Niterói 2/2016
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
ESCOLA DE ENGENHARIA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA E DE PETRÓLEO
VICTOR DE MELLO SANTOS
WESLEY CANDIDO ALVES
“DESENVOLVIMENTO DE COMPÓSITOS A BASE DE
NANOCELULOSE IMPREGNADA EM NANOPARTÍCULAS DE
PRATA VISANDO SUA APLICAÇÃO EM BIOSSENSORES
ELETROQUÍMICOS”
Niterói 2/2016
WESLEY CANDIDO ALVES
“DESENVOLVIMENTO DE COMPÓSITOS A BASE DE
NANOCELULOSE IMPREGNADA EM NANOPARTÍCULAS DE
PRATA VISANDO SUA APLICAÇÃO EM BIOSSENSORES
ELETROQUÍMICOS”
Projeto Final apresentado ao Curso de Graduação
em Engenharia Química, oferecido pelo
departamento de Engenharia Química e de Petróleo da Escola de Engenharia da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Bacharel em Engenharia Química.
ORIENTADORA
Ficha Catalográfica elaborada pela Biblioteca da Escola de Engenharia e Instituto de Computação da UFF
S237 Santos, Victor de Mello
Desenvolvimento de compósitos a base de nanocelulose impregnada em nanopartículas de prata visando sua aplicação em biossensores eletroquímicos / Victor de Mello Santos, Wesley Candido Alves. – Niterói, RJ : [s.n.], 2016.
60 f.
Trabalho (Conclusão de Curso) – Departamento de Engenharia Química e de Petróleo – Universidade Federal Fluminense, 2016. Orientador: Ninoska Isabel Bojorge Ramirez.
1. Biossensor. 2. Nanopartícula. 3. Prata. I. Alves, Wesley Candido. II. Título.
RESUMO
As nanopartículas de prata (AgNPs) estão presentes em numerosas aplicações tecnológicas. A síntese de nanopartículas de prata usando métodos químicos sustentáveis tem atraído interesses significativos. Neste trabalho, uma nova proposta de utilização de AgNPs em conjunto com nanocelulose comercial a fim de agregar vantagens na detecção do sinal a ser medido é apresentada. A síntese é feita utilizando borohidreto de sódio como agente redutor e é empregado a baixa temperatura na redução do precursor da prata (AgNO3) promovendo assim
uma melhor distribuição das nanopartículas em meio aquoso. Neste âmbito, o sal inorgânico possui a função de evitar a aglomeração das nanopartículas e agregar maior estabilidade aos íons Ag+. Os eletrodos base foram constituídos tendo como base o compósito Grafite/Epóxi (GEC) 65/35% (p/p) e foram agregados com nanocompósitos de nanopartículas de Prata e Nanocelulose. Estes foram testados por meio de voltametrias cíclicas em uma solução de K4Fe(CN)6 10 mM, pH 7.0 a diferentes velocidades de varredura com a finalidade de detecção
do analíto de interesse. A incorporação dos nanomateriais aos eletrodos base GEC apresentaram resultados significativos na condutividade do sensor garantindo sua aplicabilidade.
ABSTRACT
Silver nanoparticles (AgNPs) are present in numerous technological applications. The synthesis of silver nanoparticles using sustainable chemical methods has attracted significant interests. In this work, a new proposal to use AgNPs in conjunction with commercial nanocellulose in order to add advantages in detecting the signal to be measured is presented. The synthesis is made using sodium borohydride as the reducing agent and at low temperature in reducing the silver precursor (AgNO3) thus promoting a better distribution of nanoparticles
in aqueous solution. In this context, the inorganic salt has the function of avoiding the agglomeration of the nanoparticles and adding greater stability to the Ag+ ions. The base electrodes were composed based on the graphite/epoxy (GEC) 65/35% (w/w) composite and were aggregated with nanocomposites of silver and nanocellulose nanoparticles. These electrodes were tested by cyclic voltammetry in a solution of 10mM K4Fe(CN)6, pH 7.0 at
different scanning rates for the purpose of detecting the analyte of interest. The incorporation of the nanomaterials to the GEC base electrodes presented significant results in the conductivity of the sensor, ensuring its applicability.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Estrutura básica de um biosensor ... 16 Figura 2: Representação da enzima glicose oxidase pelo modelo de fitas... 21 Figura 3: Representação dos métodos de imobilização mais empregados. (A) Adsorção; (B) Ligação covalente; (C) Aprisionamento; (D) Encapsulamento; (E) Ligação cruzada. ... 23 Figura 4: Mecanismo de encapsulamento das AgNPs pelo Borohidreto de sódio ... 26 Figura 5: Aglomeração de uma solução coloidal de nanopartículas de prata ao longo do tempo ... 27 Figura 6: Estruturas química básicas dos nanotubos de carbono: (a) planar (b) nanotubo de carbono de simples parede (SWCNT) (c) nanotubos de paredes múltiplas (MWCNT) ... 28 Figura 7: Estrutura química da celulose ... 30 Figura 8: Esquema Eletroquímico da reação da Glicose Oxidase ... 33 Figura 9: Representação esquemática de três a geração de biossensores (a) Primeira geração (b) Segunda geração e (c) Terceira geração ... 37 Figura 10: Etapas da síntese e incorporação das NP’sAg a mistura de Grafite/Epóxi... 39 Figura 11: Eletrodo GEC. A) Montagem inicial com fio de cobre e tubo de teflon; B) Incorporação do compósito no sensor com um excesso da mistura C) Aspecto final após cura e polimento. ... 40 Figura 12: Espectros UV-Vis de AgNPs em tempos diferentes desde recentemente preparado até cinco dias depois ... 43 Figura 13: Voltamogramas cíclicos de sensor GEC em uma solução de K4Fe(CN)6, pH 7.0 a
diferentes velocidades de varredura (10, 30, 40, 75, 100 mV/s). ... 44 Figura 14: Voltamogramas cíclicos obtidos com os eletrodos sem e com nanocelulose impregnada com AgNPs em solução contendo K3[Fe(CN)6] 10mM em KCl 0,01M vs. Ag/AgCl
a velocidade de varredura de 100mV/s. ... 45 Figura 15: Relação da corrente de pico anódico e catódico em função da raiz quadrada da velocidade de varredura ... 47
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Transdutores empregados em biossensores ... 18
Tabela 2: Classificação das enzimas ... 22
Tabela 3: História dos Biossensores de Glicose ... 34
Tabela 4: Análise EDX de solução de AgNPs ... 43
Tabela 5: Comparação entre as correntes de pico dos eletrodos sem e com a aplicação Nanocelulose. ... 46
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
Ag Prata
AgNP Nanopartícula de Prata
AuNP Nanopartícula de Ouro
CB Celulose Bacteriana
CLEA Crosslinking Enzyme Aggregates CLEC Crosslinking Enzyme Crystals
CNTs Nanotubos de carbono
DDP Diferença de Potencial
Ep Potencial de pico
Epa Potencial de pico anódico Epc Potencial de pico catódico FAD Flavina Adenina Dinucleotídeo FADH2 Dinucleótido de flavina e adenina Fe(CN)6 Ferrocianeto de Potássio
GEC Grafite-Epóxi
GEC/AgNP Compósito Grafite Epóxi e Nanopartículas prata
GEC/Nafion/GOx Compósito Grafite Epóxi / Nafion e Enzima Glicose Oxidase GEC/NC/AgNPs Compósito Grafite Epóxi / Nanocelulose e Nanopartículas de prata
GOx Glicose Oxidase
H2O2 Peroxido de Hidrogênio
Ipa Corrente de pico Anódico (A) Ipc Corrente de pico Catódico (A)
IUPAC União Internacional de Química Pura e Aplicada
mV Milivolts
MWCNT Nanotubos de paredes múltiplas
N Número de elétrons NC Nanocelulose Nm Nanômetros NP Nanopartícula O2 Oxigênio QCM Quartz-Crystal Microbalance
SWCNT Nanotubo de carbono de simples parede
ʋ Velocidade de varredura (V/s)
ΔEp Diferença de Potencial (V)
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO E OBJETIVOS ... 13 1.1. Introdução ... 13 1.2. Objetivo ... 15 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 16 2.1. Biossensores ... 16 2.2. Tipos de Biossensores ... 17 2.2.1. Calorimétricos ... 18 2.2.2. Ópticos ... 18 2.2.3. Piezoelétricos ... 19 2.2.4. Eletroquímicos ... 19 2.2.4.1. Amperométricos ... 19 2.2.4.2. Potenciométricos ... 20 2.3. Bioreceptores ... 20 2.3.1. Enzimas ... 21
2.3.2. Aplicação das enzimas aos biossensores ... 22
2.3.3. Métodos de imobilização de enzimas ... 22
2.3.3.1. Imobilização por adsorção ... 23
2.3.3.2. Imobilização por ligação covalente ... 23
