UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
INSTITUTO BIOMÉDICO
CURSO DE GRADUAÇÃO EM BIOMEDICINA
KAMILLA FÉRES BOROTO
PADRONIZAÇÃO DO ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO PARA
DETERMINAÇÃO DO ÍNDICE DE AVIDEZ DE ANTICORPOS IgG
GERADOS EM CAMUNDONGOS IMUNIZADOS COM A
PROTEÍNA RECOMBINANTE LigA(625-1224aa) DE Leptospira
interrogans
NITERÓI
2015
KAMILLA FÉRES BOROTO
PADRONIZAÇÃO DO ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO PARA
DETERMINAÇÃO DO ÍNDICE DE AVIDEZ DE ANTICORPOS IgG
GERADOS EM CAMUNDONGOS IMUNIZADOS COM A
PROTEÍNA RECOMBINANTE LigA(625-1224aa) DE Leptospira
interrogans
Monografia apresentada ao Curso de
Graduação em Biomedicina da
Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do grau de Bacharel, habilitação em Análises Clínicas.
Orientadora:
Msc. Gabriela dos Santos Esteves
Mestre em Biologia; Chefe do Laboratório de Tecnologia Recombinante (LATER); Bio-Manguinhos; Fundação Oswaldo Cruz
Co-orientador:
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À minha família que sempre esteve ao meu lado, apoiando e dando força para seguir em frente com as minhas escolhas.
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Agradecimentos
À Deus por me ajudar e me guiar durante todos os momentos da minha vida, me mostrando sempre o caminho a seguir.
Aos meu pais, Olindo e Igleice, por me apoiarem sempre, e por me ensinarem a valorizar todas as minhas conquistas, mesmo que por menores que estas pudessem ser.
À minha irmã, Marianna, que sempre esteve ao meu lado nas minhas escolhas e por ser minha melhor amiga.
Às minhas amigas Sarah, Luciana, Patrícia e Gabriella, pela paciência e pelo apoio durante todos esses anos de amizade.
À minha turma, 2011.2, que me acolheu quando cheguei de transferência, e por tudo que passamos juntos nesses quatro anos de faculdade.
À minhas amigas, Raphaela, Caroline e Thaís, pelas conversas, brincadeiras e horas estudando. Vou leva-las para sempre na minha vida. Mesmo morando longe, vocês fazem parte de uma fase muito bonita da minha vida.
Ao Anderson e a Jéssica, pelas palhaçadas, piadas, risos, conselhos, e pela amizade que construímos. Vocês já fazem parte da minha vida.
Ao projeto de extensão conhecido como “Boa Noite, Bom Dia” (BNBD), por todas as nossas visitas que nunca foram iguais. Que o projeto continue sendo leve e muito bonito, fazendo sempre o bem a todos os pacientes do Hospital Universitário Antônio Pedro (HUAP) e a todos os participantes dele.
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À minha primeira orientadora, Priscilla Oliveira, por me aceitar como aluna desde o meu segundo período de faculdade e, por ter tido a paciência para me ensinar tudo o que estivesse ao alcance dela.
Aos colegas do laboratório de neurobiologia, pela ajuda, paciência, conversas, e brincadeiras durante os dois anos trabalhando no laboratório.
Ao Dr. Marco Alberto Medeiros, que aceitou me orientar durante o meu trabalho de conclusão de curso, junto a Mestre Gabriela dos Santos Esteves. Também pela oportunidade de ter proporcionado um aprendizado em outra área do conhecimento.
Aos colegas do Laboratório de Tecnologia Recombinante (LATER) pelo apoio, conversas, conselhos, piadas e momentos de confraternização.
À coordenação, corpo docente e funcionários do curso de biomedicina por nos ajudarem de todas as maneiras possíveis, facilitarem a nossa vida acadêmica e nos inspirarem com seus exemplos de dedicação ao trabalho.
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"O sucesso normalmente vem para quem está ocupado demais para procurar por ele" Henry David Thoreau.
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RESUMO
A leptospirose é uma enfermidade cosmopolita grave que acomete diferentes espécies de animais domésticos, silvestres e o homem. As vacinas convencionais baseadas na célula inteira inativada contra leptospirose, tanto para uso humano quanto veterinário, possuem sucesso limitado, pois induzem imunidade de curta duração e proteção sorovar-específica. Para vacinas constituídas por peptídeos e peptídeos recombinantes necessitam que sejam utilizados adjuvantes em suas vacinas por possuir baixa imunogenicidade. Os adjuvantes podem promover resposta celular ou humoral, e, no caso desse trabalho onde foram avaliadas formulações contendo Hidróxido de Alumínio, a principal resposta imunológica gerada é a humoral. Os anticorpos gerados a partir desta resposta necessitam que sua qualidade seja avaliada. Para tal, o teste de avidez, baseado no ensaio imunoenzimático, foi padronizado utilizando o agente caotrópico, Tiocianato de Amônio. Testamos a interferência desse agente quanto a ligação do antígeno em placa de 96 poços, e foi observado que concentrações menores que 1M não interferiam nesta ligação. Diante disso, para determinação do índice de avidez, foi estabelecida uma concentração onde o agente caotrópico diminuísse em 50% a ligação entre o anticorpo presente no soro padrão e o antígeno fixado na placa. A concentração estabelecida foi a de 0,4M e a partir dela houve a determinação da faixa do índice de avidez (41,39 a 53,72%) dos anticorpos produzidos com a formulação contendo LigA(625-1224aa) e Hidróxido de Alumínio. Em nosso estudo essa avaliação é uma ferramenta de extrema importância que serve como parâmetro para determinação do potencial dessa formulação em ensaios de desafio com Leptospiras vivas, que serão realizados futuramente.
