Efeitos do treinamento resistido sobre as alterações na reatividade vascular de ratos diabéticos induzidos por aloxano

Texto

(1)0. UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE. MARCELO MENDONÇA MOTA. EFEITOS DO TREINAMENTO RESISTIDO SOBRE AS ALTERAÇÕES NA REATIVIDADE VASCULAR DE RATOS DIABÉTICOS INDUZIDOS POR ALOXANO. ARACAJU 2010.

(2) 1. MARCELO MENDONÇA MOTA. EFEITOS DO TREINAMENTO RESISTIDO SOBRE AS ALTERAÇÕES NA REATIVIDADE VASCULAR DE RATOS DIABÉTICOS INDUZIDOS POR ALOXANO. Dissertação apresentada ao Núcleo de PósGraduação em Medicina da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Ciências da Saúde.. Orientador: Prof. Dr. Márcio Roberto V. Santos. ARACAJU 2010.

(3) 2. MARCELO MENDONÇA MOTA. EFEITOS DO TREINAMENTO RESISTIDO SOBRE AS ALTERAÇÕES NA REATIVIDADE VASCULAR DE RATOS DIABÉTICOS INDUZIDOS POR ALOXANO. Aprovada em ____/___/____. Dissertação apresentada ao Núcleo de PósGraduação em Medicina da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Ciências da Saúde.. ___________________________________________________________ Orientador: Prof. Dr. Márcio Roberto Viana Santos Universidade Federal de Sergipe – Orientador ___________________________________________________________ 1º Examinador: Profª. Drª. Luciana Venturini Rossoni Universidade de São Paulo – ICB/USP ___________________________________________________________ 2º Examinador: Prof. Dr. Daniel Badauê Passos Júnior Universidade Federal de Sergipe – DFS/UFS PARECER ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________.

(4) 3. FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DA SAÚDE UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE. M917e. Mota, Marcelo Mendonça Efeitos do treinamento resistido sobre as alterações na reatividade vascular de ratos diabéticos induzidos por aloxano/ Marcelo Mendonça Mota. – Aracaju, 2009. 63f.. Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) – Universidade Federal de Sergipe, Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa, Núcleo de PósGraduação em Medicina. Orientador (a): Prof. Dr. Márcio Roberto Viana Santos. 1. Diabetes mellitus 2. Treinamento resistido 3. Reatividade vascular 4. Ratos 5. Pesquisa experimental I. Título CDU 616.379-008.64.

(5) 4. AGRADECIMENTOS. À Deus, que nos concede saúde e proteção em todas as jornadas que enfrentamos; À minha mãe Zulnara, ao meu pai Roosevelt, pelo carinho e apoio que sempre tive, e por tudo o que fizeram e fazem por mim; À minha esposa Daniela, pela paciência, compreensão, apoio, carinho e amor. Uma pessoa maravilhosa que foi fundamental para a realização desta dissertação, estando sempre ao meu lado dando forças para vencer todas as barreiras; Aos meus filhos, Moana e Mauê, por serem a motivação da minha vida; Ao amigo Tharciano, que foi muito importante na realização desta dissertação, estando sempre disposto e pronto para ajudar; Aos amigos Anderson, Arthur, Tharcísio, Arari, Theo, Léo, Celso, Marcelo, Rodrigo, Tiago, Hélio, Renata, Laura. São muitos nomes que não caberiam nesta página; A todos os amigos e familiares que me apóiam e fazem parte da minha vida; Aos amigos que fazem ou fizeram parte do laboratório desde o início do mestrado, André, Flávia, Milene, Ana Paula Soares, por me ensinarem muitas coisas e pelo auxílio nos experimentos; Aos amigos do LAFAC, Aline, Joana, Aline, Ana Paula Barbosa, Fernando, Henry, Patrícia, Kátia, Gabriela, Luana, Pollyana, Ítalo, Ayslan, Paulo, pelo convívio e aprendizado;. Ao Prof. Dr. Márcio Roberto Viana Santos, meu orientador, a quem devo minha admiração, respeito e agradecimento. Muito mais que uma oportunidade, ele concedeu-me confiança, e com muita paciência ensinou-me a fazer ciência. Peço desculpas pelos erros que cometi e agradeço pelas correções que recebi, finalizo esta etapa com muita satisfação, pois você não foi apenas um orientador e sim um educador, que muito contribuiu para minha formação profissional e pessoal. Muito obrigado..

(6) 5. MOTA, M. M. Efeitos do treinamento resistido sobre as alterações na reatividade vascular de ratos diabéticos induzidos por aloxano. 2010. 78f. Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) – Universidade Federal de Sergipe, Aracaju.. RESUMO. O diabetes mellitus (DM) se apresenta como uma desordem metabólica caracterizada por hiperglicemia crônica que está associada à disfunção endotelial (DE). Dentre as diversas terapêuticas empregadas na melhora da DE, a prevenção primária, que inclui mudanças na dieta alimentar e treinamento físico (TF), tem sido a mais indicada. Este estudo avaliou os efeitos do treinamento resistido (TR) sobre a reatividade vascular de ratos diabéticos induzidos por aloxano. Ratos Wistar (250-300g) foram divididos em 3 grupos: controle sedentário (CS); diabético sedentário (DS) e diabético treinado com exercício resistido (DT). O TR foi realizado no aparelho de agachamento de TAMAKI em 3 séries de 10 repetições, 3 vezes por semana, durante 8 semanas. A intensidade foi definida em 40% da carga máxima estabelecida pelo Teste de uma repetição máxima. Ao final do protocolo de treinamento os animais foram sacrificados por dessangramento, e a artéria mesentérica superior foi removida e seccionada em anéis (1-2 mm), os quais foram montados em cubas contendo 10 mL de solução de Tyrode, a 37°C e gaseificada com carbogênio. As alterações na reatividade vascular para os agentes contracturantes fenilefrina (FEN) e cloreto de potássio (KCl) e relaxantes, acetilcolina (ACh), nitroprussiato de sódio (NPS) e pinacidil (PIN) foram avaliadas através da obtenção de curvas concentração-resposta. Não foram observadas diferenças entre a potência (pD2) e resposta máxima (Rmax) nas contrações induzidas pelos agentes contracturantes em todos os grupos. Por outro lado, foi observado uma redução (p <0,05) significativa da Rmax do relaxamento induzido pela ACh no DS (79,7 ± 1,4%, n = 6) quando comparado com o CS (98,8 ± 2,0%, n = 6 ), e um aumento do DT (93,1 ± 2,6%, n = 6), ambos sem alterar o pD2. Na presença do L-NAME, o relaxamento induzido pela ACh foi significativamente (p <0,05) reduzido em CS (de 7,0 ± 0,06 para 5,5 ± 0,1, n = 6) e DT (de 7,0 ± 0,08 para 4,9 ± 0,2 n; = 6), mas não no DS. Além disso, foi observado um aumento (p <0,001) significativo na pD2 do SNP em DS (7,9 ± 0,08 para 8,3 ± 0,03 comparado com CS) e PIN (de 6,2 ± 0,09 para 6,9 ± 0,08 comparado com CS). O TR foi capaz de evitar esse aumento apenas para PIN (de 6,9 ± 0,08 para 6,3 ± 0,1). Estes resultados demonstram que o TR foi capaz de melhorar o relaxamento induzido pela ACh e impedir as mudanças na sensibilidade dos canais de potássio sensíveis ao ATP (KATP), causada pelo DM. Assim, o TR apresenta um potencial terapêutico no tratamento de complicações vasculares produzidas pelo DM.. Palavras-Chave: Diabetes mellitus; treinamento resistido; reatividade vascular; ratos..

