DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA DE ALIMENTOS
ESTUDO PARA MINIMIZAR AS PERDAS DE FLAVONÓIDES
DURANTE A FERMENTAÇÃO DE SEMENTES DE CACAU
PARA PRODUÇÃO DE CHOCOLATE
Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas para obtenção do título de Mestre em Tecnologia de Alimentos.
PRISCILLA EFRAIM Engenheira de Alimentos
Prof. Dr. NELSON HORACIO PEZOA GARCÍA Orientador
Dra. DENISE CALIL PEREIRA JARDIM Co-orientadora
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DA F.E.A. – UNICAMP
Efraim, Priscilla
Ef77e Estudo para minimizar as perdas de flavonóides durante a fermentação de sementes de cacau para produção de chocolate / Priscilla Efraim. – Campinas, SP: [s.n.], 2004.
Orientador: Nelson Horacio Pezoa Garcia Co-orientador: Denise Calil Pereira Jardim
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas – Faculdade de Engenharia de Alimentos.
1.Cacau. 2.Chocolate. 3.Flavonóides. 4.Fermentação. 5.Enzimas – Inibidores. I.Pezoa Garcia, Nelson Horacio. II.Jardim, Denise Calil Pereira. III.Univerisdade Estadual de Campinas.Faculdade de Engenharia de Alimentos. IV.Título.
____________________________________________
Prof. Dr. Nelson Horacio Pezoa García
Universidade Estadual de Campinas
Orientador____________________________________________
Prof
a. Dra. Délia Rodriguez Amaya
Universidade Estadual de Campinas Membro
__________________________________________
Prof
a. Dra. Hilary Castle de Menezes
Universidade Estadual de Campinas Membro
____________________________________________
Prof
a. Dra. Marisa de Nazaré Hoelz Jackix
Universidade Estadual de Campinas Membro
Dedico aos meus pais, Betty e Simão, pela enorme importância em minha vida, pelo apoio constante, por toda dedicação, carinho e amor.
“Conhecer não é o ato através do qual um sujeito transformado em objeto recebe dócil e passivamente os conteúdos que o outro lhe dá ou lhe impõe. O conhecimento pelo contrário, exige uma presença curiosa do sujeito em face do mundo. Requer sua ação transformadora. Demanda uma busca constante. Implica invenção e reinvenção.”
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, que certamente me acompanhou e me acompanhará sempre, por toda minha vida e em todos os momentos;
Ao Professor Horacio e a Denise, orientadores maravilhosos, que não apenas auxiliaram e participaram do trabalho científico, como também me proporcionaram grandes exemplos de vida (de integridade, amizade e perseverança);
Ao Beto, por todo carinho, ajuda e amor;
Às minhas queridas amigas/irmãs Bin, Ju e Ka, que já fazem parte da minha vida há muito tempo (graças a Deus!);
À Professora Eva Magalhães, pelo grande apoio no início do trabalho, pelo carinho e atenção;
À Amanda por toda ajuda durante o trabalho; À Nádia e ao Adauto pela grande ajuda e amizade;
À Marinalda, e à pesquisadora Maria Luiza Tucci pela experiente e valiosa colaboração;
Ao pessoal do CEREAL CHOCOTEC (Ana Lúcia, Marise, Luccas, Fernanda, Cris, Ana Elisa, Lu, Magali, Marquinhos, Marina, Lindalva) por todo apoio, ajuda, carinho;
Ao Mauro e Eliana Coelho, que forneceram os frutos utilizados no trabalho;
Ao pessoal do Laboratório de Frutas (Aninha, Pri, Alê, Ana Vânia, Fer, Rafa, Dani, Elisângela, Joyce, Marcus);
Ao Renato e ao Professor Marcos Eberlin por todo auxílio e por ceder o equipamento do Laboratório Thomson de Espectrometria de Massas;
À Profa. Hélia e ao Cláudio Aguiar por toda ajuda no início do trabalho;
Ao Rodrigo pela valiosíssima amizade; ao Gonzaga pelo maravilhoso alto astral; À CAPES pelo apoio financeiro;
ÍNDICE GERAL
RESUMO... xiii SUMMARY ...xv 1. INTRODUÇÃO ... 1 2. OBJETIVOS ... 5 2.1 Objetivo geral... 5 2.2 Objetivos específicos ... 5 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 63.1 Situação mundial da cacauicultura ... 6
3.1.1 Perspectivas para o cacau brasileiro... 8
3.2 O Cacau... 9
3.2.1 Aspectos Gerais... 9
3.2.2 Valor Ecológico ... 10
3.2.3 Variedades ... 10
3.2.4 As sementes de cacau Forastero... 12
3.3 Pré-processamento do cacau ... 14
3.3.1 Quebra dos frutos... 14
3.3.2 Fermentação ... 14
3.3.3 Secagem ... 19
3.3.4 Torração... 19
3.4 Processamento do Chocolate... 20
3.4.1 Mistura dos ingredientes ... 20
3.4.2 Refino... 21
3.4.3 Conchagem... 21
3.5 Compostos Fenólicos ... 22
3.5.1 Polifenóis... 22
3.5.2 Polifenóis do cacau ... 30
3.6 Enzimas presentes no cacau... 34
3.7.1 Efeito antioxidante dos polifenóis do cacau ... 37
3.7.2 Inibição da ativação e função das plaquetas... 38
3.7.3 Manteiga de cacau: a principal gordura do chocolate ... 39
3.7.4 Possíveis efeitos negativos do cacau e do chocolate à saúde... 39
4. MATERIAL E MÉTODOS ... 43 4.1 Material ... 43 4.1.1 Frutos de cacau... 43 4.1.2 Inibidores Enzimáticos ... 43 4.1.3 Equipamentos ... 43 4.1.4 Reagentes... 44 4. 2 Métodos ... 44
4.2.1 Caracterização física dos frutos e sementes... 45
4.2.2 Fermentação e tratamento dos ensaios ... 45
4.2.3 Secagem ... 47
4.2.4 Caracterização física das amêndoas fermentadas e secas ... 47
4.2.5 Preparo dos nibs ... 48
4.2.6 Características físico-químicas dos nibs ... 48
4.2.7 Determinação dos compostos fenólicos... 49
4.2.8 Preparo dos chocolates... 52
4.2.9 Análise Sensorial... 57
4.2.10 Determinação do teor de cobre remanescente ... 60
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES ... 61
5.1 Caracterização física dos frutos e sementes ... 61
5.1.1 Frutos ... 61
5.1.2 Sementes ... 62
5.2 Parâmetros avaliados durante a fermentação e secagem das sementes de cacau ... 62
5.2.1 Sólidos solúveis... 62
5.2.3 Controle do pH da massa de sementes de cacau durante a fermentação
... 65
5.3 Caracterização física das amêndoas fermentadas e secas... 66
5.4 Classificação das amêndoas fermentadas e secas ... 68
5.5 Características físico-químicas dos nibs de cacau ... 70
5.5.1 Acidez Titulável, pH e ácidos orgânicos... 70
5.5.2 Composição Química das amêndoas de cacau ... 73
5.5.3 Compostos Fenólicos Totais das sementes frescas, durante a fermentação e ao término da secagem ... 75
5.5.4 Proantocianidinas totais das sementes frescas, durante a fermentação e ao término da secagem... 77
5.5.5 Flavan-3-óis e procianidinas das sementes frescas, em diferentes dias de fermentação e ao término da secagem ... 78
5.6 Caracterização dos chocolates produzidos a partir dos liquors obtidos dos diferentes ensaios de fermentação... 84
5.6.1 Propriedades reológicas dos chocolates produzidos a partir dos liquors obtidos dos diferentes ensaios de fermentação ... 85
5.7 Análise Sensorial dos chocolates produzidos a partir dos liquors obtidos dos diferentes ensaios de fermentação... 87
5.8 Teores residuais Sulfato de Cobre ... 92
5.9 Atividade inibidora das substâncias químicas adicionadas... 93
6. CONCLUSÕES ... 95
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 96
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 97
ANEXO I - Controle do pH da massa de sementes de cacau durante a fermentação ... 107
ANEXO II - Controle da temperatura das caixas de fermentação e média obtida para cada ensaio... 108
ANEXO III: Intensidades obtidas por espectrometria de massas dos flavonóides das sementes de cacau durante as etapas de fermentação e secagem... 109
ANEXO IV - Controle de temperatura e umidade do ambiente de fermentação em diferentes tempos... 110
TABELAS
Tabela 1 - Concentração em base seca dos polifenóis totais, catequina e
epicatequina em liquors de cacau de diferentes países... 2 Tabela 2 – Distribuição percentual da produção mundial de cacau entre 1993 e
2002. ... 7 Tabela 3 - Composição das células de armazenamento dos polifenóis em relação
ao tecido total de sementes de cacau da variedadade Forastero. ... 13 Tabela 4 - Principais classes de compostos fenólicos. ... 23 Tabela 5 - Classificação dos flavonóides encontrados em alimentos. ... 25 Tabela 6 - Quantidades de flavan-3-ol e procianidinas (µg/g) em amêndoas de
cacau desengorduradas ao longo da fermentação. ... 33 Tabela 7. Caracterização das principais enzimas ativas durante a fermentação de
sementes de cacau ... 34 Tabela 8 - Programa desenvolvido para o Reômetro Brookfield modelo RVDVIII. 55 Tabela 9 – Formulação utilizada na produção dos chocolates a partir dos liquors
obtidos em cada ensaio. ... 57 Tabela 10 – Caracterização dos frutos de cacau in natura da variedade Forastero.
