Desenvolvimento farmacotécnico e estudo de estabilidade de géis de papaína destinados ao tratamento de feridas

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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE FARMÁCIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS PARA SAÚDE

Desenvolvimento farmacotécnico e estudo de estabilidade de

géis de papaína destinados ao tratamento de feridas

DANIELE YURI MIURA

Niterói

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DANIELE YURI MIURA

Desenvolvimento farmacotécnico e estudo de estabilidade de

géis de papaína destinados ao tratamento de feridas

Niterói

2012

Dissertação apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade Federal Fluminense para obtenção do título de Mestre no Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde.

Orientadora:

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Miura, Daniele Yuri

Desenvolvimento farmacotécnico e estudo de estabilidade de géis de papaína destinados ao tratamento de feridas/Daniele Yuri Miura; orientadora: Débora Omena Futuro. – Niterói, 2012.

101f.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal Fluminense, 2012.

1. Papaína. 2. Terapêutica. 3. Cicatrização de feridas. 4.

Estabilidade de medicamento. I. Futuro, Débora Omena II. Título.

CDD 615.1901 M685

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DANIELE YURI MIURA

Desenvolvimento farmacotécnico e estudo de estabilidade de géis de papaína destinados ao tratamento de feridas

Dissertação apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade Federal Fluminense como requisito para obtenção do título de Mestre no Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde.

Aprovada em ____ / ____ / 2012.

Orientadora

Professora Dr.ª Débora Omena Futuro Universidade Federal Fluminense

Banca Examinadora

Professora Dr.ª Deborah Quintanilha Falcão Universidade Federal Fluminense

Professora Dr.ª Alessandra Lifsitch Viçosa Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)

Membros Suplentes

Professora Dr.ª Kátia Gomes de Lima Araújo Universidade Federal Fluminense

Professora Dr.ª Zaida Maria Faria de Freitas Universidade Federal do Rio de Janeiro

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DEDICATÓRIA

Aos meus pais, Luiz e Hitomi, pelo apoio incondicional e exemplo de vida. Às minhas irmãs, Tatiana e Camila, pelo carinho e momentos de alegria. Ao meu marido, Claudio, pelo amor, companheirismo, incentivo e paciência.

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AGRADECIMENTOS

À Prof.ª Dr.ª Débora Omena Futuro, minha orientadora, pela oportunidade, confiança e ensinamentos. Minha gratidão por termos feito esta caminhada juntas.

Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde e seus docentes, meu muito obrigada.

À Prof.ª Dr.ª Kátia Gomes de Lima Araújo, pelo conhecimento, entusiasmo e prestatividade; obrigada pela imprescindível ajuda durante todo o projeto. Às alunas do LABIOTEC, por serem sempre atenciosas quando necessitei de auxílio.

Ao Prof. Dr. Joel Maurício Corrêa da Rosa, pela valiosa contribuição nos estudos de superfície de resposta, parte essencial deste trabalho. Muito obrigada por nos auxiliar nessas análises.

À Dr.ª Valéria Gonçalves Costa, por compartilhar seus conhecimentos e colocar-se disponível sempre que preciso. Muito obrigada por todo o suporte, atenção e gentileza, mesmo com todas as adversidades. Ao seu aluno Ricardo, agradeço pela contribuição nos ensaios de reologia realizados.

À Prof.ª Dr.ª Deborah Quintanilha Falcão e à Prof.ª Dr.ª Samanta Cardozo Mourão, obrigada por acompanharem este trabalho desde o princípio, por contribuírem com incentivos e opiniões, e pelos materiais cedidos.

À Prof.ª Dr.ª Selma Rodrigues de Castilho, à Prof.ª Dr.ª Beatriz Guitton Renaud Baptista de Oliveira, à aluna de mestrado Andrea Pinto Leite e aos demais integrantes do Grupo de Pesquisa em Feridas, Biomateriais e Pesquisa Clínica, pelo apoio intelectual e incrível troca de experiências, que foram essenciais para determinar os rumos deste trabalho.

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À Farmácia Universitária da Universidade Federal Fluminense por, além de ser parte essencial da minha formação profissional e objeto do meu carinho, contribuir com o empréstimo de matérias-primas e vidrarias para este projeto. Aos farmacêuticos Eliana de Vares Cação e Nilo Jorge Picolli e ao Prof. Ronaldo Ferreira da Silva, meu muito obrigada.

Ao Prof. Dr. Wilson da Costa Santos, pela aquisição dos filtros para o fluorímetro, parte essencial para o desenvolvimento da metodologia analítica deste trabalho. Muito obrigada.

Ao Prof. Déo Anselmo Pinheiro, por gentilmente ceder o Laboratório de Cosméticos para produção das formulações analisadas neste projeto.

À Prof.ª Dr.ª Lenise Arneiro Teixeira e ao Prof. Dr. Geraldo Renato de Paula, do Laboratório de Controle Microbiológico, pela disponibilidade na utilização de seus equipamentos.

Às alunas de estágio e iniciação científica, Carina Menegussi Dalvi, Hingred Bosch e Luiza Mattos, pela ajuda e empenho em diversas etapas deste trabalho.

À CAPES, pela bolsa de estudos concedida.

À FAPERJ, pelo apoio financeiro.

Aos meus amigos, Luciana e João Márcio. Obrigada pelo incentivo e por tornarem tudo mais divertido.

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“Digo o que penso, com esperança. Penso no que faço, com fé. Faço o que devo fazer, com amor. Eu me esforço para ser cada dia melhor, pois bondade também se aprende. Mesmo quando tudo parece desabar, cabe a mim decidir entre rir ou chorar, ir ou ficar, desistir ou lutar; porque descobri, no caminho incerto da vida, que o mais importante é o decidir."

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RESUMO

MIURA, D.Y. Desenvolvimento farmacotécnico e estudo de estabilidade de géis de

papaína destinados ao tratamento de feridas. Dissertação (Mestrado). Programa de

Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal Fluminense, 2012.

A papaína é uma enzima proteolítica, extraída do látex da espécie Carica papaya Linne. Ela é utilizada no tratamento tópico de feridas como agente desbridante, podendo ser aplicada em concentrações de 2 a 10%, dependendo da fase do processo de cicatrização. Porém, sua baixa estabilidade é um fator limitante para aplicação em formulações.

O presente estudo analisou a influência dos adjuvantes técnicos EDTA dissódico, cloridrato de cisteína e propilenoglicol no aumento da atividade proteolítica de géis de Carbopol® 940 contendo papaína a 2 e a 4% (p/p). No estudo de formulação dos géis, as formulações foram definidas por um desenho fatorial 33 e o efeito dos adjuvantes foi avaliado através de um estudo de superfície de resposta. Para cada concentração de papaína, foram selecionadas duas formulações para o estudo de estabilidade acelerada: a formulação com melhor resultado de atividade proteolítica e aquela sem adição de adjuvantes. O estudo de estabilidade acelerada foi realizado por sessenta dias a 5ºC ± 2ºC, 26ºC ± 2ºC e 45ºC ± 2ºC. As quatro formulações apresentaram grande perda de atividade enzimática durante o tempo do estudo, mesmo aquelas armazenadas a 5ºC ± 2ºC. Contudo, o armazenamento em temperaturas mais altas intensificou a perda de atividade. Para os géis de papaína a 2%, o uso de adjuvantes não foi eficiente na manutenção da atividade proteolítica. Já para os géis de papaína a 4%, houve um intenso aumento na atividade com o uso de adjuvantes, porém este efeito não foi mantido durante o tempo. Apesar destes resultados, o estudo indicou a possibilidade de aprimoramento das formulações de gel de papaína com o uso de adjuvantes técnicos, podendo gerar uma melhora no desempenho da atividade proteolítica dos produtos.

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ix

ABSTRACT

MIURA, D.Y. Pharmacotechnical development and stability study of papain gels for

wounds treatment. Dissertation (Master’s degree). Programa de Pós-Graduação em Ciências

Aplicadas a Produtos para Saúde, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal Fluminense, 2012.

