Biologia Molecular Aplicada
A tecnologia do DNA recombinante
Teoria bem fundamentada
• Por volta do início da década de70, os fundamentos básicos da teoria já haviam sido propostos
solidamente por Crick, Watson e
C&A
• Assim, os cientistas passaram a se perguntar: será que o material
genético e o processo de expressão podem ser manipulados?
A descoberta da DNA ligase
• 1960: recombinação de
DNA ocorre em células
– Reparo de danos ocorridos por luz UV
• 1967, Martin Gellert
– Extratos de E. coli produziam
fagos lambda circulares
– Purificação da DNA ligase!
Paul Berg
• Reuniu o fago SV40 ao bacteriófago lambda
– Queria cortar o SV40 e inserir pedaços do fago lambda nele
• Usou enzimas de restrição para cortar os fagos e incubou-os juntos, utilizando DNA ligase
– Criou uma técnica, segundo ele mesmo, para ligar covalentemente
moléculas de DNA
• Como o bacteriófago era de E. coli e esta bactéria habita nossos corpos, ele teve medo de gerar um novo e letal vírus
• Posteriormente sugeriu moratória aos estudos em biologia molecular
• Nobel, 1980: “por seus estudos fundamentais em bioquímica de
ácidos nucléicos, particularmente com relação ao DNA recombinante”
Paul Berg,
1926-Fago λ
Endonucleases de restrição
• 1968, Paul Arber sugere a existência de
enzimas existentes em bactérias que atuassem como proteção à infecção por fagos
– Essas enzimas cortariam o DNA do fago em sítios específicas
– Endonuclease R
• 1968
– Meselson & Yuan: EcoRI
• 1970
– Smith & Kelly: nova endonuclease descoberta em H. influenzae -- HindIII
– Confirmação da hipótese de Arber, enzima corta DNA exógeno mas não DNA celular
– Descoberta do sítio específico de corte pela enzima (AAGCTT)
Mapa de restrição
• 1971 - Kathleen Danna and DanielNathans
• Ensaio de digestão: Usam a endonuclease R (EcoRI) para cortar o DNA do fago SV40 • Fragmentos tinham tamanho
constante e, logo, podiam ser facilmente separados em uma eletroforese!
– Verificado o fato de que a enzima corta em sítios específicos
Ec o R I Ec o R I Ec o R I Ec o R I Ec o R I Ec o R I H in d III
De novo, Berg
• 1972, Berg’s lab– Janet Mertz and Ronald Davis
descobrem que a endonuclease R1 produzia quebras espaçadas entre as duas fitas, gerando extremidades
coesivas idênticas e complementares
• Extremidades unidas e encubadas com DNA ligase poderiam gerar moléculas de DNA híbridas!
Extremidades cegas
Extremidades coesivas
Ensaio de digestão
• Adicione DNA + tampão +endonuclease de restrição • Deixe digerindo num banho a
determinada temperatura por determinado tempo
• 1 unidade de enzima de restrição digere 1 μg DNA em 1h00
• Caixa de truques do biólogo molecular contém: DNA ligase + enzimas de restrição + ...
Vetores de clonagem
• ~1970: Trabalho com plasmídeos• Peças de DNA circulares e não cromossomais encontradas em bactérias
– E às vezes trocadas por elas
• 1970
Descobriu um método segundo o qual uma E. coli adquiriria um plasmídeo conhecido como pSC101 • pSC101: contém um gene que
confere resistência ao anti-biótico tetraciclina
1936-Plasmídeo encontra
Endonucleases
• Cohen junta-se a Boyer, especialista em enzimas de restrição
• Trabalharam com dois plasmídeos,
– P1 confere resistência a tetraciclina – P2 confere resistência a kanamicina
• Experimento
– Corte os dois plasmídeos com enzimas de restrição – Incube-os com DNA ligase
– Teste a presença de bactérias duplamente resistentes no meio
• Este talvez tenha sido obtiveram o primeiro
organismo recombinante feito propositalmente por um ser humano Herbert Boyer, 1936 P1 P1/2 P2 Ec o R I Ec o R I Ec o R I Ec o R I K K T T Digestão + ligação
Cohen & Boyer
• 1973
– Inseriram genes de Xenopus laevis em E. coli e
verificaram que os genes estavam ativos nas
bactérias depois de várias gerações
– Como as bactérias reproduziam-se rapidamente,
poderiam ser utilizadas para produzir genes de
grandes mamíferos em larga-escala
– Constroem um organismo capaz de combinar e
replicar a informação genética de diferentes
espécies!
O que, então, era possível fazer?
• Era possível pegar o DNA de qualquer espécie, picotá-lo e inseri-lo em uma bactéria que o amplificaria milhões de vezes • A era da engenharia e da
manipulação genética tem início...
• Mas o que se pode fazer? Até onde podemos chegar?
– Verdade seja dita: ninguém sabe ao certo...
Engenharia genética
• Pode-se aumentar a expressão deum gene bacteriano
• Pode-se fazer bactérias produzir genes de qualquer espécie
– Expressão em levedura, células de mamíferos
• Produzir vírus transgênicos, produzir vírus contendo toxinas • Terapia gênica, knockout gênico • Que medo!?
