Desenvolvimento e estudo de estabilidade de preparações com papaí- na para debridamentos de feridas

FACULDADE DE FARMÁCIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM

CIÊNCIAS APLICADAS EM PRODUTOS PARA SAÚDE

LETÍCIA DE SOUZA GUIMARÃES DUARTE

DESENVOLVIMENTO E ESTUDO DE ESTABILIDADE DE PREPARAÇÕES COM PAPAÍNA PARA DEBRIDAMENTO DE FERIDAS

NITERÓI 2016

LETÍCIA DE SOUZA GUIMARÃES DUARTE

DESENVOLVIMENTO E ESTUDO DE ESTABILIDADE DE PREPARAÇÕES COM PAPAÍNA PARA DEBRIDAMENTO DE FERIDAS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para a Saúde da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde.

Campo de Confluência: Tecnologia Farmacêutica.

Orientadora:

PROF.a DR.a DÉBORA OMENA FUTURO

Niterói, RJ 2016

D 812 Duarte, Letícia de Souza Guimarães.

Desenvolvimento e estudo de estabilidade de preparações com papaí- na para debridamentos de feridas / Letícia de Souza Guimarães; Orien- dora: Débora Omena Futuro. - Niterói, 2016.

90 f.: il.

Monografia (Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas em Produtos de Saúde) – Universidade Federal Fluminense, 2016.

1. Tecnologia farmacêutica 2. Papaína 3. Feridas 4. Desenho experi-mental fatorial I. Futuro, Débora Omena II. Título.

LETÍCIA DE SOUZA GUIMARÃES DUARTE

DESENVOLVIMENTO E ESTUDO DE ESTABILIDADE DE PREPARAÇÕES COM PAPAÍNA PARA DEBRIDAMENTO DE FERIDAS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para a Saúde da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde.

Campo de Confluência: Tecnologia Farmacêutica.

Aprovada em 29 de março de 2016.

BANCA EXAMINADORA

____________________________________________________________________ Prof.ª Dr.ª Débora Omena Futuro - UFF

Orientadora

____________________________________________________________________ Dr.ª Thelma de Barros Machado

Faculdade de Farmácia - UFF

____________________________________________________________________ Dr.ª Zaida Maria Faria de Freitas

Faculdade de Farmácia - UFRJ

Niterói 2016

DEDICATÓRIA

Ao meu marido, Cristiano, pelo incentivo, companheirismo e pelo bom humor que me alimenta todos os dias Aos meus filhos, Laura e Vítor, para que os dias que dediquei ao trabalho sejam lembrados

como exemplo de que o esforço nos estudos é sempre válido Aos meus pais que sempre me apoiaram nos estudos e acreditaram no meu potencial

AGRADECIMENTOS

A Deus, pela bênção de ter saúde para conquistar meus sonhos.

À Prof.a Dr.a Débora Omena Futuro, por ter aceito ser minha orientadora durante o mestrado, por sua amizade, por ter se dedicado e ter apoiado minhas ideias. Minha experiência profissional e pessoal foi muito enriquecida depois de todos esses momentos de convivência.

Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas em Produtos para a Saúde e seus docentes, meu muito obrigado pelo conhecimento adquirido.

Ao Prof. Dr. Raphael Cruz, pelo apoio nos ensinamentos de físico-química.

Aos professores Dr.a _{Deborah Quintanilha Falcão, Dr.}a _{Samanta Cardozo Mourão, Dr.}a _Thelma

Machado e Déo Anselmo Pinheiro por contribuírem com incentivos e opiniões, assim como pela cedência de materiais, matérias-primas e instrumentos.

Às minhas amigas Carol e Patrícia que sempre me acolheram, me aconselharam e me animaram desde o início desse período de mestranda, um agradecimento especial.

A todos os amigos e colegas que fiz durante essa jornada no mestrado: Alessandra, Arthur, Hingred, Lívia, Lorena, Paola (Lola) e muitos outros que me ajudaram de uma forma ou de outra a encarar esse desafio.

Às colaboradoras Camila e Nelise, da Central Analítica da Faculdade de Farmácia da UFF, pela companhia e dedicação nos inúmeros dias de análise no fluorímetro.

Aos alunos de iniciação científica Vítor e Mariana, pela companhia e pela ajuda no fornecimento de dados e de insumos durante minha pesquisa.

Aos meus amigos farmacêuticos da Flor da Pele: Maria Luiza, Mauro, Angela, Anna Paula, Fernanda, Simone, Fabíola, Hider, que acompanharam a maior parte de minha vida profissional, me moldando com seus exemplos, atitudes e conselhos.

RESUMO

DUARTE, L.S.G, Desenvolvimento e estudo de estabilidade de preparações com papaína

para desbridamento de feridas. Dissertação (Mestrado). Programa de Pós-Graduação em

Ciências Aplicadas a Produtos para a Saúde, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal Fluminense, 2016.

A papaína, que corresponde a um complexo de enzimas extraídas do vegetal Carica papaya L., tem sido utilizada pela sua propriedade proteolítica em desbridamento enzimático de feridas. Diversos estudos descrevem o uso da papaína na forma de pó, solução, gel e creme sobre feridas, porém a baixa estabilidade da enzima nesses meios limita sua utilização em larga escala. O objetivo principal do trabalho consiste em desenvolver e avaliar formulações de papaína 10%(p/p) em gel carbômero, contendo antioxidantes como acetato de alfa-tocoferol e metabissulfito de sódio, associados a outros adjuvantes que permitam melhor estabilidade da enzima. As formulações iniciais para o estudo foram planejadas segundo desenho experimental fatorial 23, sendo as variáveis independentes representadas pelas concentrações de cisteína, de polissorbato 80 e de antioxidante (acetato de alfa-tocoferol ou metabissulfito de sódio). As amostras, mantidas sob refrigeração (5°C ± 3) por 7 dias, foram submetidas a ensaios de espectrofluorimetria para avaliação da atividade enzimática. Os resultados iniciais revelaram que as amostras que continham metabissulfito de sódio associado às maiores concentrações de polissorbato 80, apresentaram as melhores condições para manutenção da atividade proteolítica, enquanto que as amostras contendo alfa-tocoferol não foram capazes de manter a atividade. Sendo assim, realizou-se estudo de estabilidade com preparações contendo concentrações fixas de papaína 10% (p/p), polissorbato 80 2,0% (p/p), com variações nas concentrações de cisteína de 0,10, 0,13 e 0,16% (p/p) e metabissulfito de sódio de 0,50, 0,75 e 1,00% (p/p). Durante o período estudado, as amostras apresentaram aspecto homogêneo, sem mudanças na coloração e no odor. Na avaliação de pH não houve variação significativa dos valores (p>0,05). A variação de potencial Zeta foi menor que ǀ10ǀmV, não havendo diferença estatisticamente significativa em função do tempo (p>0,05). A partir dos resultados obtidos, novo desenho fatorial 23 _{foi traçado considerando como variáveis independentes: o tempo, as}

concentrações de metabissulfito e de cisteína. A presença de metabissulfito 0,5% ou 1,0% (p/p) associado a cisteína 0,16%(p/p) e polissorbato 80 2,0% (p/p), proporcionaram os menores valores de decaimento na concentração de papaína ativa nas formulações testadas por 28 dias.

Palavras-chave: Papaína; Acetato de alfa-tocoferol; Metabissulfito de sódio; Atividade

ABSTRACT

DUARTE, L.S.G, Development and stability tests of papain preparations for wound

debridement. Dissertation (Master’s degree). Programa de Pós-Graduação em Ciências

Aplicadas a Produtos para a Saúde, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal Fluminense, 2016.

Papain, which corresponds to a complex of enzymes from the plant Carica papaya L., has been used for its proteolytic property in enzymatic wound debridement. Several studies describe the use of papain as powder, solution, gel and cream forms over wounds; however, the low stability of the enzyme in the media limits its use in large scale. The main objective of this work is to develop and evaluate formulations with papain 10% (w/w) at carbomer gel, containing antioxidants as alpha-tocopherol acetate and sodium metabisulphite, associated with other adjuvants that enable better stability of the enzymes. The early formulations for the study were planned in a factorial experimental design 23, with the independent variables represented by cysteine, polysorbate 80 and antioxidant (alpha-tocopherol or sodium metabisulphite) concentrations. The samples, kept under refrigeration (5°C ± 3) for 7 days, were submitted to spectrofluorimetry essays for enzyme activity evaluation. Initial findings showed that the samples containing sodium metabisulphite associated with higher concentrations of polysorbate 80, presented the best conditions for proteolytic activity maintenance, whereas the samples containing alpha-tocopherol were not able to maintain activity. Thus, stability study was carried out with preparations with fixed concentrations of papain 10% (w/w), polysorbate 80 2.0% (w/w), with variations in the concentrations of cystein 0.10, 0.13 and 0.16% (w/w) and sodium metabisulphite 0.50, 0.75 and 1.00% (w/w). During the studied period, the samples showed a homogeneous appearance, without color or odor changes. At pH evaluation there was no significant change in values (p> 0.05). Zeta potential have varied less than |10|mV, with no statistically significant difference over time (p> 0.05). From the results, a new factorial design 23 was traced, considering as independent variables: time, metabisulphite and cystein concentrations. The presence of metabisulphite 0.5 % or 1.0 % (w/w) associated with cysteine 0.16 % (w/w), and polysorbate 80 2.0% (w/w), showed the lowest decay values of active papain concentration in the formulations tested for 28 days.