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Abstract
Leptospirosis is a serious cosmopolitan disease affecting different species of domestic animals, wildlife and humans. The conventional vaccines based on inactivated whole cell against leptospirosis, both for veterinary and human use, have limited success, because they induce short and serovar-specific protective immunity. Vaccines consisting of recombinant peptides and peptides are required to use adjuvants in their formulations because of their low immunogenicity. Adjuvants can promote cellular or humoral response and in this work were evaluated formulations containing Aluminum hydroxide, generate and the primary immune response generated is humoral. The quality of response generated from the antibodies need to be evaluated. To this end, the avidity test based on enzyme-linked immunosorbent assay was standardized using the chaotrope agent Ammonium thiocyanate. We tested the agent interference such as antigen binding in a 96 well plate, and we observed that the concentrations below 1M do not interfere in the linkage. Thus, to determine the avidity index, it was necessary to stabilish the chaotropic agent concentration to decrease 50% on binding between the antibody present in standard serum and the antigen fixed on the plate. The determined concentration of Amonium tiocyanate was 0.4M and consequently the determination of the avidity index range of 41.39 to 53.72% of the antibodies produced with the formulation containing LigA(625-1224aa) and Aluminum hydroxide. In our study, this evaluation is an extremely important tool that serves as a parameter to determine the potential of this formulation challenge tests with live Leptospira, which will be held in the future.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Análise da interferência do Tiocianato de Amônio, em diferentes concentrações, na sensibilização da placa. ... 18
Figura 2 - Confirmação da concentração de Tiocianato de Amônio que reduz em 50% a ligação antígeno-anticorpo. ...19
Figura 3 - Confirmação da concentração 0,4M de Tiocianato de Amônio. ... 20
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Média da densidade óptica obtida na leitura das diferentes concentrações do antígeno utilizando a diluição seriada do soro padrão. ... 16
Tabela 2: Valores de Índices de Avidez das repetições da concentração de 0,4M do Tiocianato de Amônio...19
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LISTA DE ABREVIATURAS APC: Célula Apresentadora de Antígeno
BSA: Albumina Bovina DO: Densidade óptica
ELISA: do inglês, Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay EU: Unidade de Elisa
FIOCRUZ: Fundação Oswaldo Cruz LPS: Lipopolissacarídeo
MHC: Complexo Maior de Histocompatibilidade PBS: Tampão Fosfato
PBS-T: Tampão Fosfato 1X contendo Tween 20 TMB: Tetrametilbenzidina
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SUMÁRIO
1. Introdução ... 1
1.1.Vacina ... 3
1.2.Leptospiral immunoglobulin-like (Lig) ... 5
1.3. Adjuvantes ... 6 1.3. ELISA ... 7 1.4. Teste de avidez ... 8 2. Justificativa e relevância ... 10 3. Objetivos ... 12 4. Métodos ... 13
4.1. Produção de soro hiperimune ... 13
4.2. Padronização ELISA... 13
4.2.1. Concentração de antígeno na placa / Tempo de bloqueio ... 13
4.2.2. Diluição do soro padrão e determinação do tempo ideal de revelação com TMB ... 14
4.3. Padronização do teste de Avidez ... 14
4.3.1. Interferência do Tiocianato de Amônio na sensibilização das placas ... 14
4.3.2. Teste para definição da concentração ideal de Tiocianato de Amônio capaz de reduzir em 50% a ligação antígeno-anticorpo para a determinação do índice de avidez (IA) ... 15
4.3.3. Análise dos dados... 16
5. Resultados ... 17
5.1. Padronização do ELISA ... 17
5.1.1. Concentração de antígeno na placa / Tempo de bloqueio ... 17
5.1.2. Diluição do soro padrão e determinação do tempo ideal de revelação com TMB ... 18
5.2. Padronização do Teste de Avidez ... 18
5.2.1. Interferência do Tiocianato de Amônio na sensibilização das placas ... 18
5.2.2. Teste para definição da concentração ideal de Tiocianato de Amônio capaz de reduzir em 50% a ligação antígeno-anticorpo para a determinação do índice de avidez (IA) ... 19
6. Discussão e conclusão ... 22
7. Referências bibliográficas... 25
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1. Introdução
A leptospirose é uma doença bacteriana, infecciosa sistêmica, aguda, febril, causada pela bactéria do gênero Leptospira, do qual se conhecem atualmente 14 espécies patogênicas, sendo a mais importante a L. interrogans. A unidade taxonômica básica é o sorovar. Mais de 200 sorovares já foram identificados, e cada um tem o seu hospedeiro preferencial, ainda que uma espécie animal possa albergar um ou mais sorovares. No Brasil, os sorovares Icterohaemorrhagiae e Copenhageni estão frequentemente relacionados aos casos mais graves da doença (LEVETT, 2001).
As estimativas indicam que mais de 500.000 casos de leptospirose ocorram no mundo todos os anos, sendo que mais de 10% dos casos são fatais (Ministério da Saúde, 2014). Este número subestima o impacto global por que a notificação se baseia nos casos de doença severa e o diagnóstico da leptospirose se confunde com o de outras causas de febre aguda, como a dengue (MCBRIDE et al., 2005).
A doença vem sendo reconhecida como um importante problema de saúde pública no mundo inteiro, e considerada a zoonose geograficamente mais difundida no mundo (ADLER, 2010). No Brasil a doença é de distribuição endêmica com ocorrência durante todos os meses do ano e com coeficiente médio de incidência anual de 1,9/100.000 habitantes. Além disso, epidemias urbanas anuais, principalmente em comunidades carentes, pós-enchentes e alagamentos, e surtos relacionados em áreas rurais, principalmente em locais de cultura de subsistência, também são considerados padrões epidemiológicos da doença (Ministério da Saúde, 2014). Os principais reservatórios de leptospiras são os roedores, os quais são portadores assintomáticos da doença. Em áreas metropolitanas, o rato de esgoto (Rattus norvegicus), é considerado o mais importante transmissor para o homem. A bactéria se localiza e se multiplica nos túbulos renais dos animais infectados, os quais não apresentam sintomas, e são liberadas na urina durante semanas ou meses após a fase aguda contaminando água, solo e alimentos (McBRIDE et al., 2005). Infecções de animais ou seres humanos ocorrem a partir de contato
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direto com a urina ou indiretamente através da água contaminada. Os veículos podem ser animais selvagens ou domésticos, especialmente roedores e marsupiais pequenos, gado, porcos e cães (ADLER, 2010).
A patogenia da leptospirose inclui a penetração ativa dos micro-organismos através de mucosas (ocular, respiratória e gênito-urinária), da pele escarificada e até mesmo da pele íntegra, em condições especiais que favoreçam a dilatação dos poros, como ocorre quando há permanência por tempo prolongado em coleções de água contaminada (EVANGELISTA, 2010). Vencidas as barreiras da porta de entrada, normalmente a doença segue duas fases. As leptospiras se multiplicam ativamente no interstício e nos humores orgânicos (sangue, linfa e líquor), caracterizando a leptospiremia. Uma vez a infecção instalada, na próxima fase, pode haver a evolução da doença em hospedeiros sensíveis com o desenvolvimento de imunidade protetora e eliminação do micro-organismo, ou desenvolvimento do estado de portador crônico (ATHANAZIO et al., 2008; FRAGA et al., 2011).
A maioria das complicações de leptospirose está associada com a localização da bactéria no interior dos tecidos durante a fase imune e, assim,
ocorrer durante a segunda semana da doença (LEVETT, 2001).