... 61 Tabela 11 – Dimensões e massa média das sementes de cacau in natura... 62 Tabela 12 – Valores obtidos para sólidos solúveis da polpa aderida às sementes
de cacau durante a etapa de fermentação... 62 Tabela 13 – Controle de temperatura e umidade da sala climatizada utilizada para
a fermentação de sementes de cacau em diferentes tempos. ... 63 Tabela 14– Caracterização física das amêndoas fermentadas e secas dos
diferentes ensaios ... 67 Tabela 15 - Composição em frações das amêndoas de cacau dos diferentes
Tabela 16 – Resultados da prova de corte efetuada nas amêndoas fermentadas e secas... 69 Tabela 17 – Valores de acidez titulável, pH e ácidos orgânicos das amêndoas
fermentadas e secas de cacau. ... 70 Tabela 18 - Composição química das amêndoas fermentadas e secas e da
semente fresca liofilizada. ... 73 Tabela 19 – Teor de fenólicos totais de sementes frescas, durante a fermentação
e ao término da secagem dos diferentes ensaios ... 75 Tabela 20 – Concentração das proantoacianidinas totais das amêndoas de cacau
durante a fermentação e na etapa de secagem... 77 Tabela 21 – Teor de perda total dos flavan-3-óis e procianidinas desde o início do
processo (semente fresca) ao término da etapa de secagem... 82 Tabela 22 - Umidade e tamanho de partículas dos chocolates... 84 Tabela 23 - Parâmetros reológicos e coeficientes de correlação médios dos
chocolates produzidos a partir dos liquors dos diferentes ensaios ... 86 Tabela 24 - Resultados médios obtidos no teste de aceitabilidade das amostras de
FIGURAS
Figura 1 – Frutos verdes e maduros de cacau da variedade Forastero... 9
Figura 2 – Corte transversal de um fruto de cacau da variedade Forastero. ... 11
Figura 3 – Corte longitudinal de semente de cacau; ... 13
Figura 4 – Reações observadas na semente de cacau durante a fermentação, após a morte do gérmen. ... 17
Figura 5 - Reações observadas durante a fermentação do cacau (LOPEZ, 1974 apud VASCONCELOS, 1999). ... 18
Figura 6 - Estrutura básica e sistema numérico de flavonóides ... 25
Figura 7 - Esquema da biossíntese e interconexão entre flavonóides. ... 28
Figura 8 – Fluxograma de pré-processamento e processamento dos chocolates a partir de frutos de cacau... 44
Figura 11 – Concha longitudinal utilizada para pré-tratamento dos liquors ... 54
Figura 12 – Reograma de Casson... 56
Figura 13 – Ficha de avaliação sensorial utilizada no estudo... 59
Figura 14 – Variação da temperatura da massa de sementes de cacau durante a fermentação para os diferentes ensaios: A e G (fermentações convencionais com duração de 7 e 3 dias respectivamente); B, C e F (fermentações por 7 dias, modificadas com adição de 5mg, 10mg e 5mg de bissulfito de sódio/100g de massa de sementes com polpa após 48hs, 48hs e 120hs respectivamente e D e E (fermentações por 7 dias modificadas com adição de 5mg e 10mg de sulfato de cobre/100g de massa de sementes com polpa após 48 horas do início respectivamente)... 64
Figura 15– Controle de pH da polpa nas caixas de fermentação dos diferentes ensaios: A e G (fermentações convencionais com duração de 7 e 3 dias respectivamente); B, C e F (fermentações por 7 dias, modificadas com adição de 5mg, 10mg e 5mg de bissulfito de sódio/100g de massa de sementes com polpa após 48hs, 48hs e 120hs respectivamente e D e E (fermentações por 7 dias modificadas com adição de 5mg e 10mg de sulfato de cobre/100g de massa de sementes com polpa após 48 horas do início respectivamente)... 66
Figura 16 - Espectro típico obtido por Ressonância Magnética Nuclear para determinação dos ácidos orgânicos presentes nas sementes fermentadas e secas dos diferentes ensaios... 71 Figura 17. Concentração dos principais ácidos orgânicos monitorados para os
diferentes ensaios após fermentação e secagem das sementes... 72 Figura 18 - Espectrograma típico obtido no espectrômetro de massas Q-Trap com
os flavan-3-ol (unidade monomérica) e procianidinas (unidades poliméricas). ... 79 Figura 19 – Histogramas referentes aos teores de flavan-3-óis (unidades
monoméricas) e procianidinas (unidades poliméricas) mantidos nos diferentes dias de processo: a. até o terceiro dia de fermentação; b. até o sétimo dia de fermentação e c. ao término da etapa de secagem... 81 Figura 20 - Distribuição em freqüência dos valores da escala atribuídos pelos
consumidores às amostras de chocolate quanto à aceitabilidade global (a), do sabor (b), do aroma (c); dulçor (d) e amargor (e) ... 91 Figura 21 - Reação de degradação de composto fenólico pela atuação da enzima
RESUMO
As sementes de cacau (Theobroma cacao L.) da variedade Forastero são extremamente ricas em compostos fenólicos, que representam em média 15 a 20% de seu peso seco e desengordurado, sendo que 60% pertencem à classe dos flavonóides, compostos apontados atualmente como responsáveis pela prevenção de doenças coronárias, diminuição do colesterol sérico, auxiliadores do sistema imunológico, entre outros. Durante a etapa de fermentação, são perdidos, em média, 70% dos flavonóides devido a importantes reações bioquímicas que ocorrem principalmente pela diminuição do pH, aumento de temperatura (45-50°C) e atuação de certas enzimas presentes no fruto ou produzidas pelos microrganismos que participam desta etapa. Tais reações são, em parte, responsáveis pela redução do amargor e da adstringência melhorando assim o desenvolvimento do sabor do chocolate. Desta forma, o presente trabalho visou modificar a etapa de fermentação de sementes de cacau para a produção de chocolate rico em flavonóides sem prejudicar seu sabor. Para isso, procurou-se inibir as enzimas que são possivelmente as principais responsáveis pela perda dos flavonóides através da adição de inibidores químicos (bissulfito de sódio e sulfato cúprico) na etapa de fermentação. Foram realizados sete experimentos distintos: ensaios A e G (fermentações convencionais com duração de 7 e 3 dias respectivamente); ensaios B, C e F (fermentações por 7 dias, modificadas com adição de 5mg, 10mg e 5mg de bissulfito de sódio/100g de massa de sementes com polpa após 48hs, 48hs e 120hs respectivamente e ensaios D e E (fermentações por 7 dias modificadas com adição de 5mg e 10mg de sulfato de cobre/100g de massa de sementes com polpa após 48 horas do início respectivamente). Os resultados indicaram que, de uma forma geral, todos os tratamentos propostos mantiveram maior teor de compostos fenólicos em relação à fermentação convencional (ensaio A). Quanto aos compostos fenólicos totais, o ensaio D apresentou a maior retenção (62,70%) desde o início da fermentação ao término da secagem, enquanto que no ensaio A foram retidos 36,38% destes compostos. Em relação aos flavan-3-óis e procianidinas, observou-se maior
retenção, para monômeros, nos ensaios D (34,27%) e G (33,72%); para dímeros, nos ensaios D (21,83%) e G (21,78%); para trímeros, nos ensaios C (22,85%), D (22,37%) e F (22,38); para quatrâmeros, nos ensaios C (25,84%), D (24,77%) e F (27,21) e para pentâmeros, nos ensaios C (35,24%), D (34,45%) e F (34,16). Observou-se que a maior perda dos compostos fenólicos estudados ocorreu entre o término da fermentação e a secagem. Verificou-se que o residual de Cobre remanescente da adição feita durante a fermentação (ensaios D e E) nos liquors e nos chocolates produzidos foi de 0,23 e 0,36mg de cobre/100g de liquor (ensaios D e E respectivamente) e 0,025 e 0,036mg de cobre/100g de chocolate (ensaios D e E respectivamente), todos valores consideravelmente inferiores ao Limite Máximo Tolerado (LMT) definido pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), correspondente a 3,0mg de cobre/100g de amostra. Os chocolates produzidos a partir dos ensaios B, C, D e E mostraram aceitabilidade sensorial igual ou melhor ao convencional (A), enquanto que os produzidos a partir dos ensaios F e G apresentaram aceitabilidade mediana e incertezas com relação a intenção de compra.