(7) 6. MOTA, M. M. Effects of resistance training on changes in vascular reactivity of diabetic rats induced by alloxan. 2010. 78p. Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) – Universidade Federal de Sergipe, Aracaju.. ABSTRACT Diabetes mellitus (DM) is presented as a metabolic disorder characterized by chronic hyperglycemia that is associated with endothelial dysfunction (ED). Among the various therapies employed in the improvement of ED, primary prevention, which includes changes in diet and physical training (PT), has been the right one. This study evaluated the effects of resistance training (RT) on vascular reactivity of diabetic rats induced by alloxan. Wistar rats (250-300g) were divided into 3 groups: sedentary control (SC), sedentary diabetic (SD) and diabetic trained with resistance exercise (TD). The TR was performed in a squat aparatus of TAMAKI in 3 sets of 10 repetitions, 3 times a week for 8 weeks. The intensity was set at 40% of the maximum established by the test of one repetition maximum. At the end of the training protocol the animals were sacrificed by exsanguination, and the superior mesenteric artery was removed and sectioned into rings (1-2 mm), which were put into chambers containing 10 mL of Tyrode solution at 37°C and gasified with carbogen. Changes in vascular reactivity to phenylephrine contracturantes agents (PHE) and potassium chloride (KCl) and relaxing, acetylcholine (ACh), sodium nitroprusside (NPS) and pinacidil (PIN) was assessed by obtaining concentration-response curves. It was not observed differences between the potency (pD2) and maximum response (Rmax) of the contractions induced by contract agents in all groups. On the other hand, It was observed a significant (p < 0.05) decrease of Rmax of the relaxation induced by ACh in the SD (79.7 ± 1.4%; n = 6) when compared with SC (98.8 ± 2.0%; n = 6), and an increase in the DT (93.1 ± 2.6%; n = 6), both without changing the pD2. In the presence of L-NAME, the relaxation induced by ACh was significantly (p < 0.05) reduced in SC (from 7.0 ± 0.06 to 5.5 ± 0.1; n = 6) and TD (from 7.0 ± 0.08 to 4.9 ± 0.2; n = 6), but not in SD. Furthermore, it was observed a significant (p < 0.001) increase in the pD2 of SNP in SD (from 7.9 ± 0.08 to 8.3 ± 0.03 compared with SC) and PIN (from 6.2 ± 0.09 to 6.9 ± 0.08 compared with SC). The RT was able to prevent this increase only for PIN (from 6.9 ± 0.08 to 6.3 ± 0.1). These results demonstrate the RT was able to improve the relaxation induced by ACh and to prevent the changes in the sensitivity of the ATP-sensitive potassium channels (KATP) caused by DM. Thus, the RT presents an therapeutic potential in the treatment of vascular complications produced by the DM.. Keywords: Diabetes mellitus, resistance training, vascular reactivity, rat..

(8) 7. LISTA DE FIGURAS. Figura 1: Curvas concentração-resposta para fenilefrina (FEN: 10-9 – 10-4 M) em anéis isolados de artéria mesentérica superior sem endotélio funcional (A). As barras indicam as médias ± E.P.M. das Rmax (g) das contrações induzidas por Phe (B)...................................46 Figura 2: Curvas concentração-resposta para cloreto de potássio (KCl: 10 – 80 mM ) em anéis isolados de artéria mesentérica superior sem endotélio funcional (A). As barras indicam as médias ± E.P.M. das Rmax (g) das contrações induzidas por KCl (B)..................................47 Figura 3: Curvas concentração-resposta para acetilcolina (ACh: 10-9 – 10-5 M) em artéria mesentérica superior com endotélio intacto e pré-contraídas com FEN (10 µM)....................48 Figura 4: Curvas concentração-resposta para nitroprussiato de sódio (NPS: 10-11 – 10-5 M) em anéis isolados de artéria mesentérica superior com endotélio intacto, pré-tratadas com LNAME e pré-contraídas com FEN (10 µM).............................................................................49 Figura 5: Curvas concentração-resposta para pinacidil (PIN: 10-8 – 10-4 M) em anéis isolados de artéria mesentérica superior com endotélio intacto e pré-contraídas com FEN (10 µM).....................................................................................................................................50.

(9) 8. LISTA DE TABELAS. Tabela 1: Variação de força máxima e glicemia de ratos antes e ao final de 8 semanas de treinamento: grupo controle sedentário (CS), grupo diabético sedentário (DS) e grupo diabético treinamento resistido (DT)........................................................................................44. Tabela 2: Valores de pD2 e Rmax obtidos de curvas concentração-resposta para acetilcolina (ACh: 10-9 – 10-5 M) em anéis isolados de artéria mesentérica superior de ratos com endotélio intacto pré-contraídas com fenilefrina (10 µM) antes e após o pré-tratamento com LNAME.......................................................................................................................................45.

(10) 9. LISTA DE QUADROS. Quadro 1: Representação esquemática dos procedimentos experimentais utilizados no estudo........................................................................................................................................44.

(11) 10. LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS. AC - Adenilil ciclase ACh - Acetilcolina ALX - Aloxano AMPc - Adenosina monofosfato cíclico ATP - Adenosina trifosfato Ca+2 - Cálcio CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico COX - Ciclooxigenase CS - Grupo controle sedentário DE - Disfunção endotelial DM - Diabetes mellitus DS - Grupo diabético sedentário DT - Grupo diabético treinado ECA - Enzima conversora da angiotensina EC50 - Concentração eficiente para gerar efeito igual a 50% da resposta máxima eNOS - Sintase do óxido nítrico endotelial EROs - Espécies reativas de oxigênio FEN - Fenilefrina FHDE - Fatores hiperpolarizantes derivados do endotélio GMPc - Guanosina monofosfato cíclico L-NAME - N-nitro-L-arginine methyl ester NO - Óxido nítrico NPS - Nitroprussiato de sódio O2•– - Ânion superóxido ONOO·– - Peroxinitrito PGI2 - Prostaciclina PIN - Pinacidil PKG - Proteína quinase dependente de GMPc Rmax - Resposta máxima SIAB - Sistema de Informação de Atenção Básica SOD - Superóxido dismutase.

(12) 11. STZ - estreptozotocina TA - Treinamento aeróbio TF - Treinamento físico TR - Treinamento resistido.

(13) 12. SUMÁRIO. 1 INTRODUÇÃO................................................................................................................. 13. 2 REVISÃO DA LITERATURA........................................................................................ 15. 2.1 Diabetes Mellitus............................................................................................................. 15 2.2 Diabetes Experimental..................................................................................................... 16 2.3 Fisiologia do Endotélio.................................................................................................... 17 2.4 Disfunção Endotelial no Diabetes Mellitus..................................................................... 20 2.5 Treinamento Físico e Disfunção Endotelial..................................................................... 21. 3 OBJETIVOS.…................................................................................................................. 24. 3.1 Objetivo geral................................................................................................................... 24. 3.2 Objetivos específicos....................................................................................................... 24 4 RESULTADOS.................................................................................................................. 25. 4.1 Resistance training improves acetylcholine-induced vasorelaxations in diabetic rats.... 25 5 CONCLUSÃO................................................................................................................... 51 6 PERSPECTIVAS.............................................................................................................. 52 REFERÊNCIAIS................................................................................................................. 53 ANEXO A - Aprovação do Comitê de Ética......................................................................... 62. ANEXO B - Normas de Publicação da Vascular Pharmacology.......................................... 63 ANEXO C - Comprovante de Submissão do Artigo............................................................. 77.