A grande maioria das infecções causadas por leptospiras são ou subclínica ou de gravidade muito leve, e os pacientes provavelmente não procuram ajuda médica. É de menor proporção infecciosa, se apresentando como uma doença febril de início súbito. Outros sintomas incluem calafrios, cefaleia, mialgia, dor abdominal, derrame conjuntival e, menos frequentemente uma erupção cutânea. Estes sintomas caracterizam a Síndrome Anictérica da leptospirose, e, geralmente, com duração de cerca de uma semana, com a resolução coincidindo com o aparecimento de anticorpos. A dor de cabeça é frequentemente grave, semelhante a que ocorre na dengue, com dor retro-orbital e fotofobia. Mialgia afetando a parte inferior das costas, coxas e panturrilhas são muitas vezes intensas. Em aproximadamente 25% dos casos pode apresentar meningite asséptica. Para diagnosticar devem ser feitos testes contra infecções virais comuns, como gripe e dengue (LEVETT, 2001).
A Síndrome da Leptospirose Ictérica é muito mais grave em que o curso clínico é frequentemente muito rapidamente progressivo. Os casos mais graves possuem uma elevada taxa de mortalidade, que varia entre 5 e 15%. A icterícia
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que ocorre na leptospirose não está associada com a necrose hepatocelular, mas sim pelo nível de bilirrubina no soro estar elevada. Sendo assim, várias semanas podem ser necessárias para normalização. As complicações da forma grave da leptospirose pode enfatizar a natureza multissistêmica da doença. Ela é uma causa comum de insuficiência renal aguda, que ocorre entre 16 e 40% dos casos. A trompocitopenia ocorre em aproximadamente 50% dos casos, podendo ser um marcador para o desenvolvimento da insuficiência renal aguda. No entanto, trombocitopenia na leptospirose é transitória e não resulta
de coagulação intravascular disseminada (LEVETT, 2001). A Síndrome
Hemorrágica grave é reconhecida como uma importante manifestação da doença. Essa síndrome é considerada como um fator prognóstico relevante, já que está associada com os casos fatais de leptospirose, sendo essa a principal causa de morte por leptospirose no Brasil (FRAGA et al., 2011).
A manutenção da bactéria nas regiões urbanas e rurais do Brasil é favorecida pelo clima tropical úmido e uma vasta população de roedores. O crescimento urbano desordenado e a grande quantidade de lixo espalhado sobre as vias e terrenos baldios propiciam também um ambiente ideal para a proliferação da população murina (Ministério da Saúde, 2001).
O controle químico para roedores tem sido utilizado (Centro de Controle de Zoonoses-SP, 2003), mas representa alto custo e não pode ser mantido como intervenção de longo prazo. Entretanto, as intervenções que promovem a utilização de indumentária de proteção, assim como profilaxia com doxiciclina (DE SAINTE MARIE, 2015) são difíceis de implementar em grandes populações de risco. Estratégias de estratificação de risco não foram desenvolvidas para orientar medidas de saneamento e de controle de roedores em populações onde medidas de prevenção não podem ser facilmente implementadas. Em virtude desses motivos, se fazem necessárias estratégias de intervenção mais eficazes, tais como as vacinas.
1.1. Vacina
Vacinas são substâncias, como proteínas, toxinas, bactérias ou vírus
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levam a uma reação do sistema imunológico semelhante a que ocorreria no
caso de uma infecção por um determinado agente patogênico, desencadeando
a produção de anticorpos que acabam por tornar o organismo imune, ou ao
menos mais resistente, a esse agente (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2001).
As vacinas convencionais contra leptospirose, tanto para uso humano quanto veterinário, possuem sucesso limitado, pois falham ao induzir proteção contra a infecção. Ido e colaboradores demonstraram em 1916 que a imunização com leptospiras mortas confere proteção contra infecção em condições experimentais. No entanto, a viabilidade do desenvolvimento de vacinas humanas, especialmente para populações carentes em áreas endêmicas, ainda continua sendo um desafio. Barreiras ao desenvolvimento da vacina incluem a falta de conhecimento dos sorovares localmente circulantes, avaliação da segurança e eficácia da vacina, e custo (GUERRA, 2013). Sendo assim, vacinas seguras e efetivas para leptospirose ainda não estão disponíveis para uso humano.
Embora países como China e Cuba produzam vacinas baseadas em bacterina para utilização em humanos (Yan, 2003; Martinez, 2004), estas vacinas não têm sido licenciadas fora destes países devido a preocupações relacionadas à eficácia em longo prazo, capacidade de proteção cruzada contra a ampla variedade de sorovares e reações adversas (McBRIDE, 2005; KOIZUMI, 2005).
Existe um grande número de sorovares patogênicos, o que impõe uma maior limitação para a produção de uma vacina com componentes multi-sorovar (GAMBERINI et al., 2005). Nas imunizações a resposta gerada é predominantemente humoral e sorovar específica (EVANGELISTA, 2010). Assim, protegem somente contra infecções causadas por sorovares homólogos ou antigenicamente relacionadas.
Estratégias para o desenvolvimento de vacinas de subunidade oferecem uma série de vantagens, tais (i) ausência de reações adversas associadas ao LPS, (ii) possibilidade de indução de resposta de longa duração e (iii) a utilização de proteínas conservadas entre diversos sorovares patogênicos (HAAKE & MATSUNAGA, 2002). Os candidatos vacinais mais promissores são aqueles baseados em subunidades da proteína Lig, as quais induzem níveis de proteção que se aproximam de 100% (YAN et al., 2009; KOIZUMI, 2004). As
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Ligs são proteínas de membrana externa presentes em todos os sorovares de leptospiras patogênicas e a expressão destas proteínas ocorre somente durante a infecção (MATSUNAGA et al., 2003; KOIZUMI, 2004).
1.2. Leptospiral immunoglobulin-like (Lig)
Fatores de virulência expressos durante a infecção do hospedeiro são esperados para ativar respostas de anticorpos específicos e, portanto, podem servir como marcadores candidatos para um teste de diagnóstico sorológico à base de proteína recombinante. A nova família de proteínas associadas à superfície, imunoglobulina Leptospira (Ig) proteínas (Liga, LigB, e LigC) foram identificados (PALANIAPPAN et al, 2002; CRODA et al, 2007).
Essas proteínas são expressos durante a infecção do hospedeiro e parecem induzir fortes respostas de anticorpos em pacientes e animais infectados (CRODA et al, 2007).