SUMMARY
Cocoa seeds (Theobroma cacao L.) from the Forastero variety are very rich in phenolic compounds which represent 15-20% of the defatted dry weight. The principal compounds are (+)-catechin, (-)-epicatechin and 60% of procyanidins that belong to the flavonoid class. These compounds are currently been considered responsible for coronary heart disease prevention, lowering the serum cholesterol and helping the immunological system. During the fermentation, 70% of the total phenolic compounds are lost in important biochemical reactions accelerated by the reduction in pH, temperature increase (45-50°C) and action of some enzymes, present in the fruit or produced by the microorganism growing at this stage. These reactions contribute to a reduction in bitterness and astringency, improving the flavor of the chocolate. The objective of this work was to modify the fermentation stage of cocoa seeds to produce flavonoid-rich chocolates without prejudicing its flavor. This was done by the inactivation of enzymes probably responsible for flavonoid degradation, through the addition of chemical inhibitors (sodium bissulfite and cupric sulphate) during the fermentation stage. Seven experiments were carried out: Experiments A and G (conventional fermentations during 7 and 3 days respectively); experiments B, C and F (modified fermentations during 7 days, with the addition of 5mg, 10mg and 5mg of sodium bissulfite/100g of cocoa seeds with pulp after 48hs, 48hs and 120hs since the beginning of fermentation respectively) and experiments D and E (modified fermentations during 7 days, with the addiction of 5mg and 10mg of cupric sulphate/100g of cocoa seeds with the pulp after 48hs and 120hs since the beginning of fermentation respectively). The results showed that all the treatments proposed maintained higher quantities of phenolic compounds as compared with the conventional experiment (A). Considering the total phenolics, experiment D showed the highest retention (62,70%) from the beginning of the fermentation up to the end of the drying stage, while in the experiment A, the retention was 36,38%. Considering the flavan-3-ols and procyanidins, a higher retention of monomers was observed in experiments D (34,27%) and G (33,72%); of dimers in experments D (21,83%) and G (21,78%); of
trimers in experiments C (22,85%), D (22,37%) and F (22,38); of tetramers in experiments C (25,84%), D (24,77%) and F (27,21) and of pentamers in experiments C (35,24%), D (34,45%) and F (34,16). It was observed that the greatest loss of the phenolic compounds studied occurred between the end of fermentation and the beginning of the drying stage. It was shown that the copper residue in the liquor and chocolate remaining from the addition during fermentation (experiments D and E) was 0,23 and 0,36mg of copper/100g of liquor (experiments D and E respectively) and 0,025 e 0,036mg of copper /100g of chocolate (experiments D and E respectively). These values are below the Maximum Tolerated Limit (MTL) defined by ANVISA for this metal (3,0mg/100g). The chocolates B, C, D and E showed equal or better sensory acceptance as compared with conventional (A), and F and G chocolates which showed average sensory acceptance and uncertainty with respect to buying intention.
1. INTRODUÇÃO
A produção mundial de chocolate atualmente é de aproximadamente 5 milhões de toneladas/ano (GIL, 2001), sendo o Brasil o quinto maior produtor mundial. O chocolate é um produto apreciado mundialmente por pessoas de todas as idades, principalmente pelo seu sabor inigualável. Acredita-se que pessoas não consumam chocolate em maiores quantidades temendo possíveis problemas à saúde que possa causar, considerando-se que, em geral, um chocolate é composto de 40 a 50% de açúcar e 25 a 45% de gordura, incluindo aquela presente no leite (no caso de chocolate ao leite) e a manteiga de cacau.
Estimativas da Organização Mundial da Saúde (OMS) revelam que as doenças cardiovasculares (DCV) provocam cerca de 12 milhões de mortes por ano em todo mundo, causando a morte de uma pessoa a cada trinta e três segundos na América do Norte (LEONG & CHUAH, 2001). No Brasil, de acordo com a Organização Pan-Americana de Saúde, as DCV’s causam 172 mil mortes/ano. É neste sentido que, em busca de uma vida mais saudável, as pessoas têm se preocupado mais com a prevenção ao invés da cura de doenças já instaladas. Dessa maneira, a alimentação vem sendo vista como uma excelente forma de auxiliar na redução do risco de contração de doenças, levando a um aumento considerável das pesquisas científicas relacionadas aos constituintes dos alimentos que causam ou não benefícios à saúde, ao desenvolvimento de novos produtos, denominados atualmente pelo mercado de “alimentos funcionais”, bem como de seu consumo em todo mundo.
Estudos clínicos feitos em humanos têm revelado que as sementes de cacau atuam beneficamente à saúde, principalmente em relação a doenças cardiovasculares (REIN, 2000; MAO, 2000; HAMMERSTONE, 1999; KONDO, 1996), devido a presença de altos teores de polifenóis, grupo de compostos que atuam como antioxidantes, antimicrobianos, ativadores do sistema imunológico entre outros. Hammerstone, et al. (1999) identificou e quantificou compostos fenólicos de sementes de cacau e chocolate, encontrando uma grande variedade
destes compostos, incluindo os mais complexos, raramente encontrados em quantidades tão elevadas em outros alimentos. Estudos preliminares feitos em humanos apresentados no Simpósio da Reunião Anual de Exposição da Inovação Científica da Associação Americana de Avanços da Ciência (Anual Meeting of the
American Association for the Advancement of Sciences – AAAS) nos Estados
Unidos, indicaram que o consumo de chocolates ricos em flavonóides proporciona benefícios à corrente sangüínea, associados com a saúde do coração. O processo de obtenção dos chocolates utilizados nestes estudos preliminares resultou em uma patente cuja detentora é a empresa Mars Incorporated (Kealey et al., 1998). O método utilizado pela empresa envolve a mistura de sementes de cacau fermentadas por 2 a 3 dias (pouco fermentadas e com pouco desenvolvimento de sabor, porém, ricas em compostos fenólicos) com sementes fermentadas durante 6 a 7 dias e de alta qualidade (bem fermentadas e, portanto, com ótimo desenvolvimento de sabor, porém com baixo teor de compostos fenólicos).
A variedade de cacau Forastero é a mais utilizada mundialmente pela indústria de chocolates e confeitos. As sementes do cacau brasileiro desta variedade possuem elevada concentração de compostos fenólicos, comparadas com as sementes da mesma variedade de vários outros países produtores de cacau conforme apresenta a Tabela 1.
Tabela 1 - Concentração em base seca dos polifenóis totais, catequina e epicatequina em liquors de cacau da variedade Forastero de diferentes países
Origem das sementes de cacau fermentadas da variedade Forastero Polifenóis Totais (%) Catequina (%) Epicatequina (%) Colômbia 11,40 0,43 1,22 Equador 9,20 0,49 1,02 Costa do Marfim 6,70 0,31 0,35 Brasil 13,00 0,41 1,68 Ghana 9,70 0,31 0,82
Sanbongi et al. (1998) ressalta ainda que sementes frescas de Ghana
possuem teores de polifenóis totais, catequina e epicatequina de 19,90; 2,10 e 7,91%, o que sugere que há uma perda de aproximadamente 50% de polifenóis totais, 85% de catequinas e 90% de epicatequinas durante a fermentação das sementes de cacau. Segundo Brito (2000), o teor de fenóis totais diminui cerca de 70% na etapa de fermentação, sendo que a (-)–epicatequina sofre redução de 90% em sua concentração inicial. Isso tem ligação com a formação do sabor desejável do chocolate; ou seja, a degradação dos compostos fenólicos, seja por complexação com as proteínas, ou por modificação bioquímica é uma das responsáveis pelo desenvolvimento do sabor desejável do chocolate, sendo, portanto, precursora de sabor no pré-processamento do chocolate.
Considerando os atributos funcionais concedidos atualmente aos flavonóides e sem desconsiderar sua importância ao sabor dos produtos de chocolate, tornou-se relevante um estudo sobre uma forma alternativa de fermentação das sementes de cacau conservando maior quantidade de compostos fenólicos sem grandes prejuízos ao sabor, para a obtenção de chocolate rico em flavonóides.
