ANA CRISTINA ALVES DE ALMEIDA
AVALIAÇÃO DO EFEITO DO ALCALOIDE
ÍNDIGO EM MODELOS EXPERIMENTAIS DE
COLITE
CAMPINAS 2015
iii
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
ANA CRISTINA ALVES DE ALMEIDA
“Avaliação do efeito do alcaloide índigo em modelos
experimentais de colite”
Tese apresentada ao Instituto de Biologia da UNICAMP como parte dos requisitos exigidos para obtenção do Título de Doutora em Ciências na área de concentração em Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde.
Orientadora: Profa. Dra. Alba Regina Monteiro Souza Brito
CAMPINAS, 2015 Este exemplar corresponde à versão
final da Tese defendida pela candidata
Ana Cristina Alves de Almeida
e orientada pela Profa. Dra. Alba Regina Monteiro Souza Brito
v Campinas, 21 de janeiro de 2015
vii RESUMO
A Doença Inflamatória Intestinal (DII), que compreende a Doença de Crohn (DC) e a Retocolite Ulcerativa (RCU), é marcada por resposta inflamatória exacerbada a componentes da microbiota, com danos à mucosa do cólon. O tratamento de DII envolve drogas ineficazes para a remissão de todos os parâmetros da doença, com vários efeitos colaterais e custo elevado. Assim, pesquisas com substâncias ativas na inflamação intestinal podem trazer alternativas terapêuticas para DII. Sendo os produtos naturais uma importante fonte para desenvolvimento de medicamentos, buscou-se, nesse trabalho, avaliar o efeito do alcaloide índigo em modelos experimentais de colite. Inicialmente, foi avaliado o tratamento oral com índigo em colite aguda induzida por ácido trinitrobenzeno sulfônico (TNBS) em ratos HanUnib: WH (Wistar), um modelo experimental de DC. O tratamento com índigo resultou em redução da lesão macroscópica, medida através de escore, na dose de 3 mg/kg, e da área de lesão ulcerativa (doses 0,1; 3; 10 e 30 mg/kg). Apenas a administração da maior dose (30 mg/kg) evitou o aumento da razão peso/comprimento do cólon e não houve diminuição da diarreia e aderência do cólon, após tratamento com o alcaloide. Danos histológicos foram minimizados no cólon de animais tratados com índigo (3, 6 e 12 mg/kg). Como a lesão macroscópica por TNBS é bastante severa, a dose de 3 mg/kg, que reduziu tanto o índice (escore) quanto a área de lesão, foi selecionada para as análises posteriores. Observou-se redução dos níveis de glutationa (GSH) e da atividade da glutationa peroxidase (GPx), aumento na atividade da superóxido dismutase (SOD) e níveis de peroxidação lipídica (LPO) no cólon dos animais com colite (Veículo + TNBS), em comparação ao Controle. Nos ratos tratados com índigo (3 mg/kg), houve aumento na atividade de SOD, redução de GPx, como no grupo Veículo + TNBS, redução dos níveis de LPO e, parcialmente, de GSH. A expressão de ciclooxigenase 2 (COX-2) e fator nuclear de transcrição B (NF-B) aumentou e a concentração da citocina anti-inflamatória interleucina 10 (IL-10) diminuiu no cólon de animais colíticos (Veículo + TNBS), em comparação ao Controle. O tratamento com índigo (3 mg/kg) evitou aumento de COX-2, e não mostrou efeito significativo na expressão de NF-B e concentração de IL-10. O segundo modelo experimental empregado neste
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trabalho apresenta similaridades com a RCU, através da indução de colite aguda por dextrana sal sódico (DSS), em camundongos Unib: SW (Swiss). A administração de índigo (3 mg/kg) não levou à redução significativa do índice de atividade da doença (DAI), que engloba alteração de peso corporal, presença de diarreia e sangue nas fezes; entretanto, foi eficaz em evitar o aumento da razão peso/comprimento do cólon. Em análise histológica, notou-se aumento da parede do cólon, com infiltração celular na mucosa e submucosa, áreas de necrose e desorganização do epitélio na inflamação causada por DSS e o tratamento com índigo levou a menor gravidade desses danos. Houve aumento na concentração cólica das citocinas IL-6 e IL-1β no grupo colítico tratado com veículo, o que foi prevenido com o tratamento com índigo. Em modelo experimental de colite crônica, com recidiva, associada a câncer de cólon por azoximetano/DSS (AOM/DSS) em camundongos Unib:SW machos, a administração de índigo reduziu a mortalidade, minimizou a perda de massa corporal dos animais e evitou o aumento da razão peso/comprimento do cólon. A substância teste, entretanto, não foi capaz de reduzir o DAI, nesse experimento, por não minimizar a perda de consistência e o aparecimento de sangue nas fezes. Durante a realização do modelo de colite crônica por AOM/DSS (9 semanas), animais sadios tratados com salina fisiológica (veículo) ou índigo (3 mg/kg) foram monitorados para análise de sinais de toxicidade do índigo, a partir dos parâmetros: mortalidade, evolução de peso corporal, consumo de ração, peso e avaliação macroscópica dos órgãos coração, pulmões, rins e fígado. Não foram encontrados indícios de toxicidade nos parâmetros avaliados, mas devido à mortalidade de 17 % dos camundongos tratados com o alcaloide, foi realizado teste de toxicidade aguda de dose única. Após 14 dias da administração oral e intraperitoneal de índigo (1000 mg/kg), em camundongos Unib:SW machos e fêmeas, não foram observadas alterações na evolução de peso corporal, consumo de água e ração, peso de órgãos vitais, comportamento e sobrevivência dos animais. Apesar de não haver melhora em todos os parâmetros da colite estudados, notou-se que os animais tratados com índigo ficavam, em geral, menos debilitados (evidenciado pelo maior peso e consumo de ração) que os animais com colite não tratados.
ix ABSTRACT
Inflammatory Bowel diseases (IBD) are known as an exacerbated imune response within the intestinal tract, mainly the mucosa of the colon. The IBD treatment is rather ineffective, including various side effects and high costs. Thus, the research with active compounds may bring therapeutic alternatives for IBD. Since natural products have been a vast source for pharmacology, we decided to investigate the effect of Indigo alkaloid in experimental models of IBD. The oral administration of Indigo (3 mg/kg) in trinitrobenzenesulphonic acid (TNBS) -induced colitis showed beneficial results in the macroscopic and microscopic lesions, without significant results in the other evaluated parameters (diarrhea and intestine adhesion). We observed a reduction in the sulfhydryl groups (GSH) and in the activity of Glutathione peroxidase (GPx), an increase in the activity of Superoxide Dismutase (SOD) and Lipid Peroxidation (LPO). The treatment with Indigo (3 mg/Kg) prevented an increase in the LPO levels, and partially, the reduction of GSH levels. Furthermore, Indigo inhibited the increase of Cycloxigenase 2 (COX-2) expression. In the Indigo-treated animals, the expression of the Nuclear Factor kB (NF-kB) and the concentration of interleukin 10 (IL-10) were kept at intermediary levels between the healthy group and the non-treated colitic group (Veículo + TNBS). In the Dextran Sodium Salt (DSS), Indigo showed no effect on the disease associated index (DAI), which includes body weight reduction, consistence and blood in feces. However, the 7-day oral treatment with Indigo was capable of avoiding the weight/length ratio of the colon, which is usually augmented in the intestinal inflammation. In the histological, we observed a thickening of the intestinal wall, with mucosal and submucosal cell infiltration, necrotic areas as well as epithelium disorganization in the DSS-induced inflammation. The treatment with Indigo showed less severe morphological lesions. In the DSS-induced colitis, IL-6 and IL-1β levels were higher in the negative control group (DSS), which was prevented with the treatment with Indigo. In the azoximethane/DSS-cancer associated recidive model of colitis, the administration of Indigo lowered the death rate, minimized the body weight loss and prevented the increase in the wejght/length ratio of the colon. Indigo was not capable of reducing DAI in this model, since it didn`t minimize
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the loss of consistence and neither the blood in feces. Animals treated with saline or Indigo for 9 weeks were used for the analyses of Indigo toxicity through the following parameters: body weight evolution, chaw consumption, organ weight and macroscopic evaluation (heart, kidneys, lung and liver). In this analysis, no signs of toxicity were found for this dose of Indigo. Although it did not enhance all the parameters studied in this model of colitis, we observed that the Indigo-treated animals were, in general, less debilitated than the non-treated ones. Other studies and parameters have to be performed for a better understanding of the alkaloid effects in the intestinal inflammation.