2.3.3.3. Imobilização por aprisionamento ou encapsulamento ... 24
2.3.3.4. Imobilização por ligação cruzada ... 24
2.4. Nanomateriais aplicados aos biossensores ... 24
2.4.1. Nanopartículas metálicas ... 25
2.4.2. Nanotubos de carbono ... 28
2.4.3. Nanocelulose ... 29
2.5. Métodos de controle glicêmico ... 32
2.5.1. Biossensores na medição do nível de glicose ... 33
2.6. Geração dos Biossensores ... 34
2.6.1. Biossensores de primeira geração ... 34
2.6.2. Biossensores de segunda geração ... 35
3. METODOLOGIA ... 38
3.1. Reagentes e Materiais ... 38
3.2. Síntese das nanopartículas de prata ... 38
3.2.1. Impregnação de nanocelulose com nanopartículas de prata ... 39
3.3. Confecção dos eletrodos ... 40
3.4. Caracterização das nanopartículas de prata ... 41
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 42
4.1. Caracterização da dispersão coloidal da solução de AgNPs ... 42
4.1.1. Caracterização por espectrometria de absorção atômica ... 42
4.1.2. Caracterização por espectrometria por energia dispersiva de raios X (EDX) ... 43
4.2. Caracterização eletroquímica dos eletrodos de trabalho por voltametria cíclica ... 44
4.2.1. Eletrodo grafite/epóxi com incorporação de nanopartículas de prata ... 44
4.2.2. Eletrodo grafite/epóxi/AgNps com incorporação de nanocelulose ... 44
5. CONCLUSÕES ... 48
5.1. Perspectivas e Sugestões para Trabalhos Futuros ... 48
1. INTRODUÇÃO E OBJETIVOS
Neste capítulo será abordado as razões nas quais motivaram o estudo da importância do uso de biossensores na atualidade, mostrando as vantagens do uso de matérias nanoestruturados para construção dos mesmos. Além disso, ressalta-se também a relevância do uso da nanocelulose e a tecnologia de imobilização enzimática na construção de biossensores. 1.1. Introdução
Nos últimos anos, o desenvolvimento de materiais nanoestruturados tem sido alvo de intenso estudo de muitos pesquisadores devido a sua enorme gama de aplicações em diversas áreas, como biologia, medicina, agroindústria e outras (HARRIS E GRAFFAGNINI, 2007; JOHNSTON, et al., 2005).
A nanotecnologia traz novas possibilidades para a construção de biossensores auxiliando no desenvolvimento de sensores eletroquímicos. Estes novos materiais tornaram-se muito interessantes porque as suas propriedades diferenciam das exibidas pelos seus precursores (FILHO e FAGAN, 2007). Dessa maneira, obtém-se a otimização de propriedades como: melhorias na capacidade de transferência de elétrons, biocompatibilidade, boa estabilidade e a possibilidade de imobilização de enzimas aliadas a dimensões reduzidas (GOPALAN, et al., 2009; WANG, et al., 2009). Diferentes tipos de nanocompósitos têm sido sintetizados como matrizes para a imobilização de enzimas, tais como nanocompósitos baseados em grafite, nanocompósitos à base de nanotubos, nanocompósitos à base de nanopartículas metálicas e assim por diante (CUI, et al., 2008; KANG, et al., 2009; AJEET, 2010; VIMAL, 2015; WANG, et al., 2009).
A integração dos nanomateriais em dispositivos eletroquímicos oferece uma fácil portabilidade aliado ao seu baixo custo, devido à facilidade de miniaturização tanto do material quanto ao sistema de transdução. A síntese de nanopartículas de prata é empregada para ter um melhor controle sobre o tamanho das partículas, distribuição, morfologia, pureza, quantidade e qualidade (AHMAD, et al., 2007).
A tecnologia de imobilização enzimática tem desempenhado um papel importante neste sentido, não só possibilita na fixação do componente para o transdutor, mas também favorece a estabilizá-lo para reutilização. O material biológico pode ser imobilizado diretamente sobre o transdutor ou em membranas, que podem ser subsequentemente montadas no transdutor (GARCIA, 2010). A escolha do método de imobilização depende de muitos fatores, tais como a natureza do elemento biológico, o tipo de transdutor utilizado, as propriedades físico-químicas
da substância a analisar e as condições de funcionamento do biossensor. Os reagentes consumidos ou produtos formados podem ser detectados ou medidos através de transdutores. A enzima álcool-oxidase é geralmente utilizada imobilizada para confecção dos biossensores eletroquímicos, monitorando o consumo de O2 ou a produção de H2O2. Esta enzima oxida
álcoois de baixo peso molecular aos seus aldeídos correspondentes utilizando como receptor de elétrons o oxigênio molecular (HERZENHAUT, 2013).
É bem conhecido que as propriedades dos nanomateriais dependem não só dos propriedades dos seus componentes individuais, mas também das suas características morfológicas e interfaciais resultantes da combinação de materiais distintos (SANCHEZ, 2010). Por conseguinte, a utilização de polímeros, tais como celulose, amido, alginato, dextrano, carragenano e quitosano, entre outros, apresenta grande relevância não só devido à sua natureza renovável e biodegradabilidade, mas também devido a uma grande variedade de formulações que pode ser explorada dependendo da funcionalidade desejada (TRINDADE, 2011; BELGACEM, 2008).
A nanocelulose (NC) vem se destacando no mundo dos materiais e da nanotecnologia devido sua propriedade química e mecânica. Em temperatura ambiente o material se apresenta em forma de pasta espessa e é obtida através do processamento da polpa de madeira (SOUZA, 2014). Quando se está entrelaçada, a nanocelulose pode formar materiais porosos e mecanicamente fortes, tais como papéis de nanocelulose, filmes ou aerogel. Estes materiais porosos podem ser utilizados como substratos para a impregnação de uma gama de diferentes nanomateriais (WEI, 2014). Além disso, na área de engenharia e meio ambiente a nanocelulose tem demonstrado grande potencial de aplicação em sensores eletroquímicos melhorando suas propriedades de condutividade elétrica, óptica e catalítica.
Neste trabalho, um compósito baseado em nanopartículas de prata impregnadas em nanocelulose foi utilizado para fabricação do sensor eletroquímico devido às suas propriedades únicas, tais como satisfatória biocompatibilidade, boa condutividade e extensa área de superfície que foram adquiridas devido as nanopartículas de prata (AgNPs) e nanocelulose.
1.2. Objetivo
O objetivo deste estudo é apresentar um eletrodo-compósito a base de grafite e epóxi baseado em nanopartículas de prata e nanocelulose comercial visando sua aplicação em detecção de analitos de interesse.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Neste Capítulo apresenta-se o estudo dos biossensores e suas aplicações. Também se apresenta a aplicação da nanocelulose com base na literatura cientifica. Nele são apresentados os conteúdos de apoio e referências da literatura para estudo, aplicação e elaboração das práticas experimentais realizadas no laboratório.
2.1. Biossensores
Um biossensor é um dispositivo analítico utilizado para a detecção de um analito de interesse, que combina um componente biológico com um detector físico-químico. Este é composto por 3 componentes básicos:
Elemento sensor biológico Transdutor
Dispositivo de processamento do sinal eletrônico
Diversos esforços e pesquisas na área científica e tecnológica têm sido feitas para obter avanços nos campos da engenharia de biotecnologia, a fim de atender as necessidades exigidas, seja pela complexidade de análise ou medição de por exemplo um analito numa solução e etc. Entende-se, por biossensoriamento o processo segundo o qual emprega-se materiais de origem biológica (enzimas, células, tecido animal ou vegetal, etc.) que combinado aos transdutores, que são dispositivos que convertem o que foi aferido em um tipo de sinal elétrico mensurável, sendo este proporcionalmente equivalente a magnitude ou frequência do analito alvo (FILHO, 1992; PATHAK, et al., 2007; WANG, 2000). Na figura 1 observa-se a estrutura básica de um biossensor.
Figura 1: Estrutura básica de um biossensor. Fonte: (CALIL e SILVA, 2011).