Uma vez que as sementes de cacau da variedade Forastero provenientes do Brasil contêm teores de compostos fenólicos, inclusive da classe dos flavonóides, mais elevados em relação aos outros países produtores; que as sementes desta variedade exigem um tempo de fermentação de 5 a 7 dias para um melhor desenvolvimento de sabor e que os flavonóides são perdidos em grande quantidade ao término da fermentação (do quinto ao sétimo dias), pela atuação de enzimas; a proposta do presente trabalho foi utilizar inibidores químicos enzimáticos durante a etapa de fermentação do cacau procurando minimizar a degradação dos flavonóides sem, no entanto, impedir que as reações desejáveis ao desenvolvimento do sabor de chocolate ocorressem. Quando a fermentação das sementes de cacau da variedade Forastero é feita por apenas três dias, um grande teor de compostos fenólicos é mantido, principalmente por
não haver tempo suficiente para sua degradação. Por outro lado, o desenvolvimento de sabor é bastante prejudicado devido ao elevado amargor e adstringência. Por isso, trabalhou-se com diferentes ensaios de fermentação: fermentação convencional durante sete dias (a qual foi utilizada como padrão em termos de sabor); fermentação convencional durante três dias (a qual foi utilizada como padrão em retenção de compostos fenólicos); e cinco fermentações modificadas com duração de sete dias através da adição de substâncias químicas como o bissulfito de sódio e o sulfato cúprico em diferentes teores; possibilitando não apenas obter matérias-primas para a produção de chocolate com elevado teor de flavonóides como também com bom desenvolvimento de sabor e conseqüentemente, com boa aceitação pelo mercado consumidor.
2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral
Desenvolvimento de processos alternativos de fermentação do cacau utilizando inibidores enzimáticos seletivos para a obtenção de matérias-primas para a produção de chocolate com maior retenção de flavonóides.
2.2 Objetivos específicos
- Avaliação da importância da influência das enzimas polifenoloxidase e glicosidases na fermentação do cacau;
- Quantificação relativa e absoluta da perda dos compostos fenólicos totais e flavonóides de interesse durante as etapas de fermentação e secagem;
- Obtenção de equilíbrio entre alta concentração de flavonóides e sabor agradável dos chocolates produzidos com as matérias-primas obtidas na fermentação modificada e nas etapas subseqüentes.
- Produção de chocolates utilizando-se os liquors obtidos;
- Testes sensoriais de aceitabilidade que permitiram escolher o produto mais agradável sensorialmente e com alto teor de compostos fenólicos, em especial da classe dos flavonóides.
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Situação mundial da cacauicultura
O cacau tem importância econômica no contexto internacional por ser um
commodity de participação relevante no comércio mundial de produtos agrícolas
tanto em importações quanto exportações. Observando-se a Tabela 2, constata-se que a produção mundial de amêndoas de cacau vem caindo. Em 2002 foram produzidas 2,83 milhões de toneladas em comparação com 3,16; 3,44 e 3,11 milhões de toneladas produzidas respectivamente em 1999, 2000 e 2001. O maior produtor, em 2002, foi a Costa do Marfim com um milhão de toneladas, seguido de Ghana, Indonésia, Nigéria e Brasil (GUYTON, 2003).
A África Ocidental detém cerca de 68% da produção mundial. A Costa do Marfim é a maior produtora da região e do mundo, detendo 35,3% em 2002. Entretanto, a situação atual deste país envolve uma grave crise política ocasionada por uma guerra civil e rebeliões armadas. Além disso, nas fazendas ao leste, as árvores estão envelhecidas, ocasionando diminuição em sua produtividade ano após ano. Outro fator que gera um decréscimo na produtividade é o ataque por fungos, caracterizado pela Podridão Parda, a qual tem contribuído com consideráveis perdas na produção. Em Ghana, espera-se um aumento na produção de 6,0% para 2002/03, em parte pelo programa desenvolvido pelo governo para controlar a disseminação da Podridão Parda e em parte pela diminuição do intercâmbio de cacau pelas fronteiras de Ghana com a Costa do Marfim. Nigéria e Camarões juntos produzem 16% do cacau da África Ocidental (GUYTON, 2003).
Nas regiões da Ásia e Oceania, a Indonésia é o maior produtor, detendo 80% da produção da região. As condições climáticas têm sido favoráveis ao norte do país, porém, a seca ao sul não vem auxiliando a produção. As plantações da região enfrentam uma doença causada por um lagarto (Conopomorpha
sementes de cacau. Com isso, espera-se declínio de 1% na produção. Na Malásia, espera-se aumento de 7% na produção (GUYTON, 2003).
A produção na América vem aumentando. Para o Equador, espera-se um aumento de 6%. O maior aumento na produção é previsto para o Brasil (16,5%), pelas condições climáticas favoráveis e pelos extensivos programas desenvolvidos para selecionar árvores resistentes às doenças fúngicas (GUYTON, 2003).
Tabela 2 – Distribuição percentual da produção mundial de cacau entre 1993 e 2002. PRODUÇÃO MUNDIAL DE CACAU (%)
1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 Costa do Marfim 30,0 30,3 37,5 38,0 37,1 36,6 41,3 40,6 38,6 35,3 Ghana 9,5 10,8 13,5 12,4 10,7 12,5 12,6 12,7 13,2 13,4 Indonésia 9,7 9,1 9,3 10,8 10,9 13,1 14,0 13,5 10,9 12,3 Nigéria 11,5 12,1 6,8 10,0 10,6 11,3 7,1 9,8 10,9 11,9 Brasil 12,8 12,4 10,0 8,2 9,2 8,6 7,0 5,6 6,0 6,1 Camarões 3,7 4,0 4,5 4,0 4,2 3,8 3,7 3,6 3,7 4,0 Equador 3,1 3,0 2,8 2,9 2,8 1,1 3,0 2,9 3,4 3,8 México 2,0 1,6 1,7 1,2 1,5 1,4 1,3 0,8 1,5 2,0 Malásia 7,5 6,7 4,4 3,7 3,5 2,8 2,7 2,9 3,2 1,8 Colômbia 2,2 1,9 1,9 1,5 1,7 1,6 1,6 1,3 1,5 1,7 República Dominicana 2,0 2,4 2,2 2,1 1,9 2,1 0,8 1,1 1,5 1,6 Mundial (milhões de toneladas) 2,67 2,67 2,99 3,24 3,02 3,28 3,16 3,44 3,11 2,83 Fonte: FAO, 2003.
3.1.1 Perspectivas para o cacau brasileiro
O cacau, além de ter sido de grande importância para a economia brasileira e para o Estado da Bahia principalmente na década de setenta, foi determinante para gerar riquezas de muitos outros países produtores. Neste período, cerca de 90% da produção brasileira era exportada (Bastos, 1987), sendo que desde 1997, a grande queda na produção tem obrigado o Brasil a importar sub-produtos de cacau para consumo da indústria de alimentos (ALVES, 2003).
O maior impedimento à produção brasileira de cacau vem sendo causado pelas doenças fúngicas. Entre elas, a vassoura-de-bruxa é a mais importante. A queda na produção nacional nos últimos anos pode ser explicada, em parte, pela introdução do patógeno causador da vassoura-de-bruxa do cacaueiro: Crinipellis
perniciosa (Stahel) Singer na Bahia em 1989 (PEREIRA et al., 1990). A CEPLAC
(Comissão Executiva para o Plano da Lavoura Cacaueira) tem recomendado, para a reabilitação de plantas suscetíveis à vassoura-de-bruxa, o uso de variedades cloniais resistentes por meio de enxertia (ROSA, 1998). O uso destas variedades é uma das estratégias adotadas pela CEPLAC para reverter, o mais rápido possível, o quadro de degradação em que se encontram as plantações nos pólos produtores de cacau na Bahia. Com isso, através de reprodução assexuada, é possível transmitir todo o potencial genético de uma planta (produtividade, qualidade de semente, tolerância à vassoura-de-bruxa) aos seus descendentes, aumentando a esperança de recuperação e de garantia do futuro da cultura cacaueira com a permanência da vasta e densa cobertura vegetal remanescente da Mata Atlântica, que serve de proteção a essa lavoura. Com a enxertia do cacaueiro há uma previsão da retomada da produção. Considerando-se a enorme demanda pelos sub-produtos de cacau e a queda mundial na produção acelerada pela crise política na região da Costa do Marfim, o Brasil se apresenta hoje como um país com grande perspectiva de aumento em sua produção.
3.2 O Cacau
3.2.1 Aspectos Gerais
O cacaueiro é uma planta nativa das matas equatoriais da região amazônica. Pertence à família Esterculiaceae, gênero Theobroma, espécie
Theobroma Cacao. O nome da planta é de origem asteca: cacahuatl (cacau) ou cacahuaquahuitl (cacaueiro); o nome chocolate vem da bebida, tchocoatl, de
origem maia, que já era consumida há mais de três mil anos (LAJUS, 1982). A Figura 1 apresenta os frutos verdes e maduros em um cacaueiro da variedade
Forastero.
Figura 1 – Frutos verdes e maduros de cacau da variedade Forastero.
Fonte: COCOAPRO, 2002.