Três proteínas Lig foram descritas, designadas LigA, LigB, e LigC que estão envolvidos na adesão de leptospira a proteínas de matriz extracelular e proteínas do plasma, incluindo colagénios I e IV, laminina, fibronectina e fibrinogénio são induzidas a osmolaridade fisiológica. As proteínas Ligs têm domínios repetidos in tandem do tipo BIg (bacterial immunoglobulin-like) de 90 aminoácidos, os quais são encontrados em fatores de virulência como intimina
e invasina.O número de domínios BIg varia de 12 a 13 em função da proteína
Lig. LigB e LigC tem uma região carboxi-terminal, a qual não está presente em LigA. Os genes lig estão presentes em todas as espécies patogênicas e não estão presentes em leptospiras saprófitas. A expressão de lig está ligada à virulência das cepas de Leptospira e as proteínas são super-expressas durante a infecção (Lehmann et al, 2014). Assim, as proteínas Lig parecem estar intimamente associadas à infecção do hospedeiro mamífero, sugerindo que eles podem ser imunógenos protetores (CHOY, 2007).
Alguns dados preliminares indicam seu potencial no desenvolvimento de vacinas recombinantes contra leptospirose, pois são proteínas de membrana externa presentes em todos os sorovares de leptospiras patogênicas e a expressão destas proteínas ocorre somente durante a infecção (MATSUNAGA et al., 2003; KOIZUMI; WATANABE, 2004). O nosso grupo inicialmente
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demonstrou que um único fragmento, LigA(625-1224aa), o qual corresponde aos seis domínios carboxi-terminais da molécula LigA, conferiram imunoproteção contra mortalidade (67-100%, P <0.05) em hamsters que receberam dose letal da cepa Fiocruz L1-130. Dados recentes do nosso grupo demonstraram que a imunização com fragmentos de LigA(625-1224aa) conferiram proteção 90-100% contra desafio letal por via intramuscular e subcutânea com 20ug de proteína formulada com adjuvante Hidróxido de Alumínio, contudo falhou em conferir imunidade estéril (MEDEIROS et al., 2006).
1.3. Adjuvantes
Adjuvantes (do latim adjuvare, que significa "para ajudar ou auxílio"), foram descritas pela primeira vez por Ramon como "substâncias utilizadas em combinação com um antígeno específico que produziu uma resposta imunológica mais robusta do que o antígeno sozinho" (RAMON, 1924 – citado em AWATE S. et al, 2013). Adjuvantes imunológicos são substâncias capazes de aumentar a resposta imunológica específica e auxiliar o antígeno a desencadear uma resposta precoce, elevada e duradoura (MOTA, 2006; RESENDE, 2004).
Como os antígenos constituídos por proteínas recombinantes apresentam estrutura e conformação menos complexas do que os agentes patogênicos inativados, a utilização de adjuvantes é necessária para aumentar a imunogenicidade dessas proteínas. (AUDIBERT, 2003; RESENDE, 2004).
Os adjuvantes apresentam diversos mecanismos de ação e devem ser selecionados baseados na rota de administração e na imunidade requerida pelo tipo de vacina. De acordo com alguns estudos, vem sendo descrito que os melhores componentes para serem utilizados como adjuvantes incluem extratos de parede bacteriana, óleos de parafinas, sais de metais, endotoxinas, e recentemente, lipossomos, Interferon, entre outros (RESENDE, 2004; RUSH, 2000).
Os adjuvantes têm sido tradicionalmente usados para aumentar a magnitude de uma resposta imune adaptativa a uma vacina, com base no título de anticorpo ou na capacidade de prevenir a infecção. Além disso, um segundo
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papel tornou-se cada vez mais importante: os adjuvantes podem ser utilizados para direcionar a resposta adaptativa, de modo a produzir formas mais eficazes de imunidade para cada patógeno específico. Os adjuvantes são atualmente utilizados para: (I) aumentar a resposta a uma vacina na população em geral; (II) aumentar as taxas de soroconversão em populações com reduzida capacidade de resposta devido à idade, doença, ou por medidas terapêuticas; (III) facilitar o uso de doses menores de antígeno; e (IV) permitir imunização com menos doses de vacina. Para vacinas atualmente em desenvolvimento, os adjuvantes são cada vez mais utilizados para promover tipos de imunidade que não podem ser geradas somente pelo antígeno. (COFFMAN et al., 2010).
Evidências sugerem que os adjuvantes possuem um ou mais dos seguintes mecanismos para induzir respostas imunitárias: (I) liberação prolongada de antígeno no local da injeção; (II) up-regulation de citocinas e quimiocinas; (III) recrutamento celular no local da injeção; (IV) aumento da absorção de antígenos e apresentação do antígeno pelas células apresentadoras de antígeno (APC); (V) de ativação e maturação de APC,
aumento da expressão de moléculas do complexo principal de
histocompatibilidade (MHC) classe II e de moléculas co-estimulatórias (AWATE et al., 2013).
Com a utilização de adjuvantes, a resposta imunológica pode ser modulada seletivamente entre o Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) Classe I ou Classe II, e resposta tipo T helper1 (Th1), que é muito importante para formação de resposta protetora contra patógenos intracelulares, ou resposta tipo T helper2 (Th2), que se direciona para antígenos e micro-organismos extracelulares (RESENDE, 2004).
O Hidróxido de Alumínio (Al(OH)3) continua sendo o adjuvante mais
utilizado nas vacinas para humanos, contribuindo na indução de uma boa resposta do tipo Th2. Entretanto, ele possui uma capacidade limitada na estimulação da resposta imunológica celular Th1, importante para a proteção
contra diversos patógenos (HOGENESCH, 2002; RESENDE, 2004).
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O Ensaio Imunoenzimático (do inglês: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay, ELISA) foi desenvolvido como uma alternativa ao radioimunoensaio para a detecção de antígenos e anticorpos. O seu princípio básico é a imobilização de um dos reagentes em uma fase sólida, enquanto outro reagente pode ser ligado a uma enzima, com preservação tanto da atividade enzimática como da imunológica do anticorpo.
O teste detecta quantidades extremamente pequenas de antígenos ou anticorpos, podendo ter elevada precisão se os reagentes e os parâmetros do ensaio forem bem padronizados. Especial atenção deve ser dada ao material utilizado na produção da placa, cujas propriedades podem variar de acordo com a composição. O grau de pureza do antígeno ou do anticorpo que será disposto também é muito importante, pois qualquer material heterólogo competirá pelo espaço na placa. O objetivo do ensaio é a quantificação ou verificação da presença de um antígeno ou anticorpo (FERREIRA et al., 1996).
Devido à técnica do ELISA ter um alto nível de sensibilidade e reprodutibilidade e permitir automação, tornou-se um método de eleição para avaliação de um grande número de amostras. Existem vários tipos de ELISA sendo eles do tipo direto, indireto, duplo sanduíche. (VAZ et al., 2007).