Os biossensores empregados nos processos de interação biológica podem também ser subdivididos em duas grandes categorias de sensores: sistemas de medição direta e indireta. Nos casos onde é feita diretamente, o biossensor se baseia numa medição direta de um fenômeno físico que ocorre durante uma reação bioquímica na superfície do transdutor. Enquanto que quando realizada indiretamente o biossensor necessita de um analito alvo, por exemplo a enzima. A nível de escolha sobre qual utilizar, o primeiro é de utilização simples e possui uma maior estabilidade ao passo, que o segundo é mais sensível, possui baixo custo e tempo de operação simplificado, logo a opção por um ou outro acaba sendo dependente das características do sistema que será empregado (MEHRVAR e ABDI, 2004; PATHAK, et al., 2007; LIU, et al., 2009).
As exigências e condições impostas pelos diferentes tipos de processos e objetivos de interesse no que se diz respeito as medições do analito, determinará qual o melhor sensor que será utilizado (SCHULTZ, 2001).
2.2. Tipos de Biossensores
O emprego de cada tipo de biossensor depende do fenômeno ou características que se deseja avaliar. Para cada amostra tem-se a combinação do material biológico a ser empregado e o transmissor mais apropriado para tal (FILHO e CAPELATO, 1992). Contudo, cada tipo de biossensor possui uma vantagem com relação aos demais, porém estudos comprovam que ainda não se obteve um transmissor característico para cada analito de interesse (KAMPRFATH e HINTSCHE, 2009).
Os biossensores podem ser classificados de acordo com o tipo de sistema em que este é constituído, e o elemento de transmissão que é empregado e utilizado acoplado ao componente biológico (MALHOTRA e TURNER, 2003; NAKAMURA e KARUBE, 2003). O emprego de cada tipo de transdutor vai depender do tipo de material que se deseja avaliar. Devido a suas características únicas como alta sensibilidade a variação da concentração do meio e facilidade de operação no presente trabalho, optou-se pela utilização da técnica de potenciometria como sistema de transdução. De uma maneira geral, esse tipo de técnica mede a diferença de potencial (DDP) entre um eletrodo indicador e um de referência. No que se refere a alguns dos tipos de transdutores na tabela 1 é apresentado os diferentes tipos de transdutores utilizados na construção de biossensores e suas principais aplicações.
Tabela 1: Transdutores empregados em biossensores.
Fonte: (SILVA, 2011).
2.2.1. Calorimétricos
Reconhecidos no mercado como termistores (THÉVENOT, 2001). Estes baseiam-se na detecção do calor que é produzido nos processos reacionais, seja uma mistura, ou ainda, uma diluição de componentes (MELO, 2008). Entretanto, uma grande parcela do calor não é quantificada, promovendo consequentemente a diminuição do grau de sensibilidade desse tipo de biossensor (MALHOTRA e TURNER, 2003; NAKAMURA e KARUBE, 2003; MEHRVAR e ABDI, 2004).
2.2.2. Ópticos
São biossensores baseados nas modificações de propriedades ópticas, onde é possível quantificar a concentração do analito alvo por meio de alterações na luz observada ou emitida em um sistema reacional, seja biológico ou químico (MALHOTRA e TURNER, 2003; NAKAMURA e KARUBE, 2003). Nesses as propriedades que podem ser observadas são: absorção, comprimento de onda, índice de refração, fluorescência, fosforescência e refletividade. Quando comparados a outros tipos de biossensores, não necessitam de constituintes ativos na biocamada e possuem um tempo de resposta mais curto (MALHOTRA e TURNER, 2003; NAKAMURA e KARUBE, 2003; MEHRVAR e ABDI, 2004).
2.2.3. Piezoelétricos
Constitui-se em cobrir a superfície do biossensor com um componente biológico (seletivo), que ao imergir o mesmo em um meio onde se encontra o analito alvo, a massa de quartzo cresce, e de maneira equivalente a frequência das oscilações diminuem (MEHRVAR e ABDI, 2004). Esse tipo de cristal possui uma aplicabilidade enorme em sistemas piezoelétricos devido a sua sensibilidade de alteração de massa e alta faixa de frequência (106 ciclos/segundos). Motivados pela característica única de sensibilidade deste tipo de biossensor, um tipo de sensor, Quartz-Crystal Microbalance (QCM), foi construído com o objetivo de quantificar as quantidades menores de massa (nanogramas) no momento em que algo entra em contato com o sensor e se adere ao mesmo (WANG, 2011).
2.2.4. Eletroquímicos
Consistem do elemento biológico, o qual reconhece o analito alvo e o eletrodo -transdutor, que "traduz" o fenômeno do bio-reconhecimento em um sinal elétrico útil. Constituem-se de uma classe que possuem como características: instrumentação de baixo custo, sensíveis, confiáveis e com resposta rápida. Além disso, não se faz necessário realizar um tratamento prévio para emprega-los e abrangem uma ampla faixa de concentração. O material biológico tem a função de fazer o reconhecimento do substrato e o transdutor (traduzir o sinal medido em algo mensurável). Estes, são amplamente empregados na área clínica, seja para testes de monitoramento ou diagnósticos (GAUA, 2005; SANTOS, et al. 2016).
Os biossensores eletroquímicos podem ser de três tipos: potenciométrico, condutométrico e amperométrico.
2.2.4.1. Amperométricos
Mensuram a corrente elétrica proveniente do processo oxidativo ou redutivo de uma espécie eletroativa, comumente no ato de transferência dos elétrons entre o substrato e o transdutor (THÉVENOT, 2001; WANG, 2008). Porém, operam por meio do processo difusivo e por isso, tem como pontos negativos: apresentar uma parte reduzida, devido a saturação das enzimas, um acréscimo de aumento dos potenciais que acarretam na oxidação de constituintes afetando assim as correntes, que são influenciadas pela velocidade de difusão do substrato até ao eletrodo. Mas estudos baseados nas limitações dos processos difusivos vêm sendo feitos, de modo a garantir que a concentração do analito permaneça em níveis mais baixos de saturação da enzima (PEREZ, 2000).
2.2.4.2. Potenciométricos
Medem a diferença de potencial (DDP) entre um eletrodo indicador e um de referência ou ainda, entre dois de referência isolados por uma membrana permeável, onde é inexistente a presença de corrente (THÉVENOT, 2001). Dentre os biossensores potenciométricos, os de íon-seletivo vem sendo muito empregados na detecção de íons de natureza orgânica e inorgânica em análises ambientais, clínicas e até mesmo industriais (BRATOV, et al., 2010).
2.2.4.3. Condutimétricos
O transdutor condutimétrico mede a mudança na condutância entre um par de eletrodos metálico como consequência de um componente biológico. Dificilmente empregadas, mas quando utilizado possibilita aferir a alterações de condutância existente, pela utilização da enzima (de ação catalítica), que pode consumir ou produzir constituintes iônicos modificando assim o número de cargas do eletrólito (MELO, 2008; WANG, 2008). Esse tipo de biossensor não exige o uso de eletrodos de referência. O sinal obtido neste caso, depende significamente da temperatura, logo impossibilitam de serem estáveis e as amostras analisadas jamais devem ser diluídas (GERARD, et al., 2002).
2.3. Bioreceptores
A biocamada que constitui os biossensores inclui o bioreceptor ou material biológico de alta seletividade, permitindo diferenciar em alguns casos, isómeros de uma molécula. Existem diferentes tipos de bioreceptores que se podem imobilizar sobre os transdutores, tais como: anticorpos, ácidos nucleicos, microorganismos, tecidos orgânicos, e enzimas.
Dentre as opções, quanto ao uso do elemento de reconhecimento biológico destacam-se as enzimas. A aplicabilidade prática dos biossensores enzimáticos permitem que alterem não apenas o grau de especificidade, mas também, o tempo de resposta frente ao analito (KARIM e FAKHRUDDIN, 2012). A utilização das enzimas pode por um lado acarretar pontos não vantajosos no processo de obtenção do biossensor, pois não são muito estáveis quando submetidas a variações físico-químicas, porém esse ponto pode ser contornado ajustando por exemplo a temperatura, pressão ou pH do meio em que a reação ocorre (MELO, 2008). Sendo as mais utilizadas na produção de biossensores devido à sua disponibilidade no mercado e fácil manipulação no seguinte item se descreverá com mais detalhe o referido bioreceptor.