Papain is a proteolytic enzyme extracted from latex of Carica papaya Linne. It is used in the topical wounds treatment as a debriding agent and can be applied at concentrations of 2-10%, depending on the phase of the healing process. However, its low stability is a limiting factor for use in formulations.

The present study examined the influence of technical adjuvants disodium EDTA, cysteine hydrochloride and propylene glycol on increasing of proteolytic activity of Carbopol® 940 gels containing 2 and 4% (w/w) of papain. In the gels preformulation study, the formulations were defined by a 33 factorial design and the effect of adjuvants was evaluated using a response surface study. For each concentration of papain, two formulations were selected for the accelerated stability study: a formulation with best result of proteolytic activity and that without adjuvants. The accelerated stability study was carried out for sixty days at 5°C ± 2°C, 26ºC ± 2°C and 45ºC ± 2°C. The four formulations showed a large loss of enzyme activity during the time of the study, even those stored at 5°C ± 2°C. However, storage at higher temperatures increased the loss of activity. For gels with 2% papain, the use of adjuvants was not efficient in maintaining the proteolytic activity. As for the gels with 4% papain, there was an intense increase in activity with the use of adjuvants, but this effect was not maintained over time. Despite these results, the study indicated the possibility of improvement of papain gel formulations with the use of technical adjuvants, wich can provide a better performance of the proteolytic activity of the products.

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Propriedades físicas da papaína. ... 12

Tabela 2. Classificação dos géis segundo a natureza da fase coloidal. ... 22

Tabela 3. Classificação dos géis segundo o número de fases. ... 22

Tabela 4. Classificação dos géis segundo a natureza da fase líquida. ... 22

Tabela 5. Formulação do gel base de Carbopol® 940. ... 29

Tabela 6. Formulações de géis de papaína a 2 e a 4% preparadas para seleção do gel base mais adequado. ... 30

Tabela 7. Volumes utilizados das soluções das amostras e do padrão no teste de recuperação. ... 34

Tabela 8. Formulações avaliadas no teste de especificidade. ... 35

Tabela 9. Formulações analisadas no estudo de formulação de gel de papaína 2%. ... 37

Tabela 10. Formulações analisadas no estudo de formulação de gel de papaína 4%. ... 38

Tabela 11. Codificação das variáveis para o estudo de superfície de resposta, utilizando pacote RMS do programa R. ... 39

Tabela 12. Composição das formulações P2-01, P2-20, P4-01 e P4-28, selecionadas para o estudo de estabilidade acelerada. ... 40

Tabela 13. Parâmetros de avaliação das características sensoriais das formulações. ... 42

Tabela 14. Resultados experimentais obtidos na curva de calibração da papaína padrão secundário 30.000 UI/mg. ... 46

Tabela 15. Resultados obtidos da avaliação da precisão intra-corrida para soluções de papaína padrão 0,450; 1,500; e 3,750 UI/mL. ... 48

Tabela 16. Resultados do teste de recuperação da papaína a 2 e a 4% nas amostras de gel de Carbopol® 940. ... 49

Tabela 17. Resultados experimentais da análise da interferência de diversos excipientes na determinação da atividade da papaína em gel de Carbopol® 940. ... 50

Tabela 18. Resultados obtidos para o cálculo dos limites de detecção e quantificação da papaína pelo método de microplacas. ... 52

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Tabela 19. Resultados da atividade proteolítica do estudo de formulação do gel de papaína

2%... 54

Tabela 20. Resultados da atividade proteolítica do estudo de formulação do gel de papaína 4%... 60

Tabela 21. Resultados do teste de steepest ascent from ridge do gel de papaína a 4%. ... 64

Tabela 22. Composição das formulações de gel de papaína selecionadas para o estudo de estabilidade acelerada. ... 65

Tabela 23. Avaliação das características sensoriais das formulações P2-01, P2-20, P4-01 e P4-28 no tempo zero. ... 65

Tabela 24. Valores de pH das formulações P2-01, P2-20, P4-01 e P4-28 no tempo zero. ... 67

Tabela 25. Resultados da análise de viscosidade aparente das formulações P2-01, P2-20, P4-01 e P4-28 no tempo zero. ... 68

Tabela 26. Valores referentes à viscosidade aparente (no ponto de máximo gradiente de cisalhamento) e tixotropia para as formulações P2-01, P2-20, P4-01 e P4-28. ... 72

Tabela 27. Valores da atividade proteolítica das formulações P2-01, P2-20, P4-01 e P4-28 no tempo zero. ... 73

Tabela 28. Avaliação das características sensoriais da formulação P2-01 em 60 dias... 74

Tabela 32. Valores de pH e seus percentuais de variação para formulação P2-01. ... 80

Tabela 36. Avaliação da atividade proteolítica da formulação P2-01 durante 60 dias, em diferentes temperaturas de armazenamento. ... 85

Tabela 37. Avaliação da atividade proteolítica da formulação P2-20 durante 60 dias, em diferentes temperaturas de armazenamento. ... 85

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xii

Tabela 38. Avaliação da atividade proteolítica da formulação P4-01 durante 60 dias, em

diferentes temperaturas de armazenamento. ... 87

Tabela 39. Avaliação da atividade proteolítica da formulação P4-28 durante 60 dias, em

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xiii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Estrutura tridimensional da papaína, onde os dois domínios da cadeia principal

estão representados em verde e o sítio catalítico, em azul (CAPUCHO, 2007). ... 13

Figura 2. Esquema da microplaca de 96 poços para análise de uma amostra. ... 32 Figura 3. Curva de calibração da papaína 30.000 UI/mg. ... 46 Figura 4. Curva de unidades de fluorescência x tempo obtida da análise da formulação 1,

apresentando a equação da reta e o coeficiente de correlação (R2). ... 50

Figura 5. Curva de unidades de fluorescência x tempo obtida da análise da formulação 2,

Figura 8. Gráficos das curvas de contorno do gel de papaína 2% - (a) EDTA dissódico x

cloridrato de cisteína; (b) EDTA dissódico x propilenoglicol; (c) cloridrato de cisteína x propilenoglicol. ... 58

Figura 9. Gráficos das superfícies de resposta do gel de papaína 2% - (a) EDTA dissódico x

Figura 10. Gráficos das curvas de contorno do gel de papaína 4% - (a) EDTA dissódico x

Figura 11. Gráficos das superfícies de resposta do gel de papaína 4% - (a) EDTA dissódico x

Figura 12. Fotografias das formulações no tempo zero de análise - (a) P2-01; (b) P2-20; (c)

P4-01; (d) P4-28. ... 67

Figura 13. Gráfico de viscosidade aparente x velocidade das formulações P2-01, P2-20,

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Figura 14. Reograma da formulação P2-01 no tempo zero de análise. ... 70

Figura 18. Fotografias das formulações de gel de papaína a 2%, P2-01 e P2-20, entre os 7º e 60º dias do estudo de estabilidade, nos armazenamentos em geladeira (5ºC ± 2ºC), temperatura ambiente (26ºC ± 2ºC) e estufa (45ºC ± 2ºC). ... 76

Figura 19. Fotografias das formulações de gel de papaína a 4%, P4-01 e P4-28, entre os 7º e 60º dias do estudo de estabilidade, nos armazenamentos em geladeira (5ºC ± 2ºC), temperatura ambiente (26ºC ± 2ºC) e estufa (45ºC ± 2ºC). ... 79

Figura 20. Gráfico de viscosidade aparente da formulação P2-01, na velocidade de 100 rpm, durante 60 dias, em diferentes temperaturas de armazenamento. ... 82

Figura 24. Gráfico da avaliação da atividade proteolítica da formulação P2-01 durante 60 dias, em diferentes temperaturas de armazenamento. ... 86

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LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

AA Adesivo acrílico a.C. Antes de Cristo

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária app Tm Temperatura de desnaturação térmica aparente