xi SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ... 1
1. Considerações Iniciais ... 1
2. Doença Inflamatória Intestinal ... 2
2.1. Epidemiologia ... 2
2.2. Etiologia ... 4
2.3. Manifestações Clínicas ... 7
2.4. Patogênese ... 7
2.5. Tratamento ... 12
3. Modelos Experimentais de Inflamação Intestinal ... 15
4. Produtos Naturais ... 17 4.1. Alcaloides ... 17 4.2. Índigo ... 19 OBJETIVOS.... ... 21 1. Objetivo Geral ... 21 2. Objetivos Específicos ... 21 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ... 23
1. Obtenção do alcaloide índigo ... 23
1.1. Material Vegetal ... 23
1.2. Extração e Isolamento do Índigo ... 23
2. Animais ... 24
3. Modelos experimentais ... 24
CAPÍTULO I: EFEITO DO TRATAMENTO COM O ALCALOIDE BIS-INDÓLICO ÍNDIGO EM COLITE AGUDA INDUZIDA POR TNBS EM RATOS ... 25
1. RESUMO ... 25
2. INTRODUÇÃO ... 26
3. MATERIAL E MÉTODOS ... 27
3.1. Indução da Inflamação Intestinal por TNBS ... 27
3.2. Grupos Experimentais ... 28
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3.4. Análises Histológicas ... 29
3.5. Análises de marcadores de estresse oxidativo ... 30
3.6. Análise de Mediadores Inflamatórios ... 32
3.7. Análise Estatística ... 33
4. RESULTADOS ... 34
5. DISCUSSÃO ... 44
CAPÍTULO II: EFEITO DO ALCALOIDE ÍNDIGO EM COLITE AGUDA E CRÔNICA POR DSS ... 49
1. RESUMO ... 49
2. INTRODUÇÃO ... 51
3. MATERIAL E MÉTODOS ... 52
3.1. Indução de colite aguda por DSS ... 52
3.2. Indução de colite com recidiva associada a agente carcinogênico (AOM/DSS) ... 53
3.3. Índice de atividade da doença (DAI) ... 54
3.4. Análises histológicas ... 55
3.5. Análises de marcadores de estresse oxidativo ... 55
3.6. Análise de mediadores inflamatórios ... 57
3.1. Toxicidade em doses repetidas (dose em teste) ... 57
3.2. Toxicidade aguda em dose única ... 57
4. RESULTADOS ... 58 5. DISCUSSÃO ... 70 CONCLUSÕES ... 73 PERSPECTIVAS ... 75 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 77 ANEXO………. ... 85
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Ao meu querido Henri, que me trouxe serenidade para essa caminhada, dedico.
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AGRADECIMENTOS
Esse trabalho resulta do auxílio de diversas pessoas e reflete, mesmo que indiretamente, as mais diferentes aprendizagens com as pessoas com quem convivi, especialmente, durante o Doutorado. A elas, quero expressar meus agradecimentos.
À Profª Drª Alba Regina Monteiro Souza Brito pela oportunidade de realizar esse trabalho e por permitir que eu atrapalhasse um pouco sua aposentaria, fazendo parte do final de sua lista orientações concluídas. Obrigada pelo carinho!
A todos os colegas e amigos que passaram pelo agora extinto Laboratório de Produtos Naturais, com quem, desde minha iniciação científica, dividi não só momentos de trabalho e experimentos, mas alegrias, conquistas, ideias, angústias, histórias, saberes... Não cito todos os nomes, mas ressalto que cada um é uma parte do que tornou esse laboratório um lugar especial para mim. Muito obrigada a todos pela amizade, convivência e pela aprendizagem!
Aos meus queridos “irmãos científicos” Anderson, Felipe, Ricardo, Luís e Eduardo, por toda a ajuda e convivência durante o doutorado. Em especial, ao Felipe e ao Luís pelo companheirismo até o final desse trabalho, mesmo estando em outro grupo. E ao Anderson, por ser nosso amigo, mestre e exemplo!
Ao Prof. Dr. Wagner Vilegas, à Drª Tamara Calvo e equipe do Laboratório de Química e Produtos Naturais do IQAr/UNESP pela obtenção do índigo e colaboração.
Ao Prof. Dr. Carlos Amilcar Parada por abrir as portas de seu laboratório e permitir que eu prosseguisse com os experimentos após o fechamento do Lab. Produtos Naturais.
À toda equipe do Laboratório de Estudos da Dor, pela amizade, apoio e receptividade. Em especial, aos funcionários Catarine e César.
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Aos docentes Profª Drª Clélia Akiko Hiruma Lima, Prof. Dr. Carlos Real Martinez, Profª Drª Ana Maria Caetano de Faria e Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho pela participação na banca de defesa e pelas valorosas contribuições a esta tese.
Aos docentes Profª Drª Alessandra Gambero, Prof. Dr. Carlos Real Martinez e Prof. Dr. Stephen Hyslop, pela participação em meu exame de análise prévia da tese, pelas sugestões e colaborações ao trabalho.
Aos docentes Profª Drª Alessandra Gambero e Profª Drª Ana Beatriz Albino de Almeida pela participação em meu exame de qualificação e sugestões para o projeto.
Aos funcionários do Depto. de Biologia Estrutural e Funcional (setor de Fisiologia), da Secretaria Centralizada e da Coordenadoria de Pós-graduação do IB-Unicamp.
À Coordenação do Programa de Pós-graduação em Biociências e Tecnologia de Produtos Bioativos, em especial ao Prof. Dr. Marcos José Salvador, e ao secretário Rafael Chagas Pessoa por todo apoio, atenção e compreensão.
Aos meus pais, Maurício e Celina, por tudo! Às minhas irmãs, Adriana e Aline, e ao meu irmão, Eduardo, pelas risadas e por todo o apoio. A toda minha família, em especial as minhas tias Maria e Cida, minha avó Celesta e meu padrinho Armando, pelo grande incentivo!
Ao meu querido Henri, pelo carinho, força, companheirismo, e pela ajuda para o término do curso de doutorado.
Aos meus amigos e colegas de trabalho da Prefeitura de Campinas (escolas CAIC e Violeta) e da Unicamp (LIPEX e LabLeish), pelo apoio, convivência e aprendizagem.
Aos amigos de ontem e de hoje por fazerem parte do que sou.
À CAPES, pela bolsa concedida, e à FAPESP, pelo apoio financeiro para o desenvolvimento desse projeto.
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“A visão de ciência que se difunde através dos livros-texto sugere uma história meio sem graça e asséptica, povoada de “grandes homens” (e as mulheres?) que avançam desde a infância com passo firme e decidido até seus grandes descobrimentos como se soubessem desde o seu nascimento o que lhes reservaria o destino. Visão muito cômoda para elaborar bonitos quadros sinóticos e para extrair ensinamentos edificantes com os quais se torturam alunos, mas também, quem sabe se por sorte ou por infortúnio, completamente falsa.
Não, a história da ciência não é limpa, linear e asséptica como se pretendeu até muito pouco tempo atrás. A história da ciência está cheia de despenhadeiros e de personagens estranhos que em nada se parecem com “o grande pensador” de bronze que quiseram nos retratar alguns mestres tresnoitados. A história da ciência é rica e intricada, confusa, assombrosa, desconcertante, e às vezes profundamente comovedora.”
