Modelos experimentais - Avaliação do efeito do alcaloide índigo em modelos experimentais de col

A pesquisa de novas substâncias ativas para o tratamento de DII abrange diferentes modelos experimentais em animais, principalmente camundongos e ratos. Podem-se dividir os modelos de inflamação intestinal em quatro grupos: indução por transgenia, indução por manipulação imune, inflamação espontânea e indução por agentes químicos (Jones-Hall e Grisham, 2014).

Camundongos geneticamente modificados deficientes em IL-10 (IL-10-/-₎

desenvolvem enterocolite e são utilizados como modelo para DC. Nesses animais, podem se formar granulomas e a inflamação se localiza na mucosa e submucosa, com resposta predominante do tipo Th1. Outro modelo de DC com animal transgênico é camundongo TNF-αARE_{, que apresenta superexpressão de TNF-α e desenvolve inflamação transmural}

no íleo, com granulomas e reposta Th1/Th17 (Kontoyiannis et al., 1999; Kontoyiannis et

A transferência de células T CD4+CD45RBhigh_{a camundongos imunodeficientes}

(RAG-/-_{, SCID, CD3}-/-_{, TCRα}-/-_{x TCR}-/-_{, nude) leva ao desenvolvimento de colite após 6 a 8}

semanas, com reposta Th1/Th17 (Powrie et al., 1993; Powrie et al., 1994). A severidade da inflamação depende da linhagem utilizada, sendo Balb/SCID a que apresentou sinais de maior gravidade da doença, em menor tempo após a transferência de células, em um trabalho de padronização de protocolo (Ostanin et al., 2009)

A inflamação espontânea do íleo é observada em camundongos com senescência acelerada. Camundongos SAMP1/Yit e SAMP1/YitFc, selecionados inicialmente no Japão para estudos de senescência, desenvolvem ileíte na 30ª semana de idade, com caraterísticas histológicas semelhantes à DC (Kosiewicz et al., 2001; Jones-Hall e Grisham, 2014).

O estudo de mecanismos patológicos de DII e de possíveis agentes terapêuticos se vale, em grande parte, do uso de modelos experimentais de colite induzida por agentes químicos como TNBS, DSS, ácido acético, carragenina, DAINE, oxazolona. Colite por TNBS, DSS e oxazolona são os modelos mais utilizados e mimetizam sintomas, características morfológicas e histológicas da DII humana. O TNBS, dissolvido em etanol, é administrado por sonda intra-retal, em ratos ou camundongos. O etanol ocasiona desorganização da barreira intestinal, enquanto o TNBS age como hapteno, levando a uma resposta Th1, com densa infiltração celular, que atinge todas as camadas do cólon, como na DC. Oxazolona também é um agente administrado via intra-retal em camundongos ou ratos, geralmente após pré-sensibilização subcutânea (abdômen), que induz aumento de produção de citocinas Th2 e inflamação no cólon distal com similaridades à RCU. Já o DSS é adicionado à agua dos bebedouros de ratos ou camundongos (solução de 2 – 5 %), por períodos variados (frequentemente 5 – 7 dias). Apresenta efeito tóxico às células epiteliais do intestino, aumenta a permeabilidade da mucosa e induz alterações morfológicas compatíveis com RCU (Wirtz et al., 2007; Randhawa et al., 2014).

17 4. Produtos Naturais

Produtos naturais, principalmente as plantas, são utilizados na medicina popular, há milhares de anos, para o tratamento das mais diversas enfermidades. A fitoterapia é baseada em observações empíricas acumuladas e transmitidas ao longo das gerações. Assim, o conhecimento popular sobre o uso terapêutico de plantas serve de base para a extração, estudo, isolamento e purificação de compostos com ação farmacológica. Plantas são fontes de diversos fármacos utilizados clinicamente: um quarto dos medicamentos é de origem vegetal ou contêm substâncias sintetizadas a partir de estruturas encontradas em plantas (Gurib-Fakim, 2006). Avaliação de atividade anti-inflamatória é objetivo de diversos estudos com produtos naturais, os quais têm mostrado que diferentes metabólitos atuam sobre diversos mediadores inflamatórios. Entre eles, destacam-se flavonoides, terpenos e alcaloides (Khanna et al., 2007).

4.1. Alcaloides

A palavra alcaloide é originaria do árabe e significa “alquali”, uma denominação simples, para a “soda” da qual foi obtida, são compostos nitrogenados, derivados de aminoácidos, com baixo peso molecular. Os alcaloides apresentam grande variedade de atividades farmacológicas como anticolinérgica, antitumoral, diurética, antiviral, anti- hipertensiva, antimicrobiana, antidepressiva, analgésica, anti-inflamatória (Henriques et

al., 2004; De Sousa Falcao et al., 2008).