Keywords: Papain; Alpha-tocopherol acetate; Sodium metabisulphite; Proteolytic activity;

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Propriedades físicas da papaína ... 22

Tabela 2: Valores de EHL de polissorbatos ... 35

Tabela 3: Concentrações de uso dos polissorbatos ... 36

Tabela 4: Descrição da formulação do gel base de Carbopol® 940... 39

Tabela 5: Composições das formulações submetidas ao ensaio de determinação de CMC... 41

Tabela 6: Desenho experimental fatorial 23. ... 42

Tabela 7: Formulações determinadas por desenho experimental fatorial 23 ... 42

Tabela 8: Formulações para estudo de estabilidade ... 47

Tabela 9: Valores de tensão superficial para amostras de gel de papaína 10%(p/p) da série com acetato de alfa-tocoferol (AAT), contendo diferentes concentrações de polissorbato 80 (P80). ... 51

Tabela 10: Valores de tensão superficial para amostras de gel de papaína 10%(p/p) da série com metabissulfito de sódio (MBS), contendo diferentes concentrações de polissorbato 80 (P80). ... 53

Tabela 11: Resultados de velocidade de fluorescência para diferentes concentrações de papaína padrão secundário 30.000 USP-U/mg ... 56

Tabela 12: Valores de concentração e atividade proteolítica para padrão e matéria-prima ... 57

Tabela 13: Resultados relativos à concentração de papaína ativa em D1 e D7, para formulações de gel contendo papaína à 10%(p/p), da série do acetato de alfa-tocoferol ... 58

Tabela 14: Resultados relativos à concentração de papaína ativa nos dias D1 e D7, para formulações de gel contendo papaína à 10%(p/p), da série do metabissulfito de sódio ... 60

Tabela 15: Coeficientes de regressão para a concentração de papaína ativa em D1. ... 62

Tabela 16: Coeficientes de regressão para a concentração de papaína ativa em D7. ... 65

Tabela 17: Características sensoriais relativas às preparações submetidas ao estudo de estabilidade. ... 69

Tabela 18: Valores de pH e suas variações em 28 dias de avaliação das formulações de géis de papaína a 10,0%, AF1 a AF5. ... 71

Tabela 19: Resultado do tratamento estatístico de médias para avaliação da significância (Teste de Tukey) para valores de pH das amostras individuais no decorrer dos 28 dias. ... 72

Tabela 20: Valores de potencial zeta no período de avaliação da estabilidade das formulações finais de géis de papaína 10% (p/p) contendo metabissulfito como antioxidante ... 72

Tabela 21: Resultado do tratamento estatístico das médias para avaliação da significância (Teste de Tukey) para valores de potencial zeta das amostras individuais no decorrer dos 28 dias. .. 73

Tabela 22: Resultados relativos ao estudo de atividade de papaína para as formulações finais, nos dias D1, D14 e D28 ... 74

Tabela 23: Coeficientes de regressão para a concentração de papaína ativa durante o estudo de estabilidade acelerada. ... 76

LISTA DE FIGURAS

Quadro 1: Classificação de géis ... 25

Quadro 2: Parâmetros de avaliação das características sensoriais das preparações ... 48

Figura 1: Estrutura da papaína ... 22

Figura 2: Representação da exposição de grupos ácidos na molécula de carbômero. ... 27

Figura 3: Fórmula estrutural dos tocoferóis ... 28

Figura 4: Tensão superficial de solução de tensoativo x concentração, com formação de micelas. ... 32

Figura 5: Exemplo de gráfico gerado por testes em tensiômetro para determinação de CMC 33 Figura 6: Mecanismo de estabilização de proteínas por tensoativos ... 34

Figura 7: Estrutura química dos polissorbatos 20 e 80.. ... 35

Figura 8: Tensiômetro EasyDyne (KRÜSS) equipado com placa de platina. ... 40

Figura 9: Método de medida de tensão superficial através de placa de Wilhelmy ... 40

Figura 10: Esquema de microplacas para análise por fluorimetria ... 44

Figura 11: Gráfico de tensão superficial X concentração de polissorbato 80 para as preparações de gel de papaína 10% (p/p) contendo acetato de alfa tocoferol. ... 51

Figura 12: Gráfico para determinação da CMC de polissorbato 80 das preparações de gel de papaína 10% contendo acetato de alfa tocoferol (AAT). ... 52

Figura 13: Gráfico de tensão superficial X concentração de polissorbato 80 para as preparações de gel de papaína 10% contendo metabissulfito de sódio ... 53

Figura 14: Gráfico para determinação da CMC de polissorbato 80 das preparações de gel de papaína 10% contendo metabissulfito de sódio (MBS). ... 54

Figura 15: Curva analítica da papaína 30.000 USP-U/mg ... 56

Figura 16: Representação gráfica da concentração de papaína ativa no produto (U/mg), em 7 dias, para gel de papaína 10% (p/p), da série do acetato de alfa-tocoferol (AAT)... 59

Figura 17: Representação gráfica da concentração de papaína ativa (U/mg de produto) em 7 dias para gel de papaína 10% (p/p), da série do metabissulfito de sódio (MBS) ... 61

Figura 18: Diagrama de Pareto dos efeitos sobre a concentração de papaína ativa em D1 ... 62

Figura 19: Gráficos de superfície de resposta para concentração de papaína ativa em função da concentração de cisteína (Cys) e polissorbato 80 (P80), fixando a concentração de metabissulfito de sódio (MBS) em (A) 0,5% e (B) 1,0%, em D1. ... 63

Figura 20: Gráficos de superfície de resposta para concentração de papaína ativa em função da concentração de Metabissulfito de sódio (MBS) e cisteína (Cys), fixando a concentração de polissorbato 80 (P80) em (A) 1,0%, (B) 1,5% e (C) 2,0%, em D1. ... 63

Figura 21: Gráficos de superfície de resposta para concentração de papaína ativa em função da concentração de metabissulfito de sódio (MBS) e polissorbato 80 (P80), fixando a concentração de cisteína em (A) 0,1%, (B) 0,2% e (C) 0,3%, em D1. ... 64

Figura 23: Gráficos de superfície de resposta para concentração de papaína ativa em função da concentração de cisteína (Cys) e polissorbato 80 (P80), fixando a concentração de

metabissulfito de sódio (MBS) em (A) 0,5% e (B) 1,0%, em D7. ... 66 Figura 24: Gráficos de superfície de resposta para concentração de papaína ativa em função da concentração de metabissulfito de sódio (MBS) e cisteína (Cys), fixando a concentração de polissorbato 80 (P80) em (A) 1,0%, (B) 1,5% e (C) 2,0%, em D7. ... 66 Figura 25: Gráficos de superfície de resposta para concentração de papaína ativa em função da concentração de metabissulfito de sódio (MBS) e polissorbato 80 (P80), fixando a

concentração de cisteína em (A) 0,1%, (B) 0,2% e (C) 0,3%, em D7. ... 67 Figura 26: Imagens digitais das preparações finais durante estudo de características sensoriais. ... 70 Figura 27: Representação em histograma de valores de potencial zeta, com desvio padrão, para as formulações finais nos dias D1, D14 e D28. ... 73 Figura 28: Representação gráfica da concentração de papaína ativa (U/mg de produto) nos estudos de estabilidade das formulações de gel de papaína 10% (p/p), nos dias D1, D14 e D28. ... 75 Figura 29: Variação da concentração percentual da papaína ativa, frente ao declarado, nas amostras submetidas ao estudo de estabilidade. ... 75 Figura 30: Diagrama de Pareto dos efeitos sobre a concentração de papaína durante o estudo de estabilidade ... 77 Figura 31: Gráficos de superfície de resposta para concentração de papaína ativa em função da concentração de cisteína (Cys) e do tempo, fixando a concentração de metabissulfito de sódio (MBS) em (A) 0,50%, (B) 0,75% e (C) 1,00%. ... 78 Figura 32: Gráficos de superfície de resposta para concentração de papaína ativa em função da concentração de metabissulfito de sódio (MBS) e do tempo, fixando a concentração de cisteína em (A)0,10%, (B)0,13% e (C)0,16%. ... 79 Figura 33: Gráficos de superfície de resposta para concentração de papaína ativa em função da concentração de metabissulfito de sódio (MBS) e cisteína (Cys), fixando o tempo em (A) 14 dias, (B) 20 dias e (C) 30 dias ... 80