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LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Distribuição de taxas de incidência e prevalência de Doença de Crohn (A) e retocolite ulcerativa (B) em países com dados reportados nas bases EMBASE e MEDLINE, entre 1980 e 2008. Extraído e adaptado de Molodecky et al. (2012). ... 2 Fatores genéticos e ambientais contribuem para redução da integridade da mucosa intestinal, provocando interação entre produtos da microbiota e células do sistema imune e resposta inflamatória. A não resolução da resposta inflamatória acaba por tornar o processo crônico, ocasionando danos aos tecidos e complicações. Extraído e adaptado de Neurath (2014). . 5 Organograma das estratégias “step-up” e “top-down” no tratamento de DII. Extraído e adaptado de Aloi et al. (2014). ... 13 Fórmula molecular do alcaloide bis-indólico índigo. ... 19 CCDC dos alcaloides It1 e It2, isolados de “fr. alcaloides”, em comparação ao padrão de índigo autêntico (Fluka). O alcaloide It1 foi identificado como índigo. ... 24 Representação esquemática dos procedimentos do modelo de indução de inflamação intestinal por TNBS. Ratos machos foram tratados oralmente com o veículo salina fisiológica (10 ml/kg) ou com índigo (0,1 a 30 mg/kg) 72, 48, 24, 2 h antes e 24 h após a indução de colite por sonda intra-retal de TNBS (10 mg) em etanol 50 %. Após 48 h da administração de TNBS, os animais sofreram eutanásia. ... 27 (A) Cólon de ratos não colíticos (grupo Controle - C) e colíticos tratados com veículo salina 10 ml/kg (grupo VEÍCULO - V), ou índigo nas doses 3, 6 e 12 mg/kg (grupos IND3, IND6 e IND12), em modelo de indução de colite por TNBS e (B) índices de lesão macroscópica nos diferentes grupos experimentais, expressos em mediana. Análise estatística de Kruskal-Wallis, seguida pelo teste de Dunns. *p<0,05, ***p<0,001, comparado ao grupo Veículo + TNBS. ... 34 Efeito do tratamento com índigo (3, 6 ou 12 mg/kg) sobre o peso corporal de ratos submetidos ao modelo de colite por TNBS (n = 5 – 7). Dados expressos em média. ANOVA (2 vias), seguido de teste Bonferroni. **p<0,01 e ***p<0,001 comparado ao grupo Veículo + TNBS. ... 35 Fotomicrografias de cólon de ratos expostos ao modelo de inflamação intestinal por TNBS. Coloração H&E. Aumento 100 X. m = mucosa, sm = submucosa, mm = muscular, * = debris celulares (necrose). ... 37 (A) Cólon de ratos não colíticos (grupo Controle) e colíticos tratados com veículo salina 10 ml/kg (grupo V + TNBS), ou índigo nas doses 0,1; 1; 3; 10 e 30 mg/kg (grupos IND0,1, IND1, IND3, IND10 e IND30), em modelo de indução de colite por TNBS e (B) índice de lesão e área de lesão ulcerativa nos diferentes grupos experimentais, expressos em media ± e.p.m. Análise estatística ANOVA (2 vias), seguida de teste de Bonferroni. *p<0,05; **p<0,01 e ***p<0,001; comparado ao grupo V + TNBS. ... 38 Efeito do tratamento com índigo sobre o peso corporal de ratos submetidos ao modelo de colite por TNBS (n = 7 – 9). Dados expressos em média. ANOVA (2 vias), seguido de teste Bonferroni. ***p<0,001 comparado ao grupo Veículo + TNBS. ... 39
xx
Níveis de GSH e LPO em cólon de ratos tratados com índigo (3 mg/kg) ou veículo salina fisiológica (10 ml/kg), submetidos ao modelo de inflamação intestinal por TNBS (n = 5 – 7). Dados expressos em média ± epm. ANOVA (1 via), seguida de teste de Tukey. Letras diferentes mostram diferença estatística entre os grupos (p<0,05). ... 40 Efeito do tratamento com índigo (3 mg/kg) na expressão das enzimas COX-1 e COX-2 no cólon de ratos submetidos a modelo de colite por TNBS (n = 5 – 7). Dados expressos em média ± e.p.m. Análise de Kruskal-Wallis, seguida de teste de Dunns. Letras diferentes mostram diferença estatística entre os grupos (p< 0,05). ... 42 Efeito do tratamento com índigo (3 mg/kg) na expressão do mediador inflamatório NF-B no cólon de ratos submetidos a modelo de colite por TNBS (n = 5 – 7). Dados expressos em média ± e.p.m. Análise estatística de Kruskal-Wallis, seguida de teste de Dunns. Letras diferentes mostram diferença estatística entre os grupos (p< 0,05). ... 43 Níveis da interleucina anti-inflamatória IL-10 em cólon de ratos (n = 5 – 7) submetidos ao modelo de inflamação intestinal por TNBS. Dados expressos em média ± e.p.m. ANOVA (1 via), seguida por teste de Tukey.Letras diferentes mostram diferença estatística entre os grupos (p<0,05)... ... 43 Representação esquemática do protocolo experimental do modelo de indução de inflamação intestinal por DSS. ... 52 Representação esquemática do protocolo experimental do modelo de indução de câncer colorretal por AOM/DSS. ... 53 Evolução do peso corporal (A) e consumo de ração (B) de camundongos tratados com índigo (3 mg/kg) ou com o veículo salina (10 ml/kg) expostos ou não ao tratamento com DSS (n = 17). A porcentagem de peso corporal é determinada em relação ao peso do animal no 1º dia de tratamento e o consumo de ração é normalizado por 100 g de peso corporal dos animais. Os dados estão expressos em média. Análise estatística por ANOVA (2 vias), seguida de Tukey.
**p<0,01 e ***p<0,001 comparado ao grupo SAL + DSS... 58
O índice de atividade da doença (DAI) em animais tratados com veículo (SAL) ou índigo (IND) expostos ou não ao DSS (n = 10) ao final do tratamento. (A) DAI ao final do tratamento. Dados expressos em média ± e.p.m. Análise estatística de Kruskal-Wallys, seguido de Dunns . (B) Alteração de peso corporal, considerando a diferença entre os 1º e 8º dias de tratamento de animais utilizados no modelo de colite por DSS. Dados expressos em média ± e.p.m. ANOVA, seguida de teste de Tukey. (C). DAI ao longo do tratamento. Dados expressos em média. Análise ANOVA (2 vias), seguida de teste de Bonferroni. Letras diferentes mostram diferença estatística entre os grupos (p<0,05). ... 59 Efeito do tratamento oral com índigo (3 mg/kg) na razão peso/comprimento do cólon de camundongos expostos à indução de colite por DSS. Dados expressos em média ± epm. Análise estatística ANOVA, seguida de teste de Tukey (A). Observação macroscópica de cólon de camundongos em modelo de colite por DSS (B) ... 60
xxi
Fotomicrografias de cólon de camundongos expostos ao modelo de DSS. Coloração H&E. Aumento 10X... 61 Evolução do peso corporal (A) e consumo de ração (B) de animais expostos ao modelo de colite e câncer de cólon por AOM/DSS. Dados expressos em média. Análise estatística ANOVA (2 vias), seguida de teste de Bonferroni. ... 63 Curva de sobrevivência de animais tratados com veículo salina (10 ml/kg) ou com o alcaloide índigo (3 mg/kg) em modelo experimental AOM/DSS. ... 64 DAI (Escore 0 – 4) observados ao final de cada ciclo de DSS em camundongos submetidos ao modelo de câncer de cólon por AOM/DSS. Dados expressos em média ± epm. Análise estatística ANOVA (uma via), seguida de Tukey. Letras diferentes mostram diferença estatística entre os grupos. ... 65 Razão peso/comprimento do cólon de camundongos expostos a repetidos ciclos de DSS associados ou não ao agente carcinogênico AOM. Dados expressos em média ± epm. Análise ANOVA (uma via), seguida de Tukey. Letras diferentes mostram diferença estatística entre os grupos... ... 65 Efeito do tratamento diário e oral com índigo (3 mg/kg), por 9 semanas, em camundongos, na evolução do peso corporal (A) e no consumo de ração, normalizado pelo peso dos animais (B) em comparação ao tratamento com o veículo salina (10 ml/kg). ANOVA (2 vias), seguida de teste de Bonferroni. p>0,05. ... 66 Curva de sobrevivência de animais (n = 12) tratados oralmente com índigo (3 mg/kg) ou com o veículo salina (10 ml/kg), durante 9 semanas. Teste estatístico de Mantel-Cox. p>0,05. 67 Peso de fígado, rins, pulmões e coração de animais tratados com índigo (3 mg/kg) ou com o veículo (10 ml/kg). Análise estatística ANOVA (2 vias), seguida de teste de Bonferroni.