Vários trabalhos mostram atividade anti-inflamatória de alcaloides, envolvendo inibição ou regulação de mediadores da inflamação. Por exemplo, alcaloides fenatroindolizidinicos presentes na espécie Ficus septica (Moraceae) reduziram a expressão do NF-κB e, por consequência, os níveis da COX-2, iNOS e citocinas (Yang et al., 2006). A piperina, um alcaloide oriundo da pimenta preta (Piper nigrum, Piperaceae) reduziu níveis das citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IL-1β (Pradeep e Kuttan, 2004). A isatina, um alcaloide encontrado em leguminosas dos gêneros Indigofera, Isatis e

Calanthe, apresenta atividade anti-inflamatória com inibição de COX-2 e iNOS (Matheus et al., 2007). Um trabalho de revisão sobre os artigos publicados com avaliação de atividade

anti-inflamatória e antinociceptiva de alcaloides relatou 40 desses compostos com atividade significativa (Souto et al., 2011).

Diversos alcaloides apresentam atividade antioxidante em diferentes modelos experimentais ou condições patológicas. Entre eles estão a berberina, que mostrou atividade antioxidante significativa em ensaios in vitro (Shirwaikar et al., 2006). Extrato etanólico de raiz de Tinospora cordifolia (Menispermaceae), rico em alcaloides, reduziu nefrotoxicidade induzida por aflatoxina, envolvendo aumento da atividade de enzimas antioxidantes e redução de estresse oxidativo (Gupta e Sharma, 2011). O alcaloide índigo apresenta atividade antiulcerogênica, envolvendo ação antioxidante, com redução de apoptose e inibição da infiltração de neutrófilos (Farias-Silva et al., 2007).

Há atividade protetora de alcaloides na colite experimental reportada em diversos trabalhos. A berberina reduziu danos macroscópicos e microscópicos ao cólon, induzidos por TNBS e DSS, inibindo a infiltração de neutrófilos (redução de MPO e IL-8), o estresse oxidativo (redução de MDA e 4-HNE e aumento de GSH e da atividade de GPx, CAT e SOD) e a liberação de mediadores inflamatórios (TNF-α, INF-, IL-12, IL-17) (Zhou e Mineshita, 2000; Lee et al., 2010; Hong et al., 2012; Yan et al., 2012). Administração de oximatrina diminuiu escores de lesão em modelos de colite por DSS e TNBS, reduzindo a expressão de TNF-α IL-6, ICAM-1 e NF-B (Zheng et al., 2005; Fan et al., 2012; Guzman et al., 2013). A cafeína teve efeito significante na redução de lesão e da perda de peso de camundongos expostos ao DSS, envolvendo diminuição do número de bactérias, células CD4 e CD11b, níveis de TNF-α, INF- e IL-17 e da expressão de Akt e aumento das interleucinas anti- inflamatórias IL-10 e Il-4 no tecido inflamado (Lee et al., 2014). Uma fração de alcaloides da espécie Sophora alopecuroides (Leguminosae) apresentou efeito protetor em colite induzida por TNBS em ratos, com redução de escore de lesão macro e microscópico e manutenção em níveis normais das células CD4+ e CD25+ e expressão e quantidade de IL- 10, uma interleucina anti-inflamatória que tem seus níveis reduzidos na inflamação induzida por TNBS (Zhou et al., 2010).

19 4.2. Índigo

Índigo é um dos corantes mais utilizados no mundo, pertencente ao grupo de pigmentos indigóides, antigamente extraído de plantas do gênero Indigofera sp. (Doukyu et al., 2003), plantas utilizadas no tratamento de diversos problemas de saúde.

O índigo (Fig. 4) ou pigmento indigóide, um alcaloide bis-indólico, é conhecido desde a antiguidade e obtido a partir de plantas dos gêneros Indigofera, Isatis,

Polygonum, entre outros. As espécies deste gênero são tropicais e encontram-se na África,

Ásia e América do Sul (Maugard et al., 2001). Comunidades indígenas da América Central utilizam espécies do gênero Indigofera, popularmente conhecidas como "anileira", no tratamento de úlceras. Também na América Central a "anileira" é descrita como anti- inflamatória e analgésica (Roig, 1988).

Extratos e frações de I. suffruticosa Miller e I. truxillensis Kunth apresentaram atividade anticâncer, antiulcerogênica, antimicrobiana relatadas (Leite et al., 2006; Vieira et al., 2007; Luiz-Ferreira et al., 2012). Extrato metanólico de partes aéreas de I.

suffruticosa e I. truxillensis mostraram ação mutagênica em ensaio em linhagens de Salmonella typhimurium (Calvo et al., 2011). Lopes e colaboradores mostraram atividade

imunomodulatória, em macrófagos murinos, e citotóxica, em linhagens tumorais LP07 e LM2, de fração alcaloídica e do alcaloide índigo extraídos de I. suffruticosa (Lopes et al., 2011).

Nosso grupo demonstrou atividade antiulcerogênica e antioxidante do indigo, obtido de partes aéreas de I. truxilensis. Em úlcera gástrica induzida por etanol absoluto, o tratamento com esse alcaloide inibiu a infiltração de neutrófilos (redução da atividade da MPO), a fragmentação de DNA e depleção de GSH na mucosa gástrica, além de aumentar a atividade da enzima GR (Farias-Silva et al., 2007).