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

AAT Acetato de alfa-tocoferol

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

Asn Asparagina

BHA Butil hidroxianisol

BHT Butil hidroxitolueno

CMC Concentração micelar crítica

Cys Cisteína

Cys Cl Cloridrato de cisteína monoidratado

Da Daltons

DMSO Dimetilsulfóxido

DP Desvio padrão

EDTA-Na2 Etilenodiaminotetracetato dissódico

EHL Equilíbrio hidrófilo-lipófilo

FDA Food and Drug Administration

g Grama His Histidina MBS Metabissulfito de sódio µL Microlitro mg Miligrama mL Mililitro

mPa.s Milipascal segundo

N-CBZ-PHE-ARG-7-MCA Cloridrato de carbobenzoxi-L-fenilalanina-L-arginina-4-metilcumarina-7-amido

NA Não se aplica

nm Nanômetro

P80 Polissorbato 80

p/p Peso por peso

p/v Peso por volume

PMMA Polimetil-metacrilato

PPG Propilenoglicol

® Marca registrada

R Coeficiente de correlação

R2 Coeficiente de correlação linear

U Unidade

UR Umidade relativa do ar

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ... 15

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 16

2.1 DESBRIDAMENTO ... 16

2.1.1 Tipos de Desbridamento ... 17

2.2 CARACTERÍSTICAS E APLICAÇÕES DA PAPAÍNA... 21

2.3 ESTABILIDADE DAS FORMULAÇÕES COM PAPAÍNA ... 23

2.4 AGENTES GELIFICANTES ... 25

2.4.1 Hidrogéis ... 26

2.5 AGENTES ANTIOXIDANTES E OUTROS ADJUVANTES ... 28

2.5.1 Alfa-tocoferol ... 28

2.5.2 Metabissulfito de sódio ... 29

2.5.3 EDTA Dissódico ... 30

2.6 AGENTES SOLUBILIZANTES ... 31

2.6.1 Uso de tensoativos em produtos contendo proteínas ... 33

2.6.2 Polissorbatos ... 34 3. OBJETIVO ... 37 4. MATERIAIS E MÉTODOS ... 38 4.1 MATERIAIS ... 38 4.1.1 Matérias-primas ... 38 4.1.2 Equipamentos ... 38 4.2 MÉTODOS ... 39

4.2.1 Desenvolvimento das formulações ... 39

4.2.2 Determinação da concentração micelar crítica (CMC) ... 40

4.2.3 Estudo da influência de antioxidantes sobre a atividade proteolítica da papaína .... 41

4.2.4 Avaliação da atividade enzimática ... 43

4.3. ESTUDOS DE ESTABILIDADE ... 46

4.3.1 Avaliação das características sensoriais ... 47

4.3.2 Avaliação de pH ... 48

4.3.3 Avaliação do potencial zeta ... 48

4.3.4 Atividade proteolítica ... 49

4.4. ESTUDOS ESTATÍSTICOS ... 49

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 50

5.1 CONCENTRAÇÃO MICELAR CRÍTICA (CMC) ... 50

5.1.1 Preparações contendo polissorbato 80 e acetato de alfa-tocoferol ... 50

5.1.2 Preparações contendo polissorbato 80 e metabissulfito ... 52

5.2 ESTUDO DO EFEITO DE ANTIOXIDANTES NA ATIVIDADE PROTEOLÍTICA DA PAPAÍNA ... 55

5.2.1 Atividade proteolítica da papaína ... 55 5.3 ESTUDOS DE ESTABILIDADE ... 69 5.3.1 Características sensoriais ... 69 5.3.2 Avaliação de pH ... 71 5.3.3 Potencial Zeta ... 72 5.3.4 Atividade proteolítica ... 74 6. CONCLUSÕES ... 82 7. REFERÊNCIAS ... 84

1. INTRODUÇÃO

Desbridamento é o processo utilizado na terapia tópica de feridas agudas ou crônicas com o propósito de remover tecidos necrosados e corpos estranhos, até a exposição de tecido saudável, com o objetivo de promover a cicatrização das feridas (BORGES, 2008).

Existem diversos métodos conhecidos para realizar o desbridamento sendo os mais utilizados: mecânico, cirúrgico, autolítico, biológico e enzimático. Indicações, contra indicações, vantagens e desvantagens de cada método devem ser conhecidos e considerados na escolha da técnica mais adequada para cada paciente (BORGES, 2008, STOHAL, 2013).

Enzimas proteolíticas de diversas fontes podem ser utilizadas no processo de desbridamento enzimático. A papaína, extraída do vegetal Carica papaya L., é um complexo de enzimas proteolíticas comumente utilizado em desbridamento de feridas (BEITZ, 2005; BORGES, 2008; LEITE, 2012; STROHAL, 2013). Formulações em gel de papaína na concentração de 2 a 10% são descritas no Formulário Nacional da Farmacopeia Brasileira (2012).

A papaína tem sido utilizada na forma de pó, solução, gel e creme para aplicação em feridas, entretanto seu uso é limitado devido à baixa estabilidade da enzima nesses meios, podendo ser influenciada pela temperatura, pH, luz, oxigênio e umidade (CAPUCHO, 2007; MIURA, 2012).

Produtos para desbridamento que utilizam géis como veículo, apresentam algumas vantagens, pois são capazes de manter a umidade do leito da ferida, são facilmente removíveis com água e possuem consistência compatível com as práticas de curativo, evitando e extravasamento do produto para a pele íntegra.

Esse trabalho avalia o efeito dos antioxidantes acetato de alfa-tocoferol e metabissulfito de sódio, associados a outros adjuvantes, sobre a atividade da papaína em preparações contendo a enzima à 10%(p/p), incorporada em gel de carbômero.

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 DESBRIDAMENTO

O desbridamento é um procedimento realizado no tratamento de feridas tópicas quando há necessidade de remoção de tecido desvitalizado ou necrótico, tecido infectado, corpos estranhos, fragmentos de ossos ou de qualquer origem biológica do leito da ferida, até exposição de tecido saudável com o objetivo de favorecer a cicatrização (STROHAL, 2013).

A permanência de tecido desvitalizado mascara a extensão e profundidade da ferida, aumenta a possibilidade de infecção e retarda a cicatrização (BORGES, 2008). Sua remoção, além de facilitar a cicatrização, promove aumento na qualidade de vida do paciente na medida em que diminui o odor proveniente da ferida, melhora a microcirculação, diminui a infecção e o excesso de umidade (STROHAL, 2013).

A ocorrência de tecido desvitalizado ou necrótico pode ter origem em lesões agudas ou crônicas (BORGES, 2008). Sua ocorrência se deve ao aporte insuficiente de oxigênio às células. A respiração celular torna-se anaeróbica, acionando uma série de eventos que culminam na dissolução do núcleo celular e sua morte (HUETHER e McCANCE, 2000 apud O’BRIEN, 2002).

Úlceras de compressão, úlceras ocasionadas por insuficiência venosa ou arterial e queimaduras de terceiro grau apresentam tecido necrótico aderido ao fundo da ferida através de pontes de colágeno (fibras colágenas) (BORGES, 2008).

Esfacelo e escara são as duas formas na qual o tecido necrosado pode se apresentar, sendo ambas aderidas à ferida. O esfacelo é um tecido úmido com coloração variável de branco amarelado à amarronzado ou até mesmo cinza esverdeado (BEITZ, 2005), dependendo da quantidade de leucócitos presente. Sua aparência pode ser pegajosa, mucinosa ou firme. A escara apresenta-se como um tecido seco, semelhante a couro, macio ou firme, com coloração geralmente preta, podendo variar em tons de marrom. A superfície da ferida pode estar completamente coberta por escara, ou a mesma pode apresentar-se dispersa nas margens da ferida (SPEAR, 2010).

A partir da detecção de tecido necrótico na ferida, o profissional envolvido no tratamento deverá escolher o melhor método de desbridamento considerando vários fatores como: dor provocada pelo procedimento, ambiente do paciente, preferência do paciente, idade,

habilidade e recursos do profissional que realizará o tratamento, qualidade de vida do paciente, regulamentações e protocolos (STROHAL, 2013)

2.1.1 Tipos de Desbridamento

2.1.1.1 Desbridamento mecânico

Considerado um procedimento doloroso e de certa forma invasivo, baseia-se na remoção da necrose, esfacelo e corpos estranhos através da aplicação de força física utilizando-se: gaze úmida a seca, fricção e/ou instrumental cortante (BORGES, 2008).

 Gazes úmidas a secas

Nesse processo uma gaze úmida é aplicada sobre a ferida com tecido necrótico ou esfacelo e permanece até secar. Ao retirar a gaze, o tecido desvitalizado que está aderido a mesma é também removido (BORGES, 2008; STROHAL, 2013).