p>0,05... ... 67
Efeito do tratamento oral e intraperitoneal com índigo (1000 mg/kg) na evolução do peso corporal (A) e no consumo diário de ração (B) em camundongos, em comparação ao tratamento com o veículo salina (10 ml/kg). Análise estatística ANOVA (2 vias), seguida de teste de Bonferroni. p>0,05. ... 68 Peso de fígado, cólon, rins, pulmões e coração de animais tratados com índigo (1000 mg/kg) ou com o veículo (10 ml/kg), após 15 dias do tratamento em dose única. Análise estatística ANOVA (2 vias), seguida de teste de Bonferroni. p>0,05. ... 69
xxiii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Grupos experimentais do modelo de inflamação intestinal por TNBS. ... 28
Tabela 2. Critérios para avaliação das lesões do cólon de ratos submetidos ao modelo de inflamação intestinal por TNBS (Bobin-Dubigeon et al., 2001). ... 29
Tabela 3. Efeito do tratamento com índigo em sinais de colite por TNBS. ... 35
Tabela 4. Efeito do tratamento com índigo em sinais de colite por TNBS. ... 40
Tabela 5. Atividade das enzimas antioxidantes GPx, GR, SOD e CAT em cólon de ratos tratados com índigo e submetidos ao modelo de colite por TNBS. ... 41
Tabela 6. Grupos experimentais do modelo de inflamação intestinal por DSS. ... 52
Tabela 7. Grupos experimentais do modelo de indução de câncer colorretal por AOM/DSS. .... 54
Tabela 8. Critérios para pontuação de parâmetros de avaliação da evolução da doença inflamatória intestinal induzida por DSS, segundo Vicario et al. (2005). ... 54
Tabela 9. Efeito do tratamento oral com índigo (3 mg/kg) nos níveis de GSH e atividade das enzimas GPx, GR e SOD no cólon de camundongos em modelo de DSS. ... 62
Tabela 10. Efeito do tratamento com índigo (3 mg/kg) sobre os níveis das citocinas 1β, 6,
1
INTRODUÇÃO______________________________________________________________
1. Considerações Iniciais
A inflamação é uma resposta do organismo a microrganismos, danos teciduais ou traumas para restauração da homeostasia, envolvendo uma complexa cascata de eventos, com liberação de diversos mediadores. Contudo, quando esta resposta não é modulada, ocorre exacerbação do processo, que pode tornar-se crônico e conduzir à perda de função e doenças (Gilroy et al., 2004; Serhan e Savill, 2005).
Entre as doenças inflamatórias de natureza crônica está a doença inflamatória intestinal (DII), que compreende duas desordens: retocolite ulcerativa (RCU) e doença de Crohn (DC), cada uma com um grande espectro de manifestações clínicas. DII tem etiologia complexa, permeada pela interação entre fatores ambientais, predisposição genética e sistema imune (Hanauer, 2006; Fakhoury et al., 2014).
Diversos medicamentos são utilizados na terapêutica da DII. Dentre eles, destacam-se derivados do salicilato, antibióticos, corticosteroides, imunossupressores e agentes biológicos (Van Assche et al., 2005). No entanto, essas drogas apresentam vários efeitos colaterais, custo elevado e podem perder a eficácia após certo período de utilização, o que estimula a busca de alternativas de tratamento e novos alvos terapêuticos (Fakhoury et al., 2014; Sales-Campos et al., 2014).
Pesquisas envolvendo caracterização química e avaliação de atividade farmacológica de produtos naturais contribuem para o desenvolvimento de alternativas terapêuticas (Newman e Cragg, 2012) e, considerando a grande biodiversidade presente nos biomas brasileiros, a avaliação de atividade biológica de substâncias e produtos de origem vegetal pode trazer novos agentes ou adjuvantes para o tratamento de DII.
2 2. Doença Inflamatória Intestinal 2.1. Epidemiologia
RCU e DC, as duas principais formas de DII, são doenças da sociedade moderna ocidental, apresentando maior incidência e prevalência nas populações dos países desenvolvidos (Danese e Fiocchi, 2011), como apresentado na figura 1.
Distribuição de taxas de incidência e prevalência de Doença de Crohn (A) e retocolite ulcerativa (B) em países com dados reportados nas bases EMBASE e MEDLINE, entre 1980 e 2008. Extraído e adaptado de Molodecky et al. (2012).
A
3
Para a RCU, a maior incidência (24.3/100 mil habitantes) e prevalência (505/100 mil hab./ano) são encontradas na Europa, enquanto a DC tem maior incidência na América do Norte (20.2/100 mil hab.) e a maior prevalência (322/100 mil hab./ano) na Europa. Em uma população recém-diagnosticada com DII, a RCU tem maior incidência e prevalência que DC (Danese e Fiocchi, 2011; Molodecky et al., 2012).
A DII pode acometer pessoas de qualquer idade, mas o pico de incidência ocorre entre a segunda e quarta décadas de vida, com maior número dos casos entre 20 e 29 anos (Molodecky et al., 2012; Laass et al., 2014). Entre as crianças e adolescentes, a incidência de DII está entre 8 e 10 casos/100 mil hab./ano, aproximadamente 25 % dos casos de DII diagnosticados são pacientes em idade pediátrica (Aloi et al., 2014). Nessa faixa etária, a DC é mais prevalente que a RCU.
Em recente revisão sistemática, observou-se que há aumento significativo da incidência de DII praticamente em todos os países onde há dados relatados, mesmo em locais com poucos casos, como Ásia e América Latina (Molodecky et al., 2012). A prevalência e incidência de DII têm aumentado em países em desenvolvimento, o que se deve, possivelmente, a uma maior eficácia na identificação dos pacientes, aliada a maior acesso a ferramentas de diagnóstico, e às mudanças ambientais como industrialização e adoção de estilo de vida semelhante a dos países desenvolvidos (Gasparetto e Guariso, 2013; Ponder e Long, 2013).
No Brasil, estudos epidemiológicos de DII são escassos, restritos a certas regiões e foram realizados apenas em sistemas públicos de saúde, o que acaba por contribuir para dados subestimados da incidência e prevalência de RCU e DC. Apenas as internações em decorrência de DII em hospitais do Sistema Único de Saúde (SUS) são relatadas para todo o país. O maior número de casos de internações por DII é encontrado na região Centro-Oeste (3,32 internações/100 mil hab./ano), seguida pelas regiões Sul (3,07 internações /100 mil hab./ano) e Sudeste (2,42 internações /100 mil hab./ano). Os menores índices de internação por DII estão no Norte (1,16 internações /100 mil hab./ano) e Nordeste (2,17 internações/100000 hab./ano) (Leite, 2012).
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Um estudo epidemiológico realizado em Recife (PE) entre os pacientes com DII mostrou maior prevalência de RCU (62,7 %). A maioria dos pacientes era do sexo masculino, com idade média de 40 anos, e o tempo de diagnóstico foi superior a cinco anos (Salviano, 2007). Oliveira e colaboradores (2010) reportaram 363 internações hospitalares em razão de DII (0,6 % do total de internações), entre 1998 e 2005, na macrorregião leste de Minas Gerais, com período médio de 6,5 dias. Cerca de 70 % dos pacientes tinha idade entre 20 e 70 anos e não houve diferença entre homens e mulheres.
2.2. Etiologia
A patogênese das DII ainda não está clara, mas se sabe que há uma complexa interação entre fatores genéticos, ambientais e imunológicos (Figura 2). Acredita-se que a perda de tolerância imunológica seja um fator responsável pela resposta inflamatória descontrolada na DII aguda, em indivíduos com predisposição genética (Wirtz e Neurath, 2000; Chassaing e Darfeuille-Michaud, 2011; Khor et al., 2011).
O lúmen intestinal, ao mesmo tempo em que abriga possíveis patógenos e substâncias tóxicas, que exigem rápida resposta do sistema imune, está repleto de antígenos inócuos, presentes nos alimentos, e bactérias comensais, que produzem vitaminas e metabolizam componentes luminais não absorvíveis, fornecendo nutrientes ao epitélio do cólon (Verma et al., 2013; Geremia et al., 2014). Ou seja, o tecido linfoide intestinal deve ser capaz de reagir de forma diferenciada: iniciar uma reação inflamatória aos antígenos potencialmente prejudiciais e reconhecer os antígenos inofensivos, mantendo tolerância frente a eles (Geremia et al., 2014).
Há um grande número de evidências de que a origem das DII está associada a uma resposta imune inadequada ou exagerada aos constituintes normais da microbiota intestinal. Pacientes com DC que passaram por cirurgia de extrusão de trânsito apresentaram remissão da inflamação na porção intestinal não exposta ao conteúdo luminal, e recidiva da inflamação após restauração do trânsito normal (Rutgeerts et al., 1991). A composição da microbiota é diferente entre pacientes com DII e indivíduos saudáveis: há menor diversidade e menor densidade de bactérias dos grupos Firmicutes e
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Bacteroidetes, os principais filos da microbiota intestinal, além de maior número de
bactérias aderidas à mucosa do cólon (Chichlowski e Hale, 2008; Andoh et al., 2011; Ghouri et al., 2014; Koboziev et al., 2014).
Fatores genéticos e ambientais contribuem para redução da integridade da mucosa intestinal, provocando interação entre produtos da microbiota e células do sistema imune e resposta inflamatória. A não resolução da resposta inflamatória acaba por tornar o processo crônico, ocasionando danos aos tecidos e complicações. Extraído e adaptado de Neurath (2014).