2.3.1. Enzimas
As enzimas são proteínas que tem a capacidade de poderem ser utilizadas como agentes catalisadores em reações, como por exemplo as biológicas (FILHO e CAPELATO, 1992). A aplicabilidade desta no processo de catálise se deve ao fato de essas possuírem alta especificidade e seletividade (NELSON e COX, 2002). A figura 2 apresenta uma representação ilustrativa da enzima glicose oxidase (GOx) pelo método de fitas.
Figura 2: Representação da enzima glicose oxidase pelo método de fitas.
Fonte: (PROTEIN DATA BANK, 2016).
As enzimas podem ser classificadas por uma diversidade de modos, contudo o mais comum e de maior importância dentre eles é o estabelecido pela IUPAC (MARQUES, 2012). Neste caso, as enzimas podem ser classificadas de acordo com a classe e o tipo de reação que essas promovem (COPELAND, 2000). Na tabela 2, pode-se observar as classificações das enzimas e o tipo de reação associada.
Tabela 2: Classificação das enzimas.
Fonte: (COPELAND, 2000).
2.3.2. Aplicação das enzimas aos biossensores
As enzimas têm sido vastamente empregadas em biossensores, onde essas atuam como meio de identificação, devido as suas características catalíticas e elevada especificidade. A aplicabilidade prática dos biossensores enzimáticos permitem que alterem não apenas o grau de especificidade, mas também o tempo de resposta frente ao analito (KARIM e FAKHRUDDIN, 2012). A utilização das enzimas, pode por um lado acarretar pontos não vantajosos no processo de obtenção do biossensor, pois não são muito estáveis quando submetidas a variações físico-químicas, porém esse ponto pode ser contornado ajustando por exemplo a temperatura, pressão ou pH do meio em que a reação ocorre (MELO, 2008).
2.3.3. Métodos de imobilização de enzimas
Um outro ponto de interesse a considerar ainda na primeira etapa da elaboração de um biossensor baseado em enzimas é a imobilização desta molécula em uma matriz capaz de garantir totalmente ou em parte as características da enzima. Contudo, desafios que dizem respeito a uma melhor imobilização com a finalidade de obtenção de filmes mais concentrados por tempos maiores, consistem em efetuar a deposição em uma matriz constituída de moléculas que promovam uma resposta mais rápida e de sinal que pode ser medido (NOBRE, et al., 2010). A imobilização enzimática pode ser feita fisicamente, onde neste caso há uma interação entre o suporte utilizado e a enzima empregada para tal, e também pode ocorrer quimicamente, onde
há presença de ligações covalentes entre eles (CARVALHO, et al., 2006). Na presente figura 3, exemplifica-se alguns tipos dos métodos de imobilização de enzimas.
Figura 3: Representação dos métodos de imobilização de enzimas mais empregados. (A) Adsorção; (B) Ligação covalente; (C) Aprisionamento; (D) Encapsulamento; (E) Ligação
cruzada.
Fonte: (SCHÖFFER, 2013).
2.3.3.1. Imobilização por adsorção
Neste caso, a enzima é adsorvida por forças de interações fracas (interação eletrostática, força de Van der Waals ou ligação de hidrogênio). Dentre os métodos existentes este se enquadra entre os mais simples, de baixo custo e não há necessidade de realização de pré-tratamento, porém a enzima pode acabar sendo dessorvida se estiver sendo empregada em meios aquosos
2.3.3.2. Imobilização por ligação covalente
Dentre os métodos de imobilização este apresenta um grau de complexidade maior, devido a necessidade de ativar previamente ou realizar um impedimento de grupos reativos pós-imobilização (GALASIS, 2011). O emprego e a utilização do método garantem que a enzima fique fixa e impede que migre para o meio facilmente, evitando com isso a contaminação do produto de interesse. O aumento do número das ligações covalentes das enzimas diminui a
desnaturação da proteína e vibrações térmicas, contudo a alteração química promove uma diminuição do grau de atividade das enzimas (CAO, 2005).
2.3.3.3. Imobilização por aprisionamento ou encapsulamento
Neste método de imobilização os suportes empregados possuem a função de aprisionar ou até mesmo encapsular a enzima, contudo existem algumas restrições quanto aos tamanhos dos poros desses que devem permitir a difusão do substrato utilizado sem maiores dificuldades garantindo ainda que a enzima permaneça fixa. Uma das maiores dificuldades para este caso, está na utilização de substratos com tamanhos maiores e a alta instabilidade dos suportes, que limitam seu uso em espaços de tempo maiores (CARVALHO, et al., 2006).
2.3.3.4. Imobilização por ligação cruzada
Consiste em utilizar suportes ou emprega-se o uso de biocatalisadores interligados na imobilização das enzimas que oferecem vantagens como: baixo custo de produção, alta estabilidade e nível de atividade alto (SHELDON, 2007). No referido método, as enzimas quando imobilizadas sem suporte utilizam-se cristais de enzimas reticulados (CLEC) ou os chamados cristais de agregados (CLEA) nos casos onde se emprega a CLEC a enzima pura, é cristalizada e em seguida é feita a adição do agente químico (permite a formação das ligações cruzadas) com a finalidade de realizar a reticulação química e quando se faz o uso da CLEA essa reticulação é realizada após o processo de junção das enzimas (CAO, 2005).
2.4. Nanomateriais aplicados aos biossensores
A nanotecnologia é uma ciência multidisciplinar que envolve o desenvolvimento e preparação de sistemas com um tamanho na escala dos nanômetros (LANE, 2011). É um ramo que compreende a utilização de partículas pequenas com um tamanho entre 1-1000 nm e que explora novas propriedades da matéria a uma nanoescala (NASIR, 2010). Atualmente a ciência de materiais atingiu um alto nível de sofisticação. Isso é resultado de um progresso contínuo da síntese, funcionalização e manipulação em escalas micro e nano. A maioria dos materiais exibe propriedades diferenciadas quando diminuídos para a escala nanométrica, que não podem ser extrapoladas como comportamento do material bulk. No entanto, a nanotecnologia não é somente a miniaturização das escalas. Em geral, nanotecnologia pode ser entendida como o design, a fabricação e aplicação de nanoestruturas e nanomateriais. Engloba materiais e sistemas cujas estruturas e componentes exibem novas e grandes melhorias nas propriedades físicas, químicas e biológicas devidas ao seu tamanho (SMART e MOORE, 2005). Materiais
nanoestruturados podem ter diferentes morfologias e incluem nanopartículas esféricas, nanobastões, nanofios, filmes finos e materiais bulk constituídos de nanoestruturas, em meio a estes as nanopartículas metálicas, devido ao fácil controle de suas propriedades como tamanho e qualidade são mais amplamente empregadas em sensores.
Os nanomateriais têm demonstrado as suas propriedades para aplicações em biossensoriamento. O uso inteligente dos nano-objetos levou a atingir desempenhos com maiores sensibilidades e redução dos valores de limites de detecção. Uma vantagem geral do uso de nanomateriais é uma elevada área de superfície específica, permitindo assim a imobilização de uma quantidade maior de bioreceptores. No entanto, um dos desafios constantes é a estratégia de imobilização utilizada para conjugar o bio-receptor e os nanomateriais. Além do mais, a técnica usada para a imobilização da enzima é um dos fatores-chave no desenvolvimento e confiabilidade do biossensor (HOLZINGER, et al., 2014).
2.4.1. Nanopartículas metálicas
Na era da nanotecnologia, as nanopartículas (NPs) de metais nobre têm desempenhado um papel importante no desenvolvimento de novos biossensores e no aprimoramento das existentes técnicas biossensoriamento para atender a demanda de diagnósticos mais específicos e altamente sensíveis. De fato, as NPs são em geral, uma das abordagens mais comuns na nanotecnologia no desenvolvimento de biossensores, devido a sua simplicidade, maleabilidade e elevada área de superfície (AZZAZY, 2009). As NPs podem medir entre 1 a 100 nm de diâmetro, têm formas diferentes e podem ser compostas de um ou mais compostos inorgânicos, tais como metais nobre, metais pesados, ferro e etc (WANG, et al., 2009).
