resposta ao hormônio são desregulados nesse mutante, a exemplo CIPK3,
RD29A, RD29B e RAB18 (Nishimura et al., 2009). Além disso, ABA induz a expressão de
AHG2 (Nishimura et al., 2005, 2009). Deste modo, o controle da expressão gênica em resposta a ABA deve envolver os mecanismos de deadenilação de transcritos (Nishimura et al., 2005, 2009).
Após deadenilação, o RNAm pode ser degradado pelo exossoma, que é um complexo composto de múltiplas exoribonucleases de sentido 3’-5’ (Chantarachot and Bailey-Serres, 2018). Alternativamente, o transcrito deadenilado pode ser submetido a via de degradação de RNA 5’-3’, que envolve a remoção do cap-5’ (decapeamento) e degradação do RNAm no sentido 5’-3’. O decapeamento envolve a participação da enzima que catalisa a remoção do cap, DECAPPING 2 (DCP2), e seus ativadores DCP1, DCP5, VARICOSE e proteínas do complexo LSM. Após a remoção do cap-5’, o transcrito é degradado por XRN4, uma exoribonuclease de sentido 5’-3’. Os componentes da maquinaria de decapeamento e XRN4 tem sido associado ao controle da expressão de genes responsivos a estresses abióticos, como estresse hídrico, calor e salinidade (Xu and Chua, 2009, 2012; Merret et al., 2013; Motomura et al., 2015; Perea-Resa
et al., 2016; Soma et al., 2017).
Por fim, a estabilidade e tradução do RNAm pode ser regulada por microRNAs (miRNAs) (Martínez de Alba et al., 2013). A via de miRNAs começa com a transcrição de um pri-miRNA pela RNA polimerase II, que por sua vez é processado em um pre-miRNA por diversas proteínas, sendo as mais conhecidas HYPONASTIC LEAVES 1 (HYL1), SERRATE (SE) e DICER-LIKE 1 (DCL1). Em seguida, DCL1, processa o pre-miRNA em um miRNA maduro (Mallory and Vaucheret, 2006; Rogers and Chen, 2013; Martínez de Alba et al., 2013). O miRNA é exportado para o citosol, onde é incorporado à proteína ARGONAUTE (AGO1), que é o principal componente do complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC - RNA
induced silencing complex). Esse complexo procura RNAm-alvos complementares a sequência
do miRNA, para então inibir a tradução desse RNAm ou promover sua clivagem (Mallory and Vaucheret, 2006; Rogers and Chen, 2013; Martínez de Alba et al., 2013). Após clivagem, os fragmentos RISC 5’ e RISC 3’ são degradados pelo exossoma e por XRN4, respectivamente (Chantarachot and Bailey-Serres, 2018). Alternativamente, a via de degradação de RNA 5’-3’ foi reportado por também promover a degradação de fragmentos RISC 5’ (Ren et al., 2014; Chantarachot and Bailey-Serres, 2018). Na via de miRNAs, os mutantes hyl1-2, dcl1-11 e
ago1-25 são sensíveis a ABA, e genes envolvidos nas respostas a esse hormônio foram desregulados
nesses mutantes (Lu and Fedoroff, 2000; Zhang et al., 2008; Duarte et al., 2013). Além disso, como citado anteriormente, em resposta a ABA, as quinases SnRK2 da subclasse III fosforilam HYL1 e SE, alterando o padrão de biogênese de miRNAs e a expressão de seus alvos (Yan et
al., 2017). Esses resultados sugerem que ABA também controla a expressão gênica através das
vias de miRNAs.
Em suma, a literatura demonstra que diversas vias que controlam o metabolismo de RNA estão ligadas a sinalização de ABA. Portanto, para responder apropriadamente a situações
de estresse, ABA deve modular a expressão gênica também através do controle da estabilidade de diversos RNAm. Nosso grupo de pesquisa identificou que ABA regula a estabilidade de 245 transcritos, entre eles os transcritos para os receptores PYL4, PYL5 e PYL6 (Duarte, 2012). Dessa forma, ABA também deve controlar a homeostase de sua sinalização através de mecanismos de regulação transcricional. Contudo, os mecanismos de controle pós-transcricional envolvidos, bem como o sentido fisiológico dessas regulações são aspectos que precisam ser melhor elucidados. A compreensão de como as plantas controlam a extensão das respostas adaptativas disparadas por ABA poderá auxiliar programas de melhoramento genético, que visem o desenvolvimento de cultivares que tolerem diferentes estresses abióticos, sem comprometer o seu crescimento e reprodução. Essa compreensão do funcionamento da via central de ABA é ainda mais importante dentro do contexto das mudanças climáticas e o seu impacto na produção de alimentos.