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A alta concordância para DC entre gêmeos monozigóticos e o histórico familiar positivo associado à DII são duas das evidências de que a predisposição genética é um fator importante na etiologia dessa doença. Entretanto, um alelo suscetível geralmente requer outros fatores genéticos e não genéticos para que a doença se manifeste (Ishihara
et al., 2009; Khor et al., 2011). A identificação de fatores genéticos associados à DII se
iniciou com a descoberta de que variantes de NOD2 (domínio intracelular de oligomerização de nucleotídeos 2) estão correlacionados com a suscetibilidade à DC (Zheng et al., 2003). Já foram identificadas mais de 160 loci de risco para DII, os quais são envolvidos, em grande parte, na resposta imune e reconhecimento de antígenos. Há diferentes grupos de genes de risco para DC e RCU, mas também há inúmeros loci de risco compartilhados, mostrando similaridade no desenvolvimento das duas condições (Ek et
al., 2014). Os genes implicados no surgimento de DII no início da infância e da fase adulta
são os mesmos, sugerindo contribuição semelhante das predisposições genéticas e vias fisiopatológicas (Khor et al., 2011).
Diversos fatores ambientais estão implicados no desenvolvimento ou nas recidivas de DII como tabagismo, dietas ricas em gordura e açúcar, o uso de certos medicamentos, estresse. É notável que as maiores taxas de incidência e prevalência de DII em países ocidentais desenvolvidos têm ligação com o estilo de vida de suas populações (Krishnan e Korzenik, 2002; Danese et al., 2004; Maunder, 2005; Lakatos, 2009).
O tabagismo é um fator envolvido na etiologia de DII de uma maneira paradoxal: enquanto o hábito de fumar cigarros aumenta o risco e piora o curso da DC, reduz o risco e atividade da doença da RCU. Na RCU, pacientes fumantes tendem a ter um curso de doença mais leve do que os não fumantes, e a atividade da doença é maior nos indivíduos que deixam de fumar (Mahid et al., 2006; Lunney e Leong, 2012). Por outro lado, o cigarro parece exacerbar a DC, e o abandono do tabagismo pode contribuir para o tratamento e melhora do quadro clínico (Johnson et al., 2005).
7 2.3. Manifestações Clínicas
Tanto DC quanto RCU são caracterizadas por inflamação crônica da mucosa intestinal, que resulta frequentemente em dor abdominal intermitente, febre e disenteria. São diferenciadas principalmente pela localização geral e distribuição da inflamação e acometimento do tecido. RCU é restrita ao cólon e reto, com distribuição continua da inflamação, que acomete mucosa e submucosa intestinal, enquanto a DC pode afetar qualquer porção do trato gastrintestinal, tem lesões difusas e afeta todas as camadas da parede intestinal, podendo ultrapassar a serosa e gerar fístulas (Hanauer, 2006; Cho e Abraham, 2007).
RCU é caracterizada por resposta inflamatória, com diferentes graus de edema, ulceração e hemorragia, e alterações morfológicas, com infiltração de polimorfonucleares, formação de abscessos nas criptas e distorção das glândulas mucosas, pequenas ulcerações superficiais, subjacentes à Placa de Peyer e por inflamações crônicas focais que atingem a submucosa (Hendrickson et al., 2002; Hanauer, 2006). Na DC observam-se como alterações histológicas, a distorção na arquitetura das criptas, o aumento de linfócitos na mucosa e granulomas (Laass et al., 2014).
Em pacientes com DII, podem surgir manifestações extraintestinais com acometimento das articulações, dos olhos e da pele. Entre as complicações não autoimunes estão episódios tromboembólicos, anemia e osteoporose (Gasche, 2000).
RCU e DC apresentam condições clínicas e algumas características distintas, entretanto há indícios de que se tratam de duas condições extremas de uma faixa contínua de enfermidades, já que cerca de 10 % dos pacientes apresentam características indefinidas e intermediárias entre RCU e DC (Hanauer, 2006).
2.4. Patogênese
A forma ativa das DII é caracterizada pela infiltração de células imunes inatas (neutrófilos, macrófagos, células dendríticas, células T natural killers) e adaptativas (linfócitos T e B) na lâmina própria da mucosa gastrointestinal. Essas células aumentam os níveis de TNF-α e interleucinas (IL) pró-inflamatórias (Bouguen et al., 2011). Entre as
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interleucinas com níveis elevados em DII estão IL-1, IL-2, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12. Macrófagos liberam TNF-α nos estágios iniciais da resposta inflamatória e esta citocina tem participação em uma série de eventos como adesão de leucócitos, ao estimular a expressão de moléculas de adesão, ativação de neutrófilos, eosinófilos, macrófagos e linfócitos. TNF-α exerce papel importante no desenvolvimento de DII e o uso de bloqueadores de TNF-α foi aprovado nos EUA e Europa para tratamento de Doença de Crohn (Beck e Wallace, 1997; Bosani et al., 2009). IL-6, que parece ser uma das mais importantes citocinas na resposta inflamatória, atua na ativação de células T e B, além da indução de proteínas hepáticas de fase aguda. IL-8, que tem ação quimiotática para neutrófilos, tem níveis elevados de acordo com a atividade de DII (Beck e Wallace, 1997).
Os danos ao tecido e formação de granulomas característicos de DII são resultado, em parte, da migração e degranulação de neutrófilos. A infiltração de neutrófilos nos tecidos gera peptídeos antimicrobianos e ERO, além de levar ao recrutamento e ativação de outras células como macrófagos (Hanauer, 2006). A migração de neutrófilos pode ser monitorada pela enzima mieloperoxidase (MPO), cujo aumento de atividade é observado em diversas enfermidade e inflamações como aterosclerose, tumores e doenças degenerativas do sistema nervoso (Nauseef, 2001). A enzima MPO está presente em altas concentrações nos grânulos citoplasmáticos de neutrófilos e catalisa a reação de N-cloroaminas ou íons cloreto e peróxido de hidrogênio, formando hipoclorito, ambos com ação antimicrobiana nos fagossomos, além de serem lesivos a tecidos e células (Segal, 2005; Hansson et al., 2006).
A desregulação da resposta imune pode estar associada com o aumento da produção de metabólitos reativos de oxigênio e nitrogênio (Singer et al., 1996). A incapacidade de regular efetivamente a ativação de leucócitos fagocíticos (eosinófilos, monócitos, polimorfonucleares) resultaria no aumento da produção das espécies reativas de oxigênio (ERO) dentro do tecido via ativação de NADPH oxidase (Pavlick et al., 2002).
O organismo possui agentes antioxidantes como as enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e glutationa redutase (GR). Outros importantes antioxidantes não-enzimáticos são as vitaminas A, E e C, a provitamina A
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(beta caroteno), a glutationa reduzida (GSH), o alfa tocoferol, transferrina, compostos com grupamento sulfidrila e quelantes como EDTA (Szelenyi e Brune, 1988; Halliwell, 1997; Mangge et al., 2014). Quando os eventos oxidativos excedem a capacidade do sistema antioxidante, ocorre o estado conhecido como “estresse oxidativo”, observado em grande parte dos processos patológicos (Bhattacharyya et al., 2014; Kardeh et al., 2014).
Com o estresse oxidativo há aumento da peroxidação lipídica e da carbonilação de proteínas, redução dos níveis de grupamentos sulfidrilas e indução de apoptose (Kardeh et
al., 2014). ERO também podem ativar citocinas, angiotensina e fatores de crescimento e
regular a expressão de fatores de transcrição como NF-κB, c-jun e c-fos (Mangge et al., 2014; Rahal et al., 2014). NF-κB, um mediador central da resposta imune, regula a expressão de várias citocinas, como as interleucinas (IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IL-12), fator de necrose tumoral (TNF-), além de moléculas de adesão (MAd-CAM) e de outros mediadores inflamatórios, como a enzima NO sintase (iNOS) (Fialkow et al., 2007).
Sabe-se que substâncias antioxidantes podem estar envolvidas na prevenção e cura de doenças intestinais e na recuperação da mucosa do cólon, porque se constituem em substrato para o reparo desse tecido ao inibirem a produção de fatores pró-inflamatórios como TNF- e NO (Rodriguez-Cabezas et al., 2002; Stone et al., 2014).