A partir das flores pequenas, avermelhadas, inodoras, unidas ao tronco, se originam as bagas ou frutos, que medem até 25cm de comprimento. Quando maduros, adquirem tonalidade alaranjada, amarela ou roxa (dependendo da variedade). Contêm cinqüenta ou mais sementes envoltas por uma polpa mucilaginosa. O cacaueiro pode viver mais de cem anos, começando a frutificar com três, produzindo abundantemente a partir dos oito e mantendo produção satisfatória até os trinta anos. Regiões com temperaturas médias anuais entre 24
e 28ºC possuem as melhores condições para o cultivo. Temperaturas inferiores a 12ºC impedem ou reduzem a frutificação (LAJUS, 1982).
3.2.2 Valor Ecológico
Ao lado da indiscutível importância econômica, o cacau tem um grande valor ecológico. Cultivado racionalmente, em condições que se assemelham às do seu "habitat" natural, em florestas, com um sombreamento permanente de árvores de maior porte, o cacaueiro protege o solo dos efeitos da erosão e da lixiviação (carreamento de elementos nutritivos pelas águas). Suas plantações substituem a floresta original sem destruir o ambiente ecológico existente, preservando a heterogeneidade e com ela o micro-clima e a vida das espécies vegetais e animais das áreas cultivadas. Sob este aspecto o cacaueiro difere de outros cultivos brasileiros que por suas próprias características se transformaram em lavouras itinerantes, deixando, ao longo de sua passagem, vastas áreas de terras esgotadas e improdutivas. Na paisagem rural brasileira, há vários exemplos de cultivos que empobrecem e degradam o ambiente. O cacaueiro, embora mais exigente quanto às condições de clima e solo, restitui à terra grande parte daquilo que dela retira, mantém o equilíbrio ecológico e se constitui num cultivo perene, renovável e permanente. Este caráter de lavoura eminentemente estável confere ao cacau uma significativa importância ambiental (CEPLAC, 2003).
3.2.3 Variedades
Com base na origem botânica e na expansão geográfica da espécie, distinguem-se duas variedades de cacau cultivadas: Criollo e Forastero. Os frutos de cacau Criollo são caracterizados pela forma alongada, com ponta proeminente. Sua superfície externa é enrugada e possui cinco sulcos longitudinais profundos e cinco menos pronunciados. As sementes são ovais e se encontram relativamente soltas na polpa. Os cotilédones não contêm células pigmentadas, sendo, portanto, de coloração branca. São encontrados principalmente na Venezuela, América
Central, México, Java, Ceilão e Samoa (LAJUS, 1982; MATTIETTO, 2001; LOPES, 2000).
A variedade Forastero é caracterizada por frutos com forma mais arredondada, casca dura e superfície quase lisa. As sementes são achatadas, de forma quase triangular e se encontram firmemente alojadas à polpa. Os cotilédones têm coloração violeta por possuírem células pigmentadas (LAJUS, 1982). Em comparação ao cacau Criollo, cujo aroma é considerado suave e de excelente qualidade, o cacau da variedade Forastero tem um sabor mais ácido e característica adstringente. É encontrado em todos os países produtores de cacau do mundo. Possui frutos com cerca de 25cm de comprimento e 10cm de diâmetro. Cada fruto contém entre 30 e 50 sementes que são envolvidas por uma mucilagem denominada de polpa, com coloração branca a levemente rosada, sabor doce e ácido. Nos frutos maduros, a placenta se encontra solta entre as sementes. A Figura 2 mostra um corte transversal de um fruto de cacau da variedade Forastero.
Figura 2 – Corte transversal de um fruto de cacau da variedade Forastero. a: polpa mucilaginosa; b: placenta; c: cotilédone
Fonte: GRAPIUNAMENTE, 2002.
As formas híbridas entre as variedades Forastero e Criollo são denominadas Trinitário, que conservam características das duas variedades que as originaram: sabor frutal e suave da variedade Criollo e maior resistência a pragas da variedade Forastero. Os países produtores são essencialmente aqueles
b. c.
que cultivam o tipo Criollo: Trinidad, Venezuela, Ceilão, Indonésia e República dos Camarões.
3.2.4 As sementes de cacau Forastero
Para melhor compreensão do que se passa no interior das sementes de cacau durante a fermentação e nas outras etapas subseqüentes, torna-se importante examinar sua constituição e histologia. As sementes têm forma de amêndoas, sendo por esta razão denominadas de amêndoas de cacau. Em geral, esta denominação é reservada às sementes que já perderam sua capacidade de germinação, o que ocorre durante a fermentação. A semente é composta de casca, membrana prateada ou endosperma, dois cotilédones e radícula. Possui, em geral, 2,5cm de comprimento em média (LAJUS, 1982).
Segundo Bradeau (1970), o tecido dos cotilédones é constituído por dois tipos de células: o primeiro apresenta pigmentos compostos de polifenóis (taninos, catequinas, antocianinas e proantocianidinas) e metilxantinas (teobrominas e cafeína); já o segundo são células de reserva, que contêm amido, gorduras, proteínas e enzimas. As células de armazenamento de polifenóis na amêndoa representam entre 11 e 13% do total e as de reserva representam aproximadamente 90%, ocupando maior volume nos tecidos (BECKETT, 1988). A Tabela 3 apresenta a composição das células de armazenamento dos polifenóis em relação ao tecido total.
A Figura 3 ilustra as diferentes partes da semente de cacau. As matérias-primas para a produção do chocolate (manteiga de cacau e liquor) são extraídas dos cotilédones, comercialmente chamados nibs. Antes da fermentação, apresentam coloração violácea e aspecto compacto; após a fermentação e secagem, devem apresentar coloração marrom, sulcos e serem friáveis.
Figura 3 – Corte longitudinal de semente de cacau; a: casca; b: cotilédone; c: gérmen ou embrião.
Fonte: GRAPIUNAMENTE, 2002.
Tabela 3 - Composição das células de armazenamento dos polifenóis em relação ao tecido total de sementes de cacau da variedadade Forastero.
Composto (%)* de compostos na célula armazenadora % de compostos nos cotilédones Catequina 25,0 3,0 Proantocianidina 21,0 2,5 Proantocianidinas (olig.) 17,5 2,1 Antocianinas 3,0 0,4 Fenóis totais 66,5 8,0 Teobromina 14,0 1,7 Cafeína 0,5 0,1 Açúcares livres 1,6 Polissacarídeos 3,0 outros 14,4 * Base seca Fonte: BECKETT, 1988 a. b. c.
3.3 Pré-processamento do cacau 3.3.1 Quebra dos frutos
Após a colheita, os frutos devem ser quebrados e deles retiradas as sementes com a polpa aderida, que serão submetidas à fermentação. O período entre a quebra e o início da fermentação não deve ser superior a 24 horas para que não ocorram reações químicas indesejáveis. Sementes provenientes de quebras em dias diferentes não devem ser fermentadas juntas, pois isso conduz a uma fermentação desigual.
3.3.2 Fermentação
A fermentação é uma etapa essencial para a obtenção de amêndoas de boa qualidade. Segundo Minifie (1989), a fermentação e a secagem das sementes de cacau são de vital importância, sendo que nenhum outro processamento posterior é capaz de corrigir falhas nesta etapa. No processo de fermentação, o sistema, a temperatura do ambiente e da massa, o pH e a acidez da polpa e do cotilédone, o tempo de processo, o revolvimento da massa bem como a microflora presente são fatores de grande importância (ROHAM & CONNEL, 1964; LOPEZ & QUESNEL, 1973). Os sistemas mais comuns para fermentação são: montes, caixas, cestos, sacos de lona, gavetas de madeira, etc.
O desenvolvimento dos microrganismos que participam desta etapa é propiciado pela polpa mucilaginosa que envolve as sementes de cacau, que em geral é caracterizada por conter cerca de 80 a 90% de água, 10-13% de açúcares, sendo 1/3 sacarose e 2/3 monoses e pH variando entre 3,5-3,6. (FORSYTH & QUESNEL, 1963). Esse meio, associado ao baixo teor de oxigênio disponível devido a compactação da massa no interior dos montes ou cochos de fermentação, é excelente para o desenvolvimento de leveduras, as quais multiplicam-se rapidamente e são responsáveis pela fermentação alcoólica inicial (ROELOFSEN, 1958). A polpa dos frutos de cacau sadios é isenta de
pelas mãos dos operadores e depois pela exposição ao ambiente (LAJUS, 1982). A atividade microbiana provoca aumento da temperatura da massa, que contribui para o término do poder germinativo da semente. Tem-se então condições propícias às reações bioquímicas, que culminam com a síntese dos precursores de sabor e aroma.
A microflora, que pode naturalmente variar de acordo com as condições existentes e com a atividade microbiana, desenvolve-se na seguinte seqüência: leveduras, bactérias produtoras de ácido láctico, bactérias produtoras de ácido acético e bactérias esporulantes.