A importância da compreensão da sinalização de ABA em um planeta ameaçado pelas mudanças climáticas.
O clima pode ser referido como as condições atmosféricas características de uma região do planeta Terra (i.e., temperatura, precipitações, pressão atmosférica, umidade, vento, incidência solar e cobertura de nuvens) (Tripathi et al., 2016). Qualquer alteração dessas condições atmosféricas em uma região, que difere sistematicamente das observações existentes anteriores ao longo de vários anos, pode ser determinada como mudança climática (Tripathi et
al., 2016). No último século, a intensa atividade antrópica tem aumentado a emissão de gases
do efeito estufa na atmosfera, a exemplo do CO2 (Dai, 2012; Trenberth et al., 2014; Tripathi et
al., 2016; Allen et al., 2018) (Figura 7). Esse aumento na emissão de gases do efeito estufa
eleva a temperatura do planeta, cuja a projeção é que, se mantivermos o atual padrão de emissão de gases, aumentaremos em 1.5ºC a temperatura global em relação ao período pré-industrial (período que compreende de 1850 à 1900) (Figura 7) (Dai, 2012; Trenberth et al., 2014; Tripathi et al., 2016; Allen et al., 2018). Esse aumento global da temperatura, poderá promover extensas mudanças nos padrões de chuvas, elevação do nível do mar, aumento da acidificação dos oceanos, enchentes, secas, ondas de calor etc. (Dai, 2012; Trenberth et al., 2014; Mickelbart
Figura 7: O aumento da concentração atmosférica de gases do efeito estufa, como o dióxido de carbono (CO2), está envolvido no aumento da temperatura global nos últimos anos.
A. O gráfico mostra o aumento médio da concentração atmosférica de CO2 ao longo dos anos. Os dados são apresentados como uma fração molar de ar seco, que é definida como o número de moléculas de CO2 dividido pelo número total de moléculas contidas no ar, incluindo o próprio CO2, após o vapor de água ter sido removido. Essa fração molar é expressa em partes por milhão (ppm). Gráfico adaptado do Earth System Research Laboratory (ESRL)/Global Monitoring Division, National Oceanic and Atmospheric Administration (NOAA) (https://www.esrl.noaa.gov/).
B. Aumento da temperatura média global ao longo dos anos devido a ação antropogênica. Em 2017 a temperatura
média global aumentou aproximadamente 1°C em relação aos níveis pré-industriais (1850-1900). No ritmo atual de emissão de gases do efeito estufa, estima-se que por volta do ano de 2040 a temperatura global aumentará 1.5°C em relação ao período pré-industrial. Gráfico adaptado de Allen et al. (2018).
Os efeitos das mudanças climáticas representam uma ameaça grave aos sistemas biológicos, econômicos, sociais etc., contudo, atualmente, a falta de uma discussão ampla sobre as mudanças climáticas com a população é um dos principais fatores que colocam em risco a segurança do planeta (Leviston et al., 2013; Geiger and Swim, 2016). Além disso, a ascensão de governos que negam não somente a existência das mudanças climáticas, mas também desestimulam o desenvolvimento da ciência, tende a ser um agravante nessas questões de importância global.
Dentre os efeitos diretos das mudanças climáticas, a redução na produção agrícola é um fator que ameaça a segurança alimentar global. Tanto os dados atuais quanto as projeções futuras indicam um decréscimo significativo na produtividade agrícola devido as condições climáticas desfavoráveis (Tripathi et al., 2016; Kissoudis et al., 2016; Allen et al., 2018). Por exemplo, o acontecimento de secas mais severas, como o resultado da redução do regime das chuvas e/ou aumento da taxa de evapotranspiração, afetam o rendimento e a qualidade da produção de diversas culturas como trigo, arroz, milho, assim como frutas e vegetais frescos (Asseng et al., 2015; Tripathi et al., 2016; Fodor et al., 2017).
Dessa forma, uma das tarefas para otimizar o rendimento agrícola em função das mudanças climáticas é promover o melhoramento de características que estão por trás da adaptação das plantas aos diferentes estresses. Inicialmente, é importante caracterizar a vasta quantidade de informações genéticas (genômica, transcriptômica, proteômica, interatomas etc.) que podem estar envolvidos nas respostas adaptativas das plantas aos diversos estresses ambientais (Mickelbart et al., 2015; Kissoudis et al., 2016). Por exemplo, entre as respostas fisiológicas que as plantas apresentam quando sujeitas à seca, estão a regulação do crescimento da raiz e do movimento estomático, que por sua vez, são processos regulados, principalmente, pela via central de sinalização de ABA (Finkelstein, 2013; Kissoudis et al., 2016; Belda-Palazon et al., 2018; Yoshida et al., 2019a; Dittrich et al., 2019).