Trata-se de um método não seletivo, já que pode também retirar tecido de granulação, inclusive com risco de sangramento, bastante utilizado no Brasil (BORGES, 2008) e nos Estados Unidos, estando em desuso na Grã-Bretanha (O’BRIEN, 2002).

 Fricção

Utilizando-se gazes ou esponjas macias, realiza-se fricção do leito da ferida, em movimentos centrífugos, por 2 a 3 minutos para remoção mecânica do tecido desvitalizado e corpos estranhos apenas em feridas agudas e traumáticas. Não deve ser utilizada em feridas crônicas (BORGES, 2008).

A principal limitação desta técnica está no fato de que provoca muita dor e por isso o paciente deve estar sob o efeito de anestesia local ou geral. Embora não seletiva, muitas vezes é um método necessário quando se precisa remover óleo, carvão e outras sujidades do leito da ferida (BORGES, 2008).

 Instrumental cortante

O desbridamento com instrumental cortante dependerá da habilidade do profissional e pode ser considerado o método mais agressivo, entretanto apresenta um resultado mais rápido comparado aos outros métodos mecânicos (BORGES, 2008).

Como instrumentais, podem ser empregados: bisturi, tesoura ou outro instrumental conforme a necessidade do procedimento que pode envolver uma região superficial ou mais profunda (BORGES, 2008).

Em feridas crônicas o método envolvendo instrumental cortante se restringe a retirada de tecido necrosado sem interferir no tecido viável. Nesses casos utiliza-se apenas tesoura e bisturi, no próprio leito, sem demanda de anestesia (BORGES, 2008).

O desbridamento cirúrgico, um dos métodos de desbridamento instrumental, é realizado por cirurgiões, em sala cirúrgica, e demanda aplicação de anestesia geral ou local, dependendo da região, extensão e profundidade da lesão. Utiliza-se esse processo quando há necessidade de remoção de toda necrose incluindo a margem viável da ferida. Devido ao aspecto invasivo, o profissional envolvido deve possuir experiência e qualificação para realizar esse tipo de procedimento (BORGES, 2008; STROHAL, 2013).

2.1.1.2 Desbridamento autolítico

Esse método se baseia na autólise natural que ocorre no tecido necrótico. O processo é intensificado através da umidificação da região que pode ser realizada através do uso de curativos com propriedades oclusivas e hidrocolóides (STROHAL, 2013).

O desbridamento autolítico apresenta vantagens por ser seletivo, não invasivo, indolor, porém é considerado lento, se comparado aos métodos enzimático e mecânico (BORGES, 2008).

2.1.1.3 Desbridamento por terapia larval

A terapia larval é realizada com larvas vivas, criadas em condições estéreis, geralmente Lucilia sericata, que são colocadas sobre a ferida a ser desbridada. As secreções produzidas por essas larvas contêm substâncias antibacterianas e enzimas proteolíticas, que rompem a matriz de colágeno degradando a escara (HOROBIN, 2005 apud STROHAL, 2013).

2.1.1.4 Desbridamento enzimático

Nesse desbridamento a remoção do tecido desvitalizado ocorre através da ação de enzimas proteolíticas, que agem sinergicamente com enzimas endógenas (KÖNIG, 2005 apud STROHAL, 2013).

Para Strohal e colaboradores (2013), o desbridamento enzimático é considerado altamente seletivo, pouco doloroso e de manuseio fácil e seguro. Para sua aplicação é necessário manter meio úmido.

 Colagenase

As colagenases são enzimas endógenas que fazem parte da família das metalo-proteinases, responsáveis pela degradação do colágeno (HARVEY, 2012). Durante o processo de cicatrização, ocorre a produção endógena de colagenases de maneira a controlar o colágeno proveniente do processo de necrose, porém essa produção não ocorre em quantidade suficiente (BORGES, 2008). Colagenases clostridianas, provenientes da bactéria Clostridium histolyticum e outras colagenases de origem microbianas são utilizadas na preparação de produtos para feridas, apresentando ótimos resultados (STROHAL, 2013).

 Estreptoquinase / estreptodornase

A estreptodornase é uma desoxirribonuclease, com atividade sobre o DNA das células do tecido não-viável, não exercendo efeito sobre as células vivas. Geralmente é usada em associação com a estreptoquinase, que degrada fibrinogênio e fibrina (BORGES, 2008; STROHAL, 2013).

 Bromelina

Bromelina é o nome genérico dado a um grupo de enzimas proteolíticas (cisteína proteases), extraídas do abacaxi (Ananas comosus), que são capazes de romper a ligação peptídica das proteínas e peptídeos (FRANÇA-SANTOS, 2009).

Em 2012 iniciou-se na Europa a comercialização do NexoBrid®, produto patenteado para uso em desbridamento, que tem a bromelina como principal componente. Diversos processos de purificação são aplicados à bromelina bruta, retirando inibidores da bromelina através de precipitação e filtragem. A composição resultante compreende enzimas proteolíticas com pesos moleculares de aproximadamente 23 kDa, a Debrase® (GORECKI, 2012).

Para manter a atividade enzimática proteolítica, NexoBrid® é comercializado como produto para uso extemporâneo para ser preparado no momento de sua aplicação. O concentrado de enzimas proteolíticas proveniente da bromelina, na forma de pó, é adicionado a um gel carbômero e após homogeneização obtém-se o produto na proporção de 0,09g/g de ativo (GORECKI, 2012; EMA, 2012).

De acordo com a patente, a Debrase® poderá ser usada em uma grande variedade de feridas incluindo: queimaduras com espessura total ou parcial, queimaduras de sol, queimaduras causadas pelo frio, lesões ulcerativas como as úlceras de pressão e varicose, vaginite, cervicite, tecido cicatricial de catarata, locais com enxerto de pele, feridas associadas a procedimentos cirúrgicos como amputação, incisão, circuncisão e episiotomia (GORECKI, 2012).

 Papaína

Essa enzima promove remoção do tecido desvitalizado e liquefação dos detritos fibrinosos. Apresenta maior atividade proteolítica na presença de grupo sulfidrila (como a cisteína), em pH de 5 a 8 (BORGES, 2008).

O desbridamento através da papaína é considerado altamente seletivo, pois remove apenas o tecido necrótico, demonstrando ser uma alternativa para uso em tratamentos prolongados e home care. Grandes vantagens desse método se devem ao fato de apresentar aplicação fácil, segura, pouco dolorosa, podendo ainda ser usado em pacientes que fazem uso de anticoagulantes, visto que não promove sangramento. Como efeito colateral pode apresentar: irritação da pele ao redor da ferida, com sinais de inflamação, sensação de queimação e desconforto (BEITZ, 2005; STROHAL, 2013).

Nos Estados Unidos há relatos de pacientes alérgicos ao látex de origem vegetal, e que apresentaram reação cruzada com o uso de papaína. Segundo a Associação Brasileira de Enfermagem em Dermatologia (SOBEND) e a Associação Brasileira de Estomaterapia: estomias, feridas e incontinências (SOBEST), no Brasil não há registros de alergias ao látex do fruto do mamoeiro, embora existam relatos de casos que apresentaram dor e ardência que diminuíam gradativamente, durando 20 minutos no máximo (LEITE, 2012).

Na maior parte dos países a papaína não é encontrada comercialmente para desbridamento (O’BRIEN, 2002), entretanto, é utilizada no Brasil em forma de solução, pó, gel ou creme. Para utilizar a solução, realiza-se a diluição da papaína pó em água destilada ou soro fisiológico no momento da aplicação, com a recomendação de uso imediato (FERREIRA, 2005). As outras formas: pó, gel e creme, são manipulados em farmácias magistrais ou farmácias hospitalares, constando inclusive no Formulário Nacional formulação de 2 a 10% de papaína em veículo gel (BRASIL, 2012). Na concentração de 10% a papaína é utilizada para tecidos com necrose e de 4 a 1% para tecido fibrinoso ou de granulação (PIEPER, CALIRI, 2003 apud FERREIRA, 2005).

Outra forma de aplicação é realizada através da papaína associada ao silicato de magnésio. Coutinho (2004) reivindicou em patente essa forma de apresentação com papaína em diversas concentrações (0,5 – 10%) para cicatrização de feridas. A técnica consiste em aplicar diretamente a formulação na forma de pó sobre o tecido a ser tratado, cobrir com uma camada de gaze umidificada com soro fisiológico e após, uma camada de gaze seca. Para aplicação em feridas com presença de tecido necrótico liquefeito (esfacelo), foi reivindicado 8,0-10,0% de papaína. Para desfazer e remover o tecido necrótico, reivindicou-se 100% de papaína para ser aplicada diretamente na ferida.