DII também são importante fator de risco para o desenvolvimento de câncer colorretal. Estudos clínicos demonstram que pacientes com colite ulcerativa têm 2 a 8 vezes mais chances de desenvolver câncer de cólon, comparado com a população em geral. É sugerido que a inflamação intestinal crônica ou repetitiva da mucosa intestinal pode levar ao surgimento de tumor, devido a certas mutações genéticas, aumento da proliferação celular e mudanças no metabolismo das células da mucosa, alteração da circulação entero-hepática de ácidos biliares e modificações na microbiota intestinal. Trabalhos com modelos experimentais de colite ulcerativa em camundongos (induzida por dextrana sal sódico – DSS) levam ao desenvolvimento de carcinomas em 15 a 20 % dos animais, após 90 dias de experimento, o que suporta a hipótese de que a inflamação exerce papel fundamental no desenvolvimento tumores do cólon (Clapper et al., 2007; Tanaka et al., 2009).
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O desenvolvimento de câncer colorretal é um complexo e longo processo, de células epiteliais normais, via formação de criptas aberrantes e adenomas in situ, ao carcinoma e, então, metástase. Existem vários modelos experimentais que mimetizam a patofisiologia do câncer colorretal humano; um deles é induzido pela administração de um agente carcinogênico, azoximetano (AOM), seguida de indução de inflamação intestinal por DSS. Nesse modelo, foi evidenciada presença de COX-2, iNOS e β-catenina na displasia, e ausência de imunorreatividade a p53, o que indica o desenvolvimento de tumor como consequência da inflamação (Tanaka, 2009; De Robertis et al., 2011).
Estudos em modelos animais mostraram que o estresse psicológico pode resultar em aumento da permeabilidade epitelial, que é mediada por fatores neuronais e imunológicos, e pode aumentar a sensibilidade a estímulos pró- inflamatórios ou reativar a inflamação (Soderholm e Perdue, 2001; Kiank et al., 2010).
Citocinas afetam as funções imunológicas, além do paradigma clássico de células T auxiliares Th1/Th2, onde Th1 indica resposta predominantemente mediada pela produção de interferon- (IFN-) na DC, enquanto Th2 aparece na RCU mediada por aumento na produção de IL-13 (Scaldaferri e Fiocchi, 2007). As respostas Th1 e Th2 na DC e RCU, na verdade, podem ser secundárias a defeitos da resposta imune inata; à disfunção de células T reguladoras, que pode contribuir para anormalidades imunes das mucosas, e às células Th17, recentemente descritas, que também estão envolvidas na resposta inflamatória do intestino em ambas as formas de DII (Bouguen et al., 2011).
Na DII, a diferenciação e sobrevivência de células T dependem da quantidade relativa de citocinas-chave reguladoras produzidas, principalmente, por macrófagos e células dendríticas. Na presença de IL-12 e IFN-γ, células T virgens CD4+ adotam um fenótipo Th1, o qual as faz ativar macrófagos que secretam IL-1, IL-6 e TNF-α, criando um ciclo de feedback positivo; já na presença de IL-4, estas células T adotam um fenótipo Th2 (Monteleone e Caprioli, 2008; Abraham e Cho, 2009).
O papel do TNF-α parece ser ainda mais amplo, através da ativação do NF-B, induzindo a expressão de vários genes como o da ciclo-oxigenase-2 (COX-2) e fator de
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crescimento endotelial (vEGF). Além disso, múltiplos efeitos biológicos como a indução do recrutamento de leucócitos (incluindo a indução de molécula de adesão de célula vascular, VCAM), secreção de IL e modulação do óxido nítrico (NO) também são atribuídos a esta citocina (Bouguen et al., 2011). Além do TNF-α, outra citocina chave, a IL-12, comanda a resposta inflamatória mediada por células Th1 (Monteleone & Caprioli, 2008). Tanto respostas normais do hospedeiro a agentes patogênicos intracelulares, quanto respostas inflamatórias anormais ligadas a doenças autoimunes, como a DC, onde aumento da produção de IL-12 nas células apresentadoras de antígenos da mucosa intestinal é encontrado, seriam comandados por esta citocina (Bouguen et al., 2011) .
O desenvolvimento Th17 é desencadeado por IL-6, IL-21, IL-23 e por fator de transformação do crescimento-β (TGF-β). Embora a função das células Th17 não seja ainda bem conhecida, existe uma parte importante desta população de células T que expressa receptores de IL-23. Esta interleucina, secretada por células apresentadoras de antígeno, é também citocina central envolvida com diferenciação e função das células Th17. A interação IL-23-Th17 medeia defesas microbianas e inflamação intestinal IL-12 e IL-23 são potentes ativadoras de células Th1 e Th17, respectivamente; ambas são compostas de uma subunidade p40; em consequência anti-p40 pode ter potencial terapêutico na inibição da ativação de Th1 por IL-12 e de Th17 por IL-23 nas DII (Peyrin-Biroulet et al., 2008; Abraham e Cho, 2009; Mcgeachy et al., 2009; Galvez, 2014).
De forma resumida, células intestinais (imunes, epiteliais, endoteliais e nervosas) liberam citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento, eicosanóides, ERO, enzimas proteolíticas, neuropeptídeos, moléculas de adesão, ou seja, substâncias diversas que contribuem para o recrutamento celular e para a cronicidade da inflamação (Podolsky, 2002). Dessa forma, substâncias que inibem o estresse oxidativo, regulam a secreção de mediadores inflamatórios e reduzem a infiltração celular podem ser potenciais agentes alternativos ou adjuvantes na terapia de DII.
12 2.5. Tratamento
O tratamento deve começar pelo diagnóstico preciso, o que não é tarefa fácil, pois depende de um conjunto de resultados compreendido por história clínica, anamnese, exames endoscópicos, radiológico, histológicos e laboratoriais. O conjunto permite ainda distinguir a DC da RCU; no entanto, em aproximadamente 10% dos pacientes, pelo menos inicialmente, isto não é possível (Xavier e Podolsky, 2007).
O tratamento de DII visa a eliminação de sintomas, o equilíbrio nutricional e a cicatrização da mucosa (Bryant et al., 2014). Em geral, os aminosalicilatos são escolha de primeira linha no tratamento de DII. Na ausência de melhora clínica ou perda de resposta ao medicamento, há substituição ou complementação com corticosteroides ou imunossupressores. E, em caso de falência destes, emprega-se a terapia com os agentes biológicos. Essa estratégia, denominada step-up, consiste no uso sequencial de drogas mais eficazes, mas que apresentam maior efeito colateral. Recentemente, estratégia inversa (top-down) tem sido empregada na terapêutica de pacientes com DC – o tratamento se inicia com um agente biológico e, caso necessário, se adotam os imunomoduladores, corticosteroides e aminosalicilatos, como ilustrado na figura 3 (Ben-Horin e Chowers, 2011; Aloi et al., 2014; Bernstein, 2014; Fakhoury et al., 2014).
Corticosteroides, aminosalicilatos (5-ASA) e agentes imunossupressores, como azatioprina e metotrexato, são rotineiramente empregados no tratamento da DII (Pithadia e Jain, 2011). Os esteroides são o tratamento de escolha para crises moderada e grave, mas são inadequados para uso no longo prazo devido aos seus efeitos colaterais e incapacidade de manter a remissão. Corticosteroides também têm sido empregados quando 5-ASA se mostra ineficiente. São tratamentos eficazes para DC, mas muitos pacientes experimentam sintomas recorrentes quando as doses são reduzidas ou retiradas, podendo causar dependência (Ray, 2012). Além disso, esteroides não são eficazes no tratamento de pacientes de DC com fístulas. Estudos mostraram que esses pacientes recebendo prednisona apresentaram piora e tiveram maior necessidade de intervenção cirúrgica em comparação com pacientes que não tomavam corticoides (Nielsen et al., 2009).
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Organograma das estratégias “step-up” e “top-down” no tratamento de DII. Extraído e adaptado de Aloi et al. (2014).
Estudos demonstraram que 5-ASA é funcionalmente ativo porque bloqueia a produção de prostaglandinas e leucotrienos, inibe a quimiotaxia dos neutrófilos, a secreção de substâncias pró-oxidantes e a ativação do NF-B (Kim et al., 2009). Dentre as preparações de 5-ASA, sulfasalazina e mesalazina (também conhecida como mesalamina) têm sido utilizados por muitos anos no tratamento de DII, tanto para a doença ativa quanto para controle de remissão. Os últimos dados clínicos desses aminossalicilatos no tratamento de DII demonstram que sulfassalazina e mesalazina são úteis para o tratamento da RCU, ativa ou não, enquanto não têm efeito clínico sobre a DC (Nielsen e Munck, 2007). Os efeitos colaterais do 5-ASA ocorrem em 10 a 45% dos pacientes com RCU e alguns desses efeitos são dose-dependentes como dores de cabeça, fadiga e náuseas. Reações alérgicas a esses medicamentos incluem febre, erupção cutânea, síndrome de Stevens-Johnson, hepatite, pneumonia, anemia hemolítica, e imunossupressão (Pithadia e Jain, 2011).