(14) 13. 1 INTRODUÇÃO. O diabetes mellitus (DM) é caracterizado como um grupo heterogêneo de desordens metabólicas que apresentam em comum a hiperglicemia e a resistência à insulina, associada a complicações secundárias no sistema cardiovascular. (DE ANGELIS et al., 2000; DE VRIESE et al., 2000; SHI Y. et al., 2007). Essa hiperglicemia é o resultado de distúrbios na ação da insulina, na secreção de insulina ou em ambos (FEIN et al., 1980; SBD, 2006). Atualmente no Brasil, o DM se apresenta como uma doença fortemente associada à mortalidade, gerando um elevado custo médico-social, constituindo a principal causa dos internamentos por problemas cardiovasculares, sendo também a principal causa de amputação de membros e cegueira adquirida (SBD, 2003). De acordo com o Sistema de Informação de Atenção Básica - SIAB, o Estado de Sergipe possui 34.725 diabéticos cadastrados numa perspectiva total de 60.000 doentes. No ano de 2008 foram contabilizados 1.235 casos de hospitalização devido às complicações do DM, enquanto que até julho de 2009 já foram realizadas 735 hospitalizações (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2009). Movidos pela busca de soluções para essa problemática social, diversos estudos têm sido continuamente desenvolvidos no sentido de esclarecer as causas, os efeitos e o tratamento desta doença (MACHADO et al., 2000). O desenvolvimento de modelos experimentais em animais de laboratório tem dado contribuições significativas para o desenvolvimento de estudos que definem com acurácia e precisão esta patologia, o que tem possibilitado o estudo de métodos preventivos, paliativos e curativos (BARRETO et al., 2005; SCHAAN et al., 2004; TOSCANO, 2004). Os modelos experimentais mais conhecidos e utilizados para o estudo do DM em animais é o induzido por estreptozotocina (STZ) e aloxano (ALX). Estas drogas proporcionam alterações morfológicas e funcionais das células β (secretoras de insulina), subsequentemente, causa à perda do controle sobre o metabolismo da glicose (FISCHER, 1985; ISLAS-ANDRADE et al., 2000; VERSPOHL, 2002). A hiperglicemia é acompanhada por sintomas como poliúria, polidipsia, perda de peso, polifagia e visão turva, ou por complicações agudas que levam risco a vida como a cetoacidose diabética e a síndrome hiperosmolar hiperglicêmica não cetótica. A hiperglicemia crônica está associada a dano, disfunção e falência de vários órgãos, especialmente olhos, rins, nervos, coração e vasos sanguíneos (GROSS et al., 2002; SBD, 2006)..

(15) 14. Estudos demonstram que elevadas concentrações plasmáticas de glicose estão associadas à disfunção endotelial (DE) in vivo e in vitro (TESFAMARIAM et al., 1991; TING et al., 1996). A DE é um fenômeno sistêmico e refere-se ao desequilíbrio da produção endotelial de mediadores que regulam o tônus vascular, agregação plaquetária, coagulação e a fibrinólise (DE VRIESE et al., 2000). Este tipo de disfunção está associada a diversos fatores de risco para desenvolvimento e progressão da aterosclerose, como hipertensão arterial, DM, resistência à insulina, tabagismo e envelhecimento, entre outros (BUSSE; FLEMING, 2006). Vários estudos corroboram com a idéia de que o TF proporciona melhoras na DE decorrentes do DM (CHAKRAPHAN et al., 2005) por promover ajustes metabólicos, neuroendócrinos e cardiovasculares (COSTA et al., 2004; DE ANGELIS et al., 2000; HAMBRECHT et al., 2004; HARTHMANN et al., 2007; IRYGOYEN et al., 2005; LOIMAALA et al., 2003). Entretanto, os protocolos de TF utilizados nestes estudos foram baseados em modelos de treinamentos aeróbicos. Recentemente alguns estudos também têm demonstrado o valor potencial e a relativa segurança do treinamento resistido (TR) no portador de DM (CIOLAC; GUIMARÃES, 2004; SANCHEZ; LEON, 2006). Além disso, evidências sugerem que o TR pode ser utilizado como uma terapia coadjuvante na administração do DM e talvez no auxílio da prevenção do DM em indivíduos suscetíveis (POLLOCK et al, 2000; FLETCHER et al, 2001). Diante desta perspectiva, espera-se que tal estudo promova uma melhora adicional no tratamento do DM, oferecendo subsídios para o desenvolvimento de pesquisas no campo das Ciências da Saúde, bem como possibilidade de avanço na compreensão e controle desta problemática..

(16) 15. 2 REVISÃO DA LITERATURA. 2.1 Diabetes Mellitus. Diabetes mellitus (DM) é um grupo de disfunções metabólicas resultantes de defeitos na secreção da insulina, na ação da insulina ou de ambas. Estima-se que o número de pessoas com DM aumente de 150 milhões em 2000 para 220 milhões em 2010 e 300 milhões em 2025 (ZIMMET; ALBERTI; SHAW, 2001). Além disso, a estimativa da prevalência mundial de DM para todos os grupos etários em 2000 é de 2,8%, e em 2030 será de 4,4% (WILD et al., 2004). Ainda que a prevalência de obesidade permaneça estável até 2030, o que parece improvável, o número de pessoas com DM mais que duplicará em conseqüência do envelhecimento e urbanização da população. Contudo, estas estimativas provavelmente estão subestimando os valores reais, visto que dados da Federação Internacional de Diabetes indicam. que. aproximadamente. 246. milhões. de. pessoas. no. mundo. têm. DM. (INTERNATIONAL DIABETES FEDERATION, 2007). No Brasil, um censo realizado entre os anos de 1986 e 1989 pelo Ministério da Saúde e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), com o apoio da Sociedade Brasileira de Diabetes, demonstrou uma prevalência de diabetes de 7,6% na população entre 30 e 69 anos (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007). Os processos patogênicos envolvidos no desenvolvimento do DM variam da destruição auto-imune das células β (beta) pancreáticas, com conseqüente deficiência da secreção de insulina, a anormalidades que resultam na resistência à ação da insulina. O DM apresenta muitas classificações, sendo as principais: diabetes mellitus tipo 1 (anteriormente denominado insulino-dependente ou juvenil) e tipo 2 (anteriormente denominado insulinoindependente ou senil) (AMERICAN DIABETES ASSOCIATION, 2005). O DM tipo I é uma doença auto-imune multifatorial, cuja susceptibilidade é determinada por uma combinação de fatores genéticos e ambientais (ROSSINI, 2004). Essa doença é caracterizada por uma hiperglicemia crônica e pelo desenvolvimento de patologias vasculares específicas (BROWNLEE, 2001). Neste tipo de DM, há destruição, mediada pelas células T, das células secretoras de insulina das ilhotas pancreáticas. Esse processo destrutivo leva a severa depleção de insulina, sendo necessária à administração exógena deste hormônio (KELLY et al., 2003)..

(17) 16. O DM tipo II ocorre mais lenta e tardiamente do que o Tipo I, e se caracteriza pela resistência à insulina que por sua vez leva a um quadro hiperglicêmico característico (HAYASHIA et al., 2006). O DM tipo II representa cerca de 90% de todos os diabéticos e pode ser desencadeado por vários fatores tais como a obesidade, dieta hipercalórica e falta de exercício físico (IVY et al., 1999). O DM não-controlado tem como conseqüências agudas a hiperglicemia com cetoacidose ou a síndrome hiperosmolar não-cetótica. Os sintomas característicos de hiperglicemia são poliúria, polidipsia, perda de peso corporal, muitas vezes com hiperfagia e visão confusa (AMERICAN DIABETES ASSOCIATION, 2005). A hiperglicemia crônica é tóxica e causa sérios danos micro e macrovasculares (LEE et al., 2005; STETTLER, 2006). Como conseqüência, a patologia microvascular no DM é uma das principais causas de cegueira, doença renal em estágio final e uma variedade de neuropatias debilitantes. O DM também está associado à doença macrovascular aterosclerótica, afetando artérias que suprem coração, cérebro e extremidades inferiores. Pacientes diabéticos correm risco maior de sofrer infarto do miocárdio, derrame e amputação de membros (BROWNLEE, 2001). Diante desta perspectiva, torna-se imprescindível a melhor compreensão dos mecanismos fisiopatológicos do DM e de suas complicações, além da busca por um tratamento capaz de contrapor as alterações endócrino-metabólicas causadas por esta doença (ISLAS-ANDRADE et al., 2000). Uma alternativa para investigações mais profundas é a utilização de modelos experimentais, que foram criados com o objetivo de contornar obstáculos de ordem ética e de operacionalização encontrados em pesquisas com seres humanos (VERSPOHL, 2002).. 2.2 Diabetes Experimental. Modelos com animais experimentais são freqüentemente utilizados em pesquisa sobre o DM (RAKIETEN et al., 1963). Embora vários modelos de promoção do DM estejam disponíveis, o mais freqüentemente utilizado é a administração dos tóxicos aloxano (ALX) e estreptozotocina (STZ) (SZKUDELSKI, 2001). A STZ foi inicialmente isolada e caracterizada como um antimicrobiano de largo espectro a partir de colônias de Streptomyces achromogenese (PORTHA et al., 1989). Estudos pré-clínicos da STZ revelaram que a sua administração endovenosa em altas doses produzia DM em ratos e cães (RERUP, 1970). RAKIETEN et al. (1963), estabeleceram que a administração endovenosa de 50 mg/Kg de STZ promovia DM de longa duração, e que as.