Em 2008, o órgão regulador de alimentos e medicamentos nos Estados Unidos, Food and Drug Adminstration (FDA), proibiu a comercialização de produtos para uso tópico contendo papaína alegando inexistência de aprovação técnica legal e hipersensibilidade grave relatadas por pacientes que fizeram uso de produtos contendo papaína. Entre outros produtos, Accuzime® e Panafil® são exemplos de medicamentos que eram comercializados para desbridamento e cicatrização de feridas contendo papaína e ureia. Essa associação da enzima proteolítica a um desnaturante de proteína fornece duas vantagens, demonstradas em estudos in vitro: (1) exposição do grupo sulfidrila, sítio ativador da papaína por ação solvente e (2) desnaturação de tecido não viável deixando-o mais susceptível às ações enzimáticas (SHI, ANGUIANO, WRIGHT 2003 apud LANGER et al, 2013)

Leite (2012), em revisão sistemática do uso da papaína em processo de cicatrização de feridas, constatou que não há um padrão de formas e apresentação para o produto com papaína, embora tenha verificado, nos trabalhos avaliados, a efetividade no uso da papaína como desbridante e estimulante do processo de cicatrização de feridas.

2.2 CARACTERÍSTICAS E APLICAÇÕES DA PAPAÍNA

Extraída do látex da Carica papaya L., a papaína é uma enzima proteolítica (tiol proteinase) que apresenta uma cadeia polipeptídica com 212 resíduos de aminoácidos e peso molecular de aproximadamente 23.000 Da (KAMPHUIS, KALK, SWARTE et al., 1984; SATHISH, KUMAR, PRAKASH, 2009). Sua estrutura está representada na figura 1 (pág. 21). A cadeia peptídica apresenta dois domínios de tamanho aproximadamente igual, mas com diferentes conformações. A molécula é dobrada de tal modo que a fenda é formada na superfície da enzima; o local ativo é constituído por resíduos de cisteína na posição 25 (Cys-25), histidina na posição 159 (His-159) e asparagina na posição 175 (Asn-175), nos dois

domínios. Asn-175 tem importante papel na estabilidade estrutural da papaína (VERNET et al. 1995 apud SATHISH, KUMAR, PRAKASH, 2009).

Figura 1: Estrutura da papaína (Fonte: https://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/enzymes/)

A papaína apresenta grupos tióis livres, que quando estão reduzidos, a deixam ativa e quando estão oxidados, a enzima se apresenta na forma inativa. Reagentes aldeídicos, agentes que atuam no grupo SH (iodocetamida e p-cloromercuriobenzoato) e íons metálicos (Cd2+_,

Zn2+, Fe2+, Cu2+, Hg2+ e Pb2+) são inibidores da papaína, enquanto substâncias como cianeto, cisteína e sulfetos são ativadores da mesma (LIMA, 2001), por esses motivos têm-se utilizado etilenodiaminotetracetato dissódico (EDTA) e cisteína como adjuvantes em formulações contendo papaína. O EDTA por ter a propriedade de quelar metais e a cisteína por ter ação na ativação da enzima (CAPUCHO, 2007; FERREIRA, 2005; MIURA, 2012; SILVA, 2003; USP XXXI, 2008).

Recomenda-se o armazenamento da papaína em embalagem bem fechada, protegida da luz, umidade e calor. Algumas características da papaína encontram-se na tabela 1.

Tabela 1: Propriedades físicas da papaína

Propriedades físicas Características

Apresentação Pó amorfo de cor branca leitosa, com odor forte e característico, similar ao enxofre. Solubilidade Parcialmente solúvel em água e glicerol. Insolúvel em álcool, éter e clorofórmio.

Massa molecular 23.406 Da

Ponto isoelétrico pH 8,75

λmax 278 nm

Temperatura ótima para atividade enzimática 65ºC Faixa de pH ótimo para atividade enzimática 5,0 a 7,0

Faixa de pH da solução aquosa 2% 4,8 a 6,2

A papaína apresenta propriedades úteis em diversas áreas. Na área alimentícia é utilizada na clarificação de cervejas e no amaciamento de carnes. Para uso oral, na área farmacêutica, a papaína é disponibilizada na forma de cápsulas e drágeas para uso como auxiliar da digestão (LIMA, 2001). Produtos que removem proteínas de lentes de contato também utilizam papaína, assim como alguns cosméticos para fins de esfoliação e depilação (TRAVERSA, MACHADO-SANTANELLI, VELASCO, 2007; HARA, N. et al 2014).

Silva e colaboradores (2010) avaliaram o potencial mutagênico e tóxico da papaína, verificando resultado negativo através de experimentos com cepas de E.coli e plasmídio DNA. Na odontologia faz-se uso de um produto em gel que apresenta a papaína como principal ativo, o Papacarie®. Patenteado por pesquisadores brasileiros e produzido pelo laboratório Fórmula e Ação, o produto, que deve ser mantido sob refrigeração, apresenta validade de 1 ano e é utilizado na remoção químico-mecânica da cárie de forma prática, indolor e seletiva. Age sobre as fibrilas colágenas desestruturando o tecido cariado. Miyagi e colaboradores (2006) realizaram testes de citotoxicidade e concluíram que o produto é biocompatível. Recentemente, o mesmo laboratório lançou outro produto contendo papaína, o Papacarie Duo®_{, que possui a mesma indicação do Papacarie}®_{, porém com validade de 2 anos}

e armazenamento à temperatura ambiente. Segundo descrito na patente, a maior validade da versão Duo se deve ao uso de veículo à base de polietilenoglicol na formulação, possibilitando um produto sem presença de água, o que mantém a estabilidade do produto por mais tempo (MIZIARA, BUSSADORI, 2014). A utilização de polietilenoglicol foi possível nesse caso, pois o produto é aplicado diretamente no dente. No caso de desbridamento de feridas esse veículo não seria adequado, pois seu uso é contraindicado em feridas abertas, queimaduras extensas e em pacientes com comprometimento renal (ROWE, 2012).

2.3 ESTABILIDADE DAS FORMULAÇÕES COM PAPAÍNA

Formas farmacêuticas contendo papaína foram avaliadas quanto a sua estabilidade em diversos trabalhos. Temperatura, luz, oxigênio e umidade são fatores que podem influenciar a atividade enzimática da papaína, que é mais estável em pH 5,0 a 7,0 (PINTO, 2011).

Soluções contendo papaína 2% p/v em água destilada obtiveram melhor estabilidade quando armazenadas em geladeira à 5°C comparadas às que foram mantidas em temperatura ambiente de 22°C. As amostras mantidas em temperatura ambiente após período inferior a 6 horas apresentaram 40% da atividade enzimática. Já as amostras mantidas em geladeira

permaneceram com 60% da atividade proteolítica inicial, mesmo após 52 horas do preparo (DE PAOLA et al, 1999 apud FERREIRA, 2005).

Outro experimento foi realizado com gel de papaína a 0,4% p/v. Diferentes polímeros (Carbopol 940® e Acrisint®) foram testados com armazenagem em três temperaturas: 5°C, 22°C e 37°C. Após 57 dias houve perda de atividade enzimática inferior a 50%, sendo que a amostra mantida a 5°C apresentou menor perda, embora não estatisticamente significativa. Os polímeros apresentaram características físico-químicas semelhantes (VELASCO, 1993 apud FERREIRA, 2005).

Capucho (2007) testou a estabilidade de produtos com papaína na concentração de 1% em três diferentes de géis: Pluronic® F127, Carbopol® 940 e Natrosol® 250HHR. As condições de armazenamento foram: 4°C; 30°C/70% UR e 40°C/70%UR. Testes preliminares da avaliação da atividade proteolítica indicaram baixa recuperação da atividade enzimática principalmente no gel de Natrosol®_{250HHR, portanto os testes de estabilidade seguiram apenas}

com os outros dois géis. O gel de Carbopol® _{940 apresentou melhores resultados de estabilidade}

à 4°C, sendo determinado estável por 6 meses nesta temperatura.

Estudos sobre os efeitos de cossolventes do tipo poliol sobre a papaína, sugerem que há aumento da estabilidade térmica da enzima na presença desses adjuvantes (SATHISH, KUMAR, PRAKASH, 2007). Miura (2012) desenvolveu formulações contendo papaína 2% e 4% (p/p) em gel de Carbopol® 940 avaliando a adição de adjuvantes técnicos: EDTA, cloridrato de cisteína e propilenoglicol. No tempo zero (48 horas), a adição de EDTA dissódico apresentou influência positiva na atividade proteolítica da enzima, o cloridrato de cisteína teve influência negativa, enquanto o propilenoglicol não interferiu na atividade. Observou-se que os resultados após 48 horas de preparo não se mantiveram nos estudos de estabilidade acelerada realizados em 60 dias, mesmo assim, há indicação de que o armazenamento em temperatura 5°C ± 2°C, reduz a perda de atividade enzimática dos produtos avaliados.

A partir dos resultados da Miura (2012), que observou nas formulações estudadas a formação de precipitados brancos, devido à baixa solubilidade da papaína em água, Nicoletti (2015), estudou a adição de um agente solubilizante, o polissorbato 80, em géis contendo papaína 4% (p/p). O emprego deste tensoativo e também da cisteína gerou preparações com aspecto homogêneo, com ausência de precipitados e termodinamicamente estáveis. Entretanto, após 30 dias de estudo, observou-se que a estratégia adotada não impediu a perda da atividade da papaína.