A terapia com azatioprina, um agente imunossupressor, mostrou-se mais eficaz na manutenção da remissão da DC. Azatioprina ou 6-mercaptopurina podem ser eficazes como terapia para manutenção de pacientes em que 5-ASA falhou e também naqueles
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que não toleram drogas que necessitam repetidas administrações de esteroides. Todavia, agentes imunossupressores como a azatioprina, requerem várias semanas de uso para atingir o seu efeito terapêutico, o que significa papel limitado no quadro agudo (Timmer
et al., 2012).
O metotrexato, um agente imunossupressor, quando administrado por via intramuscular, é benéfico na remissão de DC e eficaz na retirada completa de esteroides nestes pacientes. No entanto, o tratamento com essa droga por via oral não apresenta diferenças com placebo (Mcdonald et al., 2012). No entanto, o metotrexato desempenha papel limitado no tratamento de longo prazo de DII (Gonzalez-Lama et al., 2012). Outro imunossupressor usado na clínica médica é a ciclosporina, mas ainda são poucas as evidências de benefícios associados ao seu uso, assim como do tacrolimo (Khan et al., 2011).
A terapêutica das DII avançou consideravelmente com a introdução de terapias biológicas, com destaque para infliximab, um anticorpo monoclonal quimérico contra TNF-α (Rutgeerts et al., 2005; Nakamura et al., 2008). Desde que foi introduzido na prática clínica, infliximab ganhou importância no tratamento de DII. As indicações para seu uso incluem DC fistulante e luminal (em adultos e crianças), RCU recorrente e manifestações extra-intestinais. Nos últimos anos, anticorpos anti-TNF-α totalmente humanos (adalimumab e certolizumab) ampliaram as opções terapêuticas. Outro agente biológico recentemente introduzido na prática clínica é o natalizumab, um anticorpo imunoglobulina G4 (IgG4) monoclonal humanizado contra integrina α4, que inibe a adesão e migração de leucócitos para o tecido inflamado (Ahluwalia, 2012). Os inibidores da fosfodiesterase tiazolo (PDE4I) como rolipram, OPC-6535, mesopram, roflumilaste e tetomilast têm mostrado efeitos benéficos em colite experimental (Ichikawa et al., 2008). Uso de novos agentes biológicos, com alvos em IL-12, IL-23, quinase Janus (JAK) e moléculas da via de sinalização STAT, têm mostrado resultados promissores em modelos experimentais e em pacientes com DII (Sands, 2014)
Algumas terapias alternativas têm sido estudadas e adotadas em alguns casos, como a citoferese extracorpórea (CAP), o transplante de microbiota fecal (FMT) e terapia
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com helmintos. A CAP tem como objetivo diminuir populações de células inflamatórias, a partir de circulação extracorpórea, utilizando uma coluna para adsorção de granulócitos e monócitos/macrófagos (granulocitoferese – GMA) ou uma coluna para remoção de leucócitos, que retém e remove a maioria dos granulócitos, macrófagos e linfócitos, assim como plaquetas (leucocitoferese – LCAP) (Sakuraba et al., 2009). A FMT envolve o transplante de bactérias intestinais de uma pessoa saudável para uma pessoa com DII, enquanto o tratamento com helmintos consiste na infecção com Necator americanus ou
Trichuris suis. Estas terapias se valem por microrganismos comensais ou organismos
pouco prejudiciais ao hospedeiro que atuam na regulação da resposta inflamatória (Taghipour et al., 2014).
Considerando que o crescente número de pacientes com inflamação resistente a terapia biológica, especialmente anti-TNF-α, riscos e efeitos colaterais associados aos medicamentos disponíveis, são importantes as pesquisas de substâncias ativas na remissão de inflamação intestinal (Ng et al., 2011; Sands, 2014).
3. Modelos Experimentais de Inflamação Intestinal
A pesquisa de novas substâncias ativas para o tratamento de DII abrange diferentes modelos experimentais em animais, principalmente camundongos e ratos. Podem-se dividir os modelos de inflamação intestinal em quatro grupos: indução por transgenia, indução por manipulação imune, inflamação espontânea e indução por agentes químicos (Jones-Hall e Grisham, 2014).
Camundongos geneticamente modificados deficientes em IL-10 (IL-10-/-)
desenvolvem enterocolite e são utilizados como modelo para DC. Nesses animais, podem se formar granulomas e a inflamação se localiza na mucosa e submucosa, com resposta predominante do tipo Th1. Outro modelo de DC com animal transgênico é camundongo TNF-αARE, que apresenta superexpressão de TNF-α e desenvolve inflamação transmural
no íleo, com granulomas e reposta Th1/Th17 (Kontoyiannis et al., 1999; Kontoyiannis et
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A transferência de células T CD4+CD45RBhigh a camundongos imunodeficientes
(RAG-/-, SCID, CD3-/-, TCRα-/- x TCR-/-, nude) leva ao desenvolvimento de colite após 6 a 8
semanas, com reposta Th1/Th17 (Powrie et al., 1993; Powrie et al., 1994). A severidade da inflamação depende da linhagem utilizada, sendo Balb/SCID a que apresentou sinais de maior gravidade da doença, em menor tempo após a transferência de células, em um trabalho de padronização de protocolo (Ostanin et al., 2009)
A inflamação espontânea do íleo é observada em camundongos com senescência acelerada. Camundongos SAMP1/Yit e SAMP1/YitFc, selecionados inicialmente no Japão para estudos de senescência, desenvolvem ileíte na 30ª semana de idade, com caraterísticas histológicas semelhantes à DC (Kosiewicz et al., 2001; Jones-Hall e Grisham, 2014).
O estudo de mecanismos patológicos de DII e de possíveis agentes terapêuticos se vale, em grande parte, do uso de modelos experimentais de colite induzida por agentes químicos como TNBS, DSS, ácido acético, carragenina, DAINE, oxazolona. Colite por TNBS, DSS e oxazolona são os modelos mais utilizados e mimetizam sintomas, características morfológicas e histológicas da DII humana. O TNBS, dissolvido em etanol, é administrado por sonda intra-retal, em ratos ou camundongos. O etanol ocasiona desorganização da barreira intestinal, enquanto o TNBS age como hapteno, levando a uma resposta Th1, com densa infiltração celular, que atinge todas as camadas do cólon, como na DC. Oxazolona também é um agente administrado via intra-retal em camundongos ou ratos, geralmente após pré-sensibilização subcutânea (abdômen), que induz aumento de produção de citocinas Th2 e inflamação no cólon distal com similaridades à RCU. Já o DSS é adicionado à agua dos bebedouros de ratos ou camundongos (solução de 2 – 5 %), por períodos variados (frequentemente 5 – 7 dias). Apresenta efeito tóxico às células epiteliais do intestino, aumenta a permeabilidade da mucosa e induz alterações morfológicas compatíveis com RCU (Wirtz et al., 2007; Randhawa et al., 2014).
17 4. Produtos Naturais
Produtos naturais, principalmente as plantas, são utilizados na medicina popular, há milhares de anos, para o tratamento das mais diversas enfermidades. A fitoterapia é baseada em observações empíricas acumuladas e transmitidas ao longo das gerações. Assim, o conhecimento popular sobre o uso terapêutico de plantas serve de base para a extração, estudo, isolamento e purificação de compostos com ação farmacológica. Plantas são fontes de diversos fármacos utilizados clinicamente: um quarto dos medicamentos é de origem vegetal ou contêm substâncias sintetizadas a partir de estruturas encontradas em plantas (Gurib-Fakim, 2006). Avaliação de atividade anti-inflamatória é objetivo de diversos estudos com produtos naturais, os quais têm mostrado que diferentes metabólitos atuam sobre diversos mediadores inflamatórios. Entre eles, destacam-se flavonoides, terpenos e alcaloides (Khanna et al., 2007).
4.1. Alcaloides
A palavra alcaloide é originaria do árabe e significa “alquali”, uma denominação simples, para a “soda” da qual foi obtida, são compostos nitrogenados, derivados de aminoácidos, com baixo peso molecular. Os alcaloides apresentam grande variedade de atividades farmacológicas como anticolinérgica, antitumoral, diurética, antiviral, anti-hipertensiva, antimicrobiana, antidepressiva, analgésica, anti-inflamatória (Henriques et
al., 2004; De Sousa Falcao et al., 2008).