(18) 17. ilhotas de Langerhans dos animais diabéticos encontravam-se rompidas e com diminuição importante ou ausência de grânulos de células beta. A STZ inibe a secreção de insulina e causa um estado de DM insulino-dependente. Ambos os efeitos podem ser atribuídos às suas propriedades químicas específicas, designadamente a sua potência de alquilação (MENDES; RAMOS, 1994). Em 1838, Wöhler e Liebig sintetizaram um derivado da pirimidina, que mais tarde foi chamado de aloxano (HEIKKILA et al., 1976). Em 1943, começou o interesse na investigação do DM quando Dunn e McLetchie informaram que poderiam induzir o DM em animais, como resultado da necrose específica das células β pancreáticas (LENZEN, 2008). O ALX tem dois efeitos patológicos distintos: ele inibe seletivamente a secreção de insulina induzida pela glicose através da inibição específica de glicoquinase, e provoca um estado de DM insulino-dependente através da sua capacidade de induzir a formação de espécies reativas de oxigênio (EROs), resultando na necrose seletiva das células β (MROZIKIEWIC et al., 1994). Lenzen e Panten (1988) demonstraram em seus estudos que no modelo experimental de DM aloxânico, os animais apresentam sintomas semelhantes aos encontrados no DM em humanos, tais como perda de peso corporal, polidipsia, poliúria, glicosúria, cetonúria, hiperglicemia e cetonemia.. 2.3 Fisiologia do Endotélio. O endotélio não é apenas uma barreira entre o lúmen vascular e os constituintes das paredes dos vasos, mas um tecido endócrino, parácrino e autócrino ativo metabolicamente e capaz de liberar várias substâncias reguladoras do tônus vascular local e crescimento vascular, assim como de modular a coagulação e inflamação (BRITTEN et al., 1999). Atualmente, sabe-se que o endotélio é responsável pela síntese de diversas substâncias com propriedades vasoativas, sendo que o NO é o mais bem estudado e caracterizado. As prostaglandinas e o Fator Hiperpolarizante Derivado do Endotélio (FHDE), por exemplo, produzem relaxamento vascular, enquanto que a endotelina e a angiotensina II são potentes vasoconstritores. Além do efeito modulador sobre o tônus vascular, estas substâncias também controlam a interação entre o endotélio e as células circulantes, assim como a trombose e a fibrinólise vascular (MACHADO; GIRALDEZ, 2003)..

(19) 18. A função do endotélio é de modular a contração do músculo liso vascular, a agregação plaquetária, o crescimento da musculatura lisa vascular, a trombose, a adesão de célula branca e as anormalidades precoces na formação da placa de aterosclerose (GLASSER, 1996). Considerando-se os principais agentes vasoativos, o óxido nítrico (NO) é sintetizado a partir da oxidação do radical guanidino da L-arginina pela ação da sintase do óxido nítrico endotelial (eNOS), gerando L-citrulina e NO. A eNOS é uma enzima constitutiva ativada por um aumento na concentração intracelular de íons cálcio (Ca2+), induzido por agonistas como a acetilcolina, catecolaminas, ATP, substância P, Angiotensina II, ou por estímulos físicos, como a força de cisalhamento (shear stress) (MILLER; VANHOUTTE, 1988; PALMER et al., 1988). O relaxamento da musculatura lisa vascular pelo NO envolve a ativação da enzima guanilil ciclase solúvel com o conseqüente aumento na produção de guanosina monofosfato cíclico (GMPc) (FLEMING; BUSSE, 1999). Este, por sua vez, estimula a quinase dependente de GMP cíclico (PKG) que por diversos mecanismos promove um relaxamento da musculatura lisa vascular. A PKG pode ativar canais de potássio (K+) induzindo hiperpolarização ou estimulando a saída de Ca2+ do citoplasma da célula, o que leva à vasodilatação (RAPOPORT; MURAD, 1983). A PKG pode, igualmente, diminuir a sensibilidade da maquinaria contrátil ao Ca2+, diminuindo a contração muscular (RAPOPORT; MURAD, 1983). A ativação de canais para K+ diretamente pelo NO sem envolver a participação do GMP cíclico também já foi descrita (BOLOTINA et al., 1994). A via da prostaciclina (PGI2), sintetizada pela ciclooxigenase (COX), ativa a adenilil ciclase (AC) e aumenta a concentração de adenosina monofosfato cíclico (AMPc), o que leva à redução da concentração de Ca2+ intracelular nas células dos músculos lisos vasculares (STANKEVICIUS et al., 2003). Além do NO e da prostaciclina, o endotélio vascular produz um terceiro fator relaxante que produz hiperpolarização no músculo liso vascular (LINCOLN et al., 1994). Esse tipo de relaxamento dependente do endotélio é observado sem nenhum aumento nos níveis intracelulares de nucleotídeos cíclicos (GMPc e AMPc) nas células musculares lisas (GARCIA-PASCUAL et al., 1995; MOMBOULI; VANHOUTTE, 1997). A contribuição dos fatores hiperpolarizantes derivados do endotélio (FHDE) para a vasodilatação dependente do endotélio é maior nos vasos sanguíneos de resistência do que nas grandes artérias (URAKAMI-HARASAWA et al., 1997). Apesar do importante papel fisiológico que desempenha no controle do tônus vascular, a identidade química do FHDE até hoje é desconhecida e a possibilidade da existência de vários FHDEs já foi levantada (FELETOU; VANHOUTTE, 2009)..