Para sementes da variedade Forastero, a etapa de fermentação tem duração de 5 a 7 dias. Segundo Forsyth & Quesnel (1958), há duas fases definidas e distintas de reações que ocorrem no interior do cotilédone durante a fermentação:
Fase I (Hidrólise Anaeróbica): Inicia-se no momento em que os frutos são partidos e pode durar até 48 horas. No primeiro dia, a polpa aderida começa a se tornar líquida, sendo então drenada, e a temperatura aumenta gradativamente. Nestas condições anaeróbicas, microrganismos produzem álcool etílico, e em seguida, ácido acético, responsáveis em conjunto pela morte do gérmen e conseqüente perda da capacidade de germinação. É a partir deste momento que as sementes podem ser chamadas de amêndoas de cacau (LAJUS, 1982). Este processo contribui para modificações estruturais, como a remoção da compartimentação celular das enzimas e de seus substratos (proteínas, compostos fenólicos, entre outros) (WOLLGAST & ANKLAN, 2000). Segundo Brito (2000), líquidos celulares se movem através das paredes, se espalhando por todo o grão de cacau. Por volta do terceiro dia, a massa das amêndoas tem sua temperatura elevada entre 45 e 50° C. Nessa fase, há uma difusão dos conteúdos celulares, iniciando-se uma série de reações relacionadas com as alterações de sabor, aroma e cor da semente. A difusão dos ácidos para o interior do cotilédone contribui para reações enzimáticas, propiciando ainda proteção contra bactérias
putrefativas, evitando prejuízos ao sabor devido à produção de ácidos graxos voláteis C3 a C5 (QUESNEL, 1968; HARDY, 1961).
Fase II (Condensação Oxidativa): Fase posterior à hidrólise anaeróbica e que freqüentemente se sobrepõe a esta. Ressalta-se a oxidação dos polifenóis que formam ou não complexos com as proteínas e peptídeos levando a redução da adstringência e do amargor. A oxidação observada nesta fase continua na etapa de secagem até que a umidade atinja um ponto mínimo no qual cessa a atividade da polifenoloxidase. (FORSYTH & QUESNEL, 1963).
A produção de ácidos durante a etapa de fermentação está relacionada com a aeração da massa de sementes (QUESNEL, 1968). Foram observadas reduções na acidez através do aumento na freqüência de revolvimentos (LOPEZ & MCDONAL, 1982; SCHAWN et al., 1990). Os ésteres do ácido acético, retidos no interior das amêndoas depois de secas, são responsáveis pelo sabor frutal de alguns produtos de cacau. Quando em excesso, concedem um sabor ácido desagradável que deprecia o produto (LOPEZ & MCDONAL, 1982). Jinap & Dimick (1990) estudaram as amêndoas de cacau fermentadas, secas e torradas quanto ao pH, acidez titulável, ácidos voláteis e não voláteis. Amêndoas provenientes do Extremo Oriente se mostraram significativamente mais ácidas que as da América Central e oeste da África, não apresentando diferença significativa em relação às da América do Sul. Amêndoas com alta acidez foram caracterizadas pela alta concentração de ácido acético e lático. Os resultados indicaram que elevados teores de ácido acético estavam relacionados com elevados valores de pH e acidez titulável.
A Figura 4 ilustra as reações observadas por Beckett (1988) em sementes de cacau durante sua fermentação e o fluxograma apresentado na Figura 5 as descreve.
Figura 4 – Reações observadas na semente de cacau durante a fermentação, após a morte do gérmen.
Figura 5 - Reações observadas durante a fermentação do cacau (LOPEZ, 1974
apud VASCONCELOS, 1999).
SEMENTES COM POLPA Caixas de Fermentação
Açúcares
leveduras
Ausência de ar Álcool + 17,8 Kcal Elevação da Temperatura e do pH
Liquefação da polpa/Drenagem do mel
Entrada de ar na massa de fermentação Crescimento de bactérias láticas e acéticas
Álcool
Bactérias acéticas + O2
Ácido acético + 118,2 Kcal
Ácido acético CO2 + H2O + 209,4 Kcal
Ácido lático + ácido acético Morte do gérmen
Difusão dos pigmentos através das células de armazenagem
Reações enzimáticas (hidrólise, proteólise)
Desenvolvimento dos precursores de sabor
Entrada de oxigênio na semente
Reação oxidativa por ação enzimática (redução do amargor e da adstringência)
Aumento do pH para aproximadamente 5,0
24 HORAS FASE ANAERÓBICA FASE AERÓBICA 48 HORAS 96 HORAS 120-168 HORAS
3.3.3 Secagem
Esta etapa deve ser iniciada imediatamente após a fermentação. Não deve ser lenta ou mal conduzida para que não possibilite o desenvolvimento de fungos que, quando presentes, conferem sabor desagradável ao produto final. Segundo Crespo (1985), apenas 3% de amêndoas contaminadas já proporcionam sabor desagradável ao liquor de cacau, impossível de ser eliminado em processos posteriores. Por outro lado, a secagem não deve ser efetuada de forma demasiadamente rápida através do emprego de temperaturas elevadas, para evitar problemas com a gordura (manteiga de cacau) e com o desenvolvimento do sabor do chocolate. Muitas das reações bioquímicas iniciadas na fermentação continuam nesta etapa. Segundo Lopez & Quesnel (1973) e Rohan & Stewart (1967), a taxa de umidade das amêndoas deve ser reduzida de 40-50%para 6-8%. 3.3.4 Torração
A torração é fundamental na obtenção das características de qualidade do chocolate. Em condições ótimas, há o desenvolvimento máximo do potencial aromático da amêndoa (Zamalloa, 1994). Segundo Pezoa-Garcia (1989) e Mermet
et al. (1992) apud Brito (2000), as condições de torração dependem de vários
fatores: origem e tipo de amêndoa, período de colheita, tratamentos anteriores à torração, umidade, tamanho das amêndoas e dos nibs. É uma operação térmica caracterizada pelos seguintes fenômenos:
- perda do teor de água;
- diminuição dos ácidos voláteis indesejáveis (principalmente acético); - inativação de enzimas que podem degradar a manteiga de cacau;
- desenvolvimento de aromas desejáveis através da Reação de Maillard partindo dos precursores formados na etapa de fermentação;
3.4 Processamento do Chocolate
O chocolate pode ser definido como uma suspensão de partículas sólidas (açúcar, sólidos de cacau e sólidos de leite) em uma fase gordurosa contínua, que também contribui para o aroma, sabor, cor, além de promover forma ao produto final. Deve fundir rápido e completamente em temperatura próxima à do corpo humano, caso contrário, poderá promover um pobre desprendimento de aroma/sabor e, provavelmente, um residual ceroso (VISSOTO et al., 1999). No Brasil, segundo a antiga legislação (CNNPA, 1978), a denominação chocolate só poderia ser empregada para aqueles produtos os quais se tenha utilizado, para compor a fase gordurosa, apenas manteiga de cacau e/ou gordura de leite, sem adição de outras gorduras vegetais alternativas, devendo conter 32% de sólidos de cacau. Segundo a Resolução - RDC nº 227, de 28 de agosto de 2003 da ANVISA, o chocolate passa a ser denominado como o produto obtido a partir da mistura de derivados de cacau (Theobroma cacao): massa de cacau, cacau em pó e manteiga de cacau com outros ingredientes, contendo, no mínimo, 25% de sólidos totais de cacau (ANVISA, 2003). Com essa nova resolução, torna-se possível produzir chocolates utilizando-se gorduras vegetais alternativas além da manteiga de cacau, o que permitirá reduzir os custos de produção.
As matérias-primas básicas para a produção de chocolate são o liquor (obtido pelo refino da massa de cacau), a manteiga de cacau e o açúcar, podendo-se ou não adicionar leite e derivados lácteos. O processo tradicional de produção de chocolate envolve as seguintes etapas:
3.4.1 Mistura dos ingredientes
A etapa de mistura consiste na homogeneização dos ingredientes em pó (açúcar, leite em pó) com os ingredientes líquidos e semi-líquidos (manteiga de cacau e liquor de cacau fundidos), por tempo suficiente para se transformarem em uma massa plástica adequada para o refino. Essa etapa é feita, em geral, em
tachos encamisados a 40°C, para garantir que a manteiga de cacau permaneça fundida.
3.4.2 Refino
A etapa de refino é de grande importância no processamento do chocolate, pois reduz o tamanho das partículas dos ingredientes tornando-os imperceptíveis na boca durante a degustação do produto final. O teor de gordura influencia esta etapa, sendo que massas muito secas (com menores teores de gordura) são refinadas mais rapidamente, porém, apresentam tamanho de partículas mais elevado que o ideal. Por outro lado, um teor elevado de gordura faz com que a massa fique muito fluida, deslizando lentamente nos cilindros de refino. Dessa forma, permanece maior tempo nos cilindros, provocando diminuição excessiva do tamanho de partículas. Segundo Beckett (1988), a maioria das partículas da massa refinada deve ter até 40µm, mas na prática, tamanhos maiores que 25µm proporcionam arenosidade na boca ao degustar o chocolate, e por outro lado, tamanhos inferiores a 20µm podem causar problemas tecnológicos, uma vez que levam ao aumento da viscosidade e do limite de escoamento, dificultando os processos posteriores (LUCCAS, 2001).