2.4 AGENTES GELIFICANTES

Os géis constituem um tipo de forma farmacêutica semissólida que é amplamente empregada como veículo para uso tópico, geralmente desenvolvidos para exercer ação local. Podem ser descritos como: dispersões coloidais formadas por pequenas partículas ou macromoléculas, que formam uma rede entrelaçada, interpenetradas por um líquido, a fase contínua. Esse entrelaçamento é responsável pelo aumento da viscosidade gerando o estado semissólido (AULTON, 2005; ALLEN, 2007)

Diversos critérios podem ser utilizados na classificação dos géis, conforme descrito no quadro 1. Também é possível classifica-los considerando-se a existência ou não de atração entre a fase dispersa e a fase dispersante. Quando a fase dispersa interage bastante com a dispersante, o coloide é considerado liofílico, geralmente constituídos de dispersão de macromoléculas orgânicas. Quando há pouca ou nenhuma atração entre as fases, considera-se coloide liofóbico, em geral composto de partículas inorgânicas. Dispersões coloidais anfifílicas possuem agrupamentos ou associação de moléculas que possuem propriedades tanto liofílicas quanto liofóbicas, formando dispersões tanto em meio aquoso quanto não-aquoso (ALLEN 2007).

Quadro 1: Classificação de géis (adaptado de FERREIRA, 2010)

Tipo de Gel Descrição Exemplos

N at urez a da F ase C ol oi da l _Inorgânico geralmente bifásico

Gel de hidróxido de alumínio, gel de bentonita, gel Veegum®

Orgânico geralmente monofásico

Gel de goma adraganta, gel de carbômeros

N úme ro d e F ase

s Monofásico uma fase Gel de alginato de sódio, gel de carbômeros, _{gel de goma adraganta} Bifásico duas fases Gel de hidróxido de alumínio, gel de bentonita

N

at

urez

a da

Fase Líqu

ida Hidrogel substâncias hidrofílicas

Gel de sílica, bentonita, pectina, alginato de sódio, carbômero, metilcelulose, Pluronic® F127 (polaxameros), CMC-Na

Oleogel (Organogel)

substâncias lipofílicas

Plastibase, gel de parafina líquida, petrolato, PEG, PLO (Pluronic Lecithin Organogel), manteiga de cacau

2.4.1 Hidrogéis

Os géis que podem conter água são chamados de hidrogéis. Esses possuem a propriedade de reter quantidades significativas de água, mas mantêm-se insolúveis na mesma, sendo frequentemente usados no delineamento de medicamentos tópicos (SINKO, 2008).

O uso de hidrogéis como veículo em um produto para desbridamento contendo papaína torna-se uma boa alternativa visto que: (LEITE, 2012; MIURA, 2012)

-são compatíveis com a pele;

-mantém o ambiente interno da ferida úmido, necessário para a ação proteolítica da enzima;

-são de fácil aplicação, semissólidos, o que facilita a permanência da formulação no local da ferida, sem extravasar para a pele íntegra;

-são hidrossolúveis possibilitando fácil remoção, sem deixar resíduos.

 Carbômeros

Carbômeros são polímeros sintéticos de ácido acrílico reticulados com alilsacarose ou alil pentaeritritrol, modificados com acrilatos de alquila de C10 a C30. Possuem alta proporção

de grupos carboxílicos e elevada massa molecular. Proporcionam soluções aquosas ácidas, que ao serem neutralizadas tornam-se muito viscosas, atingindo máxima viscosidade na faixa de pH 6 a 11. Ocorre grande perda de viscosidade em pH menor que 3, pH maior que 12 e quando drogas ionizáveis estão presentes, o que pode ser contornado através do aumento da concentração do polímero. Dispersões de carbômeros, à temperatura ambiente, mantêm a viscosidade durante longos períodos em armazenamento (ALLEN, 2007; SINKO, 2008; ROWE, 2012).

As moléculas de carbômero no estado seco, apresentam-se bastante compactadas, mas após dispersão em água ocorre hidratação, tornando-as menos compactadas, favorecendo a exposição dos grupos ácidos, conforme demostrado na figura 2. A adição de neutralizantes promove ionização das moléculas de carbômero. Cargas negativas são geradas promovendo repulsão eletrostática o que possibilita que a molécula fique estendida. A conversão dos terminais ácidos em sais resulta no completo “desenrolamento” da molécula, proporcionando a máxima viscosidade do gel. A adição de neutralizantes em excesso, resulta em aumento na concentração de cátions, redução da repulsão eletrostática e consequente diminuição da viscosidade. Para neutralização geralmente utiliza-se bases inorgânicas (hidróxido de sódio ou

de potássio), mas aminas como a trietanolamina e dietanolamina também podem ser utilizadas (GIBSON, 2009).

Para se obter uma rápida dispersão do carbômero aconselha-se que o mesmo seja acrescentado à água sob agitação e em forma de pequenas partículas de pó, prevenindo assim a aglomeração. Após intumescimento, o agente neutralizante é adicionado para obter a viscosidade desejada (ALLEN, 2007).

Usados para diversas finalidades, os carbômeros podem funcionar como material bioadesivo, emulsificante, estabilizante de emulsões, agentes para liberação modificada, agentes suspensores e agentes para aumento de viscosidade em diversas formas farmacêuticas. Nas formas líquidas e semissólidas, eles podem fazer parte de formulações para uso oftálmico, retal, tópico e vaginal, enquanto nas formas sólidas, como comprimidos, é usado como agente de liberação controlada. Em granulações úmidas, podem ser usados como agentes ligantes (ROWE, 2012).

Figura 2: Representação da exposição de grupos ácidos na molécula de carbômero. (A) Molécula de carbômero compactada; (B) Molécula de carbômero totalmente “desenrolada”, com estrutura estendida, convertida a sal através da neutralização (adaptado de GIBSON, 2009).

Não há evidências de hipersensibilidade no uso tópico de carbômeros, que são considerados não tóxicos e não irritantes. Durante a produção dos polímeros utiliza-se benzeno como solvente, entretanto atualmente já existem processos que utilizam acetato de etila ou acetato de etil-ciclohexano, gerando carbômeros com baixa toxicidade oral (ALLEN 2007; ROWE, 2012).

Como agente gelificante os carbômero são usados nas concentrações de 0,5 – 2,0% (ROWE, 2012; ALLEN, 2007). De todas as resinas carbômero o Carbopol®940 é o mais eficiente formando géis hidroalcoólicos ou aquosos, transparentes e brilhantes além de possuir propriedades reológicas adequadas (ALLEN, 2007).

O Formulário Nacional (2012), em sua proposta de formulação gel de papaína (2% - 10%) indica gel carbômero como veículo, entretanto estudos de uma formulação em gel contendo papaína deve considerar que a mesma interfere na viscosidade da preparação (FERREIRA, 2005; MIURA, 2012).

2.5 AGENTES ANTIOXIDANTES E OUTROS ADJUVANTES

Os antioxidantes têm a função de retardar ou inibir a oxidação de componentes de formulações farmacêuticas, evitando a degradação do produto. Certos antioxidantes reagem com radicais livres, bloqueando as reações em cadeia subsequentes, como é o caso dos tocoferóis, butil hidroxianisol (BHA) e butil hidroxitolueno (BHT). Outro grupo de antioxidantes agem principalmente como agentes redutores como ácido ascórbico, metabissulfito de sódio e bissulfito de sódio. Há ainda os sinergistas de antioxidantes que agem como sequestrantes de íons metálicos que catalisam reações de oxidação, como o ácido cítrico, ácido tartárico, EDTA e lecitina (FLORENCE, SIEPMANN, 2009).

2.5.1 Alfa-tocoferol

Também chamado de vitamina E, o alfa-tocoferol tem sido objeto de diversos estudos para investigação de suas características e propriedades. Além da elucidação de sua estrutura química, vários trabalhos investigam sua atividade biológica e sua ação antioxidante (ZINGG, 2007). O termo “vitamina E” é comumente utilizado para designar um grupo de moléculas lipossolúveis com estruturas semelhantes, conforme figura 3.

Alfa-tocoferol: R1_{= R}2_{= R}3_{= CH} 3 Beta-tocoferol: R1_{= R}3_{= CH} 3; R2= H Delta-tocoferol: R1_{= CH} 3; R2= R3= H Gama-tocoferol: R1_{= R}2_{= CH} 3; R3= H *Indica centros quirais

Figura 3: Fórmula estrutural dos tocoferóis (ROWE, 2012)

As formas beta, delta e gama são consideradas mais efetivas como antioxidante, quando comparadas ao alfa-tocoferol (ROWE, 2012), porém dentre essas moléculas, a forma

biologicamente ativa é o alfa-tocoferol, que por apresentar baixa estabilidade, encontra-se comercialmente sob a forma de acetato de alfa-tocoferol (YANG, 2013).