(20) 19. Os componentes mais prováveis do FHDE são: metabólitos do ácido araquidônico, derivados do citocromo P450, peróxido de hidrogênio, íons potássio, Na+/K+-ATPase ou comunicações via gap junctions entre células endoteliais e musculares lisas (CAMPBELL, 1996). Observou-se que, mesmo com a inibição da PGI2 e do NO, permanece um grau variável de vasodilatação dependente do endotélio, em resposta a agonistas como a acetilcolina (MUGGE et al., 1991). Esta vasodilatação é acompanhada de hiperpolarização da membrana das células endoteliais e musculares lisas, envolvendo efluxo de K+ (FELETOU; VANHOUTTE, 2006). O FHDE é, portanto, responsável pelo relaxamento vascular em vasos tratados com inibidores da COX e da eNOS (MACHADO; GIRALDEZ, 2003). Além de fatores de relaxamento, o endotélio é capaz de sintetizar substâncias vasoconstritoras que, em analogia às denominações atribuídas aos fatores de relaxamento, são chamados de fatores de contração derivados do endotélio (FCDE) (THORIN; WEBB, 2010). Os principais fatores envolvidos nas contrações do músculo liso vascular são a endotelina-1 (ET-1) e a angiotensina II (ANG II), e em menor proporção, a tromboxane A2 e a prostaglandina H2 (PGH2) (VANHOUTTE, TANG, 2008). A ET-1 é liberada tonicamente, com manutenção da resistência vascular sistêmica em humanos (HAYNES; WEBB, 1994). Nesse sentido, a ET-1 age como o antagonista fisiológico do NO, que também é liberado de maneira tônica (VALLANCE et al., 1989). Entretanto, esses mediadores diferem quanto à taxa de produção liberação e à duração da ação. Enquanto a síntese de NO pode aumentar em minutos em resposta a vários estímulos, a síntese de ET-1 é regulada em nível transcricional, com retardo na sua liberação pela célula endotelial (YANAGISAWA et al., 1988). Outra diferença está no tempo de ação. Enquanto o NO tem meia-vida curta e seus efeitos acabam rapidamente após acessar a sua liberação, alguns dados sugerem que a ET-1 se liga, de maneira quase irreversível aos seus receptores no músculo liso, com consequente longa duração de suas ações vasoconstritoras e pressoras (BOULANGER; LÜSCHER, 1990). A Ang II é o peptídeo responsável pelas principais ações do sistema reninaangiotensina, modulando a pressão arterial, a homeostase de sal e água, e o sistema nervoso autônomo, entre outros (PEACH, 1977). Os efeitos da ANG II são mediado, fundamentalmente pelos receptores AT1 e AT2 da membrana plasmática (TIMMERMANS, 1993). A estimulação do receptor AT2 promove vasodilatação e inibição do crescimento do músculo liso vascular. Durante o período embrionário o receptor AT2 é expresso em artérias em desenvolvimento enquanto em tecidos adultos sua expressão está, predominantemente, no cérebro e adrenais (CAREY, 2000). Entretanto, a maioria das ações da ANG II está.

(21) 20. relacionada à ativação dos receptores AT1. O receptor AT1 é expresso em células musculares lisas, miocárdio, pulmões, cérebro, rins, fígado e glândulas adrenais (TIMMERMANS, 1993). A sinalização intracelular ligada a sua ativação adenilciclase, as fosfolipase A2, C e D, canais de cálcio dependentes de voltagem, e diversas cinases envolvidas nas cascatas de fosforilação (GRIENDLING, 1993). Dessa forma, dependendo da célula, a estimulação do receptor AT1 promove contração celular, hipertrofia, proliferação e/ou apoptose (TIMMERMANS, 1993; GRIENDLING, 1993).. 2.4 Disfunção Endotelial no Diabetes Mellitus. A DE está amplamente relacionada a fatores de risco predisponentes a aterosclerose, como: hipercolesterolemia, obesidade, hipertensão, tabagismo e DM (BRITTEN et al., 1999; NACCI et al., 2009). O índice de vasodilatação dependente do endotélio tem sido consistentemente utilizado em estudos como um dos indicadores da função endotelial (PRASAD et al. 2002; LANDMESSER et al., 2004). Várias condições clínicas ou doenças podem acarretar DE, gerando vasoconstrição, acúmulo de lípides, aumento da adesão leucocitária, proliferação de células do músculo liso vascular, agregação plaquetária, trombose, entre outros (CARVALHO et al., 1997). A DE representa um dos principais mecanismos desencadeadores das doenças do aparelho circulatório (ANDRADE et al., 2005). Estudos demonstraram a presença de DE em modelos experimentais e em estudos clínicos, tanto em DM1 como em DM2 (HADI; SUWAIDI, 2007; JÄRVISALO et al., 2004; OYAMA et al., 1986). A função endotelial no DM é modulada pelo grau de hiperglicemia, pela duração do DM, pelas concentrações séricas de insulina e pela presença de complicações crônicas, especialmente neuropatia autonômica e microalbuminúria. (ARONSON, 2008; BERTOLUCI et al., 2008; SINGH et al., 2003). A DE é freqüentemente referida pela falta da dilatação dependente de endotélio, causada pela perda da biodisponibilidade de NO, como também, pelo aumento da produção dos. fatores. contráteis. derivados. do. endotélio. (BERTOLUCI et. al.,. 2008).. O. comprometimento da função endotelial mediada pelo NO ocorre precocemente nos portadores de DM, antes da formação da placa de ateroma (BECKMAN et al., 2002). Diversos mecanismos contribuem para a diminuição da biodisponibilidade de NO nos diabéticos (WILLIAMS et al., 1996). A hiperglicemia inibe a expressão protéica da eNOS, enzima.

(22) 21. catalisadora da síntese de NO, também induz estresse oxidativo em células endoteliais e células musculares lisas, o que inativa o NO e promove síntese de peroxinitrito (ONOO·–), um oxidante sem efeito vasodilatador (CAI; HARRISON, 2000; ESPER et al., 2008; ZOU et al., 1999). Paralelamente à deficiência de NO foi constatado um aumento da síntese de vasoconstritores, particularmente a endotelina-1 que na musculatura lisa vascular induz vasoconstrição (HOPFNER; GOPALAKRISHNAN, 1999). Outros vasoconstritores, como derivados prostanóides e angiotensina II, encontram-se elevados na presença do DM (CARVALHO et al., 1997). Observa-se também aumento da síntese de metaloproteínas e fator tecidual nas células endoteliais de diabéticos favorecendo a aterogênese. Assim, um dos objetivos do tratamento do DM é a restauração da função endotelial (BECKMAN et al., 2002; DEANFIELD et al., 2007; PRASAD et al., 2002).. 2.5 Treinamento Físico e Disfunção Endotelial no Diabetes Mellitus. Nos últimos anos houve um aumento do interesse científico em relação à prescrição do TF como medida terapêutica para diversas doenças, dentre as mais investigadas estão às patologias que acometem o sistema cardiovascular. (KASAPIS; THOMPSON, 2005; PEDERSEN; SALTIN, 2006). Até a década de 90 não eram conhecidos os fatores envolvidos nos efeitos benéficos do TF sobre o endotélio. Após a descoberta da molécula de NO, diversos trabalhos foram realizados avaliando os efeitos do TF sobre as células endoteliais (DELP et al., 1993; SESSA et al., 1994). Foi observado também que o aumento do fluxo sanguíneo na parede das células endoteliais é o estímulo fisiológico ideal para a produção dos fatores relaxantes do endotélio. (HIGASHI et al., 1999; ROBERTS et al., 1999). Pesquisas têm demonstrado evidências científicas de que a presença de DE esteja relacionada a um elevado risco de eventos cardiovasculares, conduzindo à hipótese de que a reversão da DE possa modificar este quadro (KOHL, 2001; SCRUTINIO et al., 2005; WANNAMETHESE; SHAPER, 2001). Diante disso, os estudos que buscam investigar a melhoria da função do endotelial assumem um importante papel (KOHL, 2001; SUNDQUIST et al., 2005; TANASESW et al., 2002; WAGNER et al., 2002)..