3.4.3 Conchagem
Esta etapa tem como principais objetivos a volatilização de compostos indesejáveis formados durante a fermentação das sementes de cacau (ácidos como o acético), a diminuição da umidade proveniente dos ingredientes e, por outro lado, a formação de aromas desejáveis por reações como a de Maillard. A conchagem também é importante para a homogeneização dos ingredientes. Desta forma, são necessários, nesta etapa, o cisalhamento da massa, agitação e aquecimento entre 50 e 70°C, dependendo do tipo de chocolate desejado (ao leite, branco ou amargo). Quanto maior o tempo de conchagem, maior é a formação do sabor desejável do chocolate. Por isso, no método tradicional, esta etapa pode
levar de 8 a 96 horas, dependendo do tipo de produto que se deseja e do equipamento que se dispõe (BECKETT, 1988).
Para caracterização física, química e reológica de chocolates, são determinadas suas propriedades de escoamento, teor de gordura, distribuição do tamanho de partículas e teor de umidade (BECKETT, 1988).
3.5 Compostos Fenólicos 3.5.1 Polifenóis
Os polifenóis ou compostos fenólicos são uma classe de compostos que ocorrem em frutas, vegetais, nuts, sementes, flores, bebidas e alguns alimentos industrializados, como componente de um ingrediente natural que foi adicionado. Constituem um dos mais numerosos e largamente distribuídos grupos de substâncias do reino das plantas, com mais de 8000 estruturas fenólicas conhecidas (BRAVO, 1998).
São produtos do metabolismo secundário de plantas, surgindo biogeneticamente de dois principais caminhos primários de síntese: caminho do chiquimato e do acetato (BRAVO, 1998). Ambos o ácido acético e o ácido chiquímico são derivados do metabolismo da glicose (FORMICA & REGELSON, 1995; SCHWARZE, 1958 in WOLLGAST & ANKLAN, 2000). O ácido acético, em sua forma ativa acetil co-A, ou depois no caminho como malonil co-A, representa o ponto inicial da síntese de ácidos graxos em um caminho primário e é apenas ponto inicial em um caminho secundário para a síntese do anel A dos flavonóides. O chiquimato representa o caminho primário para a produção de aminoácidos aromáticos (fenilalanina e tirosina). Sua degradação leva ao caminho do fenilpropanóide, considerado secundário. Este caminho é aparentemente essencial à sobrevivência de plantas terrestres, provendo aos seus constituintes, como a lignina, importante papel mecânico e estrutural. Dessa maneira, os
compostos derivados do caminho do fenilpropanóide têm papéis distintos na fisiologia das plantas.
Os polifenóis podem ser divididos em pelo menos 10 diferentes classes de compostos, dependendo de sua estrutura básica. A Tabela 4 ilustra a estrutura química básica dos principais compostos polifenólicos.
Tabela 4 - Principais classes de compostos fenólicos.
Classe Esqueleto básico Estrutura básica
Ácidos fenólicos C6 – C1 Acetofenonas C6 – C2 Ácidos fenilacéticos C6 – C2 Ácidos hidroxcinâmicos C6 – C3 Fenilpropanonas C6 – C3 Fenóis simples C6 Benzoquinonas C6
Classe Esqueleto básico Estrutura básica Fonte: BRAVO (1998). Coumarinas, isocoumarinas C6 – C3 Cromonos C6 – C3 Naftoquinonas C6 – C4 Xantonas C6 – C1– C6 Stilbenos C6 – C2– C6 Antraquinonas C6 – C2– C6 Flavonóides C6 – C3– C6 Lignanas, neolignanas (C6 – C3) 2 Ligninas (C6 – C3)n
O grupo simples dos flavonóides, considerado o mais importante, pode ser dividido em 13 classes com mais de 5000 compostos descritos. A Tabela 5 ilustra separadamente as classes de flavonóides encontradas. Sua estrutura comum é aquela das difenilpropanonas (C6-C3-C6) e consiste de dois anéis aromáticos
ligados através de 3 carbonos que normalmente formam um heterociclo oxigenado (Porter, 1993), conforme ilustra a Figura 6.
Figura 6 - Estrutura básica e sistema numérico de flavonóides
Fonte: PORTER (1993).
Tabela 5 - Classificação dos flavonóides encontrados em alimentos.
Flavonóide Estrutura Básica
Chalconas Dihidrochalconas Auronas Flavonas Flavonóis Flavanonas
Flavonóide Estrutura Básica Fonte: BRAVO (1998). Dihidroflavonóis Flavandiol ou leucoantocianidina Antocianidinas Isoflavonóides Biflavonóides Proantocianidinas ou taninos condensados O
O anel A do flavonóide (Figura 6) é biossintetizado pela condensação de 3 mols de malonil co-A derivado do metabolismo da glicose. Os anéis B e C são derivados do mecanismo da glicose pelo caminho do chiquimato e do fenilpropanóide, respectivamente para o acréscimo de ácidos do C-9 (ácido cinâmico, hidrocinâmico e cumárico). Como derivados do co-A, esses ácidos do 9 se condensam com produtos do 6 do malonato para formar uma chalcona C-15. O subseqüente fechamento do anel e a hidratação originam os diversos flavonóides (WOLLGAST & ANKLAN, 2000). Podemos observar resumidamente na Figura 7 a representação da biossíntese dos flavonóides de acordo com FORMICA & REGELSON (1995).
Juntamente com os derivados dos fenilpropanóides e os ácidos hidrocinâmicos, os flavonóis e em menor extensão as flavonas são encontrados em quase todas as plantas. As flavanonas e as flavonas são geralmente encontradas juntas (por exemplo em frutas cítricas) e são unidas por enzimas específicas (RICE-EVANS et al., 1996).
Figura 7 - Esquema da biossíntese e interconexão entre flavonóides.
Fonte: FORMICA & REGELSON (1995).
Os flavonóides ocorrem casualmente em plantas como agliconas, apesar de serem mais comumente encontrados como derivados de glicosídeos (BRAVO, 1998). O sítio preferido de glicosilação é na posição 3 e menos freqüentemente na posição 7. Diferenças individuais em cada grupo dos flavonóides é resultado da variação no número e arranjo dos grupos hidroxila sendo que ocorrem mais freqüentemente as dihidroxilações nas posições 3´ e 4´ (RICE-EVANS et al., 1996). Os flavonóides, em especial os flavan-3-óis catequinas, epicatequinas,
Glicose Ácido Pirúvico Acetil Co-A Malonil Co-A 3 mols Unidades de C-15 Unidades de 3 desoxi C-15 Chalconas Flavanonas Flavonas Ácido Chiquímico Fenilanina Ácido Cinâmico Ácido Hidróxicinâmico Hidróxicinnamoil Co-A Unidades de 3-Hidróxi C-15 Flavonóis Antocianidina Flavan-3,4-dióis Proantocianidinas 3-Flavenos Dihidróxiflavonóis Flavan-3-óis
gallocatequinas e epigallocatequinas são os constituintes monoméricos dos taninos condensados, apesar de serem muito comuns como monômeros livres (BRAVO, 1998; KEALEY et al., 1998). As catequinas e epicatequinas são isômeros derivados de flavonas, em que o anel benzênico e as hidroxilas estão em posição trans na catequina e cis na epicatequina.
Os taninos são compostos com peso molecular desde intermediário até elevado. São moléculas altamente hidroxiladas e podem formar complexos com elevada insolubilidade juntamente com carboidratos e proteínas. A formação destes complexos confere adstringência aos alimentos ricos em taninos, percebida ao serem consumidos, devido a sua precipitação com proteínas da saliva (WOLLGAST & ANKLAN, 2000).
Os taninos de plantas podem ser divididos em dois principais grupos: taninos hidrolisáveis e taninos condensáveis. Os hidrolisáveis consistem do ácido gálico e de seus produtos diméricos de condensação. São facilmente hidrolisados com ácidos, álcalis, água quente e ação enzimática, levando à formação de álcool polihídrico e ácido fenilcarbóxico (BRAVO,1998). Os taninos condensados ou proantocianidinas são polímeros de alto peso molecular que têm como precursoras unidades monoméricas de flavan-3-óis (catequina, epicatequina) em união com flavan-3,4-dióis ou leucoantocianidinas.