Alguns problemas podem dificultar a padronização do ELISA, tais como: (I) alto background, (II) leituras superestimadas por ligações inespecíficas, (III) lavagens inadequadas, (IV) conjugado com baixa afinidade, entre outros (REIS, 2000). Por outro lado, trata-se de um teste rápido e de baixo custo, altamente sensível, que possui segurança por não utilizar o patógeno vivo. Ademais, sua análise é de fácil execução, possui objetividade da interpretação dos resultados (TOMICH, 2009) além da estabilidade e necessita de um pequeno volume de reagentes, podendo ser utilizado para estudos epidemiológicos (TIZARD,1998).
1.4. Teste de avidez
A afinidade do anticorpo por um antígeno pode ser definida como a força da ligação de um único tipo de anticorpo, tal como um anticorpo monoclonal, a um único alvo antigênico. (MURPHY et al., 2010)
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A avidez é uma medida da estabilidade global do complexo entre anticorpo e antígeno. A força total de uma interação antígeno-anticorpos é governada por três elementos principais: a afinidade intrínseca do anticorpo com o epítopo, a valência do anticorpo e antígeno, e o arranjo geométrico dos componentes que interagem. Em soro humano, a população de anticorpos é policlonal (heterogênea), e a determinação da afinidade dos anticorpos não é possível. No entanto, adaptações no conceito de afinidade foram feitas, e a determinação da estabilidade na interação antígeno-anticorpo em uma população mista de anticorpos foi denominada determinação da avidez do anticorpo. Quanto mais heterogênea é a população de anticorpos, mais difícil é estabelecer uma verdadeira medida da avidez. A população de anticorpos ideal para determinação seria uma população homogênea. Nesta situação, uma estimativa exata da constante de afinidade é determinada. (HARLOW, 1998).
Foram descritas diferentes metodologias utilizadas para a determinação da avidez de um anticorpo e avanços recentes na medição da avidez do anticorpo possibilitam a aplicação de tais medições para um grande número de soros, tais como os obtidos durante um teste de vacina (GOLDBLATT, 1997; ROMERO-STEINER et al., 2005). Assim, agentes caotrópicos, tais como Uréia, Tiocianato ou Dietilamina (DEA), estão sendo preferidos para a determinação da estimativa média da avidez do anticorpo por serem considerados métodos mais simples. O uso dos agentes caotrópicos é baseado na dissociação do complexo antígeno-anticorpo de baixa avidez enquanto os de alta avidez continuam associados (ROMERO-STEINER et al., 2005). Admite-se que o Tiocianato age sobre as ligações hidrofóbicas, e que a Uréia age nas ligações de hidrogênio (ANTTILA et al., 1998). A Dietilamina (DEA) tem ação associada ao pH da solução (GOLDBLATT, 1997).
A ressonância plasmônica de superfície (do inglês: surface plasmon ressonance) é uma metodologia utilizada para detectar adsorção molecular, e em ensaios imunológicos utiliza antígenos ligados a uma placa de metal e os anticorpos mono ou policlonais reativos para esse antígeno. Através das constantes de dissociação e cinética obtidas, também podem mensurar a avidez de um determinado anticorpo. Esse teste deve ser utilizado em conjunto com o ensaio de ELISA e/ou outras técnicas associadas (LYNCH, 2014).
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2. Justificativa e relevância
A leptospirose é uma doença de notificação compulsória no Brasil. É uma zoonose de elevada incidência no país, com uma média de 13.000 casos notificados por ano, sendo mais de 4.000 casos confirmados entre os anos de 2000 e 2013 em todo o país, possuindo letalidade média de 10,8% (SINAN, 2014). A necessidade crítica de novas estratégias de intervenção é uma prioridade em saúde pública a fim de prevenir desfechos graves da doença. A mortalidade da leptospirose é alta mesmo sob tratamento de suporte intensivo (LEVETT, 2001; BHARTI et al., 2003; MCBRIDE et al., 2005).
O uso de vacinas é uma estratégia com custo-benefício potencialmente positivo para a prevenção da leptospirose. A Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz) identificou uma nova família de fatores putativos de virulência: as proteínas Ligs. Resultados do grupo demonstraram evidências de que as proteínas Ligs conferem proteção contra desafio letal em modelo experimental para leptospirose e, assim são candidatos potenciais para uma vacina de subunidade. Porém, para as vacinas com proteínas recombinantes é necessária a utilização de adjuvantes para potencializar a resposta imunológica e assim, serão testados diferentes adjuvantes, incluindo o Hidróxido de Alumínio.
Como é sabido, a resposta imunológica mediada por este adjuvante é principalmente a resposta humoral (SCHIRMBECK et al., 1994), e assim, se faz necessário a avaliação quantitativa e qualitativa dos anticorpos produzidos a partir de uma formulação contendo este adjuvante (RESENDE, 2004). Não existem medidas efetivas de controle que possam ser oportunamente implementadas em comunidades carentes. Logo, a produção de uma vacina eficaz para tal doença, seria a melhor opção para prevenção da mesma.
Para isso, diversos testes são necessários para que uma vacina eficiente possa ser liberada para uso em seres humanos, e para tal é importante avaliar o tipo de resposta associada (celular ou humoral). Neste trabalho, utilizaremos o teste de ELISA com o qual poderemos determinar os tipos e a qualidade dos anticorpos produzidos pelos animais imunizados a partir de uma formulação vacinal, já que o Hidróxido de Alumínio estimula a resposta humoral.
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Os testes baseados na técnica de ELISA precisam ser padronizados antes de serem avaliadas as respostas nos camundongos, a fim de controlar as variações que possam ocorrer durante o teste.
Os padrões de referência para considerar que um teste baseado em ELISA seja realmente confiável devem permitir determinar a atividade do anticorpo a um nível específico de sensibilidade do teste. Para estabelece-los para qualquer ELISA, deve-se considerar a seleção de padrões que representam, em média, o que se espera de uma resposta imunológica do organismo em questão. Devem-se considerar também, os isotipos de anticorpos, concentração e avidez, bem como a especificidade antigênica (WRIGHT et al, 1993).
A avidez de um anticorpo vem sendo demonstrada como uma característica importante da resposta imune de proteção (BORROW, 2001; BORROW 2003; SOUTHERN, 2004; HARRIS, 2007). Imunologicamente, a seleção constante de clones de células B é responsável pelo aumento progressivo de anticorpos de alta avidez. As células produtoras de anticorpos de baixa afinidade vão sendo selecionadas negativamente por apoptose no folículo e, as que produzem anticorpos de alta afinidade vão se acumulando no centro germinativo, onde serão selecionadas para se tornarem células de memória (TARLINTON & SMITH, 2000).