Nanopartículas metálicas possuem aplicações em muitas áreas, incluindo biomédica, ciência dos materiais e catálise, sua incorporação pode efetivamente melhorar as propriedades elétricas, ópticas e dielétricas dos compósitos, elas atuam como condutores entre o grafite resultando em um aumento da condutância elétrica do compósito (BÜHLMANN, 2008). Numerosas técnicas têm sido desenvolvidas para sintetizar NPs metálicas, incluindo métodos químicos (por exemplo, redução química, redução fotoquímica, co-precipitação, decomposição térmica, hidrólise, etc.) e métodos físicos (por exemplo, deposição de vapor, ablação por laser, moagem e etc), no qual o objetivo principal é a obtenção de NPs com um bom nível de homogeneidade e proporcionar um bom controle sobre propriedades como: tamanho, forma e área de superfície (SPERLING e PARAK, 2010).
A síntese de nanopartículas por métodos de redução químicos são muitas vezes executadas na presença de estabilizadores, de modo a evitar a aglomeração indesejada da
solução coloidal de nanopartículas. A maioria das aplicações de biossensoriamento baseados em NPs que têm sido desenvolvidos até agora baseiam-se na NPs de ouro, devido às suas propriedades ópticas únicas e facilidade de derivatização com diferentes biomarcadores em solução aquosa (SPERLING, et al., 2008). Geralmente, o método de escolha para sintetizar NPs de prata esféricas é o método primeiramente desenvolvido por Turkevich (1951) no qual há redução química de íons de Ag+ em Ag0 utilizando borohidreto de sódio como agente redutor e esta última otimizado por Frens (1973) (GONÇALO, et al., 2012). Nessa abordagem, como mostrado na Figura 4 o borohidreto de sódio atua tanto como agente de redução como agente encapsulante, então na medida em que se forma as NPs de prata, elas são impedidas de formarem partículas maiores e, simultaneamente, conferindo-lhes uma estabilidade média, devido à repulsão eletrostática entre as NPs de prata cobertas do íon BH4- (WILCOXON e
ABRAMS, 2006).
Figura 4: Mecanismo de encapsulamento das AgNPs pelo borohidreto de sódio.
Fonte: (AGNIHOTRIA e MUKHERJI, 2014).
Modificações recentes do método de Turkevich permitiram uma melhor distribuição e controle sobre o tamanho das nanopartículas de ouro, onde uma grande quantidade entre 9-120 nm pode ser alcançada apenas pela variação da razão citrato/Au (DANIEL e ASTRUC, 2004; KIMLING, et al., 2006; TRÉGUER-DELAPIERRE, et al., 2008).
As nanopartículas de prata (AgNPs) tem sido amplamente estudadas e aplicadas devido às suas propriedades únicas (como propriedades ópticas, elétricas e magnéticas) que podem ser incorporadas em aplicações antimicrobianas, fibras compostas, materiais supercondutores criogênicos, produtos cosméticos, componentes eletrônicos e materiais para biossensores (SANTOS, et al., 2016).
Assim como na síntese de AuNPs o método mais comum empregado na obtenção de AgNPs é também o método de Turkevich, que é baseado numa reação de oxi-redução entre o citrato e o sal metálico. Trata-se de uma maneira simples, rápida, de baixo custo, reprodutível e segura de sintetizar NPs com dimensões, aproximadamente 20 nm, que são responsáveis pela alta atividade cinética proporcionando uma maior interação com o substrato (TURKEVICH, et
al., 1951).
O espectro de absorção da solução coloidal de AgNPs, exibe uma banda de absorção em aproximadamente 400 nm, apresentando uma cor amarelo ouro que é característica das AgNPs. A medida em acontece a aglomeração das nanopartículas o espectro da solução coloidal muda como mostrados na Figura 5. Tais bandas são propriedades físicas dessas nanopartículas. Quando um campo eletromagnético externo, como a luz por exemplo é aplicado a um metal, os elétrons de condução se movem em conjunto, de modo a alterar a distribuição eletrônica perturbado que é conhecido como plasma localizada perto da superfície do metal.
Figura 5: Aglomeração de uma solução coloidal de nanopartículas de prata ao longo do tempo.
Fonte: (MULFINGER, 2007).
A confecção de eletrodos quimicamente modificados com as AgNPs vem aumentando. Uma vez que a prata é quatro vezes mais econômica que o ouro, demonstra excelente atividade catalítica, boa condutividade elétrica e térmica, sua aplicação em eletroanálises é muito favorável atuando como pré-concentradores de espécies de interesse e/ou mediando reações redox (OLIVEIRA, 2012).
2.4.2. Nanotubos de carbono
Durante vários séculos, os materiais mais conhecidos formados por carbono eram o diamante e o grafite. Em 1985, os cientistas descobriram que os átomos de carbono também podiam se organizar no espaço de forma oval, como os fulerenos (TANG, et al., 2006). As pesquisas científicas envolvendo estruturas baseadas em carbono puro cresceram após a descoberta dos fulerenos, o que ocasionou um maior interesse de estudo nessas estruturas, levando à descoberta de uma série de novas formas, como os nanotubos de carbono (CNTs), os quais foram obtidos por Lijima em 1991 como subproduto na síntese de fulerenos (SOUZA, 2007). Desde então houve uma crescente busca pelos pesquisadores para elucidar o uso do nanomaterial em distintos dispositivos.
A estrutura química dos nanotubos de carbono é formada por uma folha de grafeno enrolada (que consiste em átomos de carbono que constituem uma estrutura bidimensional com hibridização sp2), ligados em hexágonos como pode ser observado na figura 6, cujo empilhamento resulta na estrutura do grafite, em dimensões nanométricas, formando uma cavidade interna oca (AWASTHI, et al., 2005). Na figura 6, tem-se exemplificado as estruturas químicas básicas dos nanotubos de carbono.
Figura 6: Estruturas químicas básicas dos nanotubos de carbono: (a) planar; (b) nanotubo de carbono de simples parede (SWCNT); (c) Nanotubos de paredes múltiplas (MWCNT).
Fonte: (KREUPL, et al., 2004).
Os CNTs têm encontrado várias aplicações, dentre elas: ponteiras para microscopia de varredura por sonda, como transistores de efeito de campo, retificadores eletrônicos, eletrodos para supercapacitores e para sensores (RIVAS, et al., 2007; HEGDE, et al., 2009). Em 1996,
Britto e Santhanan foram os pioneiros na aplicação dos CNTs para biossensores. Desde então, a pesquisa de desenvolvimento de biossensores utilizando CNTs tem sido empregada devido a suas propriedades como o aumento das iterações eletrodo-proteína, resultando em correntes faradaicas muito altas.
Os CNTs possuem diversas propriedades que atraem seu uso na aplicação de biossensores, eles têm elevada razão área superfície/volume, conferem aos eletrodos modificados maior área eletroativa, promovem reações de transferência de elétrons e baixos sobrepotenciais, melhoram a reversibilidade de alguns processos. Além disso, possuem alta condutividade elétrica, boa estabilidade química e resistência mecânica, permitem melhor imobilização de enzimas, antígeno, anticorpo, ácidos nucléicos (OU, et al., 2007; REZAEI e DAMIRI, 2008).
Através da modificação dos CNTs é possível torná-los seletivos. Então, muitos esforços e pesquisas vêm sendo feitas para otimização e estabilidade da aplicação desses nanomateriais. Isto pode ser alcançado pela correta funcionalização, conjugando grupos reativos, tais como grupos carboxílicos ou aminas. Assim os CNTs são imobilizados facilmente e ficam mais estáveis na superfície do eletrodo. Tal fato é muito importante para o desenvolvimento de biossensores em que as ligações de materiais biológicos são desejadas (FENG, et al., 2003; YUN, et al., 2007).
2.4.3. Nanocelulose
Nos últimos anos o interesse tecnológico em materiais renováveis e recursos ecológicos e sustentáveis aumentou exponencialmente principalmente no que se diz respeito a pesquisa e aplicação de nanocompósitos de celulose (KLEMM, 2005). De fato, dentro dos polímeros obtidos a partir de fontes renováveis, a celulose é o polímero natural mais abundante na natureza, bem como o componente mais importante do ‘esqueleto’ das plantas. O biopolímero formado por repetidas conexões de blocos de glicose (figura 7) é a base estrutural das paredes celulares de praticamente todas as plantas e é geralmente considerada uma fonte quase inesgotável de matérias-primas (KLEMM, 2005; ROBERTS, 1996).
Figura 7: Estrutura química da celulose.
Fonte: (ROJAS, et al., 2015).