O alfa-tocoferol sintético encontra-se sob a forma de dl-alfa-tocoferol, enquanto na natureza é encontrado na forma d-alfa-tocoferol, em concentrações que variam de 0,1-0,3% em óleos de milho, girassol, soja e gérmen de trigo (ROWE, 2012)

Com características lipofílicas, o alfa-tocoferol tem sido utilizado como solvente para drogas pouco solúveis e surfactante não-iônico em formulações para uso oral e injetável (STRICKLEY, 2004).

Citado em diversas fontes como antioxidante, a concentração usual de alfa-tocoferol com essa finalidade varia de 0,01-2% (LACHMAN, 1968 apud THOMPSON, 2013; FERREIRA, 2010), sendo considerado um aditivo seguro para uso em produtos farmacêuticos e alimentares (ROWE, 2012)

Estudos em animais testaram géis hidrofílicos contendo alfa-tocoferol, tretinoína e ácido ascórbico sozinhos ou combinados. Os animais tratados com alfa-tocoferol apresentaram redução das lesões tratadas, indicando que o mesmo protegeu as células da epiderme dos radicais livres. Notou-se também a aceleração do processo de regeneração epidérmica, que foi mais evidente quando houve associação do alfa-tocoferol e ácido ascórbico (LUCERO, 1996). Considerando que a presença de radicais livres inibe o processo de cicatrização de feridas, Lin e colaboradores (2012) testaram o tratamento de feridas em ratos diabéticos pelo uso de antioxidante utilizando creme contendo tocoferol. Nos ratos testados, foi constatado o efeito positivo do tocoferol no processo de cicatrização.

2.5.2 Metabissulfito de sódio

Utilizado como antioxidante em alimentos e em diversas formas farmacêuticas o metabissulfito de sódio é empregado em formulações medicamentosas para uso oral, parenteral e tópico em concentrações que variam de 0,01-1,0% (p/v). Como possui atividade antimicrobiana em meio ácido, também é utilizado como conservante em preparações orais (ROWE, 2012).

Embora existam relatos de reações de hipersensibilidade incluindo broncoespasmos e anafilaxia, principalmente em asmáticos, o metabissulfito de sódio é considerado ingrediente inativo pelo FDA, tem seu uso liberado em produtos para saúde no Canadá e possui licença para uso em medicamentos não-parenterais e parenterais no Reino Unido (ROWE, 2012).

Espin e Islam (1998) realizaram experimentos comparando diversos antioxidantes separadamente e em associação para estabilização da atividade proteolítica da papaína presente em cascas de mamão. Os antioxidantes testados foram diluídos em água nas concentrações de 0,10-1,50% p/v baseado no peso das cascas frescas. Essa solução foi misturada as cascas, que foram posteriormente desidratadas. O uso do metabissulfito de sódio 1% proporcionou proteção da atividade enzimática de 85%, comparando-se a atividade antes do experimento e após a mistura e desidratação. Estudo posterior utilizou cascas de mamão para desenvolvimento de amaciante de carne de baixo custo, também demonstrou eficácia do uso do metabissulfito de sódio como estabilizador da atividade enzimática da papaína (ISLAM, MOLINAR-TORIBIO, 2013).

2.5.3 EDTA Dissódico

O EDTA dissódico (EDTA-Na2) é um agente quelante bastante utilizado em

preparações farmacêuticas, pois forma complexo com metais alcalinos terrosos e metais pesados. É utilizado em diversos produtos farmacêuticos seja para uso tópico, oral ou parenteral, geralmente em concentrações entre 0,005 – 0,1% (p/v), mas já foi usado a 0,3% em transfusões de sangue (ROWE, 2012).

A adição de EDTA-Na2 em formulações contendo papaína já foi discutida em diversos

trabalhos. Capucho (2007) utilizou em seus estudos EDTA-Na2 a 0,04% e cita diversas fontes

em que se utiliza como padrão a adição de EDTA, para evitar a inativação da enzima e cisteína, com a finalidade de ativar a papaína. Miura (2012) utilizou EDTA-Na2 0,08% e 0,16% para

papaína 2% e 4%, respectivamente, e verificou após 48 horas que houve influência positiva quanto à manutenção da atividade proteolítica, embora o mesmo não tenha sido observado em estudos de atividade acelerada.

Miura (2012) concluiu em seus trabalhos que a formulação com papaína 4%, contendo como adjuvantes EDTA-Na2 0,12% e cloridrato de cisteína 0,05%, apresentou os melhores

resultados quanto a atividade proteolítica.

2.5.4 L-cisteína

Mencionada em diversos trabalhos, a L-cisteína tem importante papel na ativação da papaína (PINTO, 2005 e 2007; CAPUCHO,2007; MIURA 2012; NICOLETTI 2015). Homaei (2010) e colaboradores realizaram estudos de imobilização da papaína em Sepharose® (polímero de polissacarídeo extraído de algas) na presença de cisteína e constataram que a

atividade da enzima depende da concentração do aminoácido. Foram testadas diferentes concentrações de cisteína, de 0 a 2000mM, durante o processo de imobilização da enzima, sendo a concentração de 200mM de aminoácido o melhor resultado. O trabalho sugere que a presença de cisteína induz mudanças conformacionais na papaína para sua forma mais ativa.

2.6 AGENTES SOLUBILIZANTES

Os estudos da papaína em gel demonstraram a baixa solubilidade desta enzima no meio. Foram experimentadas formulações contendo papaína de 0,4% (DE PAOLA et al, 1999 apud FERREIRA, 2005) a 4% (MIURA, 2012), sendo que nas concentrações de 2 e 4% observou-se a presença de precipitados brancos após 48 horas, principalmente nas amostras mantidas em temperatura de 5°C ± 2°C, ideal manutenção da atividade proteolítica das mesmas (CAPUCHO, 2007; MIURA, 2012; VELASCO, 1993).

Os tensoativos são comumente utilizados como agentes solubilizantes, pois apresentam natureza anfifílica, ou seja, possuem afinidade tanto por solventes polares quanto por apolares. O número e a natureza dos grupamentos (apolar ou polar) do tensoativo determinará se é hidrofílico, lipofílico ou se é moderadamente entre os dois (SINKO, 2008). A porção hidrofóbica da molécula do tensoativo normalmente é composta de cadeia de hidrocarbonetos saturados ou insaturados, ou ainda menos comum, sistemas de anéis heterocíclicos ou aromáticos, porém considera-se a natureza do grupo hidrofílico para classificação dos tensoativos. Regiões hidrofílicas podem ser aniônicas, catiônicas, anfóteras ou não-iônicas (FLORENCE, ATWOOD, 2011).

Uma escala numérica arbitrária classifica os tensoativos quanto ao equilíbrio hidrófilo-lipófilo (EHL). Altos valores de EHL estão relacionados aos agentes hidrofílicos e baixos valores aos agentes hidrofóbicos. Os ésteres de sorbitano (Spans®), são lipofílicos e possuem baixos valores de EHL entre 1,8 e 8,6, enquanto os polissorbatos (Tweens®), são hidrofílicos com valores de EHL entre 9,6 e 16,7 (SINKO, 2008).

Dependendo do sistema em que estão inseridas, as moléculas de tensoativos primeiramente ocupam as superfícies óleo-água, líquido-ar e líquido sólido e posteriormente passam a ocupar livremente a solução, quando estão em baixa concentração. Porém, com o aumento dessa concentração, ocorre agregação, ou seja, formação de micelas que podem conter 50 ou mais monômeros. A concentração de monômeros na qual são formadas micelas é chamada de concentração micelar crítica (CMC). Esse é o ponto em que tanto a interface quanto

a fase líquida tornam-se saturadas de monômeros, acima dessa concentração a formação de micelas gera diminuição da energia livre do sistema (SINKO, 2008). A figura 4 mostra que o ponto no qual há mínima tensão superficial corresponde a CMC.

Diversas técnicas experimentais podem ser utilizadas para detectar o início da formação de micelas. Propriedades físicas como a tensão superficial, condutividade, pressão osmótica, solubilidade e intensidade de espalhamento de luz podem ser registradas graficamente como uma função da concentração, podendo ser usadas para medir a CMC (AULTON, 2005; DALTIN, 2011).

Figura 4: Tensão superficial de solução de tensoativo x concentração, com formação de micelas (KRÜSS, 2014).

Tensiômetros podem ser usados para medir a tensão superficial em uma série de concentrações do tensoativo. Quando utilizamos tensoativos puros, a tensão superficial é linearmente dependente do logaritmo da concentração ao longo de um grande intervalo. Acima da CMC, a tensão superficial é amplamente independente da concentração. A CMC resulta da intersecção entre a reta de regressão da região linearmente dependente e a reta passando pelo platô (figura 5) (KRÜSS, 2014).