(23) 22. Dentre as diversas terapêuticas empregadas na melhora da DE, a prevenção primária, que inclui mudanças na dieta alimentar e treinamento físico (TF), tem sido a mais indicada (NICKLAS et al., 2005). Diante disso, os estudos que buscam investigar a melhora da DE assumem um importante papel (SUNDQUIST et al., 2005). Essas mudanças, em conjunto ou separado, da aplicação de medidas farmacológicas como uso de inibidores da enzima conversora da angiotensina (ECA) e estatinas (HAMBRECHT et al., 2004). Existem evidências de que o TF além de reduzir os marcadores inflamatórios, proporciona melhorias na função endotelial (HAMBRECHT et al., 2000). Este fato pode ser comprovado através de estudos experimentais realizados em animais, e a partir de observações clínicas feitas em humanos (HAMBRECHT et al., 2004). O treinamento aeróbio (TA) promove efeitos benéficos à saúde, dentre eles a melhora da função endotelial, a qual está associada a uma maior biodisponibilidade de NO (MYERS, 2003). Esta melhora ocorre possivelmente devido a um aumento na expressão protéica da eNOS, aliado a um aumento na expressão protéica da superóxido dismutase (SOD), com o intuito de minimizar as reações do ânion superóxido (O2·–) com o NO (HIGASHI et al., 1999). O aumento da defesa antioxidante vascular tem sido um fenômeno freqüentemente relatado em espécies animais submetidas ao TA (RUSH et al., 2003). Chakraphan et al. (2005) demonstraram em ratos diabéticos, que 24 semanas de TA de baixa intensidade, executado cinco vezes na semana, por um período de 30 minutos por dia, reduziu significativamente os níveis de glicemia, pressão arterial, hipertrofia do ventrículo esquerdo, adesão leucocitária nas células endoteliais e os índices de DE, por meio de um aumento no fluxo sanguíneo e maior atividade antioxidante. Estes achados suportam que o TF pode ser utilizado na prevenção e terapia das complicações cardiovasculares induzidas pelo DM. Além disso, estudos demonstraram que ratos diabéticos induzidos com STZ, melhoraram a dilatação dependente do endotélio na artéria basilar (reatividade cerebrovascular) com 4 semanas de TA (MAYHAN et al., 2004). Em outro estudo, também com ratos diabéticos induzidos com STZ, foi observado que o TA com intensidade moderada e 10 semanas de treinamento, melhorou a reatividade vascular dos ratos diabéticos treinados (HEIDARIANPOUR et al., 2007). Por outro lado, outros estudos demonstraram que o TA não alterou os relaxamentos dependentes do endotélio em artérias carótidas de ratos Wistar Kyoto e artéria coronária de cães (CHEN; CHIANG, 1996; ROGERS et al., 1991) Assim, o efeito do TF na produção endotelial de NO pode ser diferente entre as espécies ou leitos vasculares examinados (MITANI, 1999)..

(24) 23. Em relação ao treinamento resistido (TR), a literatura também reporta importantes benefícios a saúde, como o aumento de força muscular, aumento da densidade mineral óssea e aumento da síntese de glicogênio muscular (POLLOCK et al., 2000). Além disso, evidências atuais têm demonstrado alguns efeitos benéficos do TR no controle de alguns fatores de risco, como resistência à insulina e a obesidade (CIOLAC; GUIMARÃES, 2004; SANCHEZ; LEON, 2006). No entanto, existem poucos estudos relacionados aos efeitos do TR sobre o sistema cardiovascular, e em especial sobre a função endotelial (BARAUNA et al., 2007; CUNHA et al., 2005 ; HARRIS et al., 2009; PINTER et al., 2008)..

(25) 24. 3 OBJETIVOS. 3.1 Objetivo Geral. - Avaliar os efeitos do treinamento resistido (TR) sobre as alterações na reatividade vascular de ratos diabéticos induzidos por aloxano.. 3.2 Objetivos específicos. - Caracterizar as alterações na reatividade vascular para agentes vasoconstrictores e vasorelaxantes em anéis de artéria mesentérica superior de ratos diabéticos induzidos por aloxano;. - Verificar o efeito do treinamento resistido (TR) sobre as alterações na reatividade vascular para agentes vasoconstrictores e vasorelaxantes em anéis de artéria mesentérica superior de ratos diabéticos induzidos por aloxano;. - Elucidar as possíveis vias de sinalização implicada nas alterações de reatividade vascular de ratos diabéticos induzidos por aloxano submetidos ao treinamento resistido (TR)..

(26) 25. 4 RESULTADOS. Research article. Resistance training improves acetylcholine-induced vasorelaxations in diabetic rats. Marcelo M. Mota a; André S. Barreto a; Milene T. Fontes a; Tharciano Luiz T. B. da Silva a; Antônio C. Cabral de Oliveira b; Márcio R. V. Santos a*. a. Physiology Department – Cardiovascular Pharmacology Laboratory. b. Physical Education Department. Universidade Federal de Sergipe – Av. Marechal Rondon, S/N, Rosa Elze, CEP 49100-000, São Cristóvão, SE, Brazil.. * Corresponding Author Dr. Márcio Roberto V. Santos - Laboratório de Farmacologia Cardiovascular, Universidade Federal de Sergipe, Av. Marechal Rondon, S/N, Rosa Elze, CEP: 49100-000, São Cristóvão, SE, Brazil, Phone: (+55) 79 21056842 FAX: (+55) 79 21056474. E-mail: marcio@infonet.com.br.

(27) 26. ABSTRACT. The effects of resistance training (RT) on the changes in vascular reactivity of diabetic rats induced by alloxan were evaluated in this work. Male Wistar rats (250-300g) were divided into 3 groups: sedentary control (SC), diabetic sedentary (SD) and diabetic trained with RT (TD). The changes in vascular reactivity were evaluated through concentrations-response curves to contractile, phenylephrine (Phe) and KCl, and relaxant, acetylcholine (ACh), sodium nitroprusside (SNP), and pinacidil (PIN), agents in rings of mesenteric artery. It was not observed differences between the potency (pD2) and maximum response (Rmax) of the contractions induced by contractile agents in all groups. However, it was observed a significant decrease of Rmax of the relaxations induced by ACh in the SD (79.7 ± 1.4%; n = 6) and an increase in the DT (93.1 ± 2.6%; n = 6), without changing the pD2. In the presence of L-NAME, Ach-induced relaxations were significantly reduced in groups SC and TD, but not in SD group. Furthermore, it was observed a significant increase in the pD2 of SNP and PIN in SD group. The RT was able to prevent this increase only in the PIN-induced relaxations. In conclusions, RT was able to improve endothelium-dependent relaxation of mesenteric artery of diabetic rats, presenting a potential therapeutic in the treatment of vascular complications caused by the diabetes mellitus.. Keywords: Diabetes mellitus, resistance training, vascular reactivity, rat. Abreviations: DM - diabetes mellitus, ED - endothelial dysfunction, RT - resistance training, PT - physical training..

(28) 27. 1. Introduction. Diabetes mellitus (DM) is characterized as a heterogeneous group of metabolic disorders that have in common the hyperglycemia associated with secondary complications in the cardiovascular system where it alters the functions of endothelial cells and vascular smooth muscle (De Vriese et al., 2000; Shi Y. et al., 2007). Hyperglycemia, resulting from disturbances in insulin action, secretion or both (Fein et al., 1980), is associated with endothelial dysfunction (ED) in vivo and in vitro (Tesfamariam et al., 1991; Ting et al., 1996). ED is a systemic phenomenon and refers to the imbalance of endothelial production of mediators that regulate among other factors, the vascular tone (De Vriese et al., 2000). Among the various therapies engaged in the improvement of ED, primary prevention, which includes changes in diet and physical training (PT), has been the most suggested one (Nicklas et al., 2005). Hence, studies that attempt to investigate the improvement of ED take up an important role (Sundquist et al., 2005). There are evidences that the aerobic PT provides improvements in ED due to diabetes (Chakraphan et al., 2005) possibly to promote metabolic, neuroendocrine and cardiovascular adaptations (Hambrecht et al., 2004; Harthmann et al., 2007). However, there are no evidences demonstrated the benefits of the resistance training (RT) on ED from diabetes. Thus, the aim of this study was to evaluate the effects of this type of training on changes in vascular reactivity of diabetic rats induced by alloxan.. 2. Materials and methods. 2.1. Animals and experimental design.