Caracterizada por suas interessantes propriedades como hidrofilicidade, quiralidade, biodegradabilidade, ampla capacidade de modificação química, formação de diferentes morfologias de fibras semi-cristalinas, a celulose tem uma significância particular devido a sua estrutura e clara tendência para formar ligações intramoleculares e ligações intermoleculares. As características influenciam no arranjo desta supermolecula de celulose, que juntamente com aspectos práticos, tais como a origem do produto e processo de tratamento, terão uma importância significativa sobre as suas propriedades finais. Este polímero é o principal constituinte de fibras longas e curtas, o que representa cerca de 40-45% de madeira seca, sendo a polpa da madeira restante a fonte mais importante para o processamento de celulose, ou seja, na fabricação de papel (KLEMM, et al., 2005; SJOSTROM, 1993; KLEMM, et al., 2006). A celulose também é amplamente utilizada na área biológica e em aplicações biomédica como o principal componente das membranas de diálise (Celulose regenerada) e TNT. Da mesma forma, celulose bacteriana (CB) e outros hidrogéis nanocelulose têm encontrado aplicações biomédicas no desenvolvimento de dispositivos médicos, tais como vasos sanguíneos artificiais, aplicação de nanocelulose bacteriana como curativos de tecido animal e cosméticos (JORFI e E., 2014).
Variadas formas de nanocelulose como nanocompósitos, géis, membranas de microdiálise, celulose microfibrilada e moldes de enxerte de superfície vem sendo
caracterizadas e discutidas devido a suas propriedades morfológicas (KLEMM, et al., 2011). Mais especificamente, materiais incluindo nanotubos de carbono, sílica, ouro mesoporoso, pontos quânticos, dendrímeros, biopolímeros e blocos de copolímeros, quando combinados com nanocelulose têm-se mostrado úteis na otimização do biosensor (KANG, et al., 2013).
Os derivados de celulose em forma de blocos de copolímeros vem sendo propostos como respostas mediadoras a estímulos que podem ser preparados regiosselectivamente modificados por meio de dissolução da celulose em líquidos iónicos, e modificado através de polimerização por radicais (KANG, et al., 2009). Celulose regiosseletivamente modificada como um derivado de polietileno glicol também é sintetizada e utilizada para dar origem a filmes modelados a favo de mel que são formados com base em propriedades anfilico celulósico (XU e KADLA, 2012). Moléculas fluorescentes e ponto de quântico são geralmente associadas aos filmes para demonstrar a potencial funcionalidade em áreas especificas adequada para os biossensores.
As enzimas podem se unir com nanocelulose através de ligações covalentes, pontes salinas, e com complexas inclusões físicas (ICANI, et al., 2013; YILUN, et al., 2012). As propriedades de superfície hidrófila proporcionam uma matriz biocompatível para a atividade seletiva ocorrer. A glicose oxidase imobilizada em celulose nanocristalina com nanopartículas de ouro ligadas através de derivados de tióis de polietilenoimina proporcionam vários níveis de atividade em função da ponte de tiol (ICANI, et al., 2013). Dendrímeros como ligantes agregados a antígenos também são usualmente ligados a nanocelulose e combinados com zeólitas para melhorar o reconhecimento específico pelo anticorpo (SANCHEZ, et al., 2012).
Desde o primeiro biosensor relatado, a glicose oxidase despertou interesse cientifico, e vem sendo estudada no monitoramento de glicose para controle de diabetes (CLARK e LYONS, 1962). Atualmente, a glicose oxidase, também tem sido imobilizada em compósitos de nanotubos de carbono e celulose bacteriana-filtrada depositada sobre eletrodos, aumentando uma transferência eletrônica direta entre a glicose e a glicose oxidase no sensor (KIM, et al., 2013). Além disso, testes vem propondo o uso de nanoparticulas quaternizadas de celulose, combinadas com acetileno preto, no qual é utilizado para inclusão física da glicose oxidase sobre a superfície de elétrodos proporcionando uma maior sensibilidade aos niveis de glicose e de peróxido de hidrogênio (LI, et al., 2012). No seguinte item se apresentará o método de controle glicêmico paar ilustrar essa aplicação.
2.5. Métodos de controle glicêmico
Diabetes mellitus é um problema de saúde pública mundial. Esta desordem metabólica resulta da deficiência de insulina e hiperglicemia e é refletida por concentrações de glicose no sangue maior ou menor do que o intervalo normal de 80-120 mg / dl (4,4-6,6 mM). A doença é uma das principais causas de morte e incapacidade no mundo. As complicações da diabetes são numerosas, incluindo os riscos mais elevados de doença cardíaca, insuficiência renal e cegueira. Tais complicações podem ser grandemente reduzidas através do controle pessoal rigoroso da glicose no sangue (REACH e WILSON, 1992).
O diagnóstico e tratamento de diabetes mellitus, requer um controle severo dos níveis de glicose no sangue. Assim, milhões de diabéticos devem testar os seus níveis de glicose no sangue diariamente, fazendo com que a glicose seja o analito mais comumente analisado. Consequentemente, os biossensores de glicose são responsáveis por cerca de 85% de todo o mercado de biossensores. Tal crescente demanda faz com que o mercado cresça consideravelmente cada ano e se torne uma doença modelo para o desenvolvimento de novos conceitos de biossensoriamento. As perspectivas econômicas associadas à gestão da diabetes, juntamente com o desafio de fornecer esse controle glicêmico confiável e preciso levou pesquisadores do mundo todo a desenvolverem técnicas inovadoras de detecção (REACH e WILSON, 1992; WANG, 2001). Eletrodos amperométricos de enzima, baseado em glicose oxidase (GOx), têm desempenhado um papel de liderança no movimento para testes dos níveis de açúcar no sangue e devem desempenhar um papel similar no movimento em direção a monitorização contínua da glicose.
2.6. Princípios básicos de funcionamento de um biossensor de glicose
O conceito básico de um biossensor de glicose é baseado no fato da GOx imobilizada catalisa a oxidação de β-D-glicose pela molécula de oxigênio, produzindo ácido glicólico e peróxido de hidrogênio, representado na Equação 2.1 (WEIBEL e BRIGHT, 1971). Para funcionar como um catalisador, a GOx requer um cofator redox de Flavina Adenina Dinucleotídeo (FAD). O FAD funciona como o aceptor inicial de elétrons e é reduzido a FADH2
como representado na equação 2.2.
Glicose + GOx + FAD++ → Gluconolactona + GOx + FADH2 (2.2)
Este cofator é regenerado por meio de reação com o oxigênio, o que leva à formação de peróxido de hidrogênio (equação 2.3).
GOx + FADH2 + O2 → GOx + FAD + H2O2 (2.3)
Como visto na reação acima o peróxido de hidrogênio é oxidado em um eletrodo de platina (Pt). O eletrodo consegue facilmente reconhecer o número de elétrons que estão sendo transferidos, e através deste fluxo de elétrons é possível calcular o nível de glicose presente no sangue (GUILBAULT e LUBRANO, 1973a). Como pode ser visto na Figura 8 abaixo:
Figura 8: Esquema eletroquímico da reação da Glicose Oxidase.
Fonte: (TURNER, et al., 1999).
2.5.1. Biossensores na medição do nível de glicose
Embora uma variedade de sensores de glicose esteja disponível, o princípio do biossensor de glicose mudou muito pouco ao longo de vários anos (Tabela 3). No entanto, o primeiro medidor de glicose no sangue não foi um biossensor, foi um Medidor de reflectância Ames (MRA) (Miles Laboratories, Elkhart, IN, EUA) com base em uma reflectómetro de Dextrostix introduzido em 1971. Dextrostix, o primeiro método de medição da faixa de glicose
no sangue está disponível desde 1965, e foi originalmente concebido para mostrar mudanças de cores (DRURY, et al., 1965; KORP, 1965).
Tabela 3: História dos Biossensores de Glicose.
Fonte: Adaptado de (YOO e LEE, 2010).
2.6. Geração dos Biossensores
Os biossensores amperométricos se classificam em três gerações, podendo ser de primeira, segunda e terceira geração, de acordo com o processo envolvido na transferência de carga, reconhecimento do analito, geração e processamento do sinal.
2.6.1. Biossensores de primeira geração
O princípio básico da primeira geração de biossensores de glicose é a quantificação da glicose através da detecção eletroquímica do H2O2 liberado, onde a corrente produzida é
proporcional à sua concentração. Em um biossensor de glicose amperométrico, as medidas são normalmente realizadas utilizando um eletrodo de platina e o potencial de trabalho sobre o qual é detectado o H2O2 é tipicamente entre 500-750 mV vs. Ag/AgCl (GUILBALT e LUBRANO,
1973).