Para a formação das proantocianidinas, ocorre condensação oxidativa entre o C-4 do heterociclo e os C-6 e C-8 das unidades adjacentes. Desta maneira, as proantocianidinas podem ocorrer na forma de polímeros com grau de polimerização variável, podendo conter 50 ou mais unidades. A auto-oxidação ou a polimerização enzimática de unidades de flavan-3-óis ou flavan-3,4-dióis têm sido sugeridas como processos que levam à formação de taninos condensados (BRAVO, 1998; KEALEY et al., 1998). As ligações intra-flavonóides são sensíveis à ácidos e levam à formação de antocianidinas durante a hidrólise ácida em soluções alcoólicas (ácido clorídrico-butanol). Essa reação é utilizada para
determinação de proantocianidinas. Caso as sub-unidades sejam compostas apenas por catequina e epicatequina, o produto resultante da reação de hidrólise será cianidina. Tais proantocianidinas são então chamadas especificamente de procianidinas (WOLLGAST & ANKLAM, 2000). Segundo Bravo (1998), quando aquecidas com ácido mineral, produzem um precipitado amorfo vermelho altamente insolúvel denominado flobafeno ou vermelho de tanino.
As proantocianidinas oligoméricas são solúveis em diferentes solventes aquosos e orgânicos como acetona e metanol. Por outro lado, os taninos condensados de alto peso molecular são insolúveis nesses tipos de compostos e formam complexos com proteínas ou com a parede celular polissacarídica. Essa insolubilidade é responsável por erros significativos na quantificação dos polifenóis presentes em plantas, pois os fenólicos são geralmente analisados em extratos, sendo sempre omitida a quantificação dos taninos insolúveis ou não extraíveis (PORTER, 1993; BRAVO, 1998).
3.5.2 Polifenóis do cacau
Os polifenóis do cacau, conforme descrito no item 2.2.4 são armazenados nas células de pigmentos dos cotilédones das sementes. A quantidade total de polifenóis solúveis presentes em farinha desengordurada de sementes frescas de cacau corresponde a 15 a 20%. Em sementes fermentadas, esse valor cai para 5% (BRITO, 2000; KEALEY et al., 1998).
Os principais compostos identificados nas sementes de cacau Forastero, segundo Sanbongi et al. (1998); Kim & Keeney (1984); Porter (1991); Kealey et al. (1998) são apresentados a seguir:
catequinas (-)-epicatequina (+)-catequina (+)-gallocatequina (-)-epigallocatequina procianidinas procianidina B1 = epicatequina-(4β→8)-catequina procianidina B2 = epicatequina-(4β→8)-epicatequina procianidina B3 = catequina-(4α→8)-catequina procianidina B4 = catequina-(4α→8)-epicatequina procianidina B5 = epicatequina-(4β→6)-epicatequina
procianidina C1 = epicatequina-(4β→8)-epicatequina-(4β→8)- epicatequina procianidina D = epicatequina-(4β→8)-epicatequina-(4β→8)-epicatequina-(4β→8) epicatequina
oligômeros elevados e polímeros homólogos a epicatequina com 2 a 18 unidades monoméricas antocianinas 3-β-D-galactosidil-cianidina 3-α-L-arabinosidil-cianidina flavonóis glicosídicos quercetina-3-O-α-D-arabinosídeo quercetina-3-O-β-D-glucopuranosídeo outros clovamida dideoxiclovamida
Segundo Hansen et al. (1998), esses compostos seriam hidrolisados pela β-galactosidase e pela α-arabinosidase, que apresentam pronunciada estabilidade no decorrer da etapa de fermentação.
Durante a fermentação, com a morte do embrião, os compostos fenólicos sofrem difusão, entrando em contato com as enzimas polifenoloxidase e glicosidases presentes nas demais células (FORSYTH, 1958). Os polifenóis se
combinam com as proteínas por complexação reversível por meio de pontes de hidrogênio e da oxidação irreversível dos polifenóis a quinonas, que por sua vez sofrem condensação covalente com os grupos reativos de aminoácidos, peptídeos, proteínas e fibras. Ao longo da fermentação, o teor de antocianinas decresce chegando a 7% do valor inicial, sendo que a maior parte dessa destruição ocorre entre o primeiro e o terceiro dias (BRITO, 2000; CROSS et al., 1982). Ainda durante esta etapa, o teor de fenóis totais diminui cerca de 70%, sendo que a degradação da (-)-epicatequina, principal substrato da polifenoloxidase existente, provoca diminuição de 90% em sua concentração. A redução do teor de polifenóis durante a secagem é atribuída ao escurecimento enzimático causado pela polifenoloxidase, seguido de escurecimento não-enzimático decorrente da polimerização das quinonas resultantes e da acumulação de compostos insolúveis (BRITO, 2000).
De acordo com Forsyth & Quesnel (1958), a polifenoloxidase não teria condições adequadas para atuar durante a fermentação por causa da diminuição do pH e do aumento da temperatura, mas durante a secagem, com valores mais altos de pH e da concentração de oxigênio, teria condições apropriadas para oxidar os compostos fenólicos. Porém, tem-se constatado que a diminuição dos compostos fenólicos não pode ser interpretada devido apenas a um processo de oxidação enzimática, pois no quinto dia de fermentação, a atividade residual da polifenoloxidase é reduzida a 5-13% da inicial (HANSEN et al., 1998; REEVES et
al., 1988). Além disso, reações entre compostos de diferentes compartimentos
solúveis em água podem ser impedidas pela fusão de vacúolos de lipídeo, que dessa forma, impediriam o contato entre os diferentes compostos (BIEHL, 1982).
A Tabela 6 mostra a quantidade de procianidinas de sementes de cacau ao longo da etapa de fermentação.
Tabela 6 - Quantidades de flavan-3-ol e procianidinas (µg/g) em amêndoas de cacau desengorduradas ao longo da fermentação.
Horas de Fermentação Flavan-3-ol e Procianidinas 0 24 48 96 120 Monômeros 21.929 21.088 20.887 9.552 8.581 Dímeros 10.072 9.762 9.892 5.780 4.665 Trímeros 10.196 9.119 9.474 5.062 4.070 Tetrâmeros 7.788 7.064 7.337 3.360 2.557 Pentâmeros 5.311 4.744 4.906 2.140 1.628 Hexâmeros 3.242 2906 2929 1160 888 Heptâmeros 1.311 1.364 1.334 464 326 Octâmeros 626 608 692 254 166 Nonâmeros 422 361 412 138 123
Decâmeros 146 176 302 traços Traços
Undecâmeros Traços Traços Traços n.d n.d
Total 60.753 57.252 58.165 27.910 22.974
n.d: Não detectado
Fonte: KEALEY et al. (1998)
Os polifenóis das sementes de cacau ficam armazenados nas células de pigmento dos cotilédones juntamente com a cafeína, a teobromina, os ácidos graxos saturados e os monoinsaturados. Porém, quando ingeridos no cacau, esses constituintes adquirem, muitas vezes, atividade biológica diferente daquela dos compostos isolados. Dessa maneira, a manteiga de cacau não provoca aumento na concentração total do colesterol sérico, apesar de este efeito ser esperado por ser uma gordura rica em ácidos graxos saturados (MAO et al., 2000). Dependendo da quantidade de antocianina presente nas células de pigmento, chamadas de células armazenadoras de polifenóis, as mesmas serão brancas ou rosadas.
3.6 Enzimas presentes no cacau
A Tabela 7 relaciona as principais enzimas que catalisam reações que ocorrem durante a fermentação das sementes de cacau, seu principal substrato e suas condições ideais de atuação.
Tabela 7. Caracterização das principais enzimas ativas durante a fermentação de sementes de cacau
Enzima Localização Substrato Produto pH T (°C) Invertases semente testa Sacarose Glicose frutose 4,0-5,25 37 Glicosidases β-galactosidase semente cotilédone Glicosídeos 3-β-galactosidilcianidina 3-α-arabinosidilcianidina Cianidina Açúcares 3,8-4,5 45 Proteinases semente cotilédone Proteínas Peptídeos Aminoácidos 4,7 55 PFO semente cotilédone
Polifenóis (epicatequina) O-quinona O-diquinona
6,0 31,5-34,5
Fonte: LOPEZ, 1986; apud BECKETT, 1988.
A alteração não microbiana mais evidente observada em frutas e vegetais é o escurecimento causado por oxidação enzimática. O escurecimento enzimático é resultado da transformação em etapas de um monofenol a um difenol e deste a uma quinona. O grupo carbonílico reage então de forma não enzimática com outros constituintes dos alimentos, e de forma particular com compostos de grupos amino, para formarem produtos de cor escura. O escurecimento é evidente na maioria dos frutos descascados e acontece rapidamente depois da ruptura das células, sendo desejável em produtos como cacau, frutas secas e chá (MATTIETTO, 2001).
A presença e a atividade da polifenoloxidase (PFO) durante a fermentação e secagem das amêndoas de cacau são fatores responsáveis pelo desenvolvimento dos precursores de sabor. Esta enzima inicia sua atividade na