Asn Asparagina

CCD Composite Central Design

CMD Concentração média determinada CME Concentração média experimental

Cp Centipoise

CT Concentração teórica CV Coeficiente de variação

Cys Cisteína

λmax Comprimento de onda de absorbância máxima

Da Dalton

d.C. Depois de Cristo

DCC Delineamento Composto Central DMSO Dimetilsulfóxido

DP Desvio padrão

DPa Desvio padrão da interseção com o eixo y das 3 curvas de calibração

DSC Calorimetria exploratória diferencial

DX Dextrana EDTA Etilenodiaminotetracetato FO First order g Grama GLU Glutaraldeído His Histidina

HUAP Hospital Universitário Antônio Pedro

I Incolor

IC Inclinação da curva de calibração INT Instituto Nacional de Tecnologia

LAMAP Laboratório de Processamento e Caracterização de Materiais Poliméricos

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LBNB Látex de borracha natural bicentrifugado LD Limite de detecção estimado

LQ Limite de quantificação estimado

µL Microlitro

µm Micrometro

mg Miligrama

mL Mililitro

mPa.s Milipascal segundo

N-CBZ-PHE-ARG-7-MCA Cloridrato de carbobenzoxi-L-fenilalnil-L-arginina 4-metilcumarina-7-amido

nm Nanômetro

Pa Pascal

p/p Peso por peso p/v Peso por volume PEG Polietilenoglicol

psi Medida de pressão em libra por polegada quadrada q.s. Quantidade suficiente

q.s.p. Quantidade suficiente para R Coeficiente de correlação R2 Coeficiente de correlação linear rpm Rotações por minuto

s Segundo

SB Dispersão de silicone bicomponente SM Dispersão de silicone monocomponente

SO Second order

TPP Tripolifosfato

TWI Two-way interactions

UI Unidade Internacional UR Umidade relativa do ar

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xvii SUMÁRIO Página 1. INTRODUÇÃO 1 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3 aa 2.1 Pele 3 AA 2.1.1 Feridas 4 aa 2.1.1.1 Processo de cicatrização 5 2.1.1.2 Tratamento de feridas 7 2.2 Papaína 10

2.2.1 Características físicas da papaína 12 2.2.2 Estrutura molecular da papaína 12 2.2.3 A papaína no tratamento de feridas 13 2.2.4 Formulações e produtos com papaína utilizados no

tratamento de feridas 16

2.2.5 Estabilização da papaína 18

2.3 Géis 21

2.3.1 Carbômero (Carbopol®) 23

2.4 Reologia 24

2.4.1 Comportamento reológico de géis de Carbopol® 26

3. OBJETIVOS 27 3.1 Objetivo geral 27 3.2 Objetivos específicos 27 4. MATERIAIS E MÉTODOS 28 4.1 Materiais 28 4.1.1 Matérias-primas e Reagentes 28 4.1.2 Equipamentos 28 4.2 Métodos 29

4.2.1 Preparação do gel de Carbopol® 940 para incorporação da

papaína 29

4.2.2 Preparação dos géis de papaína a 2 e 4% para seleção do

gel base mais adequado 30

4.2.3 Determinação da atividade proteolítica da papaína 31 4.2.3.1 Validação da metodologia 33

aa 4.2.3.1.1 Curva de calibração 33

4.2.3.1.2 Precisão 33

4.2.3.1.3 Exatidão 34

4.2.3.1.4 Especificidade 35

4.2.3.1.5 Limites de detecção e quantificação 36

(19)

xviii

4.2.4.1 Estudo de superfície de resposta 39 4.2.5 Estudo de estabilidade acelerada 40

4.2.5.1 Preparo das amostras 40

4.2.5.2 Condições do estudo 41

4.2.5.3 Características avaliadas 41

4.2.6 Análise estatística 43

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 45

5.1. Seleção do gel base de Carbopol® 940 para incorporação da

papaína 45

5.2 Validação da metodologia de determinação da atividade

proteolítica da papaína 46

5.2.1 Curva de calibração 46

5.2.2 Precisão 47

5.2.3 Exatidão 48

5.2.4 Especificidade 49

5.2.5 Limites de detecção e quantificação 52

5.3 Estudo de formulação 53

5.3.1 Gel de papaína a 2% 54

5.3.2 Gel de papaína a 4% 60

5.4 Estudo de estabilidade acelerada 64 5.4.1 Caracterização dos géis de papaína no tempo zero do

estudo de estabilidade acelerada 65 5.4.1.1 Características sensoriais 65

5.4.1.2 pH 67

5.4.1.3 Viscosidade aparente 68

5.4.1.4 Comportamento reológico 70 5.4.1.5 Atividade proteolítica 73 5.4.2 Avaliação das características sensoriais durante 60 dias de

armazenamento dos géis 74

5.4.3 Avaliação dos valores de pH durante 60 dias de

5.4.4 Avaliação da viscosidade aparente durante 60 dias de

5.4.5 Avaliação da atividade proteolítica durante 60 dias de

6. CONCLUSÕES 92

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1 1. INTRODUÇÃO

Ferida pode ser descrita como qualquer tipo de alteração na integridade anatômica da pele, resultante de trauma físico, químico, mecânico ou causado por afecção clínica. Ainda nos dias atuais, as feridas representam um problema de saúde para o ser humano, com repercussões físicas e psicoemocionais e diminuição na qualidade de vida e no convívio social.

O tratamento de feridas é complexo, envolvendo aspectos sistêmicos e locais. A terapia tópica é um fator essencial para o tratamento de feridas e envolve os processos de limpeza, desbridamento e cobertura. O desbridamento consiste na remoção de tecidos necrosados ou exudatos purulentos presentes no leito da ferida, que interferem no processo de cicatrização. Pode ser realizado por técnicas mecânicas e/ou químicas. O desbridamento mecânico apresenta as desvantagens de ser uma técnica cansativa, muito delicada, normalmente traumática e causadora de sofrimento ao paciente. A opção pelo desbridamento com enzimas proteolíticas apresenta-se vantajosa, com remoção rápida e seletiva, não-traumática, sem causar prejuízos ao paciente.

Amplamente utilizada na prática clínica como agente desbridante, a enzima papaína, oriunda do látex da espécie Carica papaya, apresenta também características bactericida/bacteriostática, anti-inflamatória e bioestimulante. Outras vantagens do seu uso são o baixo custo e a ausência de efeitos colaterais. A papaína pode ser utilizada em todas as fases do processo cicatricial, sendo indicadas diversas concentrações dependendo do grau de cicatrização da ferida: preparações a 2% para feridas com tecido de granulação, produtos com 4% a 6% de papaína em feridas que apresentem exsudato purulento, e formulações onde a papaína encontre-se a 8 e a 10% quando a ferida apresentar tecido necrótico.

No Brasil, as preparações com papaína são provenientes da farmácia magistral e só recentemente foram contempladas pelo Formulário Nacional, na forma farmacêutica em gel. Não existem produtos industrializados a base de papaína para uso tópico em nosso país e não foram encontrados registros de estudos de estabilidade de produtos nas concentrações preconizadas pelo Formulário Nacional. Por tratar-se de uma enzima, a papaína apresenta baixa estabilidade, tornando necessário que sejam feitos estudos mais aprofundados para

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2

determinação de veículos compatíveis, adjuvantes técnicos necessários, condições de armazenamento e estabilidade físico-química dessas formulações.

Deste modo, foi elaborado o presente trabalho, visando contribuir para um melhor entendimento a respeito da estabilidade dos géis de papaína a 2 e a 4% (p/p), produtos amplamente utilizados no tratamento de feridas.

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3 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Pele

A pele é considerada o maior e mais complexo órgão do corpo humano, representando aproximadamente 15% do peso corporal, tendo a função de revesti-lo e delimitá-lo, além de estar constantemente relacionada com atividades biológicas e bioquímicas (CAMARGO, 2006; HAX, 2009; DÂNGELO e FATTINI, 1998). Ela contém, pelo menos, cinco diferentes tipos de células que contribuem para sua organização estrutural e demais tipos celulares, provenientes dos sistemas circulatório e imunológico (HADGRAFT, 2004; MENON, 2002; QUEIROZ, 2008). É composta por três camadas: epiderme, derme e hipoderme (CAMARGO, 2006; DÂNGELO e FATTINI, 1998).