Medidas de formação de peróxido de hidrogênio têm a vantagem de serem mais simples, especialmente quando estão relacionados a dispositivos miniaturizados (UPDIKE e HICKS,
1967). No entanto, o principal problema com a primeira geração de biossensores de glicose era que a medição amperométrica de peróxido de hidrogénio necessitava de um elevado potencial de operação para uma alta seletividade.
A detecção de peróxido de hidrogênio também pode ser realizada pela redução do mesmo em eletrodo de platina segundo a Equação 2.4:
H2O2 + 2H+ + 2é→ 2H2O (2.4)
A dependência da necessidade de consumo de O2 pela via enzimática se tornou um
grande problema para os biossensores baseados em peroxido de hidrogênio pois sua concentração pode variar de acordo com o meio. Com efeito de diminuir a dependência do sinal amperométrico com o meio, membranas com características hidrofóbicas foram usadas de modo a restringir o fluxo de glicose, admitindo uma maior concentração de oxigênio.
A baixa solubilidade de O2 em solução aquosa, a dificuldade associada com o controle
da pressão parcial de produtos gasosos e o alto potencial aplicado, levaram ao desenvolvimento de biossensores amperométricos de segunda geração (WANG, 2008).
2.6.2. Biossensores de segunda geração
As limitações dos biossensores de glicose da primeira geração foram superadas utilizando biossensores mediadores de glicose. As melhorias foram conseguidas através da substituição de oxigênio com aceptores de elétrons não-fisiológicos, chamados mediadores redox que foram capazes de transportar elétrons a partir da enzima para a superfície do eletrodo de trabalho (LIU e WANG, 2001). Após a oxidação da β-D-glicose pela GOx, a forma reduzida de um mediador é formada em vez de peróxido de hidrogênio e, em seguida reoxidada no eletrodo, fornecendo um sinal amperométrico e regenerando a forma oxidada do mediador como apresentado nas equações 2.5, 2.6 e 2.7 (TURNER, et al., 1999). Uma variedade de mediadores de elétrons, tais como ferroceno, ferricianeto, quininos, tetrathialfulvalene (TTF), tetracianoquinodimetano (TCNQ), tionina, azul de metileno, e metilviologênio são utilizados para melhorar o desempenho do sensor (CASS, et al., 1984; CHAUBEY e Malhotra, 2002).
β-D-glicose + GOx(FAD++) →Gluconolactona +GOx(FADH 2)
FADH2 → FAD++ + 2MED(red) +2H+
2MED(red) → 2MED(ox) +2e-
(2.5) (2.6) (2.7)
Sendo Med(ox) e Med(red) as formas oxidadas e reduzidas, respectivamente, dos
mediadores. No caso do uso de mediadores, estes reagem rapidamente com a enzima reduzida, precisam ser preferencialmente não tóxicos e quimicamente estáveis (em ambas as formas reduzida e oxidada), e possuir um baixo potencial redox (LIU e WANG, 2001).
Várias estratégias foram empregadas para facilitar a transferência de elétrons entre o centro da GOx reduzida e a superfície do eletrodo como, a modificação química da GOx com grupos de retransmissão de elétrons e a aplicação de nanomateriais como condutores elétricos. O uso de mediadores se tornou uma técnica amplamente utilizada na fabricação de biossensores de glicose comerciais para uso próprio, pois sua independência do sinal com relação concentração de O2 e custo acessível possibilitou a produção em larga escala desses
biossensores (FERNANDES, 2005). Apesar disso, a limitação do transporte de massa por difusão dos elementos responsáveis pela troca eletrônica com o eletrodo do sistema motivou a busca por um novo método de medição, o que levando a terceira geração de biossensores de glicose.
2.6.3. Biossensores de terceira geração
Os biossensores de glicose de terceira geração são baseados na transferência direta de elétrons entre a enzima e o eletrodo, sem mediadores. Em vez de mediadores de alta toxicidade, o eletrodo pode realizar transferências eletrônica direta utilizando materiais condutores orgânicos baseados em complexas transferências de cargas (KHAN, et al., 1996; PALMISANO, et al., 2002). Portanto, biossensores de glicose de terceira geração levaram a dispositivos do tipo agulha implantáveis para monitorização ‘in vivo’ de glicose no sangue contínuo. A ausência de mediadores fornece aos biossensores uma seletividade superior. No entanto, apenas algumas enzimas, incluindo as peroxidases provaram exibir uma transferência eletrônica direta na superfície do eletrodo (ZHANG e LI, 2004; MARTINS, et al., 2003). Na figura 9 abaixo está esquematizado as três gerações de biossensores amperométricos baseados em oxidases.
Figura 9: Representação esquemática de três gerações de biossensores (a) Primeira geração (b) Segunda geração e (c) Terceira geração.
Fonte: Adapatado de (SATVEKAR, et al., 2014).
3. METODOLOGIA
O capítulo de metodologia em quatro secções. Na primeira descreve-se os reagentes e materiais empregados. Na segunda secção expõe-se o a síntese das nanopartículas de pratas e seu encapsulamento mediante a nanocelulose e na terceira secção é feita uma descrição da construção dos eletrodos em estudo. Na quarta secção aborda-se todo o procedimento relativo à caracterização das mesmas.
3.1. Reagentes e Materiais
Os reagentes utilizados foram grafite em pó (Vetec), nanocelulose em gel, obtida da Suzano Papel e Celulose S/A, resina epóxi DER 332 adquiridos da Sigma-Aldrich, nitrato de prata, borohidreto de sódio, ferrocianeto de potássio, cloreto de potássio e cloreto de potássio adquiridos da Vetec. Os reagentes utilizados no estudo foram preparados de maneira analítica e o solvente utilizado foi água destilada. Para análise da resposta eletroquímica por meio de voltametria cíclica foi utilizado um potenciostato com módulo de espectroscopia de impedância eletroquímica integrada marca Ivium, modelo CompactStat (Ivium Technologies, The Netherlands) controlado por um computador via software dá IviumSoft. As experiências foram realizadas em uma célula eletroquímica estática a 25°C a diferentes velocidades de varredura (10, 30, 50,75, 100 mV/s).
A célula eletroquímica é composta por três eletrodos: Eletrodo de Platina, eletrodo de referência Ag/AgCl (3M) e o eletrodo de trabalho onde é fixado o compósito Grafite/Epóxi (GEC) impregnados de nanopartículas de prata, nanocelulose (GEC/NC/AgNPs). Como solução eletrolítica padrão utilizou-se uma solução aquosa de K4Fe(CN)6 10 mM, em KCl
0,01M, pH 7.0. As experiências amperométrica foram realizadas num sistema agitado aplicando um potencial de -0,4V a +0,8V ao eletrodo de trabalho. Todas as soluções foram purgadas com N2 de elevada pureza durante pelo menos 20 min antes das experiências.
A preparação de cada um dos reagentes aplicados nos experimentos estão presentes no Apêndice A.
3.2. Síntese das nanopartículas de prata
O procedimento empregado para obtenção das AgNPs foi o seguinte:
Uma solução de 30ml de borohidreto de sódio 0,0020M foi preparada frescamente, e com ajuda de uma proveta graduada a solução foi vertida em um erlenmeyer de 200 ml, o qual foi mantido em um banho de gelo e deixou-se esfriar por cerca de 20 minutos. Sob agitação foi
adicionado gota a gota (cerca de 2ml) uma solução de AgNO3 0,001M á solução de borohidreto
de sódio contida no erlenmeyer, até que se formasse uma solução de coloide de cor amarelo escuro. As nanopartículas de prata que se formaram foram estabilizadas por uma camada protetora de íons borohidreto, o que garantiu sua estabilidade e evitou a aglomeração das nanopartículas de prata. Após formado o coloide manteve-se sob agitação em banho de gelo por 5 min.
Após a obtenção da solução de nanopartículas adicionou-se a 150mg de grafite puro, onde se homogeneizou e deixou em processo de secagem em estufa a 80ºC por 12 horas. Após a obtenção do compósito Grafite/AgNPs adicionou-se epóxi na proporção 65/35 (p/p) respectivamente, e foi adicionado na superfície do sensor onde deixou-se secar por 24 horas a temperatura ambiente para posterior análise eletroquímica por meio de voltametria cíclica (SANTOS, et al., 2016). A figura 10 mostra as etapas do processo da síntese das AgNPs.