Vários trabalhos mostram atividade anti-inflamatória de alcaloides, envolvendo inibição ou regulação de mediadores da inflamação. Por exemplo, alcaloides fenatroindolizidinicos presentes na espécie Ficus septica (Moraceae) reduziram a expressão do NF-κB e, por consequência, os níveis da COX-2, iNOS e citocinas (Yang et al., 2006). A piperina, um alcaloide oriundo da pimenta preta (Piper nigrum, Piperaceae) reduziu níveis das citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IL-1β (Pradeep e Kuttan, 2004). A isatina, um alcaloide encontrado em leguminosas dos gêneros Indigofera, Isatis e
Calanthe, apresenta atividade anti-inflamatória com inibição de COX-2 e iNOS (Matheus et al., 2007). Um trabalho de revisão sobre os artigos publicados com avaliação de atividade
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anti-inflamatória e antinociceptiva de alcaloides relatou 40 desses compostos com atividade significativa (Souto et al., 2011).
Diversos alcaloides apresentam atividade antioxidante em diferentes modelos experimentais ou condições patológicas. Entre eles estão a berberina, que mostrou atividade antioxidante significativa em ensaios in vitro (Shirwaikar et al., 2006). Extrato etanólico de raiz de Tinospora cordifolia (Menispermaceae), rico em alcaloides, reduziu nefrotoxicidade induzida por aflatoxina, envolvendo aumento da atividade de enzimas antioxidantes e redução de estresse oxidativo (Gupta e Sharma, 2011). O alcaloide índigo apresenta atividade antiulcerogênica, envolvendo ação antioxidante, com redução de apoptose e inibição da infiltração de neutrófilos (Farias-Silva et al., 2007).
Há atividade protetora de alcaloides na colite experimental reportada em diversos trabalhos. A berberina reduziu danos macroscópicos e microscópicos ao cólon, induzidos por TNBS e DSS, inibindo a infiltração de neutrófilos (redução de MPO e IL-8), o estresse oxidativo (redução de MDA e 4-HNE e aumento de GSH e da atividade de GPx, CAT e SOD) e a liberação de mediadores inflamatórios (TNF-α, INF-, IL-12, IL-17) (Zhou e Mineshita, 2000; Lee et al., 2010; Hong et al., 2012; Yan et al., 2012). Administração de oximatrina diminuiu escores de lesão em modelos de colite por DSS e TNBS, reduzindo a expressão de TNF-α IL-6, ICAM-1 e NF-B (Zheng et al., 2005; Fan et al., 2012; Guzman et al., 2013). A cafeína teve efeito significante na redução de lesão e da perda de peso de camundongos expostos ao DSS, envolvendo diminuição do número de bactérias, células CD4 e CD11b, níveis de TNF-α, INF- e IL-17 e da expressão de Akt e aumento das interleucinas anti-inflamatórias IL-10 e Il-4 no tecido inflamado (Lee et al., 2014). Uma fração de alcaloides da espécie Sophora alopecuroides (Leguminosae) apresentou efeito protetor em colite induzida por TNBS em ratos, com redução de escore de lesão macro e microscópico e manutenção em níveis normais das células CD4+ e CD25+ e expressão e quantidade de IL-10, uma interleucina anti-inflamatória que tem seus níveis reduzidos na inflamação induzida por TNBS (Zhou et al., 2010).
19 4.2. Índigo
Índigo é um dos corantes mais utilizados no mundo, pertencente ao grupo de pigmentos indigóides, antigamente extraído de plantas do gênero Indigofera sp. (Doukyu et al., 2003), plantas utilizadas no tratamento de diversos problemas de saúde.
O índigo (Fig. 4) ou pigmento indigóide, um alcaloide bis-indólico, é conhecido desde a antiguidade e obtido a partir de plantas dos gêneros Indigofera, Isatis,
Polygonum, entre outros. As espécies deste gênero são tropicais e encontram-se na África,
Ásia e América do Sul (Maugard et al., 2001). Comunidades indígenas da América Central utilizam espécies do gênero Indigofera, popularmente conhecidas como "anileira", no tratamento de úlceras. Também na América Central a "anileira" é descrita como anti-inflamatória e analgésica (Roig, 1988).
Extratos e frações de I. suffruticosa Miller e I. truxillensis Kunth apresentaram atividade anticâncer, antiulcerogênica, antimicrobiana relatadas (Leite et al., 2006; Vieira et al., 2007; Luiz-Ferreira et al., 2012). Extrato metanólico de partes aéreas de I.
suffruticosa e I. truxillensis mostraram ação mutagênica em ensaio em linhagens de Salmonella typhimurium (Calvo et al., 2011). Lopes e colaboradores mostraram atividade
imunomodulatória, em macrófagos murinos, e citotóxica, em linhagens tumorais LP07 e LM2, de fração alcaloídica e do alcaloide índigo extraídos de I. suffruticosa (Lopes et al., 2011).
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Nosso grupo demonstrou atividade antiulcerogênica e antioxidante do indigo, obtido de partes aéreas de I. truxilensis. Em úlcera gástrica induzida por etanol absoluto, o tratamento com esse alcaloide inibiu a infiltração de neutrófilos (redução da atividade da MPO), a fragmentação de DNA e depleção de GSH na mucosa gástrica, além de aumentar a atividade da enzima GR (Farias-Silva et al., 2007).
Outro trabalho do nosso grupo com modelos clássicos de inflamação evidenciou atividade significativa do alcaloide índigo na redução de edema e infiltração celular nos sítios de inflamação, envolvendo redução de níveis de COX-2, PGE2, TNF-α, NO e MPO
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OBJETIVOS ________________________________________________________________
1. Objetivo Geral
Avaliar a resposta anti-inflamatória do alcaloide índigo, isolado de Indigofera
truxillensis, em modelos experimentais de inflamação intestinal.
2. Objetivos Específicos
Avaliar o efeito do alcaloide índigo, in vivo, nos modelos experimentais de: Inflamação intestinal aguda por TNBS.
Inflamação intestinal aguda por DSS.
Inflamação intestinal com recidiva, associada a câncer de cólon por AOM/DSS.
Avaliar a influência do tratamento com índigo, ex vivo, em mediadores inflamatórios, agentes antioxidantes e produtos do estresse oxidativo envolvidos na inflamação intestinal.
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DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ______________________________________________
1. Obtenção do alcaloide índigo 1.1. Material Vegetal
Exemplares da Indigofera truxillensis Kunth. foram coletados ao longo da estrada Domingos Sartori em Rubião Junior, município de Botucatu, Estado de São Paulo, por Maíra Cola e Victor Barbastefano, em outubro de 2003. A identificação botânica foi realizada pelo professor Jorge Tamashiro, do Instituto de Biologia da Unicamp e um
voucher depositado no herbário da Universidade Estadual de Campinas (UEC 131827).
1.2. Extração e Isolamento do Índigo
Partes aéreas (galhos, folhas e frutos) da espécie I. truxilensis foram secas em estufa (40 °C) e moídas em moinho de facas. O material pulverizado (500 g) sofreu extração exaustiva com clorofórmio, resultando em um extrato clorofórmio (3 %) e uma torta, que foi macerada com metanol (72 horas, 3 vezes), resultando no extrato metanólico (7,3 %), após evaporação do solvente. O extrato metanólico (2,8 g) foi fracionado por cromatografia de permeação em gel (CPG) utilizando Sephadex como adsorvente. As primeiras frações coletadas foram reunidas e denominadas “fr. inicial” (46,4 %). As frações intermediárias constituídas basicamente por flavonoides (manchas amarelas características com revelador NP/PEG) foram reunidas e denominadas “fr. flavonoides” (50,2 %). As frações finais eram coloridas (azul, rosa e tons de marrom), características dos indigoides presentes no gênero Indigofera, sendo reunidas e nomeadas “fr. alcaloides” (3,2 %). A partir da fração “fr. alcaloides", o alcaloide índigo (5 mg) foi isolado e caracterizado por cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC), com padrão autêntico, espectrometria de massas, de infravermelho e ultravioleta. Esses procedimentos foram realizados por Tamara Calvo, sob orientação do Prof. Dr. Wagner Vilegas do Depto. de Química Orgânica do Instituto de Química da Universidade Estadual Paulista, Campus de Araraquara (IQ-Ar/UNESP).