(29) 28. Male Wistar rats (250 - 300 g) were used in all experiments. Animals were housed under conditions of controlled temperature (22 ± 1º C) and light-dark cycle of 12 hours, food and water were provided ad libitum. All procedures described in the present work were approved by the Animal Research Ethics Committee of the Universidade Federal de Sergipe, Brazil (Protocol number 01/2008). The animals were divided into 3 groups with 10 animals each: sedentary control group (SC), sedentary diabetic group (SD) and resistance training diabetic group (TD). The animals of the SC and SD groups were kept in their cages without exposure to RT, while animals in TD group were subjected to 8 weeks of RT.. 2.2. Drugs. The drugs used were: acetylcholine chloride (ACh), L-phenylephrine (Phe), Nώ-nitroL-arginine methyl ester hydrochloride (L-NAME), sodium nitroprusside (SNP), pinacidil (PIN) and alloxan (All from SIGMA). All drugs were freely dissolved in saline (0.9% of NaCl in distilled water).. 2.3. Diabetes Induction. The induction of experimental diabetes was performed as described by Carvalho et al. (2006). The animals were induced by administration of alloxan (Sigma Chemical Co, St Louis, MO, USA) in a single dose of 40 mg/kg, i.v. (penian vein), two weeks before the exercise protocol. Control animals received only saline. Animals with blood glucose > 200 mg/dl were selected as diabetic. Blood glucose was measured one week after treatment with alloxan using reagent strips (ACCU-CHEK Advantage II, Roche, São Paulo, SP, Brazil).

(30) 29. coupled to a portable digital glucometer (ACCU-CHEK Advantage II, Roche, São Paulo, SP, Brazil). 2.4. Exercise protocol. Resistance training was fulfilled in a squat-training apparatus following a model adapted from Tamaki et al. (1992). The animals of TD, after 1 week of adaptation, were trained by 3 sets of 10 repetitions with a 60 s rest period at 40% training load set by one repetition maximum test (1RM), 3 times a week. The training load and intensity were adjusted every 2 weeks through a new 1RM. The parameters of electrical stimulation were fulfilled as described by Pinter et al. (2008). The animals were encouraged to perform the series through the application of electrical stimulation (20 V, 0.3 s duration, 3 s intervals) by electrodes (ValuTrode, Model CF3200, Axelgaard, Fallbrook, CA, USA) settled at the tail and connected to an electro stimulator (BIOSET, Physiotonus Four, Model 3050, Rio Claro, SP, Brazil).. 2.5. Glycemia. Forty-eight hours after the last training session, blood samples were collected from the tail of the animals in all groups, and glycemia was measured as described.. 2.6. In vitro studies. The tissue preparation was performed as described in Menezes et al. (2007). After animal sacrifice the superior mesenteric artery was removed, cleaned from connective and fat tissues and sectioned into rings (1–2 mm). These rings were suspended by fine stainless hooks connected to a force transducer (Letica, Model TRI210; Barcelona, Spain) with cotton threads.

(31) 30. in organ baths containing 10 ml Tyrode’s solution (Composition in mM: NaCl 158.3, KCl 4.0, CaCl2 2.0, NaHCO3 10.0, C6H12O6 5.6, MgCl2 1.05 and NaH2PO4 0.42). This solution was continually gassed with carbogen (95% O2 and 5% CO2) and maintained at 37oC under a resting tension of 0.75 g for 60 min (stabilization period). The isometric tension was recorded through the force transducer coupled to an amplifier-recorder (BD-01, AVS, SP, Brazil). When necessary, endothelium was removed by gently rubbing the intimal surface of the vessels with a fine stainless wire and its functionality was assessed by the ability of ACh (10 µM) to induce more than 70% relaxation of Phe (1 µM) tonus. The absence of the relaxation to ACh was taken as evidence that the rings were functionally denuded of endothelium (Furchgott and Zawadzki, 1980). Changes in vascular reactivity were assessed by obtaining concentration-response curves for the contractile agents Phe (10-8 - 10-5 M), an α1 adrenergic agonist, and KCl (10 80 mM), nonspecific contractile agent; and the relaxant agents ACh (10-9 - 10-4 M), a not selective muscarinic agonist, SNP (10-11 - 10-5 M), a donor nitric oxide (NO), and PIN (10-8 – 10-4 M), a selective opening of ATP-sensitive potassium channels (KATP). Relaxing agents were tested on rings pre-contracted with Phe (1 µM). To evaluate the participation of NO in relaxation to ACh, the curves for this agent were also obtained in the presence of L-NAME (100 µM).. 2.8. Statistical analysis. Values are expressed as mean ± standard error of mean (SEM). The potency of the in vitro experiments were expressed in pD2 values and calculated by the negative logarithm of EC50 (effective concentration able to induce 50% of maximal response) obtained by nonlinear regression of concentration-response curves. When necessary, the Student T test and one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni post-test were performed to evaluate.

(32) 31. the significance of differences between means. Values were considered statistically significant when p<0.05. For all these procedures we used the statistical program GraphPad PrismTM version 3.02 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).. 3. Results. 3.1. Glycemia. Changes in glycemia before and after the 8 weeks of experiment are shown in Table 1. After the 8 weeks of study, there was not significant variation in glycemia in the SC animals, but it was observed a significant increase (p<0.05) in glycemia levels in the SD, from 316.4 ± 15.6 to 381.0 ± 25.3 mg/dl, and a significant reduction (p<0.05) in TD from 330.1 ± 18.5 to 270.2 ± 17.0 mg/dl (Table 1).. 3.2. Maximal Strength. To assess the evolution of the RT, a one maximum repetition test (1RM) was used. As noted in Table 1, at the beginning of the experiments, strength levels were similar in all groups. After 8 weeks of study, only TD animals obtained a significant increase (p<0.05) in strength levels from 945.4 ± 108.7 to 1,327.3 ± 98.7 g.. 3.3. Effect of resistance training on the response to phenylephrine and KCl. In isolated rings of superior mesenteric artery without functional endothelium, Phe or KCl induced contractions in a concentration-dependent manner (Figure 1 and 2). However,.

(33) 32. there was no difference between the contractions induced by KCl and Phe. Rmax of both contractile agents were not altered in all groups.. 3.4. Effect of resistance training on the response to acetylcholine. As shown in Figure 3, ACh was able to induce concentration-dependent relaxation in isolated rings of superior mesenteric artery with intact endothelium in all groups. There were no differences in the pD2 (SC = 7.0 ± 0.06; SD = 7.2 ± 0.05 and TD = 7.0 ± 0.08). However, the Rmax of the SD was significantly reduced (p<0.001) when compared with the SC. This reduction was completely prevented by the RT (Fig. 3).. 3.5. Effect of resistance training in response to acetylcholine in rings pretreated with LNAME. As noted in Table 2, L-NAME (100 µM) was able to significantly reduce the pD2 and Rmax in the ACh-induced relaxations in both SC (from 7.0 ± 0.06 to 5.5 ± 0.1; p<0.001) and TD (from 7.0 ± 0.08 to 4.9 ± 0.2; p<0.01). This reduction was not observed in the SD. Between groups, the presence of L-NAME significantly increased the pD2 (from 5.5 ± 0.1 to 6.8 ± 0.1; p<0.001) of ACh-induced relaxations in the SD in relation to the SC without modifying the Rmax (Table 2). On the other hand, the L-NAME significantly reduced both the pD2 (from 6.8 ± 0.1 to 4.9 ± 0.2; p<0.001) and the Rmax (p<0.01) of the ACh-induced relaxations in the TD when compared with the SD (Table 2)..