Figura 10: Etapas da síntese e incorporação das NP’s Ag a mistura de Grafite/Epóxi.
3.2.1. Impregnação de nanocelulose com nanopartículas de prata
De modo a comparar a eficiência da incorporação da nanocelulose no compósito do biossensor, construiu-se um eletrodo baseado no compósito GEC/AgNPs/NC. O procedimento adotado foi o seguinte:
Primeiramente preparou-se o eletrodo base contendo GEC/Epóxi na proporção 65/35 (p/p) e deixado secar por 24 horas a temperatura ambiente. Em seguida, a superfície do sensor foi polida com lixa 1200 e lavada com água destilada.
Posteriormente, 4 ml de suspensão aquosa de NC foi pesada e adicionada a uma solução de 25 ml de AgNO3 0,001M previamente preparada. A solução foi mantida a 60 °C em
condições estáticas por 1 h. Dessa suspensão gotejou-se uma gota sobre a superfície do compósito GEC pré-tratado e deixou-se secar à temperatura ambiente por 24 h. Após o tempo o sensor GEC/AgNP/NC foi armazenado na geladeira a 4ºC para posterior análise eletroquímica por meio de voltametria cíclica.
3.3. Confecção dos eletrodos
A figura 11 representa o tipo de eletrodo-compósito confeccionado. O sensor desenvolvido consiste em um suporte de PVC onde foi inserido um fio de cobre previamente lixado com lixa 400 deixando aproximadamente 1,5 mm de comprimento na região onde será introduzida o compósito e aproximadamente 20,0 mm de comprimento na outra extremidade para receber a conexão do potenciostato.
Figura 1: Eletrodo GEC. A) Montagem inicial com fio elétrico e tubo de teflon; B) Incorporação do compósito no sensor com um excesso da mistura C) Aspecto final após cura
e polimento.
3.4. Caracterização das nanopartículas de prata
A caracterização da solução de AgNPs foi realizada através de uma análise por espectroscopia por energia dispersiva (EDX), utilizando o equipamento EDX-7000/8000-Shimadzu, no qual se baseia na investigação de uma amostra através de interações entre partículas e matéria, analisando os raios X emitidos pela matéria em resposta à incidência de partículas carregadas (SANTOS, et al., 2016).
Além disso, utilizou-se a Espectrometria de absorção atômica, também chamada de espectrofotometria de absorção atômica para determinar a presença das nanopartículas de prata na solução coloidal, usando como princípio a absorção de radiação ultravioleta por parte dos elétrons absorvendo apenas a radiação com comprimento de onda referente ao elemento químico do qual fazem parte.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Neste capítulo são apresentados os resultados obtidos para o trabalho, abordando discussões e análises/avaliação dos métodos empregados para a obtenção dos resultados do sistema em estudo.
4.1. Caracterização da dispersão coloidal da solução de AgNPs
4.1.1. Caracterização por espectrometria de absorção atômica
Através da técnica de espectrometria de absorção atômica pôde-se determinar a presença do metal Ag na solução. Nessa técnica os elétrons presentes na solução coloidal são excitados por uma fonte de energia e sofrem um salto quântico, quando retornam ao seu estado inicial emitem essa energia para meio em forma de fóton de luz o qual possui um comprimento de onda característico do elemento presente na solução.
A Figura 12 mostra o espectro de absorção contra o comprimento de onda da solução nanocoloidal de Ag. As curvas apresentadas são referentes ao preparo após 0h, 24h, 48h e 120h. Segundo (RASHID, 2013; RAJKUMAR, 2015) nanopartículas de prata exibem uma banda de absorção típica na região entre 350nm a 450nm, o qual confirma que a síntese da AgNPs foi bem-sucedida. Tais bandas são propriedades físicas destas nanopartículas.
A absorbância resultante da suspensão nanocoloidal de Ag recentemente preparada usando 2 mL de AgNO3 foi de 0,666 e um comprimento de onda característico de 398 nm. No
entanto, após 24 horas da síntese, já era possível notar uma mudança na absorbância do coloide, apresentando um valor de 0,591. Com o passar do tempo a absorbância da solução tendeu a um decréscimo do valor de pico. Após 120 horas o espectro de absorbância da solução coloidal de AgNP mostrou um comprimento de onda de 400nm e absorbância de 0,530. É importante notar que o pico de absorção se tornou mais largo ao longo do tempo. Isto indicou que os nanocolóides de Ag tendem a se agregar com o tempo.
Figura 2: Espectros de absorção UV-Vis de AgNPs em tempos diferentes desde recentemente preparado até cinco dias depois.
A adsorção de borohidreto desempenha um papel chave na estabilização de nanopartículas de prata proporcionando uma carga superficial sobre as partículas e deve estar em quantidades suficientes para estabilizar as partículas à medida que a reação prossegue. No entanto, com o tempo, o borohidreto de sódio em excesso na solução aumenta a força iônica global e começa a ocorrer a agregação das partículas (SOLOMON, et al., 2007).
4.1.2. Caracterização por espectrometria por energia dispersiva de raios X (EDX)
A caracterização química da amostra utilizando a técnica de Espectroscopia de raios X por dispersão em energia (EDX), mostrou a presença hegemônica de Ag0 (prata metálica)
dispersa na solução, como observado na tabela 4 abaixo.
4.2. Caracterização eletroquímica dos eletrodos de trabalho por voltametria cíclica
4.2.1. Eletrodo grafite/epóxi com incorporação de nanopartículas de prata
Para caracterização eletroquímica voltamétrica GEC, foram realizados testes de voltametria cíclica em solução de ferrocianeto [Fe(CN)6]-3. Na análise da aplicação do uso de nanopartículas de prata no compósito de grafite (65%) e Epóxi (35%) p/p respectivamente, observou-se um aumento da condutividade e uma maior sensibilidade a concentração da solução. Utilizando-se do software Ivium-n-Stat potentiostat para análise voltamétrica, foram testadas velocidades de varredura que variaram de 10 mV/s a 100 mV/s no sensor eletroquímico com nanopartículas de prata. Os resultados da caracterização eletroquímica voltamétrica é apresentado na figura 13:
Figura 13: Voltamogramas cíclicos de sensor GEC em uma solução de K4Fe(CN)6, pH 7.0 a
diferentes velocidades de varredura (10, 30, 40, 75, 100 mV/s).
4.2.2. Eletrodo grafite/epóxi/AgNps com incorporação de nanocelulose
Assim como no sensor eletroquímico com nanopartículas de prata, de modo a obter uma comparação da condutividade eletroquímica em um biossensor com e sem a aplicação de nanocelulose foram testadas velocidades de varredura que variaram de 10 mV/s a 100 mV/s em
uma solução de 50mL de K4Fe(CN)6 10mM em KCl 0,01M , pH 7. Uma outra bateria de testes
permitiu obter os voltamogramas cíclicos do biossensor sem nanocelulose e os respectivos voltamogramas cíclicos do biossensor com nanocelulose incorporadas ao compósito. Como se vê na comparação a seguir na Figura 14:
Figura 14: Voltamogramas cíclicos obtidos com os eletrodos GEC e eletrodo modificado com nanoparticulas de Prata e nanocelulose em solução contendo K3[Fe(CN)6 10mM em KCl
0,01M vs. Ag/AgCl a velocidade de varredura de 100mV/s.
O comportamento eletroquímico do compósito foi investigado no eletrodo modificado e não modificado de modo a esclarecer as diferenças entre a sua sensisbilidade e o seu desempenho eletroquímico em uma velocidade de varredura de 10Mv/s com um potencial aplicado a faixa de -0,4 a 0,8. Como mostrado na figura 14, o eletrodo GEC apresenta uma corrente de pico anódico (Ipa) igual a 0,286 mA e uma corrente de pico catódico de (Ipc) igual a 0,266 mA, o pico de potencial anódico (Epa) é ligeiramente largo e os pares redox apresentam uma separação entre os potenciais de pico anódico (Epa) e catódico (Epc), apresentando um Epa de 0,33 V e Epc de 0,15 V o que caracteriza um sistema quase-reversível. Apesar do eletrodo modificado (GEC/AgNP/NC) ter apresentado um valor semelhante de Epa igual a 0,33V e Epc em torno de 0,15 V, pode-se notar que a corrente de pico anódica e catódica do eletrodo modificado aumentou significativamente, apresentando um pico de oxidação maior com Ipa no valor de 0,365 mA e um pico de redução com Ipc igual a 0,339. A razão |Ipa/Ipc|