Outro trabalho do nosso grupo com modelos clássicos de inflamação evidenciou atividade significativa do alcaloide índigo na redução de edema e infiltração celular nos sítios de inflamação, envolvendo redução de níveis de COX-2, PGE2, TNF-α, NO e MPO

OBJETIVOS ________________________________________________________________

1. Objetivo Geral

Avaliar a resposta anti-inflamatória do alcaloide índigo, isolado de Indigofera

truxillensis, em modelos experimentais de inflamação intestinal.

2. Objetivos Específicos

 Avaliar o efeito do alcaloide índigo, in vivo, nos modelos experimentais de:  Inflamação intestinal aguda por TNBS.

 Inflamação intestinal aguda por DSS.

 Inflamação intestinal com recidiva, associada a câncer de cólon por AOM/DSS.

 Avaliar a influência do tratamento com índigo, ex vivo, em mediadores inflamatórios, agentes antioxidantes e produtos do estresse oxidativo envolvidos na inflamação intestinal.

DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ______________________________________________

1. Obtenção do alcaloide índigo 1.1. Material Vegetal

Exemplares da Indigofera truxillensis Kunth. foram coletados ao longo da estrada Domingos Sartori em Rubião Junior, município de Botucatu, Estado de São Paulo, por Maíra Cola e Victor Barbastefano, em outubro de 2003. A identificação botânica foi realizada pelo professor Jorge Tamashiro, do Instituto de Biologia da Unicamp e um

voucher depositado no herbário da Universidade Estadual de Campinas (UEC 131827).

1.2. Extração e Isolamento do Índigo

Partes aéreas (galhos, folhas e frutos) da espécie I. truxilensis foram secas em estufa (40 °C) e moídas em moinho de facas. O material pulverizado (500 g) sofreu extração exaustiva com clorofórmio, resultando em um extrato clorofórmio (3 %) e uma torta, que foi macerada com metanol (72 horas, 3 vezes), resultando no extrato metanólico (7,3 %), após evaporação do solvente. O extrato metanólico (2,8 g) foi fracionado por cromatografia de permeação em gel (CPG) utilizando Sephadex como adsorvente. As primeiras frações coletadas foram reunidas e denominadas “fr. inicial” (46,4 %). As frações intermediárias constituídas basicamente por flavonoides (manchas amarelas características com revelador NP/PEG) foram reunidas e denominadas “fr. flavonoides” (50,2 %). As frações finais eram coloridas (azul, rosa e tons de marrom), características dos indigoides presentes no gênero Indigofera, sendo reunidas e nomeadas “fr. alcaloides” (3,2 %). A partir da fração “fr. alcaloides", o alcaloide índigo (5 mg) foi isolado e caracterizado por cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC), com padrão autêntico, espectrometria de massas, de infravermelho e ultravioleta. Esses procedimentos foram realizados por Tamara Calvo, sob orientação do Prof. Dr. Wagner Vilegas do Depto. de Química Orgânica do Instituto de Química da Universidade Estadual Paulista, Campus de Araraquara (IQ-Ar/UNESP).

CCDC dos alcaloides It1 e It2, isolados de “fr. alcaloides”, em comparação ao padrão de índigo autêntico (Fluka). O alcaloide It1 foi identificado como índigo. Rf = fator de retenção. Extraído de Calvo (2007).

2. Animais

Foram utilizados ratos machos HanUnib: WH (Wistar), com 150 a 220 g e camundongos machos Unib: SW (Swiss), com 25 a 35 g, provenientes do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica da Unicamp (CEMIB/Unicamp), aclimatados às condições do laboratório por pelo menos sete dias antes da manipulação experimental, em temperatura (23 ± 2 °C) e ciclos claro-escuro de 12h controlados, alimentados com ração nuvital (Nuvilab) e água potável filtrada ad libitum. Os experimentos envolvendo animais foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Unicamp (CEUA/Unicamp), sob o protocolo nº 2399-1.

3. Modelos experimentais

O efeito do tratamento oral com o alcaloide índigo foi avaliado, inicialmente, em modelo de colite aguda por TNBS. Diferentes doses foram testadas nesse modelo e uma delas foi selecionada para os estudos seguintes – modelos de colite aguda por DSS, colite com recidiva por DSS e colite associada a câncer colorretal por AOM/DSS. Foram quantificados mediadores inflamatórios e/ou produtos do estresse oxidativo e agentes antioxidantes no cólon dos animais expostos aos diferentes modelos. Indícios de toxicidade do alcaloide também foram analisados. Os resultados estão apresentados em dois capítulos.

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CAPÍTULO I: EFEITO DO TRATAMENTO COM O ALCALOIDE BIS-INDÓLICO ÍNDIGO EM

No documento Avaliação do efeito do alcaloide índigo em modelos experimentais de colite (páginas 38-48)