Com esse estudo pretende-se avaliar a força de interação entre o anticorpo produzido e o antígeno recombinante, a fim de determinar a avidez deste anticorpo. Com anticorpos eficientes, espera-se ter uma resposta imunológica também eficaz. Sabendo disso, iremos utilizar uma formulação vacinal para imunizar os camundongos a fim de obtermos o soro padrão, e a partir dele padronizaremos a técnica. Estes resultados contribuirão, no futuro, para a escolha de formulações vacinais mais eficazes.
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3. Objetivos
a) Objetivo geral: Padronizar um ensaio imunoenzimático para determinar o índice de avidez de anticorpos murinos direcionados contra o fragmento recombinante da proteína LigA(625-1224aa) de Leptospira sp.
b) Objetivos específicos:
Determinar a concentração de antígeno pra sensibilização da placa;
Determinar o tempo de bloqueio da placa;
Determinar diluição do soro padrão e do conjugado; Determinar o tempo de revelação da reação;
Avaliar a interferência do Tiocianato de Amônio na
sensibilização da placa;
Avaliar a interferência do Tiocianato de Amônio na ligação antígeno-anticorpo (avaliação da avidez);
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4. Métodos
4.1. Produção de soro hiperimune
Este projeto cumpre todos os requisitos da Comissão de Ética em Experimentação Animal - PROTOCOLO - CEUA LW-18/13. Sendo assim, trinta camundongos da linhagem BALB/c, fêmeas, com idade entre 4 e 6 semanas, foram imunizados com 10 μg de LigA(625-1224aa) adsorvida em 0,1 mg de Hidróxido de Alumínio (Al(OH)3; Alhydrogel®, Brenntag).
Os animais receberam três doses da formulação vacinal, pela via intramuscular, com intervalo de sete dias entre cada inoculação. Sete dias após a terceira dose, os animais receberam uma dose de reforço, pela via intraperitoneal, com 10 μg de LigA(625-1224aa) sem adjuvante. Três dias após o reforço, os camundongos foram submetidos à punção cardíaca e eutanásia.
Os tubos contendo o sangue dos camundongos foram centrifugados por 10 minutos a 1000 x g. Após a centrifugação, o soro foi aliquotado e armazenado a -20ºC. Ressalta-se que os procedimentos experimentais foram avaliados e aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da FIOCRUZ/RJ, protocolado com a numeração P-63/12-2 (Anexo 1).
4.2. Padronização ELISA
4.2.1. Concentração de antígeno na placa / Tempo de bloqueio
Foram utilizados 100ng da proteína recombinante LigA 625-1224aa para a sensibilização das placas de 96 poços (NuncMaxiSorp®). Essas placas foram incubadas overnight de 2º-8ºC. No dia seguinte, foram lavadas quatro vezes utilizando tampão de lavagem; Tampão fosfato (PBS)/Tween 20 0,05% pH 7,2 (PBS-T).
O tempo de bloqueio foi testado, incubando as placas com tampão de bloqueio (PBS-T, BSA 3%, soro bovino e leite) por uma hora e outra placa por
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duas horas. As placas foram então bloqueadas e lavadas com tampão de lavagem.
4.2.2. Diluição do soro padrão e determinação do tempo ideal de revelação com TMB
Uma diluição seriada do soro padrão, na faixa de 1:100 a 1:104.857.600 foi realizada, seguindo o protocolo do ELISA, para determinar a diluição correspondente a uma DO de aproximadamente 1,0 a um comprimento de onda de 450nm.
As placas em seguida foram lavadas com tampão de lavagem; Tampão fosfato (PBS)/Tween 20 0,05% pH 7,2 (PBS-T); e incubadas com conjugado anti-IgG de camundongo produzido em coelho associado à peroxidase - Sigma, e utilizada a diluição de 1:30000 (de acordo com o fabricante) por uma hora a 37ºC.
A reação foi revelada utilizando TMB (Life Technologies) e, em um primeiro teste a placa foi revelada após 5 minutos. Esse tempo de revelação posteriormente foi testado e assim, foram utilizados os tempos de revelação da placa, com leitura após 10, 15 e 20 minutos de incubação.
Após esses tempos, a reação foi parada com a adição de Ácido Sulfúrico 2N e a leitura foi feita no comprimento de onda 450nm, na leitora de placas TECAN. Com os parâmetros analisados e padronizados, seguimos para a próxima fase.
4.3. Padronização do teste de Avidez
4.3.1. Interferência do Tiocianato de Amônio na sensibilização das placas
As placas de ELISA (NuncMaxiSorp®) foram sensibilizadas com a concentração de antígeno definida no item 4.2.1, diluídos em tampão de sensibilização. As placas foram incubadas overnight de 2º-8ºC, e no dia seguinte, lavadas utilizando PBS-T. Em seguida, foi adicionado o tampão de bloqueio e a placa foi incubada à 37ºC, de acordo com o tempo definido no item 4.2.1. As placas foram lavadas novamente com tampão de lavagem, e
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então foi adicionada a etapa com a agente caotrópico, Tiocianato de Amônio, a fim de testar a interferência deste na sensibilização da placa. Foram utilizadas diferentes molaridades do Tiocianato de Amônio, sendo elas: 2M, 1,5M, 1M, 0,5M, 0,25M, 0,12M, 0,06M; que foram diluídas em Tampão Fosfato com soro bovino a 0,3% (PBS-BSA 0,3%) e avaliadas em quadruplicata. A placa foi incubada por 15 minutos a temperatura ambiente.
Em seguida, as placas foram lavadas quatro vezes com tampão de lavagem e seguimos o protocolo do ELISA normalmente. As placas foram incubadas com o soro padrão, na diluição inicial definida no item 4.2.1, e foi feita diluição seriada. As placas foram incubadas por 1 hora a 37º C, lavadas com tampão de lavagem e incubadas com anticorpo secundário (anti-IgG de camundongo produzido em coelho associado a peroxidase - Sigma) na concentração definida no item 4.2.3, por 1 hora a 37ºC. Após lavagem da placa, o substrato TMB foi adicionado. As placas foram incubadas no tempo definido pelo item 4.2.3 à temperatura ambiente na ausência de luz, e a reação foi paralisada com Ácido Sulfúrico 2M e a absorbância foi determinada a 450nm. Esse teste foi feito para verificar a concentração de Tiocianato de Amônio capaz de desfazer a ligação antígeno-anticorpo sem afetar a sensibilização da placa.