A epiderme é a camada mais externa, composta por três diferentes linhagens de células: queratinócitos, melanócitos e células de Langerhans. Ela é organizada em camadas e, conforme as mais superficiais são eliminadas, as camadas mais profundas são restauradas por divisão celular. Suas camadas são denominadas: germinativa, espinhosa, granulosa, lúcida e córnea. A camada germinativa é a mais profunda, faz limite com a derme, e a camada córnea é a mais superficial (BLANES, 2004). A camada córnea é constituída por células escamosas, queratinizadas, impermeáveis, e proporciona proteção contra traumas físicos e químicos (BLANES, 2004; CAMARGO, 2006; SAMPAIO, CASTRO e RIVITTI, 1989). As diversas camadas de queratinócitos, unidos uns aos outros, fornecem barreira às lesões, à contaminação e à luz. A epiderme também evita a desidratação dos tecidos subjacentes, retém fluidos e nutrientes dentro da pele e produz melanina, responsável pela cor da pele e proteção dos tecidos subjacentes dos efeitos nocivos da luz ultravioleta (BLANES, 2004; CAMARGO, 2006; HAX, 2009).

A derme é uma espessa camada de tecidos conjuntivos fibrinosos de colágeno e elastina, onde se apoia a epiderme e faz a união à hipoderme (BLANES, 2004; JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004; QUEIROZ, 2008). Nela, encontram-se os anexos da pele, vasos sanguíneos, vasos linfáticos e nervos (HAX, 2009). Pode ser dividida em camada papilar, mais externa, e camada reticular, mais interna (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004; QUEIROZ, 2008). A derme contém diversos tipos de células, incluindo fibroblastos e

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4

fibrócitos, macrófagos, mastócitos e leucócitos sanguíneos, particularmente neutrófilos, eosinófilos, linfócitos e monócitos (BLANES, 2004).

A hipoderme, ou camada subcutânea, é rica em fibras e adipócitos. Atua como reserva energética, isolante térmico e protege contra choques mecânicos (CAMARGO, 2006; HAX, 2009). Ela é formada por tecido conjuntivo frouxo e une de maneira pouco firme a derme aos órgãos subjacentes (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004; QUEIROZ, 2008).

2.1.1 Feridas

Ferida pode ser denominada como uma interrupção da continuidade de um tecido corpóreo, em maior ou em menor extensão, causada por qualquer tipo de trauma físico, químico, mecânico ou desencadeada por uma afecção clínica (BLANES, 2004; CESARETTI, 1998).

As feridas podem ser classificadas em função de sua etiologia (aguda ou crônica); do mecanismo da lesão (amputação, incisa, contusa, escoriação, lacerante ou puntiforme); do grau de contaminação (limpa, limpa-contaminada, contaminada ou infectada); e do grau de perda de tecido (feridas de espessura ou densidade parcial, ou feridas de espessura ou densidade total) (PEREIRA, 2006).

Dentre as principais patologias relacionadas ao surgimento de feridas, está o diabetes. Portadores dessa doença devem ser avaliados constantemente, já que o nível de glicemia está fortemente relacionado a complicações vasculares, como a neuropatia periférica e a doença vascular periférica. Complicações como essas estão associadas a lesões tissulares e amputações de membros inferiores (MACIEL, 2008).

As neuropatias motora, sensitiva e autonômica aumentam os riscos do surgimento de ulcerações, pois diminuem os mecanismos de proteção ao trauma, através da diminuição da sensibilidade, diminuição da sudorese, modificação na regulação do fluxo sanguíneo e deformidade nos pés (MACIEL, 2008).

Uma das complicações frequentes em pacientes com anemia falciforme é a úlcera de membros inferiores. Elas ocorrem em 8 a 10% dos pacientes homozigotos. As ulcerações formadas são dolorosas e podem ser únicas ou múltiplas. Acometem áreas com pouco tecido subcutâneo e pele fina, como a região maleolar interna ou externa e tibial anterior. O

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5

aparecimento pode ser espontâneo ou gerado por pequenos traumas. Não existe forma de prevenção, a recorrência é frequente, a cicatrização é lenta e respondem pior ao tratamento que úlceras de outras etiologias (PALADINO, 2007).

A insuficiência venosa crônica é a principal etiologia das úlceras venosas. Tais lesões contribuem com cerca de 70% a 90% dos casos de úlceras de pernas e geram impacto psicológico, dor, diminuição da qualidade de vida e altos custos ao sistema de saúde, pois os pacientes costumam permanecer com a ferida por vários anos (BORGES, 2005; MACIEL, 2008).

Como consequência das doenças crônicas, as limitações físicas e a imobilidade são importantes fatores de risco para as úlceras por pressão (MACIEL, 2008; THOMAS, 2006). Elas são consideradas como indicadores da qualidade do cuidado com o paciente. Essa lesão é definida como uma área localizada de dano da pele e tecido subjacente, causado por pressão, cisalhamento, fricção ou a combinação destes fatores (CANNON e CANNON, 2004; MACIEL, 2008). Essas lesões podem atingir qualquer área de proeminência óssea corporal, porém as mais vulneráveis são as regiões sacra, calcânea e trocantérica (MACIEL, 2008; REDDY et al., 2008; THOMAS, 2006). As úlceras por pressão ocorrem com frequência em pacientes hospitalizados, com prevalência entre 3% e 12%, segundo dados americanos que contabilizaram úlceras a partir do estágio II, lesão que envolve a epiderme e/ou a derme (MACIEL, 2008). Consequentemente, elas constituem importante problema para pacientes e instituições de saúde, pois, aumentam o risco de infecção, dificultam a recuperação, prolongam a internação, geram custo elevado e contribuem para o aumento da taxa de mortalidade (CANNON e CANNON, 2004; MACIEL, 2008; REDDY et al., 2008; THOMAS, 2006).

2.1.1.1 Processo de cicatrização

A cicatrização de feridas é um processo dinâmico, contínuo e complexo, composto por diversas fases sobrepostas (BLANES, 2004; CAMARGO, 2006; CESARETTI, 1998; DECLAIR, 2002; HAX, 2009). Ela depende de vários fatores, locais e gerais, como: localização anatômica, tipo de pele, raça, técnica cirúrgica utilizada (CAMARGO, 2006). São utilizadas diferentes classificações didáticas para entendimento deste processo.

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Morfologicamente, identificam-se três fases da cicatrização: inflamatória, proliferativa e de maturação (BLANES, 2004; CESARETTI, 1998; HAX, 2009).

A fase inflamatória é uma reação local não específica à lesão do tecido e/ou invasão bacteriana (HAX, 2009). Ocorre vasoconstrição por 5 a 10 minutos imediatamente após a lesão, propiciando o fechamento dos vasos danificados. Em seguida, há o aumento da permeabilidade vascular, com a retração das células endoteliais, permitindo a passagem dos elementos sanguíneos para a ferida; plasma, eritrócitos e leucócitos (diapedese) (BLANES, 2004). A vasodilatação com extravasamento de elementos para o exterior do vaso forma um exsudato, que se manifesta clinicamente por inchaço, calor, rubor e dor; a intensidade depende do tipo e do grau de agressão sofrida pela pele (BLANES, 2004; HAX, 2009). Estas alterações correspondem à resposta vascular e são acompanhadas por uma resposta celular. Os neutrófilos realizam a digestão de bactérias e tecidos desvitalizados, e os monócitos transformam-se em macrófagos, auxiliando na fagocitose de bactérias e restos celulares (SCHULTZ et al., 2003). Ocorre a liberação de mediadores celulares, que estimulam a elaboração de substâncias responsáveis pelo fenômeno inflamatório (histamina, serotonina, bradicinina, prostaglandinas e tromboxanos, linfocinas e interleucinas 1 e 2). Há também a liberação do fator de crescimento pelas células epidérmicas e plaquetas (BLANES, 2004).

