Controle da Expressão Gênica

Aula de

Bioquímica II

Tema:

Controle da Expressão Gênica

Prof. Dr. Júlio César Borges

Depto. de Química e Física Molecular – DQFM Instituto de Química de São Carlos – IQSC

Universidade de São Paulo – USP

Controle da Expressão Gênica

Todas as células de um contêm as mesmas informações depositadas no genoma O Gene é expresso quando ele é transcrito em mRNA  Principal ponto de controle

Circuitos regulatórios guiam o desenvolvimento de eucariotos multicelulares e envolvem diversos tipos de mecanismos regulatórios

A expressão de uma proteína pode ser:

Constitutiva: Constantemente expressa

Controle da Expressão Gênica

Processos que afetam a concentração do produto gênico: pontos potenciais de controle Gene: É um segmento de DNA que leva à produção

de um transcrito de RNA e inclui regiões que antecedem e que seguem a região transcrita, bem como sequências que não são traduzidas (íntrons)

que se intercalam aos segmentos codificadores individuais (éxons), que são traduzidos.

 Inclui elementos reguladores, o promotor e oterminador da transcrição

 A iniciação da transcrição (1) é o principal mecanismo, pelo menos o mais bem

documentado  regulação sincronizada  O processamento pós-transcricional (2) e a estabilidade do mRNA (3) são muito

Controle da Expressão Gênica

Esquema geral simplificado do promotor de genes de eucariotos

Existem elementos regulatórios a milhares de bases a upstream do promotor

Em procariotos

A identidade da sequência consenso do promotor dita a “força” da transcrição pela

frequência do recrutamento da RNApol

 Existe modulação adicional por proteínas

Região promotora do gene da PEP-carboxiquinase

 Alta complexidade da regulação deste gene.

 Ajuste fino proporcional a importância do processo

Controle da Expressão Gênica

As informações para o controle da expressão gênica estão no DNA

Regulação negativa

Dependente de Repressores - Inibem a expressão gênica por bloquear o acesso da RNApol ao

promotor

- Dependem da presença do Efetor (sinal molecular)

Tipo característico em procariotos

Elementos operador próximos ao promotor

Controle da Expressão Gênica

As informações para o controle da expressão gênica estão no DNA

Regulação positiva

Dependente de Ativadores

 Induz a expressão Gênica - Dependem da presença do

Efetor (sinal molecular)

Tipo característico em eucariotos

A Expressão Gênica é regulada por proteínas

 Proteínas específicas reconhecem sequências específicas de DNA

 Possuem domínios de interação com DNA e de interação com outras proteínas - Normalmente dímeros  reconhecer sequências palindrômicas  simétricas

 o papel dos Sulcos maior (mais específico) e menor (menos específico) no DNA

Alta especificidade

K_A das proteínas regulatórias pelas sequências-alvo é 4-6

ordens de grandeza maior do que para outras sequências

- Sequências específicas de DNA  superfície específica para formação de ligações de H

Domínios típicos de Ligação ao DNA

-Formam estruturas autônomas separadas do restante da proteína

- Estruturas capazes de interagir estreita e especificamente com o DNA-alvo

- Relativamente pequenos (60-90 resíduos) - projetam-se na superfície das proteínas - Conectadas ao restante da proteína por

regiões flexíveis

 O Domínio Hélice-volta-hélice está presente em muitas proteínas ligadores de DNA

- Apresentam-se como “dímeros” de forma a reconhecer a sequência palindrômica no DNA

 Reconhecimento por uma fita beta

Hélice-alça-hélice Homeodomínios Zinc Fingers Leu Resíduos básicos Interação com o Pi Zíper de Leucina

Domínios típicos de Ligação ao DNA

Controle da expressão em Procariotos

Procariotos produzem proteínas relacionadas a processos interdependentes de forma agrupada

- Mecanismo geral simples para coordenar a regulação de genes inter-relacionados

 Sistema óperon: unidade básica de transcrição - Operador  sequência de DNA próximo ao promotor

 mRNA policistrônico:

 1 promotor  1 mRNA  várias proteínas traduzidas

- Cada sequência codificadora tem seu próprio motivo Shine-Dalguarno

Controle da expressão em Procariotos

Procariotos induzem a expressão de enzimas conforme a disponibilidade de fonte de energia

β-galactosidade é uma importante ferramenta biotecnológica  atua sobre galactosídios alternativos

Controle da expressão em Procariotos

A indução da expressão da β-galactosidase  induz a expressão de 2 outras enzimas - Galactosídeo permease: transporte de lactose pela membrana

- Tiogalactosídeo transacetilase: desintoxicação de outras moléculas transportadas pela permease

 Indução conjunta de enzimas para adaptação a um novo ambiente:

 Mecanismo comum de indução.

 Modelo do óperon: Explica a regulação paralela de diferentes proteínas

-Formado por:

- um gene regulador: codifica uma proteína repressora - uma sequência operadora: alvo da proteína repressora

P: sequência promotor

lacI: gene proteína repressora

O: operadores: sítio de ligação da proteína repressora

lacZ: gene da β-galactosidade

lacY: gene da permease

lacA: gene da tio-transacetilase

lacZ, lacY e lacA formam um mRNA policistrônico ou

poligênico

Operon Lac

Conjunto de genes envolvidos na regulação e expressão das proteínas envolvidas no metabolismo de Lactose.

Estrutura tetramérica

Cada monômero possui um domínio hélice-volta-hélice que reconhece a sequência operadora

- Ocasiona a formação do loop de DNA

Proteína repressora Lac

 Permanece fortemente ligado à sequência operadora na ausência de Lactose - K_A 1x106 _{vezes maior pela sequência operadora do que por outra sequência}  Impede a transcrição por impedir que a RNApol desenrole o DNA localmente

Proteína repressora Lac

 O ligante da Proteína repressora Lac é um produto secundário da β-galactosidase

 1,6-alolactose: INDUTOR

- A lactose não interage com a Proteína repressora Lac

Indutores

α-D-galactopiranosil-(14)-D-glicopiranose

Operon Lac

1) Na ausência de Lactose, não existe 1,6-alolactose e portanto a Proteína repressora Lac permanece ligada à sequência operadora impedindo a transcrição do DNA

2) Na presença de Lactose, parte desta é convertida a 1,6-alolactose que se liga à Proteína Repressora Lac e reduz a afinidade desta pela sequência operadora. Com a saída da

Proteína repressora Lac da sequência operadora os genes estruturais podem ser transcritos na forma de um mRNA policistrônico ou poligênico

 Mesmo na ausência de lactose, existe transcrição basal dos genes estruturais

lacI mRNA

Repressor lacI ligado ao operador bloqueia a transcrição dos genes

lacZ, lacY e lacA

lacI

mRNA lac mRNA (policistrônico)

β-galactosidase

Permease

[Glicose] alta  [AMPc] baixa e lactose ausente

Controle da Expressão Gênica em procariotos

Ativação da expressão gênica por AMPc

AMPc (coativador)  indução conjunta de enzimas catabólicas

CRP liga-se ao operador do operon Lac a -51 do Promotor

e “recruta” a RNApol

 Atuam em vários óperons AMPc liga-se à cAMP receptor Protein – CRP

[Glicose] baixa  [AMPc] alto e lactose ausente

[Glicose] alta  [AMPc] baixo e lactose presente

 Ativação fraca

[Glicose] baixa  [AMPc] alto e lactose presente

 Ativação forte

Efeito coordenado entre repressor/ativador

 Regulons: rede de óperons com reguladores

Controle da Expressão Gênica em procariotos

Em procariotos, muitos operons funcionam de forma análoga ao operon Lac

Ex: operon Pur

Controla o metabolismo de Purinas

A proteína Repressor Pur liga-se à sequência operadora na presença de um ligante:

 co-repressor

O genoma de E. coli contêm mais de 20 sequências operadora para a proteína

repressora Pur

Regulon

 Permite a regulação paralela de todos os passos metabólicos da síntese de

Controle da Expressão Gênica em procariotos

A estratégia dos atenuadores

- Comum nos operons para síntese aminoácidos

O óperon trp controla a síntese de Triptofano

Altos níveis de Trp reprime o óperon

- Ligação do Trp a proteína repressora induz ligação ao operador

Atenuação do óperon trp

- Ocorre na síntese do mRNA

- Formação de grampos de mRNA auto complementares

Se a [Trp] ↑ síntese rápido do peptídeo líder

 Formação alça 3-4  fim da transcrição

Se a [Trp] ↓ síntese lenta do peptídeo líder

Controle da Expressão Gênica em procariotos

Outros mecanismos, inclui-se a autoindução em biofilmes: quorum sensing Feedback de tradução de óperons de

proteínas ribossomais

- Visa regular a concentração das proteínas ribossomais e rRNA

 A proteína ribossomal inibe a tradução de seu próprio mRNA

 A medida que o respectivo rRNA é sintetizado, a proteína

ribossomal dissocia-se de seu mRNA e liga ao rRNA

- Maior afinidade pelo rRNA

Controle da tradução

Resposta estringente

- Depende da disponibilidade de aminoácidos - Ausência de aminoácidos

- Recrutamento do fator estringente - Síntese de ppGpp

Controle da Expressão Gênica em procariotos

Papel de pequenos RNAs  sRNA

Alguns mRNAs bacterianos são regulados por sRNA em cis ou em trans trans: outro sRNA

regula a tradução de um dado mRNA Função dependente da proteína Hfq  facilita formação de duplex RNA-RNA

cis: parte do próprio mRNA regula a própria

tradução - Riboswitches: Aptâmeros naturais de RNA dependentes de ligantes - Ligantes identificados: TPP, cobalamina, FMN, Lys, Gly, purinas e adoMet

(S-adenosilmetionina).

Indução

Repressão

Controle da Expressão Gênica em procariotos

Recombinação regula a expressão de diferentes proteínas do flagelo (FljB e FliC) a cada 1000 gerações

Mecanismo de escape do sistema imune  Sistema óperon

- Recombinase Hin inverte posição do promotor (e gene para a hin) para a FljB

Controle da Expressão Gênica em Eucariotos

 Diversidade Celular

- Impõem mais complexidade para atingir especificidade.

 Transcrição e tradução NÃO são processos acoplados.

 Os genes de uma mesma via não estão organizados em óperons.

- Existem somente algumas exceções

 Transcrição basal não observada  transcrição está inativa para a maioria dos genes

- Regulação positiva  requer Ativadores sempre

- Regulação negativa  necessitaria de grande número de repressores presentes na célula em quantidade  há poucos exemplos em eucariotos

Papeis dos ativadores ou fatores de transcrição

1) Montagem do complexo de transcrição basal com os TFII

2) Outras proteínas regulatórias específicas se unem a este complexo basal - Ligam-se à sequências “Enhancer” - Potenciadores

 São proteínas modulares e multiméricas – Domínio de Ligação ao DNA e Domínio Ativador

Remodelamento da Cromatina

O DNA de eucariotos se apresenta ligado à proteínas formando os Nucleossomos

- As regiões do DNA que estão sendo transcritas estão menos compactadas - Heterocromatina  fortemente condensada: não disponível para transcrição

- Eucromatina  Parcialmente disponível para a transcrição

Remodelamento da Cromatina

A acetilação das histonas contribuem para a ativação da transcrição

- Histonas acetilases (HAT) acetilam a Lys da cauda N-Terminal das Histonas 1) Reduz a afinidade da Histona pelo DNA  afrouxa o nucleossoma

2) Recrutamento de outros componentes da maquinaria de transcrição 3) Iniciação da remodelagem da cromatina

Reversão executada por Histonas desacetilases  repressão da transcrição por compactação da cromatina

 Regiões do DNA que estão mais ou menos compactadas são tecidos específicas

 Existem proteínas remodeladoras do DNA tecido específicas que regulam os conjuntos de genes que deverão ser

transcritos e os que devem ser “silenciados”.