4.3.2. Teste para definição da concentração ideal de Tiocianato de Amônio capaz de reduzir em 50% a ligação antígeno-anticorpo para a determinação do índice de avidez (IA)
As placas de ELISA (NuncMaxiSorp®) foram sensibilizadas com a concentração de antígeno definida no item 4.2.1, diluídos em tampão de sensibilização. As placas foram incubadas overnight de 2º-8ºC, e no dia seguinte, foram lavadas utilizando tampão de lavagem. Em seguida, foi adicionado o tampão de bloqueio e procedeu-se a incubação à 37ºC de acordo com o tempo definido no item 4.2.1.
As placas foram lavadas com tampão de lavagem, e incubadas por 1h a 37°C com soro padrão e novamente lavadas com tampão de lavagem. Em seguida, foram incubadas com Tiocianato de Amônio, em diferentes
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concentrações, por 15 minutos à temperatura ambiente. As placas foram lavadas com tampão de lavagem e incubadas com anticorpo secundário em concentração definida no item 4.2.3, durante 1 hora a 37ºC. Após lavagem, o substrato TMB foi adicionado, e as placas incubadas pelo tempo definido no item 4.2.3, à temperatura ambiente e na ausência de luz. A reação foi paralisada com Ácido Sulfúrico2M e a leitura da DO a 450nm.
Esse teste foi feito para determinar qual a diluição do soro onde se observa uma redução de 50% na ligação antígeno-anticorpo, que foi visualizada a partir da diferença de densidade óptica (DO).
4.3.3. Análise dos dados
Os dados do ELISA foram obtidos através do programa SoftMaxPro – Molecular Devices, o qual determina os títulos de IgG total em EU/mL baseados na diluição da amostra e na DO obtida.
O índice de avidez (IA) foi obtido pela razão da concentração de IgG total da amostra incubada com Tiocianato de Amônio pela amostra sem o agente caotrópico multiplicado por 100, como mostra a fórmula abaixo, cujo resultado é dado em porcentagem.
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5. Resultados
5.1. Padronização do ELISA
5.1.1. Concentração de antígeno na placa / Tempo de bloqueio
Para determinação da concentração da proteína LigA(625-1224aa) utilizada na sensibilização das placas durante o teste com as três concentrações do antígeno foram realizadas uma diluição seriada do soro do camundongo.
As concentrações do antígeno testadas não se mostraram muito diferentes, e por esta razão, foi escolhido utilizar a concentração de 100ng uma vez que a utilização de uma baixa concentração de antígeno pode acarretar na perda da sensibilidade do teste, e também evitar reações inespecíficas devido a uma maior concentração do mesmo (Tabela 1).
Tabela 1: Média da densidade óptica obtida na leitura das diferentes concentrações do antígeno utilizando a diluição seriada do soro padrão.
Ao serem testados dois tempos diferentes para o bloqueio da placa, foi observado que o tempo de bloqueio de duas horas leva a uma diminuição do background da reação. Diluição seriada 50ng (Média da DO) 100ng (Média da DO) 200ng (Média da DO) 1 / 100 1,96 2,15 2,28 1 / 200 1,41 1,60 1,90 1 / 400 0,98 1,11 1,26 1 / 800 1,00 1,00 0,97 1 / 16000 0,56 0,69 0,56 1 / 32000 0,26 0,36 0,40 1 / 64000 0,39 0,39 0,28
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5.1.2. Diluição do soro padrão e determinação do tempo ideal de revelação com TMB
A partir dos resultados obtidos no item 5.1.1, foi necessário avaliar a melhor diluição do soro que alcance a DO entre 0,8 e 1,0 à 450nm. Essa DO é desejada, pois acima é formado um platô que não pode ser utilizado para o cálculo, que analisa a faixa linear da curva. Após a incubação com o conjugado a reação do TMB foi interrompida após 5 minutos. Com esse experimento foi observado que a melhor diluição inicial foi estabelecida entre 1:800 e 1:1600, mas o tempo para revelação não se mostrou satisfatório pois a faixa de DO não foi obtida de acordo com o previsto.
Então, o ELISA foi feito repetido, e seguindo o protocolo, foi feita diluição seriada do soro a partir de 1:1000, mas ao adicionar o TMB, foram feitas leituras com intervalos de 5 minutos, sem utilizar o Ácido sulfúrico para parar a reação, até completar 20 minutos. Ao interromper a reação foi visto que na diluição de 1:2000 do soro padrão o tempo necessário para que a reação alcançasse a DO 1,0 foi de 20 minutos. Desta forma o teste de ELISA foi padronizado utilizando-se a diluição de 1:2000 do soro padrão com tempo de revelação de 20 minutos.
5.2. Padronização do Teste de Avidez
5.2.1. Interferência do Tiocianato de Amônio na sensibilização das placas
Após padronizar o teste de ELISA indireto, iniciaram-se os testes para padronização do teste de avidez utilizando o soro padrão. O Tiocianato de Amônio além de dissociar as ligações antígeno-anticorpo pode interferir na ligação do antígeno com a placa de poliestireno. Assim, era necessário definir a concentração a partir da qual o agente caotrópico não interfere na ligação da proteína recombinante com a placa.
Ao comparar a DO obtida a partir da reação sem o Tiocianato de Amônio com a DO da reação que utilizou o agente caotrópico não foi observada uma diferença significativa entre as concentrações abaixo de 1M de Tiocianato
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(Figura 1). Todas as concentrações superiores comprometeram a sensibilização das placas acarretando na dissociação do antígeno.
Figura 1: Análise da interferência do Tiocianato de Amônio, em diferentes concentrações, na sensibilização da placa.
5.2.2. Teste para definição da concentração ideal de Tiocianato de Amônio capaz de reduzir em 50% a ligação antígeno-anticorpo para a determinação do índice de avidez (IA)
Com os parâmetros do ELISA determinados, seguimos para a identificação da concentração de Tiocianato de Amônio que reduz em 50% a ligação antígeno-anticorpo. Após vários testes, optou-se por utilizar as concentrações de 0,47M, 0,45M, 0,43M e 0,4M. O experimento demonstrou que a concentração capaz de reduzir em 50% a ligação antígeno-anticorpo e ao mesmo tempo não interferir na sensibilização das placas foi de 0,4M (Figura 2). 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 5M 4M 3M 2M 1,5M 1M 0,8M 0,75M 0,7M 0,5M 0,35M Mé di a da D O Concentração do Tiocianato
Interferência do Tiocianato de Amônio na sensibilização
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Figura 2: Confirmação da concentração de Tiocianato de Amônio que reduz em 50% a ligação antígeno-anticorpo.
A partir deste dado, foi feito outro teste utilizando apenas a concentração de 0,4M para determinar uma faixa de aceitação do soro padrão (Figura 3 e Tabela 2), levando em consideração o desvio padrão. Esse dado será utilizado posteriormente.