Na fase proliferativa, ocorre a reparação do tecido conjuntivo e do epitélio. A reparação do tecido conjuntivo compreende a formação de tecido de granulação, com proliferação endotelial e de fibroblastos, que surgem por volta do segundo e terceiro dia após a lesão. Ocorre a transformação do fibrinogênio do exsudato inflamatório em fibrina, que forma uma rede. Nesta rede de fibrina, há a deposição dos fibroblastos, que passam a multiplicar-se e a secretar os componentes protéicos do tecido cicatricial (BLANES, 2004). Observa-se também uma intensa proliferação vascular (BLANES, 2004; SCHULTZ et al., 2003). Este tecido constituído por fibroblastos, substâncias produzidas por eles e vasos sanguíneos é chamado de tecido de granulação, que apresenta aspecto granuloso e avermelhado. Presente no tecido de granulação, o miofibroblasto é uma célula que confere capacidade contrátil, reduzindo a área da lesão e facilitando a epitelização. Próximo ao 15º dia, com o fim da atividade mitótica dos fibroblastos, eles passam a secretar as proteínas presentes no tecido de granulação, produzindo os componentes da substância fundamental (formada por água, eletrólitos e glicosaminoglicanos) e colágeno (BLANES, 2004). Os fibroblastos são células consideradas adaptativas, realizando função reguladora do equilíbrio

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de colágeno, devido à sua dupla função de síntese e reabsorção do mesmo (HAX, 2009; SIMÕES et al., 1985). Outro fenômeno importante desta fase, a formação do epitélio faz-se pelo aumento de tamanho, da divisão e da migração das células da camada basal da epiderme por sobre a área de reparação do tecido conjuntivo subjacente. Nos casos de feridas com perda total da derme, a epitelização ocorre apenas das margens da mesma, pois não há anexos cutâneos remanescentes (BLANES, 2004; HAX, 2009).

Na fase de maturação, observam-se dois eventos importantes: deposição, agrupamento e remodelação do colágeno, e regressão endotelial. Ocorre o direcionamento das fibras de colágeno, através das colagenases e outras proteases produzidas por macrófagos e células epidérmicas (BLANES, 2004; SCHULTZ et al., 2003). A remodelação do colágeno tem início na formação do tecido de granulação e permanece por meses após a reepitelização. Há a diminuição de todos os elementos celulares e dos elementos do tecido conjuntivo, além da redução progressiva de vasos neoformados (BLANES, 2004). A cicatriz se torna menos espessa, mais plana, passando de uma coloração rosada para esbranquiçada (BLANES, 2004; HAX, 2009; SCHULTZ et al., 2003).

2.1.1.2. Tratamento de feridas

O tratamento de feridas é uma prática observada desde os primórdios da humanidade, sendo adaptado durante os séculos para apresentar melhores resultados. Foram descritas na Alexandria, por volta de 3.000 a.C., feridas infectadas como aquelas com bordas avermelhadas e que apresentavam calor. Para o tratamento, recomendava-se aplicação de folhas de salgueiro, pão mofado ou levedo de cerveja. Os egípcios introduziram o uso de minerais, como cobre e mercúrio, além do mel para o tratamento de feridas (GOMES e CARVALHO, 2002).

Hipócrates (460 - 377 a.C.) sugeriu que as feridas deveriam ser tratadas com unguento para promover supuração, remoção de tecido necrótico e redução de inflamação, buscando eliminar o humor que estava em excesso no organismo. No início da era cristã, Cornelius Celsus (53 a.C. - 7 d.C.) foi o primeiro a descrever os quatro sinais da inflamação e diferenciou as condutas de tratamento de feridas, classificando soluções para uso tópico em: adstringentes, cáusticos, erosivos e hemostáticos. Claudius Galeno (129 - 200 d.C.), líder da escola médica de Alexandria, realizava a supuração de feridas com aplicação de unguentos e

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utilizava substâncias promotoras da cicatrização (GOMES e CARVALHO, 2002; MACIEL, 2008).

No século XIV, o uso de armas de fogo nas guerras europeias gerou um novo tipo de ferida, mais difícil de curar. Ambroise Paré, cirurgião francês (1510-1590), reformulou o tratamento desse tipo de feridas. Ele substituiu o óleo fervente, que até então vinha sendo utilizado, por pomada à base de terebentina, óleo de rosa e gema de ovo (BLANES, 2004; GOMES e CARVALHO, 2002).

Entre o final do século XIX e o início do século XX, o tratamento de feridas baseava-se em agentes tópicos com ação antimicrobiana e proteção com coberturas baseava-secas. O uso do álcool e de antissépticos metálicos tornou-se mais comum. Entre os anos de 1920 e 1940, foram introduzidas ao tratamento pomadas contendo enzimas, com o objetivo de realizar o desbridamento químico das feridas. A partir de 1950, surgiram os primeiros estudos sobre a eficácia da cicatrização de feridas em ambiente úmido. A partir de então, surgiu um novo interesse no desenvolvimento de coberturas interativas, que promoviam um melhor ambiente para a cicatrização (GOMES e CARVALHO, 2002; MACIEL, 2008).

Atualmente, apesar dos avanços tecnológicos e da maior disponibilidade de recursos, ainda existem controvérsias a respeito da melhor terapia tópica para o tratamento de feridas. É vivenciada pelos profissionais a dificuldade em decidir qual o melhor tratamento e qual o produto mais eficaz, e associar os estudos desenvolvidos sobre o tratamento de feridas à prática clínica (PEREIRA, 2006). O processo que tem sido adotado para auxiliar na escolha do tratamento de feridas é a prática baseada em evidências, onde se valoriza a decisão com base em evidências clínicas, originada de pesquisas sistemáticas. Nessa situação, pesquisa e prática clínica estão associadas em um processo sistemático e contínuo de auto-aprendizado e auto-avaliação. Tratamentos que não são baseados em evidências científicas não atingem resultados desejados, submetendo o paciente a intervenções ineficazes (MACIEL, 2008; PEREIRA, 2006).

Diversos fatores locais e sistêmicos estão envolvidos na cicatrização de feridas, como doenças crônicas e infecciosas; questões socioeconômicas e psicológicas; traumas e cirurgias; a necessidade de continuidade da utilização do curativo; avaliação do custo-benefício. A escolha do tratamento deve ser adequada à natureza, à localização e ao tamanho da ferida. Portanto, é essencial que o acompanhamento do paciente seja feito por uma equipe

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multidisciplinar, para o controle dos fatores que interferem no processo cicatricial (FRANCO e GONÇALVES, 2008; MACIEL, 2008).

Um fator importante é o nutricional, já que a cicatrização é um processo complexo, que envolve fenômenos químicos, produção de colágeno e gasto de energia, proteínas, vitaminas e minerais. Fatores psicológicos e sociais também podem influenciar no processo de cicatrização, sendo importante reduzir situações estressantes e melhorar a qualidade de vida do paciente (MACIEL, 2008).

A terapia tópica de feridas é baseada em estudos científicos sobre a fisiologia de reparação tecidual. É preciso favorecer as condições locais através da terapia tópica para viabilizar o processo fisiológico. Pode-se definir terapia tópica como o conjunto de condutas que visam à cura precoce das feridas, compreendendo limpeza, desbridamento e cobertura (BLANES, 2004; GOMES e CARVALHO, 2002).

A limpeza da ferida deve ser realizada com uso de técnica e fluido que minimize trauma mecânico e químico. Entre os princípios da terapia tópica, um dos primeiros e mais importantes componentes a serem considerados é a remoção não somente da necrose como também de corpos estranhos do leito da ferida. O uso de antissépticos em feridas tem efeito nocivo, pois, além da citotoxidade, contribuindo para o retardo da cicatrização, não é o mecanismo mais eficiente para reduzir a contagem bacteriana nas lesões. Em feridas crônicas, como úlceras de membros inferiores e por pressão, há colonização bacteriana, mas essa não retarda o processo de cicatrização. Entretanto, a presença de tecido necrótico favorece a infecção (BLANES, 2004; YAMADA, 1999).