 O DNA é metilado por Metilases específicas no C5 da C - 70% das 5’-CG-3’ estão metiladas

- A metila projeta-se para o sulco maior bloqueando interações - As 5’-CG-3’ próximas ao 5’ dos genes ativos são

hipometiladas

Remodelamento da Cromatina

Em levedura, os genes necessários para o metabolismo de galactose são ativados pela proteína GAL4.

- Reconhece a sequência: 5’-CGG(N)₁₁CCG-3’  4.000 pontos no DNA de levedura - Somente 10 deles são identificados pela GAL4  99,75% estão bloqueados

Controle da Expressão Gênica em Eucariotos

As informações para o controle da expressão gênica estão no DNA

Envolve interação, direta ou indireta, de ativadores/repressores e a RNApol em eucariotos

 Requerimento de:

- elementos potenciadores (enhancers) a longa distância do promotor

- Regulador de arquitetura para dobrar o DNA (alças ou looping)

- Coativador aumenta a taxa de recrutamento/ativação da RNApol

 Repressor pode atuar bloqueando a ação do coativador

 Controle combinatório

- Depende do subconjunto de proteínas produzidas naquele tipo celular

Controle da Expressão Gênica em Eucariotos

Controle combinatório



 Número reduzido de proteínas reguladoras  maior especificidade

 reconhecem sequências assimétricas

 Ex: 2 famílias de reguladores com 3 membros cada

Acentuadores

ou

potenciadores

- sequências específicas “acima” do promotor que funcionam como pontos de ligação específicos para proteínas ativadoras ou repressoras.

- Podem estar a milhares de pares de base à 5’ do promotor

- Dependem da presença das proteínas ligadoras específicas - Podem ajudar a expor o DNA para RNApol II

- Podem ajudar a montagem do complexo basal de transcrição

Acentuador da creatina quinase regulando a expressão

Regulação gênica em eucariotos

 UAS: upstream activator sequences: Sequências ativadoras a montante Pode ser a jusante também

 Reguladores da arquitetura: proteínas HMG

 Remodelamento da cromatina

 Coativadores: Ativadores ou repressores  interação com o Mediador  Fatores basais de transcrição

Regulação gênica positiva em eucariotos

Eventos em cascata  variável para diferentes genes

~ 50 membros no genoma humano Atuam como dímeros  reconhecem

elementos simétricos

Agonistas

Antagonistas

Expressão gênica regulada por hormônios

Receptores Nucleares

Os receptores para hormônios estereoidais atuam induzindo a transcrição

- Proteínas modulares  domínio de ligação ao DNA e domínio de ligação ao hormônio

Expressão gênica regulada por hormônios

Receptores Nucleares

Os Receptores de hormônios nucleares regulam a transcrição por recrutar Co-ativatores ou

Expressão gênica regulada por hormônios

- Livre transito pela membrana plasmática

Regulação por repressão da Tradução

Transcrição e tradução são processos desacoplados  edição do mRNA e transporte para o citoplasma

Envolve o armazenamento de mRNAs inativos no citoplasma

1) Fatores de iniciação da tradução são sujeitos a fosforilação  inibe

2) Proteínas repressoras ligam-se à região 3’ não traduzida (3’UTR - untranslated region) - Bloqueia a iniciação da tradução

Silenciamento gênico

O papel do microRNA – miRNA  60% dos genes humanos

Produção transitória  chamados como pequenos RNAs temporais (stRNA)

Eucariotos superiores (nematódeos, mosca, plantas e mamíferos)

Fazem parte de noncoding RNA (ncRNA)  incluem snRNA, tRNA, rRNA, snoRNA

- Mamíferos codificam mais ncRNA do que mRNA

- O miRNA interage com o mRNA na 3’UTR 

degradação ou inibição da tradução

- Controla o desenvolvimento do organismo - Controle de infecções virais em plantas

 Possuem ~70 nt auto-complementares 

duplex RNA-RNA  grampos

 Clivagem pela endonuclease DICER ou DROSHA

 Interação dos fragmentos de ~22 nt com o mRNA alvo em duplex RNA-RNA  inibição da

tradução ou degradação

- Base da técnica de RNA de interferência (siRNA)