Ao fazer as análises através do programa SoftMax Pro, foi obtida uma faixa de aceitação do soro padrão entre 41,39% e 53,72% (desvio padrão: 6,16).
Tabela 2: Valores de Índices de Avidez das repetições com Tiocianato de Amônio (0,4M) Teste 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 I.A (%) 47,56 55,64 51,84 58,19 45,68 40,62 45,66 45,38 46,61 38,36 0,47M 0,45M 0,43M 0,4M I.A (%) 39,38676374 44,60227485 44,19696587 49,66478991 0 10 20 30 40 50 60 índi ce de avi dez (%)
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Figura 3: Repetição do teste de avidez utilizando a concentração de 0,4M de Tiocianato de Amônio para obtenção da faixa de aceitação do soro padrão.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ín d ic e d e avi d ez (% ) repetições do teste
Teste da concentração
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6. Discussão e conclusão
A necessidade de mostrar a qualidade dos métodos de análises laboratoriais está sendo cada vez mais exigida na avaliação da resposta imunológica. Para garantir que essa avaliação gere informações viáveis sobre a amostra ela deve passar por uma etapa de padronização.
O teste de ELISA é considerado um teste altamente sensível (menor risco de falso-negativo) e específico (menor risco de falso-positivo) além de ser um teste barato e tem a possibilidade de testar várias amostras ao mesmo tempo, porém, alguns reagentes são suscetíveis a degradação com facilidade. Por ser uma técnica sensível e específica, ela está sujeita a erros de pipetagem, variações no tempo de incubação e lavagem, e alterações nos reagentes (DULL, 1976). Para a padronização do teste de ELISA foram utilizadas as concentrações e diluições determinadas na literatura como ponto inicial da pesquisa.
Os ensaios de avidez dos anticorpos fornecem uma ferramenta de laboratório baseado em ELISA para a avaliação da atividade funcional do anticorpo. É sabido que quanto mais heterogênea é a população de anticorpos, mais difícil é de estabelecer uma medida confiável da afinidade dos mesmos, sendo o ideal uma população homogênea para tal (ROMERO-STEINER et al., 2001).
Goldblatt (1997) mostrou que a utilização de diferentes agentes para verificar a avidez de um anticorpo frente ao seu antígeno não mostraria diferença quanto ao resultado do índice de avidez. Logo, a escolha do Tiocianato de Amônio foi feita visto que outros estudos experimentais que são realizados em Bio-manguinhos o utilizam.
Agentes caotrópicos, tais como Tiocianato de Sódio ou de Amônio, têm sido amplamente utilizados para a dissociação ou interferência de ligação da reação antígeno-anticorpo, permitindo que apenas os anticorpos com avidez mais elevada permaneçam ligados ao antígeno alvo. A base desta interação é dependente da concentração do composto do agente caotrópico de interferir com as interações eletrostáticas que mantêm o complexo antígeno-anticorpo. Quanto maior for a avidez dos anticorpos na amostra de soro, mais forte é a ligação antígeno-anticorpo formada, e, por conseguinte, uma concentração
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maior de Tiocianato de Amônio é necessária para quebrar ou evitar a formação de tais complexos antígeno-anticorpo. Existem três formas de se obter a avidez de um anticorpo, tais como, utilização crescente do agente caotrópico e diluição fixa do soro, utilização de uma única concentração do agente e variação da diluição do soro, e competição entre o anticorpo presente no soro e o agente caotrópico que são adicionados concomitantemente em contato com o antígeno (ROMERO-STEINER et al., 2005).
Para avaliar a concentração do agente caotrópico capaz de reduzir em 50% a ligação antígeno-anticorpo utilizamos o teste que fixa a diluição do soro, capaz de permitir um intervalo de DO entre 0,8 e 1,0, e uma diluição seriada do agente caotrópico. Tal metodologia será utilizada para análise de amostras posteriores, pois é capaz de detectar mais eficientemente as amostras com baixa e alta avidez (ROMERO-STEINER et al., 2005).
Gray and Saw (1993) relataram a presença de artefatos durante a dissociação usando concentrações mais baixas do Tiocianato de Amônio em um método para o polissacarideo pneumococal. Sendo assim, Romero-Steiner et al (2005) observaram que a utilização de uma única concentração de agente caotrópico elimina estes potenciais vieses no cálculo do índice de avidez. Foi escolhida a utilização do modelo que fixa a diluição do Tiocianato de Amônio e varia a diluição do soro, pois altas concentrações de anticorpo podem levar a uma alta avidez e com isso necessitam de uma concentração maior do Tiocianato de Amônio, entretanto esta alta concentração do agente pode acarretar na dissociação do antígeno sensibilizado na placa.
Métodos tradicionais de ELISA podem não detectar interações de baixa afinidade com taxas de dissociação rápida e esses dados podem ser menos confiáveis. Nestes ensaios tradicionais, um índice de avidez relativo é calculado após a dissociação de anticorpos de baixa avidez. Uma advertência notável associada com os ensaios que utilizam agentes de dissociação é que os anticorpos que se ligam a epítopos conformacionais podem ser mais facilmente dissociados do seu complexo ligado devido a alterações na conformação de epítopo. Essas alterações podem não refletir corretamente a força de ligação inerente (LYNCH, 2014). De acordo com nossos resultados, onde tivemos uma faixa de aceitação de 41,39% a 53,72%, se configurando um bom resultado. Entretanto, devido a todas as possíveis limitações técnicas já
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citadas, outras técnicas deveriam ser associadas, como Surface Plasmon Resonance (SPR), que permitiria embasar melhor os resultados obtidos se avaliado em conjunto com o ELISA. Além disso, de acordo com estudo de Kasturi et. al (2011), para análise da quantidade e qualidade dos anticorpos produzidos na avaliação do desenvolvimento de vacinas associadas à adjuvantes, outras técnicas associadas ao estudo também devem ser avaliadas. No nosso caso, a avaliação de citocinas e interleucinas seria este componente adicional do estudo.
Existe a necessidade da avaliação da qualidade de anticorpos produzidos frente a diferentes formulações vacinais para a proteína recombinante LigA(625-1224aa). Este projeto está inserido dentro de um projeto maior, onde serão testadas diferentes formulações vacinais, utilizando esta proteína recombinante combinada com diferentes adjuvantes, e para este fim, a padronização do ensaio imunoenzimático para determinação do índice de avidez destes anticorpos foi necessária, pois será utilizada como base para a avaliação da qualidade dos anticorpos gerados a partir dessas diversas formulações vacinais.
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8. Anexo