Em solução, as micelas estão em equilíbrio dinâmico com as moléculas livres (monômeros), ou seja, as micelas são continuamente desfeitas e refeitas. Esse fato difere as soluções micelares de outros tipos de soluções coloidais (AULTON, 2005; FLORENCE, ATWOOD, 2011).

Figura 5: Exemplo de gráfico gerado por testes em tensiômetro para determinação de CMC (KRÜSS, 2014)

2.6.1 Uso de tensoativos em produtos contendo proteínas

De acordo com revisão realizada por Lee e colaboradores (2011), formulações contendo proteína podem sofrer perda de atividade devido a acontecimentos como: adsorção, perda da estrutura tridimensional da molécula e agregação. Para evitar esses processos, a indústria tem lançado mão do uso de tensoativos para estabilização de proteínas em produtos farmacêuticos. Tensoativos não iônicos têm sido muito empregados em formulações contendo proteínas, especialmente porque apresentam baixa toxicidade e baixa sensibilidade a presença de eletrólitos.

Com o uso de tensoativos em medicamentos biológicos contendo proteínas, tornou-se importante a verificação da CMC dessas formulações, para assegurar a existência de quantidade suficiente de tensoativo para evitar a agregação de proteínas. Por outro lado, também deve-se evitar excesso de tensoativo, que pode ser um fator para reação imunológica ao produto. Vários tensoativos possuem valores de CMC descritos em literatura, mas a presença de proteínas provoca um aumento nesses valores, sendo necessário então a verificação da CMC para cada formulação (HORIUCH, WINTER, 2015).

Em revisão sobre interação entre proteínas e excipientes, Kamerzell e colaboradores (2011) relatam que as proteínas costumam sofrer adsorção e acumulam-se nas interfaces, resultando em perda de atividade, degradações químicas e agregação. Tensoativos não-iônico estabilizam proteínas pelo fato terem mais afinidade pela interface ar-água, ocupando o espaço na superfície hidrofóbica, prevenindo a desnaturação da proteína. Além disso, os tensoativos podem interagir diretamente com regiões hidrofóbicas das moléculas de proteína.

De acordo com Lee e colaboradores (2011), os tensoativos podem atuar modulando a adsorção e agregação de proteínas localizando-se preferencialmente nas interfaces, para impedir a adsorção da proteína e/ou associando-se às proteínas em solução, inibindo a agregação. A figura 6, ilustra esses mecanismos de estabilização da proteína pelo uso de tensoativos.

Figura 6: Mecanismo de estabilização de proteínas por tensoativos. (a) tensoativos localizados preferencialmente na interface, inibindo a adsorção; (b) tensoativos associando-se preferencialmente às proteínas, prevenindo a

agregação das mesmas (Adaptado: LEE et al., 2011).

O uso de polissorbato 20 e polissorbato 80 pode prevenir agregação de proteínas induzida por agitação, assim como protegê-las do estresse nos processos de congelamento, liofilização ou reconstituição (KERWIN, 2008; KAMERZELL et al., 2011; OHTAKE, KITA, ARAKAWA, 2011). Na liofilização, os tensoativos exercem efeitos de proteção contra agregação das proteínas em todas as fases do processo (mistura, congelamento, secagem e reidratação) (OHTAKE, KITA, ARAKAWA 2011).

2.6.2 Polissorbatos

Polissorbatos são tensoativos não iônicos, de natureza anfifílica, compostos de misturas complexas de ésteres parciais de ácidos graxos de sorbitol e seus mono e di-anidridos copolimerizados com aproximadamente 20, 5 ou 4 moles de oxido de etileno para cada mol de sorbitol e seus anidridos. Comercialmente conhecidos como Tween®, são miscíveis em água, usados como agentes emulsionantes (óleo-em-água) e possuem altos valores de EHL (FLORENCE, ATWOOD, 2011; ROWE,2012). A tabela 2 apresenta alguns polissorbatos e seus respectivos valores de EHL e a figura 7 ilustra a representação da estrutura química dos polissorbatos 20 e 80, comumente usados na indústria farmacêutica.

Tabela 2: Valores de EHL de polissorbatos

Nome químico Nome comercial EHL

Laurato de polioxietileno sorbitano Polissorbato (Tween) 20 16,7 Palmitato de polioxietileno sorbitano Polissorbato (Tween) 40 15,6 Estearato de polioxietileno sorbitano Polissorbato (Tween) 60 14,9 Triestearato de polioxietileno sorbitano Polissorbato (Tween) 65 10,5 Oleato de polioxietileno sorbitano Polissorbato (Tween) 80 15,0 Trioleato de polioxietileno sorbitano Polissorbato (Tween) 85 11,0

Adaptada de FLORENCE, ATWOOD, 2011

Figura 7: Estrutura química dos polissorbatos 20 e 80. Cada molécula não excede 20 unidades de oxietileno no total de w+x+y+z (Fonte: KERWIN, 2008).

Os polissorbatos são muito utilizados como agentes emulsificantes em preparações farmacêuticas, como agentes solubilizantes para várias substâncias como óleos e vitaminas lipossolúveis e como agentes molhantes em suspensões para uso oral e parenteral, conforme tabela 3. São também muito empregados em produtos cosméticos e alimentícios. Para o FDA, os polissorbatos 20, 40, 60 e 80 são considerados ingredientes inativos e no Reino Unido os polissorbatos em geral possuem licença para uso em medicamentos parenterais e não-parenterais (ROWE, 2012).

Tabela 3: Concentrações de uso dos polissorbatos

Uso Concentração (%)

Agente emulsionante

Uso sozinho em emulsões óleo-em-água 1-15

Uso em combinação com emulsionantes hidrofílicos em emulsões óleo-em-água

1-10 Uso para aumentar a propriedade de retenção de água em

Pomadas

1-10 Agente solubilizante

Uso em constituintes ativos pouco solúveis em bases lipofílicas 1-10 Agente molhante

Uso em constituintes ativos insolúveis em bases lipofílicas 0,1-3 Fonte: (ROWE, 2012)

Diferentes combinações de polissorbato 80 e L-cisteína foram utilizadas em estudos de formulações em gel contendo papaína 4,0% (p/p). Utilizou-se o polissorbato 80 na faixa de 0,400 a 1,000% (p/p) em associação a L-cisteína utilizada na faixa de 0,000 a 0,500% (p/p). Concluiu-se, através de estudo de gráficos de superfície, que os melhores valores de atividade da papaína foram obtidos nas formulações contendo os adjuvantes em suas maiores concentrações, ou seja, o polissorbato 1,00% (p/p) e a cisteína 0,05% (p/p) (NICOLETTI, 2015).

3. OBJETIVO

Avaliar o efeito dos antioxidantes acetato de alfa-tocoferol e metabissulfito de sódio em géis contendo papaína 10% para uso em desbridamento de feridas.

Objetivos específicos

Realizar o desenvolvimento farmacotécnico e caracterização de géis de papaína a 10% (p/p) contendo como antioxidantes: acetato de alfa-tocoferol ou metabissulfito de sódio.

Estudar a estabilidade de géis de papaína 10% (p/p) contendo antioxidante quanto às suas características sensoriais, pH, potencial Zeta e atividade proteolítica.

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 MATERIAIS

4.1.1 Matérias-primas

• Acetato de alfa tocoferol – Pharma Nostra • Ácido acético glacial P.A. – Proquimios • Água purificada de osmose reversa • Água ultra-pura Purelab Flex - Veolia

• Carbômero 940 - AQUPEC® _{HV-505 – Sumitomo Seika}

• Cloridrato de Carbobenzoxi-L-fenilalanil-L-arginina 4-metilcumarina-7-amid (N-CBZPHE-ARG-7-MCA), grau de pureza analítico – Sigma Aldrich • Cloridrato de Cisteína Monohidratada – Galena

• Dimetilsulfóxifo (DMSO) P.A. – Vetec

• Etilenodiaminotetracetato dissódico (EDTA-Na2) – Quimicos Essiod S.A.

• Fosfato de sódio dibásico anidro – Vetec • Hidróxido de sódio em micropérolas – Vetec • Metabissulfito de sódio - Basf

• Metilparabeno – Gemini

• Papaína 6.000 U/mg – Chemical Industries • Papaína Padrão 30.000 USP-U/mg – Merck

• Polioxietileno 20 sorbitano monooleato (Polissorbato 80) – Farmos • Propilenoglicol – Farmos

4.1.2 Equipamentos

• Agitador mecânico - IKA® _{RW20 digital}

• Balança analítica - Gehaka® _{AG 200}

• Balança semianalítica - Marte® _{BL 320H}

• Espectrofluorímetro de microplacas - FLUOstar OPTIMA • pHmetro - PHTEK - PHS-3B – PH Meter Model

• Placa Aquecedora - IKA® _{C-MAG HS 7}

• Refrigerador Continental Combinado Frost Free RFCT 450 • Tensiômetro EasyDyne - KRÜSS® Modelo K20