Discussões éticas
• 1974
– Paul Berg (juntou SV40 com fago lambda e se arrependeu) alerta para o perigo da biotecnologia e sugere uma moratória
• 1975
– Conferência Asilomar
– Moratória de 16 meses ao DNA recombinante – Bomba atômica da biologia?
• Watson acha que a natureza já fez muitos mais experimentos, por muito mais tempo e muitos mais jeitos do que podemos
imaginar e nada de muito significativo aconteceu...
– Se fosse causar algum dano, a natureza
Joshua Lederberg
• 1958, Nobel com Beadle e Tatum (um gene, uma enzima) • 1960
Enquanto as discussões giravam sobre clonagem humana, sugeriu que a biotecnologia se desenvolveria através da microbiologia
Lederberg defendia a terapia gênica e a engenharia de fenótipos • 1974, Asilomar
Defendia a tecnologia para diagnose de doenças, medicina terapêutica, produção de proteínas humanas em larga escala, processos de fermentação, produção maciça de antibióticos • 1978, Genentech
O DNA recombinante hoje
• Há centenas de vetores de clonagem comerciais, cada um
com vantagens específicas (encontrar promotores, descobrir
interações entre genes, expressar proteína em larga escala,
etc)
• DNAs das mais variadas espécies são clonados a todo instante
em laboratórios de biologia molecular em todo o mundo
• Parece que nada de muito anormal aconteceu... Ainda...
Plantas transgênicas
• Genes de resistência a patógenos
– Resistência a inseticidas (Roundup)
– Aumento da produtividade, desequilíbrio ecológico
• Aumento nutricional
– Adição de determinado aminoácido torna alimentos mais nutritivos
– Banana vacina
• Rotulação!
• Prejuízo ecológico da monocultura
– A maior parte do prejuízo ecológico vem da simples monocultura
– A engenharia genética adiciona um nível de prejuízo ecológico ligeiramente maior
• É preciso diferenciar a tecnologia de transgênicos de seu abuso pela indústria do capital
– Produção de insulina, hormônio de crescimento, etc.
Clonagem de genes
Pra quê clonar genes?
• Amplificar milhares de vezes apenas este gene
• Realizar um estudo individual da função de genes
• Identificar mutações que modifiquem a função deles
• Entender a ação enzimática da proteína produzida
• Verificar com quais outros genes ele interage
• Produzir a proteína em larga-escala
• Montar genomas completos
• Produzir organismos transgênicos de interesse
• Etc etc etc etc
Clonagem de fragmentos de DNA
• Enzimas – enzimas de restrição – DNA polimerases – DNA ligase/Topoisomerases – Fosfatases • Vetores – Plasmídios – Fagos – Cosmídeos – BACS/YACS – Vírus, bacteriófagos • Hospedeiros – Escherichia coli – Levedura – Células animais – Células vegetaisVetor plasmidial
• Origem de replicação
• Gene repórter
Ligação do DNA exógeno ao plasmídeo
• Produção da molécula
de DNA recombinante
• Plasmídeo + DNA
cortado do organismo
de interesse
• Ligação das
extremidades coesivas
DNA Ligase
• Realiza a ligação fosfodiéster
Ensaio de digestão e subclonagem
Kb 1 2 PM 0,5 1,0 2,0Clivagem do inserto clonado no vetor com enzima de restrição
Clonagem de fragmentos de DNA
INSERTO: Fragmento de DNA
VETOR ou veículo de clonagem:
-plasmídeo -bacteriófago -cosmídeo
-cromossomo artificial de bactéria (BAC) -cromossomo artificial de levedura (YAC)
Amplificação do clone em bactérias
inserto fragmento de DNA ligado ao vetor bactéria transformada introduzir nas células: transformação e seleçãoconstrução
Objetivo: Obter muitas Cópias do gene pretendidoTransformação
• Inserção do
plasmídeo
em bactérias
• Replicação bacteriana
• Produção em massa
da proteína
recombinante!
Métodos de
transformação bacteriana
A transformação natural descrita por Griffiths, em 1928, e por Avery e colaboradores, em 1944, é um evento raro.
Permeabilização com CaCl2 -- Choque térmico
Eletroporação -- Choque elétrico
Gene gun
-- Bombardeamento • Plasmídeos pequenos são mais facilmente incorporados pela célula bacteriana competente.
• DNA linear é pobremente incorporado, talvez pelo fato de sofrer degradação pelas
enxonucleases presentes no espaço periplasmático.
Seleção de clones
Será que entrei?• Bactérias são colocadas em meio nutritivo
com antibiótico para que cresçam e
amplifiquem nosso DNA do inserto
• Gene repórter
– Reporta se a transformação aconteceu – Bactérias não-transformadas não sobrevivem – Gene de resistência a algum antibióticoSeleção de recombinantes
Durante a clonagem de fragmentos, a DNA ligase pode fechar o plasmídeo sem que nenhum inserto tenha sido clonado. Para evitar a análise de um vetor
Keywords
• Conceitos-chave para a tecnologia do DNA
recombinante:
– Vetor
• Sítio múltiplo de clonagem • Genes repórteres
– Inserto
– Endonucleases de restrição sítio-específicas
– Digestão, ligação, clonagem
http://www.youtube.com/watch?v=acK WdNj936o&feature=related