A construção de plantas transgênicas para diferentes genes da via central de sinalização da ABA tem se mostrado uma alternativa para a aquisição de plantas tolerantes ao estresse hídrico. Por exemplo, plantas de A. thaliana que superexpressam diferentes receptores PYR/PYL/RCAR são mais tolerantes à seca, aumentaram a eficiência do uso da água e aceleraram a expressão de genes responsivos ao estresse em comparação com as plantas do tipo selvagem (Park et al., 2015; Li et al., 2018; Yang et al., 2019). Resultado semelhante também foi observado em culturas de trigo (Triticum aestivum), onde plantas transgênicas que super-expressam o receptor PYL4 (TaPYL4), um ortólogo do gene PYL4 em A. thaliana, foram mais tolerantes ao estresse hídrico, além de apresentaram uma melhor qualidade e rendimento na produção de grãos por litro de água em comparação ao tipo selvagem (Mega et al., 2019). Contudo, os mecanismos subjacentes à essas melhorias ainda não foram completamente elucidados (Mega et al., 2019).
Embora a engenharia genética de componentes do nó central de sinalização do ABA mostre ser um caminho promissor para o melhoramento genético de culturas, ainda é pouco esclarecido como as plantas controlam a extensão das respostas desse hormônio. Por exemplo, a ativação da via central de sinalização de ABA, reprime TOR, um gene central na regulação do crescimento das plantas (Rosenberger and Chen, 2018; Wang et al., 2018b). Deste modo, as respostas a ABA poderiam afetar negativamente o desenvolvimento das plantas caso essa via central de sinalização não for apropriadamente reiniciada. Dessa forma, faz-se necessário mais estudo genético-moleculares para entender como as plantas reiniciam a via central de sinalização de ABA, e assim, no sentido mais amplo, tentar compreender como ocorre o controle da homeostase da sinalização desse hormônio.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Allen MR, Dube OP, Solecki WF, et al. 2018. Framing and Context. In: Global Warming of 1.5°C. An IPCC Special Report on the impacts of global warming of 1.5°C above pre-industrial levels and related global greenhouse gas emission pathways, in the context of strengthening the global response to the threat of climate change, sustainable development, and efforts to eradicate poverty.
Ang J, McMillen DR. 2013. Physical Constraints on Biological Integral Control Design for
Homeostasis and Sensory Adaptation. Biophysical Journal 104, 505–515.
Asseng S, Ewert F, Martre P, et al. 2015. Rising temperatures reduce global
wheat production. Nature Climate Change 5, 143–147.
Assmann SM, Jegla T. 2016. Guard cell sensory systems: recent insights on stomatal responses
to light, abscisic acid, and CO2. Current Opinion in Plant Biology 33, 157–167.
Bai Y, Du F, Bai Y, Liu H. 2010. Determination strategies of phytohormones: recent advances.
Analytical Methods 2, 1867.
Bari R, Jones JDG. 2009. Role of plant hormones in plant defence responses. Plant Molecular
Biology 69, 473–488.
Belda-Palazon B, Gonzalez-Garcia M-P, Lozano-Juste J, et al. 2018. PYL8 mediates ABA
perception in the root through non-cell-autonomous and ligand-stabilization-based mechanisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 201815410.
Belkhadir Y, Jaillais Y. 2015. The molecular circuitry of brassinosteroid signaling. New
Phytologist 206, 522–540.
Boursiac Y, Léran S, Corratgé-Faillie C, Gojon A, Krouk G, Lacombe B. 2013. ABA
transport and transporters. Trends in plant science 18, 325–33.
Chamizo-Ampudia A, Sanz-Luque E, Llamas A, Galvan A, Fernandez E. 2017. Nitrate
Reductase Regulates Plant Nitric Oxide Homeostasis. Trends in Plant Science 22, 163–174.
Chan Z. 2012. Expression profiling of ABA pathway transcripts indicates crosstalk between
abiotic and biotic stress responses in Arabidopsis. Genomics 100, 110–115.
Chantarachot T, Bailey-Serres J. 2018. Polysomes, Stress Granules, and Processing Bodies:
A Dynamic Triumvirate Controlling Cytoplasmic mRNA Fate and Function. Plant physiology
176, 254–269.
Chiang M-H, Shen H-L, Cheng W-H. 2015. Genetic analyses of the interaction between