O desbridamento consiste na remoção de tecidos necrosados aderidos ou de corpos estranhos do leito da ferida, usando técnicas mecânicas e/ou químicas. Existem diversos métodos de desbridamento, cujas indicações, contraindicações, vantagens e desvantagens devem ser conhecidas para a escolha mais adequada às necessidades do paciente. Dentre os métodos de desbridamento estão os desbridamento autolítico, desbridamento enzimático ou químico, desbridamento mecânico e desbridamento cirúrgico/instrumental (BLANES, 2004; YAMADA, 1999).

O procedimento de oclusão das feridas com coberturas visam manter as células viáveis e permitir que elas liberem fatores de crescimento, estimulando sua proliferação. Algumas características para a escolha da cobertura mais apropriada são: manter umidade na interface

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ferida/cobertura, remover o excesso de exsudato, permitir a troca gasosa, promover isolamento térmico, proporcionar proteção contra infecção, ser isento de partículas e contaminantes e permitir a remoção sem causar traumas. Além dessas, devem apresentar disponibilidade, flexibilidade, facilidade de manuseio e custo-eficácia. Os efeitos benéficos do meio úmido incluem a prevenção de desidratação do tecido e morte celular; a angiogênese acelerada; o desbridamento autolítico, pois eles retêm as enzimas e água que ajudam na fibrinólise; e a redução da dor, atribuída à proteção das terminações nervosas que o meio úmido fornece contra o ressecamento e a exposição. As coberturas podem ser classificadas como primária, que são aquelas que permanecem em contato direto com a lesão, e secundária, sendo aquelas que ficam sobre a cobertura primária, podendo ser gazes, chumaços, entre outros. Para a escolha da cobertura mais apropriada é imprescindível conhecer as principais categorias de produtos disponíveis, adequados à realidade de trabalho, assim como sua forma de ação, indicações, contraindicações, vantagens e desvantagens (BLANES, 2004; DEALEY, 1996; PEREIRA, 2006).

O mercado mundial disponibiliza mais de 2.000 produtos para o tratamento de feridas, tornando a escolha da cobertura correta uma tarefa difícil e desafiadora. Alguns exemplos de coberturas utilizadas ultimamente são: filme de poliuretano, hidrocolóide, hidrogel, papaína, carvão ativado e alginatos (BLANES, 2004; PEREIRA, 2006).

2.2 Papaína

A papaína é uma enzima de origem vegetal, encontrada nas folhas e nos frutos da

Carica papaya Linne. Ela é isolada a partir do látex do fruto verde dessa espécie

(CAPUCHO, 2007). A enzima é amplamente utilizada na indústria alimentícia, em estabilização de cerveja e amaciamento de carnes (CHAMBERS et al., 1998; ESPÍN e ISLAM, 1998; PAQUES e MACEDO, 2006). Na indústria farmacêutica, pode ser encontrada em medicamentos para uso interno, para tratamento de problemas digestivos, e para uso externo, destinados ao tratamento de lesões cutâneas (CHAMBERS et al., 1998; ESPÍN e ISLAM, 1998; FERREIRA et al., 2005; PAQUES e MACEDO, 2006). Na produção de cosméticos, é utilizada em preparações para clareamento da pele, esfoliantes e agentes depilatórios. Também é empregada na remoção de proteínas das superfícies de lentes de contato (TRAVERSA, MACHADO-SANTELLI e VELASCO, 2007). A papaína também tem

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aplicações na indústria têxtil, na produção de seda, em curtumes, no tratamento de efluentes industriais e domésticos, na indústria de borracha, entre outras (ESPÍN e ISLAM, 1998; FERREIRA et al., 2005; PAQUES e MACEDO, 2006).

O látex da Carica papaya L. é um fluído de aparência leitosa, com comportamento tixotrópico. Ele possui aproximadamente 15% de matéria seca, das quais 40% correspondem a enzimas, principalmente cisteínas endopeptidases, que constituem mais de 80% da fração total de enzimas (AZARKAN et al, 2003; CAPUCHO, 2007). A papaína consiste em uma mistura de enzimas proteolíticas, papaína e quimopapaína, essencialmente. Essas enzimas são capazes de hidrolisar polipeptídeos, amidas e ésteres, principalmente nas ligações envolvendo aminoácidos básicos, leucina ou glicina, produzindo peptídeos de baixo peso molecular (PINTO, 2005).

Além da papaína, são encontradas outras endopeptidases no látex da Carica papaya

L., como as quimopapaínas A e B, a endopeptidase papaia III, a endopeptidase papaia IV e,

acredita-se que, uma outra denominada endopeptidase Ω. Essas endopeptidases são um risco para a própria planta; porém, elas estão presentes no látex como pró-formas inativas, que são ativadas após a liberação do látex pela planta (CAPUCHO, 2007).

Dentre essas endopeptidases, a papaína é a que se encontra em menor quantidade (aproximadamente 8%); contudo, é a mais facilmente purificada (CAPUCHO, 2007). Foi isolada em forma cristalina a partir do látex fresco pela primeira vez em 1937, sendo o processo aprimorado por Balls e Lineweaver (1939).

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12 2.2.1 Características físicas da papaína

Algumas características físicas da papaína estão descritas na Tabela 1.

Tabela 1. Propriedades físicas da papaína.

Propriedades físicas Características

Apresentação Pó amorfo de cor branca leitosa, com odor forte e característico, similar ao enxofre. Solubilidade Parcialmente solúvel em água e glicerol. Insolúvel em álcool, éter e clorofórmio. Massa molecular 23.406 Da

Ponto isoelétrico pH 8,75

λmax 278 nm

Temperatura ótima para atividade enzimática 65ºC Faixa de pH ótimo para atividade enzimática 5,0 - 7,0

Faixa de pH da solução aquosa 2% 4,8 - 6,2

Fontes: FERREIRA et al., 2008; GLAZER e SMITH, 1961; KILARA, SHAHANI e WAGNER, 1977; MERCK

INDEX, 1996; MITCHEL, CHAIKEN e SMITH, 1970; SANCHEZ NETO et al., 1993; TRAVERSA, MACHADO-SANTELLI e VELASCO, 2007.

2.2.2 Estrutura molecular da papaína

A papaína é classificada como uma cisteína protease da família C1, pertencente à classe das enzimas proteolíticas (DARDENNE et al., 2003). Sua estrutura está representada na Figura 1. Ela consiste em uma única cadeia polipeptídica com 212 resíduos de aminoácidos (TRAVERSA, MACHADO-SANTELLI e VELASCO, 2007). Possui um grupo nucleofílico tiol essencial, do resíduo Cys-25, e um imidazol do resíduo His-159. A cadeia lateral do resíduo Asn-175 é um importante sítio de ligação das cisteínas proteases. Esses três resíduos, Cys-25, His-159 e Asn-175, formam a tríade catalítica da papaína (SANKALIA et al., 2006). A papaína hidrolisa ligações peptídicas de aminoácidos hidrofóbicos na posição P2 e, preferencialmente, aminoácidos básico na posição P1 (PINTO et al., 2007).

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13 Figura 1. Estrutura tridimensional da papaína, onde os dois domínios da cadeia principal

estão representados em verde e o sítio catalítico, em azul (CAPUCHO, 2007).

O grupo tiol do aminoácido cisteína (Cys-25) é fundamental para sua atividade enzimática (FERREIRA et al., 2005; HOMAEI et al., 2010; SILVA, 2003). Esse radical deve permanecer na sua forma reduzida, porém é facilmente oxidado a dissulfetos em soluções aquosas ou em contato com substâncias compostas por iodo, oxigênio e ferro (FERREIRA et al., 2005). Uma vez oxidado esse radical, a enzima perde sua atividade proteolítica. Para manter o radical no estado reduzido, pode-se adicionar outro tiol como cisteína, glutationa, mercaptoetanol, 2,3-dimercaptopropanol ou tioglicolato (SANKALIA et al., 2006; SMITH, KIMMEL e BROWN, 1953). A papaína pode ser parcialmente ou completamente inativada quando armazenada a temperatura ambiente por um mês (PINTO at al., 2007). Devido a essas características, recomenda-se que o armazenamento da papaína obedeça a condições específicas como abrigo de luz, umidade e calor (FERREIRA et al., 2005; SANCHEZ NETO et al., 1993).