(34) 33. 3.6. Effect of resistance training on the response to sodium nitroprusside. Figure 4 shows the SNP-induced relaxations in isolated rings of superior mesenteric artery without functional endothelium in all groups. As can be seen, the pD2 of the SD was significantly increased (p<0.001) from 7.9 ± 0.08 to 8.3 ± 0.03, compared with the pD2 of the SC (Fig. 4). No changes in pD2 were observed in the TD (pD2 = 8.2 ± 0.04) when compared with the SD (pD2 = 8.3 ± 0.03) (Fig. 4). There were no significant differences in Rmax in either group.. 3.7. Effect of resistance training in response to pinacidil. In isolated rings of superior mesenteric artery without functional endothelium, PIN induced relaxation in a concentration-dependent manner in all groups (Figure 5). A significant increase (p<0.001) in pD2 from 6.2 ± 0.09 to 6.9 ± 0.08 was observed in the SD when compared with the SC (Fig. 5). The RT was able to prevent this effect, reducing the pD2 from 6.9 ± 0.08 (SD) to 6.3 ± 0.1 (TD) (p<0.001). There were no significant differences in Rmax between the groups (Fig. 5).. 4. Discussion. There is evidence that the aerobic PT provides improvement of ED caused by DM (Chakraphan et al., 2005). However, little is known about the benefits of the RT on DE (Cunha et al, 2005). In this context, this study aimed to evaluate, for the first time in our knowledge, the effects of the RT on vascular reactivity in diabetic rats. As a model of RT, we used the squat apparatus described by Tamaki et al. (1992). In this study, we observed that the animals that were subjected to RT showed a significant increase in the levels of maximum force after the 8 weeks of study, proving the efficiency of.

(35) 34. the RT. These results are consistent with those reported by Pinter et al. (2008), who also observed a significant increase in the levels of maximum strength after 8 weeks of RT. There is evidence that the aerobic PT improves the conditions of DM, facilitating peripheral glucose uptake and the metabolism of glycogen, protein, and lipid (Peltoniemi et al., 2001). The results here presented showed that high levels of glucose produced by the diabetic animals at the beginning of the study were reduced after 8 weeks of RT. Similar results were found by Chakraphan et al. (2005) and Luciano et al. (1998) who demonstrated a reduction in blood glucose of diabetic animals after completion of aerobic training. It is reported in the literature that muscle contraction stimulates translocation of glucose transporters (GLUT4), regardless of insulin action, thus increasing glucose uptake (Jessen and Goodyear, 2005). Therefore, a possible explanation for the reduction of blood glucose in this study may be related to the increase of carriers and therefore a greater glucose uptake. Studies have shown that hyperglycemia is associated with ED in vivo and in vitro (Tesfamariam et al., 1991; Ting et al., 1996). Several studies have shown that the presence of ED provided by the DM is related to a high risk of cardiovascular events (Kohl, 2001). Reports in the literature indicate that PT causes an increase in production of endothelium-derived NO (Delp et al., 1993; Spier et al., 1999). This increase antagonizes the vasoconstrictor effects of adrenergic agonists in different isolated arteries (Chen et al., 1994; Donato et al., 2007). Our results demonstrated that RT did not alter the sensitivity of the α1adrenergic receptors in animals of all groups. According to Convertino (2003), changes in sensitivity of adrenergic receptors may be especially dependent on intensity, duration and frequency of training. Possibly the RT protocol used in this study was not able to generate an adequate stimulus to provide these changes. The vasoconstrictor response induced by increasing concentrations of KCl, an unspecific and adrenergic receptor-independent contractile agent, did not present significant.

(36) 35. differences between groups. Our findings differ from the results found by Chen et al. (2001), who demonstrated in isolated rings of rat mesenteric artery that the contractions induced by high concentrations of KCl (15 - 60 mM) were attenuated in the group of animals subjected to 8 weeks of treadmill running compared with the sedentary control group. This difference in results can be attributed to the different characteristics between the types of training adopted. Studies have shown that DM causes changes in endothelium-dependent vasodilation induced by ACh in different vascular beds (Lash et al., 1991; Cosentino et al., 1998). These changes seem to be caused both by the degree of hyperglycemia and the duration of DM (Singh et al., 2003). The results of this study showed that endothelium-dependent relaxation induced by ACh in isolated rings of rat superior mesenteric artery was decreased in diabetic animals of the sedentary group. On the other hand, 8 weeks of RT was able to reverse this reduction. A possible explanation for this phenomenon may be related to the reduction in blood glucose observed in animals of the trained group. According to the literature, hyperglycemia inhibits the protein expression of eNOS, an enzyme catalyzing the synthesis of NO, and induces oxidative stress in endothelial cells and smooth muscle cells that inactivates NO (Cai and Harrison, 2000). These effects together significantly reduce the NO-dependent relaxation. To investigate the changes produced by DM on NO-dependent relaxation and strengthen the hypothesis of the role of NO in these changes, we obtained concentrationresponse curves to ACh in isolated rings of rat superior mesenteric artery with intact endothelium and pre-treated with L-NAME, a selective inhibitor of eNOS (Moncada et al., 1991). Under these experimental conditions, we observed that L-NAME antagonized the relaxation induced by ACh in animals in the SC, but did not modify the relaxation of the SD animals. This demonstrates that DM promoted a reduction in the participation of NO in the endothelium-dependent relaxation. Interestingly, the RT was able to reverse also this.

(37) 36. reduction, since, in the presence of L-NAME, the relaxations to ACh were antagonized similarly to the SC. These findings are consistent with the results presented by Chen et al. (2001), which showed that the maximum relaxation induced by ACh were also reduced in rings of mesenteric artery of animals submitted to aerobic training for 8 weeks. It is a consensus in the literature that PT can cause changes in functional properties not only of the endothelium but also of the vascular smooth muscle in both rats and humans (Bowles, 2000; Laughlin, 2003). In order to assess possible effects of the RT on the endothelium-independent relaxations, concentration-response curves for SNP, an exogenous NO donor (Butler and Glidewell, 1987), were obtained. The results of these experiments showed that DM provided an increase in sensitivity of arterial rings to SNP. Similarly, Carvalho et al. (2010) also observed an increase in sensitivity to SNP in diabetic animals when compared with normoglycemic animals. This increased sensitivity may be related to a possible reduction in NO bioavailability caused by DM and consequent up-regulation of soluble guanylate cyclase (NO receptor) (Diederich et al., 1994). This up-regulation may enhance relaxations mediated by NO donors, such as SNP (Choudhary et al., 1991). On the other hand, the RT was unable to reverse this increase in sensitivity. Studies have shown that the chronic state of hyperglycemia characteristic of DM also may affect the function of ATP-dependent K+ channels (KATP) in the cells of vascular smooth muscle (Sobey et al., 2001). Finally, to assess the possible effects of the RT on relaxations mediated by KATP channels in vascular smooth muscle, concentration-response curves for PIN, a selective opener of KATP channels (Brayden, 2002), were obtained. Our results showed that DM was able to increase of sensitivity of arterial rings to PIN. This increased sensitivity of KATP channels observed in the SD may be related to a high metabolic state (e.g. low ATP levels) in vascular smooth muscle cells of these animals as a result of hyperglycemia (Cameron and Cotter, 1992). It is reported in the literature that hyperglycemia provides an.

(38) 37. increase in the activity of KATP channels (Fukao et al., 1997). Interestingly, it was observed that the RT was able to reverse this increase. This reversal provided by the RT may be related to reduction of glycemia and to a possible improvement in the metabolic state of TD animals.. 5. Conclusion. This study was the first to evaluate the effects of RT on DE in diabetic rats and to investigate some of the possible mechanisms of action involved in these effects. The results show that the RT was able to reduce glucose levels and provide an increase in strength levels. In addition, the results of vascular reactivity demonstrated that the RT, in the protocol adopted in this study, was able to improve endothelium-dependent relaxations of rat superior mesenteric artery of diabetic rats. Thus, the RT has a therapeutic potential in the treatment of vascular complications offered by DM. However, more studies are needed to better understand these effects.. Acknowledgements. We thank Mr. Osvaldo Andrade Santos for the technical assistance. This work was supported by grants from CNPq, CAPES, FAPITEC-SE, Ministério da Saúde, SES/SE, Brazil.. References. Bowles, D.K., 2000. Adaptation of ion channels in the microcirculation to exercise training. Microcirculation. 7, 25-40. Brayden, J.E., 2002. Functional roles of KATP channels in vascular smooth muscle. Clin Exp Pharmacol Physiol. 29 (4), 312-316..

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