2.2.3 A papaína no tratamento de feridas

A utilização da papaína no tratamento de feridas tem sido amplamente estudada quanto à sua ação e ao estabelecimento de protocolos para o tratamento de diversos tipos de lesões. Ela se destaca como uma ótima alternativa para esses tipos de tratamento devido ao seu baixo custo e ausência de efeitos colaterais (FERREIRA et al., 2005; HAX, 2009; SILVA, 2003).

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A papaína promove desbridamento químico, ativa o processo de regeneração tecidual e encurta o período de cicatrização, além de possuir ação bactericida, bacteriostática e anti-inflamatória (FERREIRA et al., 2005; FERREIRA et al., 2008). Foi uma das primeiras substâncias utilizadas no desbridamento (PIEPER e CALIRI, 2003). Ela também é capaz de hidrolisar as ligações peptídicas do colágeno e da queratina na camada córnea da pele (LOPES et al., 2008; TRAVERSA, MACHADO-SANTELLI e VELASCO, 2007). Além de facilitar a cicatrização, ela promove o alinhamento das fibras de colágeno, resultando em um crescimento mais uniforme do tecido e, consequentemente, em uma cicatriz mais plana, mais próxima à estrutura original da pele (CAPUCHO, 2007; MONETTA, 1990; SANCHEZ NETO et al., 1993).

O uso da papaína é consagrado na literatura internacional desde a década de 50 (FERREIRA et al., 2005). No Brasil, a primeira publicação científica dos resultados da utilização da papaína no tratamento de feridas foi feita por Monetta (1987), usando inicialmente o fruto in natura e, posteriormente, a solução da papaína em pó.

Monetta (1987) realizou um estudo com 15 pacientes com lesões abertas, num total de 23 lesões. Foi preparada a solução de papaína através da diluição de uma colher de café rasa da enzima em 50 mL de água destilada. A aplicação foi feita após limpeza mecânica por cobertura da lesão com gaze embebida na solução de papaína e, em áreas de tecidos necrosados, foi feita cobertura com fina camada de papaína em pó. No estudo, foi utilizada também a polpa do mamão verde. A limpeza foi feita com soro fisiológico, seguida de aplicação da polpa na lesão e cobertura secundária de gaze seca. Somente no primeiro paciente foi utilizado o mamão. No 5º dia, observou-se aumento de secreção sero-purulenta, amolecimento do tecido necrosado, afrouxamento dos bordos com pequeno aumento do tamanho da lesão e diminuição do alo de hiperemia ao redor da lesão. Dos 15 pacientes acompanhados, 3 foram submetidos a enxerto de pele na fase de aparecimento do tecido de granulação; 2 tiveram óbito, 1 caso suspenso no 13º dia devido à queixa de dor e 5 pacientes receberam alta hospitalar com lesões já em fase de cicatrização. Cinco pacientes queixaram-se de ardor moderado que diminuiu gradativamente, durando no máximo 20 minutos até cessar totalmente. Não foram observadas reações alérgicas.

Em 1953, Guzman e Guzman realizaram uma experimentação in vitro das marcas de papaína disponíveis no mercado, encontrando uma grande variação na atividade proteolítica. Eles também aplicaram soluções de papaína em pacientes com úlceras, incluindo 12 pacientes

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com queimaduras de segundo e terceiro graus majoritariamente infectadas. As soluções de papaína (2-5%) foram aplicadas em curativos com gaze cirúrgica úmida ou a própria enzima em pó foi colocada sobre a superfície úmida da ferida. Os curativos foram trocados a cada 24 horas, sendo a papaína reaplicada quando necessário. Dez dos 12 pacientes queimados apresentaram bom desbridamento entre 24-48 horas.

Em 1995, foi publicado um estudo onde foi avaliada a ação da papaína em infecção de vísceras e feridas abdominais abertas. Foram utilizadas soluções de papaína a 1, 2 e 4%. A troca dos curativos era feita três vezes ao dia. Em todos os casos, após 72 horas, observou-se diminuição acentuada da secreção e início de formação de tecido de granulação. A cicatrização de todas as feridas ocorreu em tempo médio de 30 dias (FERREIRA et al., 2005; PEREIRA e BACHION, 2005).

Foi relatado por Starley e colaboradores (1999) o uso tópico de uma pasta preparada com polpa de mamão em queimaduras infectadas em pacientes pediátricos. O tratamento das feridas durante algumas semanas tornam-nas suficientemente limpas para um enxerto. O estudo mostrou a possibilidade do uso de enzimas na remoção de escaras, sem a necessidade de intervenções cirúrgicas, diminuindo o tempo de internação do paciente. Um fator limitante para o desbridamento enzimático é a sepse, sendo que o mamão contém carpaina e agliconas, que possuem um amplo espectro de atividade antimicrobiana.

Um estudo descritivo e retrospectivo foi feito por Monetta (1998), onde a solução de papaína foi utilizada para tratamento de úlceras diabéticas, venosas e de pressão, em concentrações de 2% para lesões com tecidos viáveis e 10% em tecidos inviáveis. A média de idade dos pacientes foi de 62 anos, com predominância de mulheres (58,5%). Observou-se redução gradativa do tecido de necrose após o 14º dia até o 28º dia e, a partir do 7º dia, a granulação e epitelização aumentaram nos três grupos de pacientes.

A ação proteolítica da papaína é observada somente em tecidos inviáveis, não agredindo os tecidos sadios ao redor da lesão. Este fato deve-se à enzima α1-antitripsina, uma antiprotease plasmática presente somente nas células sadias, que impede a ação proteolítica da papaína (BLANES, 2004; FERREIRA et al., 2005).

O uso da papaína é indicado para todas as fases do processo de cicatrização, em feridas secas ou exsudativas, colonizadas ou infectadas, com ou sem necrose. Normalmente, são utilizadas as concentrações de 2% (p/p), para feridas com tecido de granulação; 4% a 6%

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(p/p), em feridas com exsudato purulento; e 8 a 10% (p/p), para tecido necrótico (FERREIRA et al., 2005; HAX, 2009; PIEPER e CALIRI, 2003).

2.2.4 Formulações e produtos com papaína utilizados no tratamento de feridas

No tratamento de feridas, a papaína é utilizada em diversas formas farmacêuticas, como solução aquosa, pó, gel e creme (FERREIRA et al., 2005).

No estudo realizado por Ferreira e colaboradores (2005), no período de 1987 a 2000, foi relatado exclusivamente o uso da papaína em solução, diluída em água destilada ou soro fisiológico 0,9%, com recomendação unânime de aplicação imediatamente após o preparo. De Paola e colaboradores (1999) avaliaram a estabilidade de solução de papaína 2% (p/v), diluída em água destilada. A solução foi armazenada em geladeira a 5ºC e em temperatura ambiente (22ºC), mostrando uma perda de 50% da atividade quando em temperatura ambiente no período de 8 a 10 horas de armazenamento. Quando armazenada em geladeira, após 52 horas, a atividade enzimática permaneceu em torno de 60% da inicial.

Um fator importante no uso da papaína em pó e em solução é a segurança na manipulação e aplicação, tanto do profissional quanto do paciente. Além da sua alta atividade proteolítica, se inalada, pode causar doenças respiratórias como asma, pneumonia e enfisema. É necessário ressaltar a necessidade da utilização de equipamentos de proteção individual, como máscaras com filtros contra pós e óculos, além de ventilação adequada (FERREIRA et al., 2005).

Foi desenvolvido e padronizado por Velasco (1993) um gel de papaína 0,4% (p/v) para uso diário em pacientes com ferimentos, abscessos e úlceras, inclusive as úlceras por pressão. Foram avaliadas quatro formulações de gel de papaína 0,4%, com temperaturas de armazenamento de 5, 22 e 37ºC, durante cerca de dois meses. Em temperatura de 5ºC, observou-se perda de 30% da atividade proteolítica; houve perda de 50% para a temperatura de 22ºC; enquanto que, para a temperatura de 37ºC, ocorreu variação de 30 a 60% de redução da atividade no período estudado.

A utilização da forma em gel se mostra vantajosa, já que mantém o ambiente da ferida úmido, condição primordial para o processo de cicatrização. O gel também se distribui facilmente, não excedendo os limites da lesão, além de apresentar fácil remoção pela lavagem da ferida com água destilado ou soro fisiológico, sem deixar resíduos. A formulação da

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papaína em gel apresenta a concentração como fator limitante, pois ela pode interferir na viscosidade do veículo. Entretanto, não foi encontrada na literatura a concentração máxima de papaína em gel que assegure a manutenção das características da formulação (FERREIRA et al., 2005).

Em 2003, Traversa avaliou a estabilidade de formulações de papaína 0,8% (p/p) em gel de Carbopol® 940 e em creme à base da cera emulsificante não-iônica Polawax®. As temperaturas de armazenamento utilizadas foram 4, 25 e 40ºC. Foram avaliados os seguintes parâmetros: características sensoriais (cor, odor e uniformidade), valores de pH e viscosidade. As maiores variações foram observadas nas formulações armazenadas a 40ºC, com alteração de odor para as duas formulações na primeira semana, e de cor para a formulação a base de Polawax® no 32º dia. Para a emulsão de Polawax®, ocorreram também alterações de viscosidade em todas as temperaturas, com variação de 48% em 40ºC.

Capucho (2007) estudou a estabilidade e a eficácia in vitro de formulações de papaína 1% em géis de Carbopol® 940, Natrosol® 250 HHR e Pluronic® F127. Os géis mostraram-se estáveis quando armazenados a 4ºC por 6 meses. Entretanto, o acondicionamento em temperaturas de 30ºC/70% UR e 40ºC/70% UR resultou em uma rápida redução da atividade proteolítica em função do tempo de armazenamento. A avaliação in vitro das formulações foi feita em gel de poliacrilamida, adicionado de gelatina como substrato, durante 6 horas a 37ºC. O gel de papaína em Carbopol® 940 apresentou resultado mais eficaz para esta análise, mesmo quando comparado com a solução extemporânea de papaína 1% em água. Foi concluído, então, que este foi o polímero mais adequado para veicular a papaína.

Novas formas farmacêuticas têm sido estudadas para a aplicação da papaína, com aumento de sua estabilidade. Ruas e colaboradores (2006) desenvolveram uma matriz polimérica para obtenção de um adesivo de uso tópico com ação cicatrizante. Foram analisadas duas dispersões de silicone: monocomponente (MED 6605) e bicomponente (MED 6640), sendo que a segunda alterou a atividade da enzima. A formulação de papaína 0,69% (p/p) em dispersão em silicone monocomponente apresentou um melhor perfil de liberação. Posteriormente, Zulli (2007) realizou a incorporação da papaína em diversas matrizes poliméricas com o objetivo de obter um sistema de liberação controlada da enzima. Foram utilizados os polímeros: látex de borracha natural bicentrifugado (LBNB), adesivo acrílico (AA), dispersão de silicone monocomponente (SM) e dispersão de silicone bicomponente (SB). As membranas de LBNB e de AA foram descartadas por apresentarem citotoxicidade.

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Então, as membranas de silicone incorporadas com a papaína a 2%, foram submetidas ao ensaio de liberação com células de difusão de Franz. Nos resultados, foi encontrada liberação constante da papaína nas 12 horas iniciais do experimento.

No Brasil, as preparações de uso tópico com papaína são exclusivamente provenientes da farmácia magistral. Somente recentemente foram inclusas no Formulário Nacional da Farmacopéia Brasileira (BRASIL, 2011) as fórmulas de géis de papaína 2% a 10%, com recomendação de armazenamento sob refrigeração. Por não apresentar forma industrializada, não se encontram registros de estudos de estabilidade dessas formulações. Foi recomendado por Sankalia e colaboradores (2006) que formulações farmacêuticas contendo papaína e outras enzimas digestivas sejam armazenadas a 2 - 8ºC ou 8 - 25ºC, desde que, sob a condição escolhida, mantenha-se um tempo de prateleira de um ano. Esses fatores são preocupantes, pois se torna impossível assegurar a eficácia e a segurança do medicamento durante o tempo de tratamento.

2.2.5 Estabilização da papaína

As enzimas têm sido muito utilizadas em cosméticos e medicamentos nos últimos anos, além de serem estudadas como uma nova opção terapêutica com menos efeitos tóxicos. Apesar desse potencial das enzimas, sua fragilidade apresenta-se como um problema. A maioria das enzimas não é estável e, em temperatura ambiente, perdem sua atividade biológica em aproximadamente um mês. Essa característica afeta a aplicação das mesmas em produtos farmacêuticos (SIM et al., 2000; VARCA et al., 2007).

As aplicações da papaína são restritas devido à sua limitada estabilidade. Sim e colaboradores (2000) avaliaram a conjugação da papaína com um biopolímero solúvel produzido pelo fungo Schizophyllum commune, a SC-glucana, para aplicações cosméticas. Foram realizadas também conjugações com a dextrana (DX) e o polietilenoglicol (PEG). Foi observada uma melhora significativa na estabilidade da enzima conjugada com a SC-glucana, sendo que 95% da atividade inicial manteve-se após um mês de armazenamento a 45ºC, enquanto a conjugação com PEG e DX apresentaram atividade de 27% e 45%, respectivamente. O complexo papaína/SC-glucana foi incorporado em uma loção base cosmética na concentração de 1%, apresentando taxa de recuperação da atividade maior que

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70%. A atividade enzimática na loção foi mantida por três meses de armazenamento a 45ºC; pelo contrário, a papaína nativa em loção foi inativada rapidamente.

Pinto (2005) estudou o efeito da incorporação de polietilenoglicol à papaína. A modificação da enzima foi realizada com polietilenoglicol modificado com peso molecular médio de 5000, utilizando concentração de papaína a 5% (p/v). Foram avaliadas emulsões acrescidas de papaína livre ou modificada, nas concentrações de 0,8% (p/p) e 22,06% (p/v), respectivamente. As formulações foram armazenadas em temperatura de 5, 22 e 40ºC durante 90 dias. Foi observada uma mudança no perfil de liberação e na atividade da papaína modificada, em relação à livre. A temperatura mais adequada para armazenamento das formulações com papaína não modificada foi de 5ºC, enquanto para as com papaína modificada foi de 22ºC. Os resultados confirmaram um aumento na estabilidade da papaína modificada e o potencial para aplicação em formulações de uso tópico.

Outro estudo, realizado por Varca e colaboradores (2007), propôs a formação de complexos de papaína com ciclodextrinas. As ciclodextrinas são amplamente utilizadas em formulações farmacêuticas devido à sua habilidade de formar complexos com outras moléculas, aumentando a estabilidade e a biodisponibilidade dos fármacos. A análise térmica dos complexos de papaína/hidroxipropil-β-ciclodextrina e papaína/β-ciclodextrina mostrou mudanças nos eventos endotérmicos e nos perfis citotóxicos, sendo que o último apresentou maior eficiência na mudança das características da enzima.

A adição de compostos polihidroxilados em soluções enzimáticas mostrou aumento na estabilidade das enzimas, provavelmente, pela interação dessas substâncias com a água do sistema. Assim, diminuem-se as interações da proteína com a água, já que as substâncias polihidroxiladas são preferencialmente hidratadas, e aumentam-se as interações hidrofóbicas da estrutura protéica. O resultado é uma maior resistência à desnaturação térmica da estrutura da proteína e da estabilidade da enzima (KILINÇ, ONAL e TELEFONCU, 2001).

Satish, Kumar e Prakash (2007) realizaram um estudo do efeito de vários co-solventes, como sorbitol, sacarose, xilose e glicerol, na papaína. Foram utilizadas medidas de atividade, espectroscopia de fluorescência e calorimetria exploratória diferencial (DSC). Nos estudos de desnaturação térmica da papaína com diversas concentrações dos co-solventes, observou-se mudança na temperatura de desnaturação térmica aparente (app Tm), sugerindo aumento da